JP5337480B2 - 水監視システム - Google Patents

Description

本発明は水の汚染物質を監視するための方法、および水の汚染物質を監視するための装置とその構成部品に関する。本発明は、居住用の建造物又は住居における給水を監視する特定の用途を有しているが、工業プラントに入る前又は入った後のいずれの工業用水の監視にも関連する。さらに、本発明は自然の川や小川、池、貯水池、さらに海水といった自然環境の水の監視にも関する。

水質の監視に関する関心は先進国全体で高まっており、世界中で重要な安全問題となってきている。このため、水源の毒性試験は大変重要な課題となっており、精度が上がった場合には、リアルタイムの連続した結果が大きな関心となる。マイクロトックス（ＭｉｃｒｏＴＯＸ）と呼ばれる現在の市場の先端技術は、およそ３０分で結果が得られ、フリーズドライ（凍結乾燥）源から活性化させたバクテリアを利用する、研究用のバッチ（回分）式システムである。

さらに、米国環境保護庁（US Environmental Protection Agency）は最近、飲料水の質を監視し評価するための早期の警告システムとして作動する技術や方法を評価するという報告を作成した。当該報告は上記目的に適したシステムの提供の必要性があると結論し、先進国世界において、ビルや住居だけでなく、給水の連続監視がテロリストの活動の抑止として作用したり、何かの理由で給水が汚染された場合に個人の生命を守ったりするというような、広範な状況において配置することができるリアルタイムの連続的な水監視システムを提供することが必要とされている、という我々の考えを支持している。

また、少なくとも、それ以上のさらなるテストに先行して、あるいはその代りに、最初の水質の指標を提供するために、研究所において使用するためのリアルタイムの連続した水監視システムを提供する必要がある。

連続水監視システムは連続して動作する検出器が必要である。さらに、検出器は汚染物質、特に健康そして生物にとって危険な汚染物質の範囲に反応する必要がある。給水の監視に水中脊椎動物を使用することが知られているが、これは、少なくとも、商業的に実現可能なスケールにおいて脊椎動物の数を維持するという観点において問題がある。

我々は、そのため発光バクテリアを使用するシステムを完成させた。多くの生物発光するバクテリアはブルー‐グリーンの光を発し、黄色の光を発するものもある。これらの種は無害である。ビブリオ・フィシェリ（Vibrio Fischeri）は生物発光する海中バクテリアであり、通常魚に寄生している。

このバクテリアは、グラム陰性の細胞壁を有し、鞭毛によって運動し、細胞は曲った棒の形をしている。ビブリオ（Vibrio）属のバクテリアはイカ、線虫、微生物との関連で、そして線虫を餌とする昆虫との関連で発見されている。共生関係により魚のポケットの中で集まっているものもいる。その魚は、発光バクテリアにより発光する。

発光が起こるのは、バクテリアの細胞の、アルデヒド、酵素、酸素、そしてリボフラビンの別の形態を含む電子伝達系のためである。分離されたビブリオは通性嫌気性菌であるが、Ｏ_２が存在する場合にのみ生物発光する。いくつかの要素がバクテリアの生物発光に必要であり、それは、ルシフェラーゼ酵素、長鎖脂肪族アルデヒド、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、そしてＯ_２である。一次電子供与体（primary electron donor）はＮＡＤＨであり、電子はＦＭＮを経由してルシフェラーゼに移動する。その反応は以下のように表わされる。

ＦＭＮＨ_２＋Ｏ_２＋ＲＣＨＯ → ＦＭＮ＋ＲＣＯＯＨ＋Ｈ_２Ｏ＋ｌｉｇｈｔ
（Luciferase）
発光系は、キノンやシトクロムのような他の電子伝達体を含まない、ＦＭＮＨ_２からＯ_２へ電子が短絡するバイパス経路を構成している。

ルシフェラーゼ酵素は自己誘導機構（autoinduction）と呼ばれる特徴的な合成の制御（regulatory synthesis）を示す。生物発光バクテリアは、培地での成長の間に蓄積するオートインデューサー（autoinducer）という特別な物質を産生し、この物質の量が臨界値に達した時、酵素の導入が起こる。V. Fischeri中のオートインデューサーはＮ-β-ケトカプロイルホモセリンラクトン（N-β-ketocaproylhomoserine lactone）であると特定された。そのため、低い細胞密度での生物発光バクテリアの培地は生物発光しないが、オートインデューサーが蓄積して機能できるような高密度に達すると、生物発光するようになる。自己誘導現象により、海水中の自由生活性の生物発光バクテリアは、オートインデューサーが蓄積できないであろうから、生物発光しないであろうことが明らかであり、生物発光は高密度に発達するのに好ましい状況である場合にのみ発生する。なぜ生物発光が自由生活性のバクテリアの密度依存性であるのかは明らかでないが、共生系統の生物発光バクテリアにおいて、密度依存性の生物発光であることの根拠は明らかである。すなわち、生物発光は、魚の発光器官において光が見える程に十分高密度であるときにのみ生じる。

