JP5286515B2 - センサチップ及びセンサチップ製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、センサチップ及びセンサチップ製造方法に関するものである。

金属微粒子と光との共鳴現象の一つであるプラズモン共鳴を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を測定するセンサーが開発されている（例えば、特許文献１参照）。

ここで、特許文献１のように、プラズモン共鳴を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を検出可能な原理について説明する。金ナノ粒子や銀ナノ粒子等の金属微粒子に光を照射すると、所定の共鳴波長において共鳴現象の一つであるプラズモン共鳴が生じる。その結果、光が照射された金属微粒子による散乱や吸収が増大するため、金属微粒子と相互作用した光を検出した際に、そのスペクトルに共鳴ピークが現出する。この共鳴ピークを生じせしめる共鳴波長は、金属微粒子周囲の屈折率に依存しているため、共鳴ピークのシフトを検出することで、金属微粒子周囲の屈折率変化を検出できることになる。

上記特許文献１に記載の局在プラズモン共鳴センサー（センサチップ）では、ガラス基板の表面上に金属微粒子としての金ナノ粒子が複数固定されて構成されており、ガラス基板の裏面側から光を照射し、その透過光を検出することによって共鳴ピークを取得する。そして、共鳴ピークの変化から金属微粒子周囲の屈折率変化を検出している。

このようなセンサチップは、例えば、次のようにしてＤＮＡやタンパク質等の被検体を検出するセンサチップとして利用される。すなわち、金属微粒子に被検体と特異的に結合するプローブ分子を固定しておき、試料液を送液すると、試料液に被検体が含まれていれば、プローブ分子に結合した被検体の影響で金属微粒子近傍の屈折率が変化して共鳴波長がシフトする。そのため、試料液の送液前後での共鳴ピークの変化を検出すれば、被検体を検出できることになり、ＤＮＡやタンパク質等の被検体を検出するセンサチップとして利用できることになる。
特開２０００―３５６５８７号公報

しかしながら、このような金属微粒子と光との共鳴現象を利用する方法では、ガラス基板上に固定する複数の金属微粒子のうち隣接する金属微粒子同士が会合すると、金属微粒子と光との共鳴現象を検出するために検出する金属微粒子と相互作用した光のスペクトルが歪み、結果として、検出感度が低下する恐れがある。

そこで、本発明は、金属微粒子周囲の屈折率変化を高感度で検出可能なセンサチップ及びセンサチップの製造方法を提供することを目的とする。

本発明に係るセンサチップは、金属微粒子と光との共鳴現象を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を検出するためのセンサチップであって、基板と、基板上に形成されると共に、金属微粒子を固定するための第１の膜と、第１の膜のセンサ領域上に固定される複数の金属微粒子と、第１の膜上に固定されると共に、複数の金属微粒子のうち隣接する金属微粒子間に配置されるブロック剤と、を備えることを特徴とする。

上記構成のセンサチップでは、センサ領域上において隣接する金属微粒子間にブロック剤が固定されているため、隣接する金属微粒子間の会合が抑制される。その結果、金属微粒子に光を照射して上記共鳴現象を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を検出する際、金属微粒子と相互作用した光のスペクトルの歪みが抑制され、金属微粒子周囲の屈折率変化を高い感度で検出することができることになる。そのため、金属微粒子に例えば被検体と特異に結合するプローブ分子を固定させておくことによって特定の被検体を高感度で検出可能である。

なお、上記基板としては、金属微粒子に共鳴現象を生じせしめる波長を含む波長帯域の光に対して透明であるものが考えられ、ガラス基板が例示される。

また、本発明に係るセンサチップでは、第１の膜はシラン化合物から形成されており、ブロック剤はカルボキシル基を有する化合物であることが好ましい。

シラン化合物はアミノ基を有しており、カルボキシル基とアミド結合を形成する。そのため、カルボキシル基を有するブロック剤を確実に第１の膜に固定することができることから、金属微粒子間の会合が抑制される。その結果、前述したように、金属微粒子周囲の屈折率変化を感度よく検出できる。

この場合、上記ブロック剤は、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸及びポリエチレングリコールの何れか一つから形成されていることが好適である。これらは、末端にカルボキシル基を有するため、確実に第１の膜にブロック剤が固定される。

更にまた、本発明に係るセンサチップでは、金属微粒子の表面上に形成されると共に、被検体を固定するための第２の膜を更に備えることが好ましい。これにより、第２の膜を利用して金属微粒子近傍に被検体を固定できる。そのため、被検体の固定による金属微粒子周囲の屈折率変化を高感度で検出でき、結果として、被検体を高感度で検出可能である。

上記第２の膜は、メルカプトウンデカン酸から形成されている、とすることが可能である。

更に、本発明に係るセンサチップでは、第１の膜上にセンサ領域を複数有し、各センサ領域上に上記金属微粒子及びブロック剤が固定されていることが好ましい。この場合、センサチップが、金属微粒子及びブロック剤が固定されるセンサ領域を複数有している。そのため、各センサ領域上の金属微粒子に例えば種々の被検体に対してそれぞれ特異に結合するプローブ分子を固定させておくことによって各センサ領域で異なる被検体を検出可能であり、結果として、センサチップで一度に複数の被検体を検出可能である。

更にまた、本発明に係るセンサチップでは、金属微粒子の粒径は５０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好適である。

また、本発明に係るセンサチップ製造方法では、金属微粒子と光との共鳴現象を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を検出するためのセンサチップを製造する方法であって、（１）基板上に形成されており金属微粒子を固定するための第１の膜のセンサ領域と、金属微粒子を含む金属微粒子溶液とを接触させることによってセンサ領域に金属微粒子を所定の粒子密度で固定する粒子固定工程と、（２）金属微粒子が固定されたセンサ領域とブロック剤導入溶液とを接触させることで、センサ領域にブロック剤を固定するブロック剤固定工程と、を備えることを特徴とする。

この方法で製造されたセンサチップでは、金属微粒子溶液を利用して所定の粒子密度で金属微粒子が固定されているセンサ領域上にブロック剤を固定するため、センサ領域上において金属微粒子が固定されていない部分にブロック剤が固定される。これによって、隣接する金属微粒子間にブロック剤が配置されることになる。その結果、金属微粒子に光を照射して上記共鳴現象を利用して金属微粒子周囲の屈折率変化を検出する際、金属微粒子と相互作用した光のスペクトルの歪みが抑制され、金属微粒子周囲の屈折率変化を高い感度で検出することができることになる。そのため、金属微粒子に例えば被検体と特異に結合するプローブ分子を固定させておくことによって特定の被検体を高感度で検出可能である。

更に、本発明に係るセンサチップ製造方法では、第１の膜はシラン化合物から形成されており、ブロック剤はカルボキシル基を有する化合物であることが好ましい。

シラン化合物はアミノ基を有しており、カルボキシル基とアミド結合を形成する。そのため、カルボキシル基を有するブロック剤を確実に第１の膜に固定することができ、金属微粒子間の会合が抑制される。その結果、前述したように、金属微粒子周囲の屈折率変化を感度よく検出できる。

この場合、上記ブロック剤は、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸及びポリエチレングリコールの何れか一つからなることが好適である。これらは、末端にカルボキシル基を有するため、確実に第１の膜にブロック剤が固定される。

また、本発明に係るセンサチップ製造方法では、被検体を固定するための第２の膜を、金属微粒子が固定されたセンサ領域と第２の膜形成溶液とを接触させることによって、金属微粒子の表面上に形成する膜形成工程を更に備えることが好適である。これにより、第２の膜を利用して金属微粒子近傍に被検体を固定することが可能である。そのため、被検体の固定による金属微粒子周囲の屈折率変化を高感度で検出でき、結果として、被検体を高感度で検出可能である。

上記第２の膜は、メルカプトウンデカン酸から形成されている、とすることができる。

更に、本発明に係るセンサチップ製造方法では、基板に固定された金属微粒子の粒径が５０ｎｍ未満の場合、基板に固定された金属微粒子を粒子成長溶液と接触させることによって金属微粒子の粒径を５０ｎｍ〜１００ｎｍに増大させる粒径増大工程を更に備えることが好ましい。

粒径増大工程により５０ｎｍ未満の粒径を上記範囲に増大させることで、金属微粒子と光との共鳴現象をより効率的に生じさせるため、金属微粒子周囲の屈折率変化をより高感度で検出できる。なお、この粒径増大工程は、金属微粒子の粒径を確実に増大させる観点から、ブロック剤導入工程の前に実施されることが好ましい。

更にまた、本発明に係るセンサチップ製造方法では、第１の膜はセンサ領域を複数有しており、粒子固定工程では、各センサ領域上に前記金属微粒子を所定の粒子密度で固定し、ブロック剤固定工程では、各センサ領域上にブロック剤を固定することとが好適である。

この場合、各センサ領域上に、金属微粒子及びブロック剤が固定されることになる。そして、センサチップがセンサ領域を複数有することで、各センサ領域で異なる被検体を検出可能であるため、センサチップで一度に複数の被検体を検出可能である。各センサ領域上の金属微粒子に例えば種々の被検体に対してそれぞれ特異に結合するプローブ分子を固定させておくことによって各センサ領域で異なる被検体を検出可能であり、結果として、センサチップで一度に複数の被検体を検出可能である。

上記所定の粒子密度としては、３０〜６０個／μｍ^２とすることが好適である。

本発明によるセンサチップ及びセンサチップ製造方法によれば、金属微粒子周囲の屈折率変化を高感度で検出可能である。

以下、図面を参照して本発明に係るセンサチップ及びセンサチップ製造方法の実施形態について説明する。以下の説明において、同一の要素には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、図面の寸法比率は説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明に係るセンサチップの一実施形態の断面構成を示す模式図である。センサチップ１０Ａは、金属微粒子としての金ナノ粒子１４と光との共鳴現象の一つであるプラズモン共鳴による共鳴散乱を利用して後述する被検体２０（図５参照）を検出するためのセンサ素子である。なお、被検体２０としてはＤＮＡやタンパク質が例示される。

センサチップ１０Ａは、シラン処理されてアミノプロピルシラン（シラン化合物）からなるアミノシラン膜（第１の膜）１２が表面１１ａに形成されたガラス基板１１を有する。ガラス基板１１の大きさは、表面１１ａ側からみたときに１８ｍｍ×１８ｍｍ程度が例示される。アミノシラン膜１２のセンサ領域１３上には、金ナノ粒子１４が例えば３０〜６０個／μｍ^２の粒子密度で固定されている。ここで、センサ領域１３とは、アミノシラン膜１２において複数の金ナノ粒子１４からなる金ナノ粒子群が固定され、被検体２０を検出するために利用される領域である。言い換えれば、金ナノ粒子群が固定された領域がセンサ領域１３となる。図１に示したセンサチップ１０Ａでは、アミノシラン膜１２の表面１２ａ全面がセンサ領域１３として機能している。金ナノ粒子１４の粒径（直径）ｄ１は、金ナノ粒子１４に光が照射された際の散乱光の強度を高くする観点から５０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。この金ナノ粒子１４の表面上には、１１−メルカプトウンデカン酸（MUA：11-mercaptoundecanoic acid）からなる自己組織化膜（第２の膜）１５が形成されている。以下では、自己組織化膜１５をＭＵＡ膜１５とも称す。

図１に示すように、センサチップ１０Ａでは、アミノシラン膜１２のセンサ領域１３内において金ナノ粒子１４が吸着していない部分の少なくとも一部に、ブロック剤１６としてのポリエチレングリコール（PEG:polyethyleneglycohol）が固定されている。これにより、隣接する金ナノ粒子１４間にブロック剤１６が配置されることになる。ブロック剤１６は、カルボキシル基（ＣＯＯＨ基）を末端に有する化合物であればよく、ＰＥＧの他、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸等が例示される。以下の説明では、特に断らない限りブロック剤１６はＰＥＧとする。