生物発光についての多くの新しい情報は、この過程の発生についての研究から現れてきている。いくつかのluxオペロンは生物発光のビブリオ種中で確認され、鍵構造遺伝子がクローン化され、配列化された。luxＡとluxＢの遺伝子は、バクテリアルシフェラーゼのａおよびｂのそれぞれのサブユニットの遺伝暗号を指定する。luxＣとluxＤとluxＥの遺伝子は、生物発光反応において、および生物発光系の必要な脂肪酸の生成と活性化において機能する、ポリペプチドの遺伝暗号を指定する。

そのため、我々は、広範囲の毒性汚染物質に反応する検出システムを提供するために、生物発光バクテリアの特徴を有効に開発して最適化した。これらの汚染物質の検出のための試験基準は、典型的に少なくともある一定時間経過後に計測された発光の減少量である。さらに、ビブリオ・フィシェリなどの研究所での毒性バッチ（回分）分析に通常用いられるバクテリアの種類が好ましい。

上に示したように、我々の課題は、連続監視システムを提供するために、このバクテリアの数を連続的、回生的に維持することであった。そのため、我々の発明は、ｉ）生存しているバクテリアおよび再生状態のバクテリアの数を維持する発酵槽と、ｉｉ）オンライン監視システムの製造を含む。オンラインという表現は、監視する水の供給を連続的に採取するシステムを意味している。建造物において、水道水供給のサンプルを我々のオンライン監視システムに迂回することも含む。

その技術分野において、供給される水の汚染物質を検出する、連続的なオンライン監視システムを作成するいくつもの研究が行われてきたが、我々が初めてこの目的を達成する。

正常に機能するシステムにするために、いくつもの変数の釣り合いをとる必要があったため、我々の研究は困難であった。さらに、バクテリアの数を支え、必要とされる性質の仕様での新鮮なバクテリアの、オンライン監視システムに対する供給を連続的に行う仕様を作成するために、そのシステムの詳細な調整について実験をする必要があった。

我々の試みの結果として、供給される水に含まれる汚染物質の存在を、リアルタイムで測定するための、連続的なオンラインの水監視システムを作成することに成功した。

本発明の第１の態様によれば、
ａ）水道又は自然給水源からのサンプルの水（以下、「サンプル水」とする）をテストチャンバー（a test chamber）に供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽（a bioreagent fermenter）と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
前記光検出手段は前記サンプル水と接触する前後の前記生物試薬の発光特性を測定し、前記サンプル水との接触後に前記発光特性に変化があった場合には、（水監視システムは）前記サンプル水が汚染物質を含んでいたと記録することを特徴とする連続水監視システムを提供する。

本発明の第２の態様によれば、
ａ）水道又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するための、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
ｆ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に、前記サンプル水の調整を行うためのサンプル水調整手段を備えることを特徴とする連続水監視システムが提供される。

本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態においては、光検出手段が前記テストチャンバーのみと関連付けられ、生物試薬のサンプルは前記テストチャンバーに収容され、発光の測定はサンプル水と混合される前に行われる。さらに又は代わりに、上記光検出手段若しくは別の光検出手段は、前記生物試薬発酵槽、又は生物試薬発酵槽から延びる管に関連しており、サンプル水が加えられた後に行われる前記生物試薬の発光特性の測定に加えて、生物試薬がテストチャンバーに入る前に前記生物試薬の発光特性を測定することができる。したがって、前記光検出手段は、前記テストチャンバーと前記生物試薬を前記生物試薬発酵槽から前記テストチャンバーに送給するための手段のいずれか又は両方に付随する単一の手段か、あるいは、少なくとも一つの光検出手段が前記テストチャンバーに付随し、少なくとも別の光検出手段が生物試薬を前記生物試薬発酵槽から前記テストチャンバーに移送するための手段に付随することで構成される複数の光検出手段で構成される。

本発明の第２の態様では、サンプル水調整手段は、生物試薬が生体適合するようにサンプル水の特性を変化させるものである。最も好ましくは、生物試薬が生体適合するため、そして、一般的に、サンプル水の塩分を変化させるために、サンプル水調整手段はサンプル水のイオン強度を変化させる。さらに、有利には、サンプル水調整手段は少なくとも一つの選択されたイオンのイオン濃度も変化させ、そして、最も好ましくは、供給される水の供給源での塩素処理、クロラミンによる消毒処理、オゾン処理により発生する、抗菌性物質を除去する。

本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、生物試薬は発光バクテリアの群であり、特に、生物発光バクテリアである。このバクテリアは、本発明のシステムにおいて作用するために必要な性質と、特に、必要な発光特性と汚染物質に対する感度の両方又はいずれかを有するような、自然に存在している、又は、遺伝子組換えにより又は遺伝子的に作り出され得るものである。さらにより好ましくは、本発明の水監視システムでの使用に適した生物試薬は、発光バクテリア種、ビブリオ（Vibrio）種、ゼノラブダス（Xenorhabdus）種、又は実際には発光するように操作された任意のバクテリアのうち、いずれか一つ又はそれ以上を含むものである。