次に、図２〜図４を利用して、センサチップ１０Ａを製造する方法について説明する。図２に示すように、センサチップ１０Ａの製造工程は、シラン処理工程Ｓ１と、粒子固定工程Ｓ２と、ブロック剤導入工程Ｓ３、粒径増大工程Ｓ４と、ＭＵＡ膜形成工程（膜形成工程）Ｓ５とを有する。なお、図２では、次に説明する各工程の主要な処理を具体例を挙げて示している。

各工程について、具体的な濃度等の数値、溶液名及び各処理時間等を一例として挙げながら説明する。図３及び図４は、センサチップの製造方法の各工程を示す概略図である。なお、図４（ｃ）は、後述するＭＵＡの化学式を示している。また、センサ領域１３は、前述したようにアミノシラン膜１２の表面全面としている。

シラン処理工程Ｓ１では、洗浄したガラス基板１１を５％の３−アミノプロピルトリメキシシラン（APTMS：3-aminopropyltrimethoxysilane）トルエン溶液に５分間浸漬する。これにより、図３（ａ）に示すように、ガラス基板１１の表面上にアミノシラン膜１２が形成されることになる。次いで、アミノシラン膜１２が形成されたガラス基板１１をエタノールで６回、純水で３回超音波洗浄する。

粒子固定工程Ｓ２では、アミノシラン膜１２上に所定の粒子密度で金ナノ粒子１４を固定する。アミノシラン膜１２が形成されたガラス基板１１を、濃度１０ｎＭの金ナノ粒子溶液に約２時間浸漬する。金ナノ粒子溶液中の金ナノ粒子１４の粒径ｄ２は約５０ｎｍ未満である。これにより、図３（ｂ）に示すように、アミノシラン膜１２の吸着サイトの一部に粒径ｄ２が約５０ｎｍ未満の金ナノ粒子１４が固定されることになる。

上記金ナノ粒子溶液は、例えばクエン酸還元法により合成したものを利用すればよく、具体的には次のようにして準備する。すなわち、約１ｍＭテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物水溶液を、ホットプレート等で加熱しながら攪拌を行う。十分に沸騰してから約１０ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液を加えてから十分加熱攪拌し、常温まで冷却した後、０．２０μｍの細孔を持つメンブレンフィルターでろ過している金ナノ粒子溶液とする。

また、金ナノ粒子１４の粒子密度は、金ナノ粒子溶液の濃度と浸漬時間の少なくとも一方を調整することで制御でき、上記条件で粒子密度３０〜６０個／μｍ^２となる。なお、ここでは、所定の粒子密度を粒子密度３０〜６０個／μｍ^２としているが、所定の粒子密度は、アミノシラン膜１２が有する全吸着サイトに金ナノ粒子１４が固定されない粒子密度であればよい。

粒径増大工程Ｓ４では、金ナノ粒子１４及びブロック剤１６が固定されたガラス基板１１を、０．４ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液と０．２４ｍＭテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物溶液との混合液である粒子成長溶液に５回浸漬する。これにより、図３（ｃ）に示すように、金ナノ粒子１４の粒径が増大し、６０ｎｍ〜７０ｎｍの粒径ｄ１に調整できる。図３（ｃ）においては、説明のために、粒径が増大する前の金ナノ粒子を破線で示している。なお、浸漬毎に粒子成長溶液は新しくする。また、浸漬回数を多くすることで粒径を大きくできる。そのため、ここでは浸漬回数は５回としたが、浸漬回数は所望の粒径に応じて決定すればよく、予め粒径と浸漬回数との関係を求めておけばよい。粒径は５０ｎｍ〜１００ｎｍとすることが好ましい。

ブロック剤導入工程Ｓ４では、２０ｍｇ／ｍｌのＥＤＡＣ、２０ｍｇ／ｍｌのＣＯＯＨ基を持つＰＥＧ（分子量２０００）１６を０．１ＭのMES buffered Salineに溶解して得られる溶液（以下、「ブロック剤導入溶液」と称す）に金ナノ粒子１４を固定したガラス基板１１を約３０分浸漬する。これにより、図４（ａ）に示すように、アミノシラン膜１２上において金ナノ粒子１４の固定されていない吸着サイトの少なくとも一部にＰＥＧ１６が吸着する。なお、上記ＥＤＡＣとは、１-エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１−ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochloride）であり、ＭＥＳとは、２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物（2-morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate）である。また、０．１ＭのMES buffered Salineは、０．１ＭのＭＥＳと０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを溶解させてｐＨを４．５〜５とした溶液である。

ＭＵＡ膜形成工程Ｓ５では、ブロック剤１６及び金ナノ粒子１４が固定されたガラス基板１１をエタノールに１，２分間程度浸漬した後に取り出して、ＭＵＡをエタノールに溶解することによって作製される１０ｍＭのＭＵＡエタノール溶液（第２の膜形成溶液）に約１０分間浸漬する。次に、余剰のＭＵＡを除去するために再度エタノールに２０分浸漬した後に取り出して、ガラス基板１１を純水へ１分間程度浸漬してから取り出して更に純水で洗浄する。これにより、図４（ｂ）に示すように、金ナノ粒子１４の表面にＭＵＡ膜１５が形成され、センサチップ１０Ａが得られることになる。なお、図４（ｂ）では、図４（ｃ）に示すようにＭＵＡをその末端のカルボキシル基で簡略的に示している。なお、図１０及び図１１でも同様としている。

なお、上記製造方法では、ブロック剤導入工程Ｓ４の前に粒径増大工程Ｓ３を実施しているため、確実に金ナノ粒子１４の粒径を増大させることができる。ただし、粒径増大工程Ｓ３は、ブロック剤導入工程Ｓ４の後に実施してもよい。

次に、センサチップ１０Ａを利用して被検体２０を検出する方法について図５を利用して説明する。図５は被検体を検出する工程の概念図である。

先ず、センサチップ１０Ａ上に被検体２０と特異的に結合するプローブ分子（結合体）２１を含むプローブ分子導入溶液をセンサチップ１０Ａ上に流すことによって、図５に示すように、プローブ分子２１をＭＵＡ膜１５上に固定する。この際、ガラス基板１１の裏面１１ｂ側から所定の波長帯域の光を金ナノ粒子１４に対して照射しておき、金ナノ粒子１４の散乱光を検出する。

金ナノ粒子１４に光を照射すると、所定の共鳴波長において共鳴現象の一つであるプラズモン共鳴が生じる。その結果、光が照射された金ナノ粒子１４による散乱光の強度が増大する。従って、散乱光のスペクトル（以下、「散乱スペクトル」と称す）は共鳴ピークを有することになる。この共鳴ピークを生じせしめる波長である共鳴散乱波長は、金ナノ粒子１４近傍の屈折率に依存している。

次に、検査すべき試料液をセンサチップ１０Ａ上に流す。試料液に被検体２０が含まれていると、図５に示すように、その被検体２０がプローブ分子２１に特異的に結合する。被検体２０の結合により金ナノ粒子１４近傍の屈折率が変化するため、共鳴散乱波長がシフトし、共鳴ピークの位置が変化する。従って、共鳴散乱波長の変化により試料溶液に被検体２０が含まれているか否かを検出することができる。共鳴ピークの変化の有無は、プローブ分子２１を固定した段階での共鳴散乱波長の散乱光強度の変化によって検出してもよいし、散乱光の散乱スペクトルを取得することによって、共鳴ピークのシフトを検出してもよい。

上述したプローブ剤導入溶液及び試料液のセンサチップ１０Ａ上への送液は、図６及び図７に示すフローセル３０を利用して実施することが可能である。図６は、フローセルの構成を概略的に示す構成図であり、センサチップ１０Ａをセットした状態の図を示している。図７は、図６のＶＩＩ―ＶＩＩ線に沿った断面図である。

フローセル３０は、図６及び図７に示すように、カバー部３１がセル本体部３３にネジ等により固定されて構成されている。カバー部３１の中央部には、センサチップ１０Ａに光を照射するための開口部３２が形成されており、開口部３２のうちセル本体部３３側の縁部は、センサチップ１０Ａをセット可能に構成されている。また、セル本体部３３のうち開口部３２と対向する領域には凹部３４が形成されている。凹部３４の底面には、試料液をフローセル３０内部に導入するための送液口３５と、試料液をフローセル３０外部に排出するための排出口３６とが形成されており、送液口３５と排出口３６には、図６に示すような送液管４１と排出管４２とが接続されるようになっている。

フローセル３０内にセンサチップ１０Ａをセットする際には、ガラス基板１１の裏面１１ｂがカバー部３１側になるように開口部３２にセットし、センサチップ１０Ａ上にＯリング３７を配置した後に、カバー部３１とセル本体部３３とをネジ止めする。これにより、センサチップ１０ＡとＯリング３７と凹部３４の底面とで囲まれた領域内に試料液を送液するための送液空間３８が形成されることになる。この送液空間３８の容量としては、約１８０μｌが例示される。

ここで、このフローセル３０を利用して被検体を検出するためのイメージング装置５０について図８を利用して説明する。図８では、送液管４１と排出管４２の表示は省略し、また、フローセル３０の表示も簡略化している。

イメージング装置５０では、白色光源５１から出力された白色光をコリメータ光学系５２で平行光にした後、干渉フィルタ５３を通して所定の波長帯域の光とする。干渉フィルタ５３としては、金ナノ粒子１４の共鳴散乱を生じせしめる共鳴散乱波長を含む５００〜８００ｎｍ範囲のうちの５０ｎｍ以内の狭帯域の光を通すものが例示される。干渉フィルタ５３を通過した平行光は、開口部３２を通ってセンサチップ１０Ａに対して斜めからセンサチップ１０Ａに照射される。光が照射されたガラス基板１１上の金ナノ粒子１４で散乱された散乱光は、ビデオカメラレンズ５４を通してＣＣＤカメラ５５で検出され、その検出データが解析装置としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）５６に入力される。なお、図８中のハッチング部は、散乱光を示すためのものである。

このイメージング装置５０では、いわゆる撮像装置としてのＣＣＤカメラ５５を利用しているため、センサチップ１０Ａの画像を取得できることになる。また、イメージング装置５０では、干渉フィルタ５３を通して金ナノ粒子１４の共鳴散乱波長を含む５０ｎｍ程度の狭帯域な波長幅を有する光が照射されているので、ＣＣＤカメラ５５の受光セルで検出される散乱光強度の変化によって、金ナノ粒子１４近傍の屈折率変化を検出できることになる。

上記イメージング装置５０において、散乱光強度の変化によって金ナノ粒子１４近傍の屈折率変化を測定できることを図９を利用して説明する。図９は、イメージング装置における散乱光強度の測定結果の一例を示す図である。この測定では、図２を利用して具体的な濃度や溶液名等を挙げて説明したセンサチップ製造方法によって製造されたセンサチップ１０Ａを利用している。そして、そのセンサチップ１０Ａをフローセル３０にセットし、屈折率１．３３の水と屈折率１．３６のエタノールを交互にフローセル３０内に流しながら散乱光の強度を測定している。センサチップ１０Ａに照射する光の波長帯域は、６００〜６５０ｎｍとしている。図９において横軸は時間（秒）を示し縦軸は散乱光強度（ａ．ｕ．）を示している。また、図中の領域Ｉ，ＩＩＩ，Ｖは、水を送液している時の散乱光の強度を示しており、領域ＩＩ，ＩＶは、エタノールを送液しているときの散乱光の強度を示している。図９から理解されるように、金ナノ粒子１４周囲の媒質が水とエタノールとでは散乱光強度が明らかに相違しており、上記イメージング装置５０で確実に金ナノ粒子１４近傍の屈折率変化を検出できることがわかる。

また、イメージング装置５０では、フローセル３０を利用しているので、試料液等を送液しながら測定できるため、種々の試料液を連続的に検査することが可能である。また、フローセル３０の送液空間３８の容量が例えば１８０μｌとすることが可能であるため、微量な試料液を検査することも可能である。