最も典型的には、バクテリアは発光特性の減少を示す方法により汚染物質に対して反応するように選別される。これは、最も典型的には、バクテリアの集団が減少又は死滅するためである。しかし、本発明の別の実施形態では、特定の汚染物質の存在に対する反応として、強い発光をするバクテリアを使用することもできる。この例においては、バクテリアの集団は、生物栄養（bionutrients）を検出しているのかもしれない。

上記構成が、汚染物質のテストのために、サンプル水と生物試薬のサンプルとを混合可能なテストチャンバーを提供することは、当業者にとって明白であろう。テストが行われた後に、混合された溶液はテストチャンバーから排出管を経由して除去され、システムから完全に排出される。同時に、又はその直後に、又はあらかじめ決められた時間後に、更なる生物試薬と更なるサンプル水がテストチャンバーに供給され、汚染物質の検出が繰り返し行われる。このように、サンプル水を連続して監視することが可能である。

本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、分割手段は、分割される方式で水源が採取されるように提供され、これにより分割した水は、採取するために分離されることを意味している。最も典型的なものとしては、あらかじめ決められた間隔で気泡を挿入することによりこの分割を行った。

本発明のいずれかの態様の好ましい実施形態において、ポンプ手段は前記サンプル水と生物試薬のサンプルのいずれか又は両方をシステム中に流すために設置される。

本発明のいずれかの態様のさらに好ましい実施形態においては、前記発酵槽は連続培養システムである。我々の連続培養システムは一定の体積を有する、すなわち新しい培地の連続した流入分と、使用済みの培地とが、理想的には一定の割合で連続して除去される。いったん連続培養システムが定常状態（平衡）に達すると、細胞の数と栄養の状態が一定となる。連続培養システムの他の種類があり、我々のある場合には、（バクテリアの）集まりの密度と培地の成長率の両方をコントロールするケモスタット（a chemostat/恒成分培養槽）として、発酵槽が動作するよう決定したものであった。

成長は集団における微生物細胞（生体量）の数の増加量で定義される。微生物細胞は自身を複製することのできる合成装置である。一つの独立した細胞は、新しい二つの細胞（対の分体）に細胞分裂するまで成長し続ける。この周期の間、細胞の全ての構造的な構成要素が二倍になる。バクテリアにおいて完全な成長周期のために必要な時間は、極めて変動しやすく、栄養面および細胞面の両方の多数の要因に依存する。成長率は、単位時間当たりの細胞数又は細胞の重量の変化を測定したパラメータである。どのような生物（有機体）の発生時間も使用される成長培地や実施される培養状況における程度に依存するということに留意する必要がある。

最も有利であるのは、発酵槽は、発酵槽の栄養供給源の方向に生物膜（biofilms）が成長することを妨げるための、成長防止装置を有する。典型としては、成長防止装置はバクテリアが発酵槽から栄養供給管内に進行していくことを阻止する障壁を備え、簡単には栄養供給管の終端がバクテリアの培地から隔離している間隙を備える。発酵槽は、バクテリアの集団が接する新鮮な空気の供給を維持するために、空気の流入部と排出部も備えている。培地のオーバーフロー管も、発酵槽の内部の培地を一定の量に保つために設置される。

好ましくは、発酵槽に対して又は発酵槽から延びる管は、微生物の成長を妨げ、殺菌効果を有する銀のような材料、又は添加物として含む材料、で形成される。この供給管又はオーバーフロー管の特徴は、管の内部での生物膜の成長を排除する、又は確実な減少をもたらす。

本発明の好ましい実施形態においては、発酵槽をケモスタットとして作動させている。しかしながら、例えばルミノスタット(luminostat)やタービドスタッ卜（turbidostat）として作動することもできる。

ケモスタットのコントロールには二つの重要な要因がある。それは、希釈率と制限栄養素（a limiting nutrient）の濃度である。ケモスタット型の発酵槽の一つの主な利点の一つは、成長率と細胞密度とを互いに独立して制御できることである。成長率は、希釈率を調整することにより制御され、細胞密度は、制限された量の中での栄養の濃度を変化させることにより制御される。

希釈率は広範囲に成長率を調整する、つまり、ケモスタットにおいて単に希釈率を変化させることにより、どのような所望の成長率であっても得ることができる。しかし、非常に低いそして非常に高い希釈率において、システムの平衡が取れなくなってしまう。高希釈率においては、その希釈を維持するのに十分な速度で成長することができず、培地が発酵槽から洗い出されてしまう。一方、非常に低い希釈率においては、細胞の代謝を維持しうるのに十分な速さで、制限栄養物質が添加されないため、大量の細胞が餓死してしまう。同様に、集団の密度は、蓄えられた培地の単一の栄養素の濃度を変化させることにより、設定することができる。

発酵槽内の細胞密度（cell/ml）は、制限栄養物質のレベルにより制御することができる。もし、希釈率が一定で、流入する培地におけるこの栄養物質の濃度が上昇すれば、細胞密度は上昇するであろう。

発酵槽で生産されるバクテリアの量はその種の成長率と培地の容量に依存する。

他の研究者は、Ｖ．フィシェリ（V. Fisheri）は３％の塩分濃度における２３℃において最も成長することを報告している。

上述のように、本発明のいずれの態様においても、水監視システムは、生物試薬がサンプル水と混合された後の生物試薬の発光を監視する、オンライン監視用の構成部材を含むものである。理想的には、そのオンライン監視システムは、各光子計測装置またはそのグループが、サンプル水と生物試薬とが混合される時点より後のあらかじめ決められた時間に発光の測定を行うように、時間が遅延する方法で制御される複数の光子計測装置を使用して、発光を検出するように適合される。加えて、別の光子計測装置が、バクテリアとサンプル水とを混合する前にバクテリアの発光特性を測定するために使用されることが好ましい。最初の混合前の測定値といずれか別の測定値とを比較することで、生物発光の減少または増加の提示が、もしあったならば、得ることができる。典型的には、汚染物質が存在する場合に減少が観測され、減少は殺菌率と呼ばれる。

本発明のさらにより好ましい実施形態において、前述のポンプ手段は、システム中におけるサンプルの比較的円滑な流れを提供するために、比較的高いパルスレートで作動するぜん動運動式の多チャンネルポンプで構成される。

本発明の第１の態様のさらにより好ましい実施形態において、水監視システムはサンプル水の調整手段を有する。調整手段は、水監視システムにおいて使用される生物試薬との生体適合性を確保するために、テストするサンプル水を変化させる。すなわち、サンプル水の調整手段は、サンプル水のイオンの濃度を変化させ、典型的にはサンプル水の塩分を増加させるとともに、好ましくはサンプル水に対する生物試薬の感度を妨げる又は変化させてしまうような粒子を除去する。例えば、サンプル水の調整手段は、ほとんどのバクテリアの発光特性に悪影響を与える、塩化物イオン又は塩素処理あるいはクロラミン処理による物質を除去することができる。

本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、水監視システムは、光検出機能を妨げるであろう空気の塊（pockets of air）を除去するための、理想的には位置を選択可能な、少なくとも一つのバブルトラップを備えている。

本発明のいずれかの態様のさらに好ましい実施形態においては、前記発酵槽と前記テストチャンバーの両方又はいずれかは、生物試薬を養う培地において空気又は酸素を均一に攪拌するアジテーター又は攪拌機を備えている。

さらに、より好ましくは、本発明のいずれかの態様の水監視システムは、発酵槽内の細胞密度を測定するために、バクテリアの培地の濁度を観測する濁度計を備える。濁度計は、発酵槽又は発酵槽の下流側に付随して設置することができる。

本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、テストに用いるサンプル水をろ過するための、前置ろ過装置が設置される。

本発明のいずれかの態様のさらにより好ましい実施形態においては、テストするサンプル水を濃縮するための、前置（事前）サンプル水濃縮手段と後置（事後）サンプル水濃縮手段の両方又はいずれかを備える。すなわち、前置サンプル水濃縮手段はテストをする前にサンプル水を濃縮し、水に含まれ得るいずれの汚染物質をも濃縮する。後置サンプル水濃縮手段は、さらにテスト又は分析を行うことができるように、テストを行った後のサンプル水を濃縮するもので、実際には、さらに測定を行う目的で本発明のテストチャンバーに戻すことが可能である。当業者は理解するであろうが、この後置サンプル水濃縮手段は、最も典型的には、適合するバルブ手段を使用する後置サンプル水濃縮手段を通過するサンプル水の選択的流れにより、選択的に稼働することが可能である。

本発明の第３の態様によれば、
給水中の汚染物質を検出するための給水を連続的に監視する方法であって、
ａ）水道または自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーへ供給するステップと、
ｂ）発光生物試薬を前記テストチャンバーへ供給するステップと、
ｃ）前記サンプル水に接触させる前と後において前記生物試薬の発光を検出するステップと、
ｄ）前記生物試薬が前記サンプル水に接触した結果、発光に変化があった場合に、前記サンプル水に汚染物質が存在していることを決定するステップと、
ｅ）上記ステップを繰り返すために、前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから除去するステップとを有することを特徴とする給水を連続的に監視する方法を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、
給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
ａ）水道水又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
ｂ）テストチャンバーと、
ｃ）前記サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に前記サンプル水のイオン強度を変化させるサンプル水調整手段と、
ｄ）発酵槽で培養された発光生物試薬であるビブリオ・フィシェリ（Vibrio Fischeri）を前記テストチャンバーに供給するために前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
ｅ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
ｆ）前記テストチャンバーから前記サンプル水と前記生物試薬を除去するための排出管とを備えることを特徴とする連続水監視システムを提供する。