次に、イメージング装置５０を利用して被検体を検出する方法について、プローブ分子、被検体及び溶液濃度等を例示しながら具体的に説明する。

先ず、イメージング装置５０において、フローセル３０内にガラス基板１１をセットした後、白色光源５１から白色光を出力させて、ガラス基板１１上の金ナノ粒子１４からの散乱光をＣＣＤカメラ５５で検出するようにしておく。次に、１ｍＭの(＋)-Biotinyl-3,6-dioxaoctanediamine（以下、単に「ビオチン」と称す）と０．１ＭのＷＳＣを含むプローブ分子導入溶液を送液管４１を通してフローセル３０内に送液する。これにより、図１０に示すように、ＭＵＡ膜１５上に、プローブ分子２１としてのビオチンが固定される。そのため、金ナノ粒子１４近傍の屈折率が変化し、共鳴散乱波長がシフトする。このように、共鳴散乱波長がシフトすることで、ＣＣＤカメラ５５で検出される散乱光の強度が変化することになる。

次に、被検体２０としての１．６ｎＭのStreptavidin（以下、単に「ストレプトアビジン」と称す）を含むPhosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）溶液を試料液として送液管４１を通してフローセル３０内に送液する。ストレプトアビジンは、ビオチンと強い相互作用を有するため、ビオチンに特異的に結合される。その結果、金ナノ粒子１４近傍の屈折率が変化し、プローブ分子２１が固定された場合と同様の理由により、散乱光の強度が更に変化することになる。従って、イメージング装置５０では、ＣＣＤカメラ５５で検出される散乱光の強度の変化によって、金ナノ粒子１４周囲の屈折率変化を検出することで、被検体２０を検出できることになる。

次に、センサチップ１０Ａ及びセンサチップ１０Ａの製造方法の効果について説明する。

センサチップ１０Ａでは、アミノシラン膜１２上に金ナノ粒子１４を固定した後に、金ナノ粒子１４が吸着していない空の吸着サイトをブロック剤１６としてのＰＥＧを吸着させることでブロックしているため、試料液をセンサチップ１０Ａ上に送液した際、被検体２０がアミノシラン膜１２上に固定されることが抑制されている。その結果、ＭＵＡ膜１５及びプローブ分子によって金ナノ粒子１４近傍に配置される被検体２０を効率良く検出することが可能である。

また、金ナノ粒子１４を固定した後、ＭＵＡ膜１５を形成する前に、ブロック剤導入溶液にガラス基板１１を浸漬させているため、センサ領域１３上の吸着サイトにおいて、金ナノ粒子１４が吸着していない部分にブロック剤１６が固定される。そのため、隣接する金ナノ粒子１４間にブロック剤１６が配置されることになる。これによって、ＭＵＡ膜１５を形成するために、ＭＵＡ膜１５を形成するための所定の溶液とガラス基板１１とを接触させても隣接する金ナノ粒子１４同士が会合することが抑制されている。

ブロック剤１６を設けることによって金ナノ粒子１４同士の会合が抑制される効果について、ブロック剤１６を設けないのセンサチップの場合と対比して具体的に説明する。

ブロック剤１６を設けていない場合には、ＭＵＡ膜１５を形成する際等に、溶液の流れ等により金ナノ粒子１４同士が会合するため、散乱光の散乱スペクトルに歪が生じる。このように歪が生じると、共鳴ピーク近傍での散乱光強度の変化又は散乱スペクトルを正確に取得できないため、結果として、被検体２０を検出するときの検出感度が低下することになる。

これに対して、ブロック剤１６を設けている本実施形態のセンサチップ１０Ａでは、ブロック剤１６によって金ナノ粒子１４同士の会合が抑制されているため、散乱光のスペクトルに歪は生じていない。そのため、共鳴ピーク近傍での散乱光強度の変化又は散乱スペクトルをより正確に取得することができるため、被検体２０を高感度で検出可能である。

隣接する金ナノ粒子１４間に確実にブロック剤１６を配置する観点から、センサ領域１３における金ナノ粒子１４の粒子密度は、前述したように、３０〜６０個／μｍ^２とすることが好適である。粒子密度が３０個より少ないと被検体２０を検出するために必要な散乱光を十分得られない一方、粒子密度が６０個より多いと金ナノ粒子１４を固定した段階で、金ナノ粒子１４同士の会合が生じやすくなるからである。そして、上記範囲の粒子密度によって被検体２０を検出するために十分な散乱光を生じせしめながら、金ナノ粒子１４の会合を抑制できる。その結果、被検体２０をより一層高感度で検出することが可能である。

ここで、ブロック剤１６として、ＰＥＧ、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸のように、カルボキシル基を有するものであることが好ましいことについて図１２〜図１５を利用して説明する。

図１２は、ブロック剤１６としてＰＥＧを利用する場合のガラス基板１１の吸収スペクトルを示す図である。図１３は、ブロック剤１６としてグリコール酸を利用する場合のガラス基板１１の吸収スペクトルを示す図である。図１４は、ブロック剤１６として酢酸ナトリウムを利用する場合のガラス基板１１の吸収スペクトルを示す図である。図１５は、ブロック剤１６として１６―ヒドロキシヘキサンデカン酸を利用する場合のガラス基板１１の吸収スペクトルを示す図である。図１２〜図１５では、金ナノ粒子１４を固定化した後の吸収スペクトル、ブロック剤１６導入後の吸収スペクトル、ＭＵＡ膜１５形成後の吸収スペクトルをそれぞれ示している。各吸収スペクトルは、図２に示すフローチャートにおいて、粒径増大工程Ｓ３、ブロック剤導入工程Ｓ４、ＭＵＡ膜形成工程Ｓ５後に吸光度計を利用して測定している。

図１２におけるブロック剤１６の固定化方法は前述した通りである。図１３〜図１５におけるブロック剤１６の固定化方法は、ブロック剤導入工程Ｓ４において、２０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧの代わりに、それぞれ３．８ｍｇ／ｍｌのグリコール酸、４．１ｍｇ／ｍｌの酢酸ナトリウム、２．７ｍｇ／ｍｌの１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を溶解している点で相違する以外は、ＰＥＧの場合と同様である。