本発明のさらなる態様によれば、以下の図面を参照しつつ、実質的に本明細書に記載されているような、連続水監視システム又はその構成部材を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、以下の図面を参照しつつ、実質的に本明細書に記載されているような、給水を連続的に監視する方法を提供する。

本発明の実施形態を、単に例示を目的として、以下の図面を参照して説明する。

図１は、本発明の水監視システムの第１の構成部材の概略図であり、本質的には、生物試薬発酵槽を示している。

図２は、水監視システムの第２の構成部材の概略図であり、本質的には、オンライン監視サブシステムを示している。

図３は濁度計の組立図である。

図１における概略図は、生物試薬を培養するために使用されるバクテリア生産システムを示している。三口の２５０ｍｌのガラスの球形のボトルを発酵槽容器として使用した。中央の口は、培地のために栄養液を供給する供給管と連結するために使用した。使用した種は生物膜（biofilms）を形成する可能性があり、栄養源の方向に向かって成長する傾向があるため、発酵槽を培地容器から離隔するために成長防止装置が設置される。成長防止装置は、培地の中央に栄養を滴らせる第１６番の針（a No.16 needle）が使用されることにより構成されており、発酵槽から供給管に通り抜けてくるバクテリアの進行を阻止する空気の障壁を形成する。

空気の流入と培地のオーバーフロー管は穴のあいたゴム栓を用いて発酵槽容器の側方の口の一つに連結した。ゴム栓を貫通するために、ステンレス鋼のチューブを使用した。発酵槽に接続される全ての管は生物膜が成長してしまうのを防ぐために、殺菌効果を有する材料で形成される、あるいは、殺菌効果を有する材料を含有する。空気の流入は外径が２ｍｍの管を用いて連結され、オーバーフロー管は外径が５ｍｍの管を用いて連結される。生物発光に対しては酸素濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以上必要とされるため、培地の中央に浸漬される散布管を通って連続的に空気が供給される。培地に酸素を拡散させるために、培地は連続的に攪拌される。バクテリアの発光は、酸素の濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以下においては変化に対して非常に敏感であることに留意する必要がある。最低限必要とする酸素の供給量は良質の生物試薬を保証するために重要な事項である。

オーバーフロー管は、発酵槽内部の培地の体積を一定に保つために用いられ、空気の排出も同様である。液位は必要な高さに排出口を配置することにより、制御する。

容器内部の液位が上昇するときは、栄養の流入量が増加したため、又は、生物試薬の需要が減少したためであり、培地がオーバーフローに到達すると、超過した体積は空気の流入による加圧により排出される。

生物試薬供給管は、他方の側方の口に連結した。この管はオンライン監視システムに新しく培養されたバクテリアを供給する。

図２には、光検出オンライン監視サブシステムの概略図を示す。

このオンライン監視システム（ＯＬＭＳ）は、生物試薬がサンプル水と混合される前と後で、生物試薬の発光を監視するために反応するシステムである。混合後の発光は、必須ではないが、理想的には、サンプルと生物試薬とが混合された時点より後の、３秒、１５秒、３０秒の位置において配置され、又は作動する、３つの光子計測装置により測定される。いくつかの実施形態においては、単一の光子計測装置が利用される。さらに、発光はいずれか一つ又はそれ以上の選択された、理想的には３０秒以内の時間間隔で、測定される。発光の変化は、生物試薬をサンプルと混合する前の生物試薬の最初の発光を考慮にいれた、算出変数（a calculated variable）を用いる方法により監視される。この変数は抑制率と呼ばれる。本発明の別の実施形態においては、光子計算機のＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３そしてＰＭＴ４は光ファイバーセンサーに置き換えることが可能である。これらのセンサーは信号を一つの主光子計算機に送信する。信号は一定の順序に配列され、次に続く信号の分析と解釈を可能とするためにタグ付け（tagged）される。この後者の構成は、典型的には、気泡の計画した定量的な導入により、連続的に供給されるサンプルから分割されたものとして、効果的にサンプルを離隔する分割システムと呼ばれるものと共に使用されるのが最も好ましい。本システムにおけるこの分割によって、いずれかの別々の光子計算機、又は一つの計算機を供給する光ファイバーセンサーを用いてパルスの読み込みと信号の解釈が可能となる。さらに、この分離した方法において本システムを使用することで、監視中における洗浄部分としての使用や、試験部分との比較のための対照部分としての使用が可能となる。分離は、さらに、抗菌性物質の利用を排出するだけでなく、システムを破壊しバクテリア群を殺す重金属をキレートするために、重金属キレート化剤のような抗毒素汚染物質の使用により、汚染物質の性質の正確な測定を可能にする点で有利である。

複数の光検出器を使用することにより、生物発光に影響を与える汚染物質の性質の分析を行うことができることは当業者にとって明らかであり、例えば、シアン化物等の汚染物質は、バクテリア群が殺された場合に抑制率が水平状態になるまで急激な上昇を素早く示すように作用するというような抑制スペクトルの特徴から、毒素の性質および濃度を推定することができる。それに比べて、重金属は、高濃度であっても、非常にゆっくり作用し、そのため抑制率が水平状態に到達するまでに非常に長く浅い曲線を示す。

本発明のシステムを使用することで、一旦汚染物質を検出した場合にシステム内の流れを停止させることについても利点を有する。このように、流れを停止した後、いずれも毒素の性質の重要な指標としての、実際の毒素作用の断定や抑制レベルの経時変化の測定を行うために、長時間（数分程度）いずれかの混合後の光検出器を使用して、抑制の経時変化を測定することができる。

以上のように、本システムは毒素特異的な抗毒試薬の添加のために使用することもできる。

サンプル水と生物試薬は、８個の回転ヘッドを有する蠕動型多チャンネルポンプで送りこまれる。多チャンネルポンプの使用は、同じポンプで複数の流れを供給することができるためシステムのコストを低減することができるという利点を有する。しかし、一方で、生物試薬とサンプル水の混合率が多岐管（the manifold tubes）の径を変更することでしか調節できないという制限を課すこととなる。そうすると、混合率は製造業者から供給される多岐管のサイズに制限されてしまう。別の実施形態としては、数種類のポンプを使用することができる。この後者の実施形態によれば、混合率を変更することが可能となる。

分析器は新しい水を監視するように構成されるが、海洋環境に基づく生物試薬生物の結果として、好ましい感度および作用が発揮されるためには、サンプル水の塩分が培地の塩分と同等である必要がある。もし、バクテリアが繁殖する培地のイオン状態が急激に変化（減少または増加）した場合、大部分のバクテリア群を殺す浸透圧衝撃が起こると思われる。（サンプル水と生物試薬の混合後の）混合物の浸透圧の減少を避けるために、サンプル水は濃縮した塩化ナトリウム溶液と混合することにより前もって調整する必要がある。サンプル水の調整溶液の調製を下記に述べる。

前述のように、急性毒性の基本的な測定は抑制率である。これは、サンプル水との混合後に、生物試薬のどのくらいの発光が変化したかのパーセンテージでの算定である。そのため混合の直前での生物試薬の発光は、対照例として使用する。抑制率の計算に用いる式は、

である。

ＰＭＴ_１は混合地点の前に設置されている光子計測装置により報告される光子の計測結果であり、ＰＭＴ_Ｘは混合地点より３秒、１５秒そして３０秒後に設置されている３つの光子計算機のそれぞれにおける光子数である。

ＯＬＭＳのために使用しているぜん動ポンプはＷａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ製の多チャンネルぜん動ポンプ（ポンプモデル：５０５Ｕ，ヘッドモデル：３０８ＭＣ）である。ぜん動ポンプは正確な流量であり、殺菌した溶液を扱う必要がある場合には最適な選択である。全体のシステムは、システムの殺菌の効果を無くすことなく、組み立て、オートクレーブそしてポンプに後付けで設置することができる。他方、ぜん動ポンプは流れのパターンが連続ではなくパルスであるという不利益を有する。このパルスの流れの影響は、ポンプ速度が低い場合においては拡大する。ＯＬＭＳは発光の測定のために光子計測装置を使用しているため、流量が変化した場合には光子の数が変化する。光子の数のパルスの流れに起因する変動を最小にするために、ポンプを最大速度（５５ＲＰＭ）で駆動させるのが好ましい。

ＯＬＭＳは３つの流れを扱う必要があり、３つの流れは、サンプル水、生物試薬、そしてサンプル水調整溶液である。生物試薬とサンプル水との希釈率は、適切な希釈率が明らかとなるまで製造業者が提供できる管のサイズを変更して決定する。生物試薬は内径０．２５ｍｍの多岐管（manifold tubing）（カラーコード：青‐オレンジ）を使用して供給されている。サンプル水は、内径０．８８ｍｍの管（カラーコード：オレンジ‐オレンジ）により供給される。

これらの管は、生物試薬については名目流量０．２３ｍｌ／ｍｉｎで、サンプル水については流量２．６ｍｌ／ｍｉｎである。サンプル水との混合後の生物試薬の濃度は５０％から５％で、好ましくは７．５２％である。

多くの気泡がサンプル水の管および生物試薬の管において観察される。気泡は光子が放出されない空の部分であるから、光子の数において負のピークの要因となる。気泡の大きさにより、監視システムにおいて空の空間は誤検出を発生させてしまう。