図１２〜図１５に示すように、上記ブロック剤１６を使用することによって、各吸収スペクトルに歪みがみえず、金ナノ粒子１４の会合が抑制されていることがわかる。ＰＥＧ、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸等がカルボキシル基を有することによる。すなわち、アミノシラン膜１２は、金ナノ粒子１４の吸着サイトとしてアミノ基を有しているが、上記のようにカルボキシル基を有する化合物をブロック剤１６とすることによって、金ナノ粒子１４を固定化した後の空の吸着サイトを、アミド結合を形成させて塞ぐことができる。その結果、例えば、ＭＵＡ膜１５を形成する際などにおいても、隣接する金ナノ粒子１４の会合を確実に抑制することができる。よって、ブロック剤１６としては、カルボキシル基を有する化合物であればよく、ＰＥＧの他、例えば、上記のように、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を利用することが可能である。なお、センサチップ１０Ａを利用してタンパク質を検出する場合には、ブロック剤１６へのタンパク質の非特異吸着を抑制するＰＥＧ誘導体を利用することが好ましい。

また、金ナノ粒子１４の粒径は５０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。図１６は、金ナノ粒子１４周囲の媒質の屈折率を１．３５としてＭｉｅ散乱理論を利用して計算された金ナノ粒子１４の散乱スペクトルを示す図である。図１６において横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は散乱断面積を示している。金ナノ粒子１４の粒径は、３０ｎｍ、５０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１５０ｎｍ、１８０ｎｍ、２００ｎｍとして計算を行っている。図１６に示すように、金ナノ粒子１４の粒径が５０ｎｍ以上で共鳴ピークが生じていることが分かる。また、粒径が１５０ｎｍを超えると散乱スペクトルが歪だすことが分かる。

また、図１７は、散乱光強度の屈折率依存性を示す図である。図１７において横軸は屈折率を示し、縦軸は散乱断面積を示している。屈折率依存性は、図１６に示した散乱スペクトルを微分した際の長波長側のピーク位置を基準、より具体的には、散乱スペクトルの共鳴ピークに対して長波長側における散乱スペクトルの勾配の最大値を持つ波長位置を基準にして取得している。各粒径において、散乱断面積（散乱光強度）は屈折率に対してほぼ直線状になっており、この直線の傾きがセンサチップ１０Ａのセンサとしての感度に対応する。センサチップ１０Ａの感度は、金ナノ粒子１４の粒径が８０ｎｍ程度からほぼ一定となり、１００ｎｍより大きいものに対してはほとんど変化していない。

図１６及び図１７より、粒径が大きい方がより大きな散乱断面積が得られることになるが、粒径が１００ｎｍより大きくしてもセンサの感度の向上はあまり望めないことがわかる。よって、共鳴散乱現象を利用して被検体２０を検出する際には、金ナノ粒子１４の粒径は５０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。金ナノ粒子１４を、例えば、前述したようにクエン酸還元法等を利用して合成する場合には、一度の合成プロセスで３０ｎｍ程度の粒径が得られる一方、５０ｎｍ以上の粒径を得ることは困難である。そのため、図２を利用して説明したように、例えば、５０ｎｍ以上の粒径の金ナノ粒子１４を得るためには、金ナノ粒子１４をガラス基板１１に固定した後に粒径を増大させる必要がある。そして、粒径の増大は、粒子成長溶液に複数回浸漬させて実施することになる。上記粒径の範囲で示したように、センサ感度を考慮して、粒径を１００ｎｍ以下とすることで、ガラス基板１１を粒子成長溶液への浸漬回数を低減できるため、被検体２０の検出感度の高感度化を図りながら、効率的にセンサチップ１０Ａを製造可能である。

また、センサチップ１０Ａを利用した被検体２０の検出では、プラズモン共鳴による散乱光の強度変化（又は散乱スペクトルの共鳴ピーク位置の変化）を利用しているため、例えば、表面プラズモン共鳴を利用する場合に比べて高感度に被検体２０を検出可能である。更に、いわゆる蛍光法のように、被検体２０に蛍光プローブをラベル化しなくてもよいことから、試料液中の被検体２０の有無の検査を実施するための検査コストを低減することができる。また、蛍光法のように、被検体２０の検出するための前段階の準備工程として、蛍光プローブをラベル化する工程を有しないため、より簡易な準備で被検体２０を検出可能である。

図１８は、本発明に係るセンサチップの他の実施形態の平面図である。図１９は、図１８のＸＩＸ−ＸＩＸ線に沿った断面構成を示す模式図である。

図１８及び図１９に示すセンサチップ１０Ｂは、いわゆるマイクロアレイである。センサチップ１０Ｂの構成は、ガラス基板１１の表面に形成されたアミノシラン膜１２上にセンサ領域１３を複数（図１９では、６個）有する点で、図１に示したセンサチップ１０Ａの構成と主に相違する。なお、図１９では、各センサ領域１３上の構成を簡略化して記載しているが、各センサ領域１３上の構成は、図１に示したセンサチップ１０Ａのセンサ領域１３上の構成と同様である。すなわち、金ナノ粒子１４が所定の粒子密度で固定されており、金ナノ粒子１４が吸着していない吸着サイトは、ブロック剤１６でふさがれている。そして、金ナノ粒子１４の表面には、ＭＵＡ膜１５（図１９では不図示）が形成されている。なお、ガラス基板１１の表面１１ａ側からみた場合のガラス基板１１の大きさが例えば１８ｍｍ×１８ｍｍである場合であって、図１８に示すように、センサ領域１３が円形の場合には、センサ領域１３の直径ｄ３としては約５００μｍが例示される。

センサチップ１０Ａの製造方法は、図２に示した粒子固定工程Ｓ２において、ガラス基板１１を濃度１０ｎＭの金ナノ粒子溶液に浸漬させる代わりに、各センサ領域１３に上記金ナノ粒子溶液を、例えばピペットを使用して滴下することによって、各センサ領域１３に金ナノ粒子１４を固定する。また、粒径増大工程Ｓ３においても同様に、ブロック剤１６が固定された各センサ領域１３上に粒子成長溶液を、例えばピペットを使用して滴下することによって、各センサ領域１３上の金ナノ粒子１４の粒径を増大させる。更に、ブロック剤導入工程Ｓ４においても同様に、各センサ領域１３に上記ブロック剤導入溶液を、例えばピペットを使用して滴下することによって、各センサ領域１３内において金ナノ粒子１４が固定されていない部分にブロック剤１６を固定する。更に、ＭＵＡ膜形成工程Ｓ５においても同様に、各センサ領域１３上にＭＵＡエタノール溶液を滴下することで、各センサ領域１３における金ナノ粒子１４表面にＭＵＡ膜１５を形成する。なお、粒子固定工程Ｓ２、粒径増大工程Ｓ３、ブロック剤導入工程Ｓ４、ＭＵＡ膜形成工程Ｓ５におけるガラス基板１１の洗浄方法等は、図２に示したセンサチップ１０Ａの製造方法の場合と同様であるため説明を省略している。

センサチップ１０Ａを利用して被検体２０を検出する場合には、先ず、複数のセンサ領域１３上に、プローブ分子導入溶液をピペット等を利用して滴下させて各センサ領域１３のＭＵＡ膜１５上にプローブ分子２１を固定させる。この際、センサ領域１３毎に異なるプローブ分子導入溶液を滴下することによって、センサ領域１３毎に異なるプローブ分子２１を固定する。

次いで、プローブ分子２１が固定されたセンサチップ１０Ｂをフローセル３０にセットし、図８に示したイメージング装置５０で、センサチップ１０Ａの場合と同様にして、散乱光を検出すると共に、センサチップ１０Ｂの画像を取得する。そして、送液管４１及び排出管４２を利用してフローセル３０内に検査するべき試料液を送液する。試料液内に、各センサ領域１３に固定されたプローブ分子と特異的に結合する被検体２０がそれぞれ含有されていれば、被検体２０が対応するプローブ分子２１に結合する。その結果、被検体２０がプローブ分子２１に結合したセンサ領域１３での散乱強度が変化することになる。各センサ領域１３に固定されたプローブ分子２１及びそれに対応する被検体２０は既知であるため、試料液中に含まれている被検体２０が確実に検出される。この場合、センサチップ１０Ｂ上に複数のセンサ領域１３が設けられていることから、一度の測定で、複数の被検体２０を検出できることになる。その結果、効率的に試料液の検査を実施できる。

以上、本発明に係るセンサチップ及びセンサチップ製造方法の好適な実施形態について説明したが、本発明に係るセンサチップ及びセンサチップ製造方法は上記実施形態に限定されない。例えば、センサチップ１０ＡはＭＵＡ膜を有するとしたが、図２０に示すようにＭＵＡ膜を有しないセンサチップ１０Ｃとすることも可能である。なお、図２０では、センサ領域１３が１つの場合のみ示しているが、センサ領域１３を複数有する場合も同様である。図２０に示したセンサチップ１０Ａを利用して被検体２０を検出する場合には、センサチップ１０Ｃをフローセル３０にセットした後、プローブ分子導入溶液を送液する前に、ＭＵＡエタノール溶液をフローセル３０に送液して金ナノ粒子１４の表面上にＭＵＡ膜１５を形成した後、前述したように、センサチップ１０Ａの場合と同様にして、プローブ分子導入溶液及び試料液を順に送液すればよい。ただし、センサチップ１０Ｃが、センサ領域１３を複数有しており、センサ領域１３毎に異なる被検体２０を検出する場合には、フローセル３０を利用して各センサ領域１３にＭＵＡ膜１５を形成した後、一度フローセル３０からセンサチップ１０Ｃを取り出して各センサ領域１３に異なるプローブ分子導入溶液を滴下した後、再度フローセル３０にセットして試料液を送液して、被検体２０を検出すればよい。

更に、金属微粒子１４は金ナノ粒子１４としたが、光と共鳴現象を生じせしめるものであれば特に限定されず、例えば、銀からなる微粒子を利用することも可能である。また、第１の膜１２は、シラン化合物からなるアミノシラン膜１２としたが金属微粒子を吸着させることが可能であればよく、ブロック剤１６も、カルボキシル基を有する化合物としたが、隣接する金属微粒子１４同士の会合を抑制可能であって第１の膜１２に固定できるものであれば特に限定されない。例えば、第１の膜が末端にチオール基を有する化合物から形成されている場合には、ブロック剤１６として、チオール基を有する化合物、又はマレイミド基を有する化合物を利用することも可能である。更に、第２の膜１５はＭＵＡ膜１５としたが、金属微粒子１４表面に形成可能であり被検体２０をプローブ分子２１等を介して固定可能なものであれば、特に限定されず、例えば、メルカプトプロピオン酸を利用することも可能である。更にまた、基板１１はガラス基板１１としたが、金属微粒子の共鳴波長を含む波長帯域の光を透過できるものであれば特に限定されない。

また、センサチップ１０Ａ〜１０Ｃを利用した被検体２０の検出方法の説明では、散乱光を検出するようにしているが、例えば、センサチップ１０Ａ〜１０Ｃが有するガラス基板１１に光を入射させて透過光を検出することで被検体２０を検出することも可能である。また、センサチップ１０Ａ〜１０Ｃを利用して被検体２０を検出する場合には、例えば、散乱スペクトル測定装置によって散乱光の散乱スペクトルを取得することで共鳴散乱波長のシフトを実際に検出して、被検体２０を検出するようにしてもよい。

更に、センサチップ１０Ａ〜１０Ｃでは、金属微粒子１４の粒径は、５０ｎｍ〜１００ｎｍが好適であるとしたが、金属微粒子の粒径は、５０ｎｍ未満であっても良い。ただし、共鳴散乱を利用する場合には、より効率的に散乱光を生じせしめる観点から、上記粒径の範囲が好ましいことは、前述の通りである。