気泡の存在は、ポンプから供給された後に試薬とサンプル水の管に気液分離器を導入することにより解決される（図２参照）。気液分離器の気泡の除去における有効性は１００％である。気液分離器の使用の利点は、分離室の内部の空隙が、ポンプの回転によるパルス効果を減少するパルス緩衝部材として機能するというものである。他方、気液分離器の導入は分離器容器の内部に死容積を形成するという欠点を有し、管を通過する過剰な空気を放出することにより液体レベルをコントロールするためのコントロールシステムが必要となる。容器の内部の液体の体積は滞留時間を決める。これは、粒子を分離システムに通過させる時間である。結果として、滞留時間は生物試薬の酸化を減少すること及び検出時間が増加することによってシステムを低下させる。この副作用を減少するために、滞留時間は最小に抑える必要がある。

微生物の成長の監視は、どのような連続培養システムにおいても鍵となるパラメータである。細胞の数の推定値を得るために最適な方法は、濁度測定器を使用することである。バクテリアの培地は、培地内の細胞が溶液を透過する光を散乱するため、より濁って見える。細胞の数が増えると、散乱は増加し、そのために溶液はより濁る。細胞の懸濁液に光を透過し、現れた散乱していない光の量を測定することにより、濁度を測定することができる。発酵槽内部の細胞密度を監視するために、濁度計は生物試薬を供給するラインの気泡トラップの後に設置される（図２参照）。光源は高強度（2000mcd）の緑色の発光素子（ＬＥＤ）を用いて形成される。光源の強度は分圧器に接続された１０キロオームのポテンシオメータを用いて、調整することができる。ＬＥＤは電力供給と制御のためにデジタル出力に接続される。散乱していない光を測定するために、増幅器を内蔵したフォトダイオードが使用される（ＯＰＴ３０１）。増幅器の増幅率は、二つの１０メガオームの抵抗を使用することによって２０×１０^６に設定した。フォトダイオードは二つの電源（＋／−12Vdc）を必要とし、出力を０〜１０Vdcの範囲に復帰させる。濁度計からの、ＬＥＤに適用した電圧とフォトダイオードが受信した電圧の、二つの信号が監視される。

生物試薬として用いられるバクテリアは、シリコンチューブの内壁上に成長する傾向があり、生物膜（biofilms）を形成する。連続して４８時間動作した後、生物膜はオンライン監視システム（ＯＬＭＳ）のチューブ内で発見された。これらの生物膜は、光の伝播を妨げることにより、光子計算機によって報知される測定結果の質を低下させる。さらに、チューブの内径を減少させる。チューブの内径の減少はシステムを横断する流量と圧力についての問題を引き起こす。時間が経過することにより、バクテリアは成長を維持して、生物膜は厚くなり、流速が上昇する。流速の上昇は抵抗を上昇させ、生物膜の存在によって内側部分が減少した場合、下流側を塞ぐ生物膜の塊が放出される。オンライン監視システムの整合性（インテグリティ）を損なうように、生物膜が厚く成長することを避けるために、システムは、理想的には、２４時間毎又は４８時間毎に酸性溶液で常に洗い流すようにする必要がある。

毒物を監視する生物試薬は、海中バクテリアに基づいている。これらの微生物は、生理機能を発揮するために３％の塩分濃度を必要とする。典型的に、毒性の監視は淡水のサンプルを目的とするものであるから、サンプル水の塩分を生体適合のために上昇させる必要がある。そのため、サンプルの浸透圧条件を培地の状態と同等にするために、サンプルの水を塩化ナトリウム水溶液と混合する。サンプル水調整用溶液（ＳＣＳ）の適切な濃度は、生物試薬の塩化ナトリウム濃度（２５ｇ／Ｌ）によって決定される。たとえば、我々のケースでは、サンプル水は名目流量が2.6 ml/minで供給され、生物試薬は0.23 ml/minで供給した。ＳＣＳの濃度を計算するために、以下の式を用いた。

Ｖ_１はＳＣＳの流量であり、Ｃ_１はＳＣＳの濃度（ｇ／Ｌ）であり、Ｖ_２はサンプル水とＳＣＳの流量であり、Ｃ_２は生物試薬のＮａＣｌの濃度である。上記名目流量の場合には、ＳＣＳの濃度は、
３０７．６１ｇ／Ｌである。

飲料水は抗菌物質の添加による処理が行われる。飲料水のための処理のために、塩素処理、クロラミン処理、オゾン処理の３つの抗菌工程がある。列挙した選択肢のうち、塩素処理が最もよく行われる。塩素は、水源からもたらされるバクテリアを殺菌するために用いられ、移送する過程の間バクテリアから水を保護するために、残存量が０．５〜１．０ｍｇ／Ｌに維持される。

そのような抗菌性のため、塩素が微生物を殺すことによってバイオセンサーを妨げる。もし、塩素量が一定であった場合には、塩素の妨げは問題にならないと思われるが、水道水に含まれる塩素量は常時塩化するため、この変化が毒性物質として観測されたり、偽陽性の結果を生じたりするおそれがある。この好ましくない動作を避けるために、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３）を加えることによりサンプル水から塩素を除去することができる。