また、センサ領域１３上の金属微粒子１４の粒子密度（所定の粒子密度）は、３０〜６０個／μｍ^２であることが、前述した理由から好適であるがこれに限定されない。所定の粒子密度としては、第１の膜１２のセンサ領域１３内の吸着サイトを全て金属微粒子１４によってふさがれないような粒子密度であればよい。

更に、図２〜図４を利用して説明したセンサチップ１０Ａの製造方法において具体的に例示した溶液の組成及び処理時間等の数値は一例であり、それに本発明のセンサチップの製造方法が限定されるものではない。

以上の説明では、センサチップ１０Ａ〜１０Ｃでは、ＤＮＡやタンパク質等の被検体２０を検出するものとしたが、例えば、所定の溶媒を溶解した溶液の屈折率の測定などにも利用することが可能である。この場合には、第２の膜１５を備えなくてもよい。

本発明に係るセンサチップの一実施形態の構成を示す概略図である。 センサチップの製造方法のフローチャートである。 センサチップの製造方法の工程を示す概略図である。 センサチップの製造方法の工程を示す概略図である。 センサチップを利用した被検体を検出する方法の概念図である。 フローセルの構成を示す構成図である。 図６のＶＩＩ―ＶＩＩ線に沿った断面図である。 イメージング装置の構成を概略的に示す構成図である。 イメージング装置を利用した金属微粒子近傍の屈折率変化の測定の一例を示す図である。 センサチップにプローブ分子が固定した状態を示す模式図である。 図１０のプローブ分子に被検体が吸着した状態を示す模式図である。 ブロック剤としてＰＥＧを利用する場合の吸光度変化を示す図である。 ブロック剤としてグリコール酸を利用する場合の吸光度変化を示す図である。 ブロック剤として酢酸ナトリウムを利用する場合のの吸光度変化を示す図である。 ブロック剤として１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を利用する場合の吸光度変化を示す図である。 金属微粒子の散乱スペクトルの粒径依存性を示す図である。 散乱光強度の屈折率依存性を示す図である。 本発明に係るセンサチップの他の実施形態の平面図である。 図１８のＸＩＸ−ＸＩＸ線に沿った構成を示す概略図である。 本発明に係るセンサチップの更に他の実施形態の構成を示す概略図である。

符号の説明

１０Ａ，１０Ｂ、１０Ｃ…センサチップ、１１…ガラス基板、１１ａ…ガラス基板の表面、１２…アミノシラン膜（第１の膜）、１３…センサ領域、１４…金ナノ粒子（金属微粒子）、１５…ＭＵＡ膜（第２の膜）、１６…ブロック剤、２０…被検体、ｄ１…粒径（金属微粒子の粒径）。

Claims (12)

1. 金属微粒子と光との共鳴現象を利用して前記金属微粒子周囲の屈折率変化を検出するためのセンサチップであって、
   基板と、
   前記基板上に、前記基板に接するように形成されると共に、前記金属微粒子を固定するための第１の膜と、
   前記第１の膜のセンサ領域上に固定される複数の前記金属微粒子と、
   前記第１の膜上に固定されると共に、複数の前記金属微粒子のうち隣接する前記金属微粒子間に配置されるブロック剤と、
   を備え、
   前記ブロック剤は、前記第１の膜の前記センサ領域において、前記金属微粒子が吸着していない部分の少なくとも一部の前記第１の膜に固定されている、
   ことを特徴とするセンサチップ。
2. 前記第１の膜はシラン化合物から形成されており、
   前記ブロック剤はカルボキシル基を有する化合物であることを特徴とする請求項１記載のセンサチップ。
3. 前記ブロック剤は、グリコール酸、酢酸ナトリウム、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸及びポリエチレングリコールの何れか一つからなることを特徴とする請求項２に記載のセンサチップ。
4. 前記金属微粒子の表面上に形成されると共に、被検体を固定するための第２の膜を更に備えることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のセンサチップ。
5. 前記第２の膜は、メルカプトウンデカン酸からなることを特徴とする請求項４に記載のセンサチップ。
6. 前記第１の膜上に前記センサ領域を複数有し、
   前記各センサ領域上に前記金属微粒子及び前記ブロック剤が固定されていることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載のセンサチップ。
7. 前記金属微粒子の粒径は５０ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のセンサチップ。
8. 金属微粒子と光との共鳴現象を利用して前記金属微粒子周囲の屈折率変化を検出するためのセンサチップを製造する方法であって、
   基板上に、前記基板に接するように形成されており前記金属微粒子を固定するための第１の膜のセンサ領域と、前記金属微粒子を含む金属微粒子溶液とを接触させることによって前記センサ領域に前記金属微粒子を所定の粒子密度で固定する粒子固定工程と、
   前記金属微粒子が固定された前記センサ領域とブロック剤導入溶液とを接触させることで、前記センサ領域において、前記金属微粒子が吸着していない部分の少なくとも一部の前記第１の膜にブロック剤を固定するブロック剤固定工程と、
   を備えることを特徴とするセンサチップ製造方法。
9. 被検体を固定するための第２の膜を、前記金属微粒子が固定された前記センサ領域と第２の膜形成溶液とを接触させることによって、前記金属微粒子の表面上に形成する膜形成工程を更に備えることを特徴とする請求項８に記載のセンサチップ製造方法。
10. 前記基板に固定された前記金属微粒子の粒径が５０ｎｍ未満の場合、前記基板に固定された前記金属微粒子を粒子成長溶液と接触させることによって前記金属微粒子の粒径を、５０ｎｍ〜１００ｎｍに増大させる粒径増大工程を更に備えることを特徴とする請求項８又は９に記載のセンサチップ製造方法。
11. 前記第１の膜は前記センサ領域を複数有しており、
    前記粒子固定工程では、前記各センサ領域上に前記金属微粒子を前記所定の粒子密度で固定し、
    前記ブロック剤固定工程では、前記各センサ領域上に前記ブロック剤を固定することを特徴とする請求項８〜１０の何れか一項に記載のセンサチップ製造方法。
12. 前記所定の粒子密度は、３０〜６０個／μｍ^２であることを特徴とする請求項８〜１１の何れか一項に記載のセンサチップ製造方法。

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