サンプル水から塩素を取り除くために必要なチオ硫酸ナトリウムの量は、遊離塩素の量に依存する。化学量論計算を行うことができるが、計算は非常に複雑であり、信頼性のある結果を得るためには、すべての外的要因を考慮する必要がある。サンプル水の調整のために使用される投与量は、マイクロトックスの使用者マニュアルから得られ、サンプル水処理のための推奨濃度は１００ｍｇ／Ｌである。ＳＣＳに添加する必要のあるチオ硫酸ナトリウムの量の決定のため、式１を使用する必要がある。塩化ナトリウムの例に用いた流量と同じ流量の場合、ＳＣＳに含まれるチオ硫酸ナトリウムの濃度は、１．２３ｇ／Ｌである。

明示していないが、本技術分野における当業者であれば、浮遊している固形物や、最も典型的には、生物発光に影響する物質を取り除く目的で、試験を行うサンプル水をろ過するためのフィルターが、システム内において使用されることは明らかである。さらに、すべての汚染物質を検知する機会（採取前）を増やすために、採取される水を濃縮する場合には、採取前と採取後の両方又はいずれかにおいて濃縮手段を配置することができる。さらに、又はもう一つの方法として、もし測定値が満足できない場合に、すでにある生物試薬を使用してもう一度測定を試みる場合、又は、新たな生物試薬を加えて測定を行う場合のいずれかの前に、サンプルの水を濃縮できるように、サンプル後の濃縮手段を配置することができる。

シアン化物、硫酸タリウムそして塩素の３つの基準物質についての、環境保護庁の基準値に相当する市場標準に対して、我々の水監視システムのテストを行い、それぞれの場合において、我々のシステムは環境保護庁の基準値と１００％適合し、あるいはそれ以上であることがわかった。表１を参照のこと。

さらに、０．２５ｍｇ／Ｌのシアン化物又は２４０ｍｌ／Ｌの硫酸タリウムを通常の塩素処理水（塩素濃度は０．２から１ｍｇ／Ｌで、長時間経過）にあらかじめ導入したテストサンプルのＰｏＣ装置への導入後、３０秒以内での「毒性警報」の表示を行うことによる、「３０秒の検出時間」の実現可能性の実証を行った。結果は表２に示し、適合性は１００％であった。

最初のサブシステム中の流れ内での連続発光培地の自動的な植え付け及び定着、最初のサブシステム中の流れ内での十分な発光のための係属中の目標の検知、連続的な毒性測定ができるように、そのような方法で第２のサブシステム中の流れの中で次に続く連続発光培地の植え付け及び定着を行うことによる、「８週間の消耗周期」の実現可能性の実証を行った。結果は表３に示した。適合性は１００％であった。

そのため、我々の水監視システムは、リアルタイムで水の連続したサンプリングのための新しく発明的なシステムを提供すると考える。

本発明の水監視システムの第１の構成部材の概略図 水監視システムの第２の構成部材の概略図 濁度計の組立図

Claims (27)

1. ａ）水道又は自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーに供給するための供給管と、
   ｂ）テストチャンバーと
   ｃ）生物試薬発酵槽において培養された発光生物試薬を前記テストチャンバーに供給するために、前記テストチャンバーと流体連通状態の生物試薬発酵槽と、
   ｄ）前記生物試薬からの発光を測定するために、少なくとも前記テストチャンバーと関連する光検出手段と、
   ｅ）前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから取り除くための排出管とを備える、給水中の汚染物質を検出するための連続水監視システムであって、
   前記テストチャンバーの上流側にさらに混合前テストチャンバーを備え、前記混合前テストチャンバーはサンプル水と接触する前の生物試薬の発光特性を測定する光検出手段と関連づけられ、前記混合前テストチャンバーと前記テストチャンバーとにおいて検出される発光特性が変化したら、サンプル水が汚染されたことを示すことを特徴とする連続水監視システム。
2. 前記テストチャンバーは順番に接続される複数のテストチャンバーを含み、各テストチャンバーは対応する光検出手段を有することを特徴とする請求項１に記載の連続水監視システム。
3. 前記テストチャンバーと前記混合前テストチャンバーとの間に混合地点を有し、該混合地点において生物試薬にサンプル水が導入されることを特徴とする請求項２に記載の連続水監視システム。
4. 前記複数のテストチャンバーは前記混合地点から、所定の流量において所定時間だけ間隔をあけて配置されることを特徴とする請求項３に記載の連続水監視システム。
5. サンプル水を前記テストチャンバーに供給する前に、前記サンプル水の調整を行うためのサンプル水調整手段をさらに備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１つに記載の連続水監視システム。
6. 前記サンプル水調整手段は、生物試薬と生体適合性を有するようにサンプル水の性質を変化させることを特徴とする請求項５に記載の連続水監視システム。
7. 前記サンプル水調整手段は、前記サンプル水のイオン強度を変化させることを特徴とする請求項５または６に記載の連続水監視システム。
8. 前記サンプル水調整手段は、選択した少なくとも一つのイオンのイオン濃度を変化させることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の連続水監視システム。
9. 前記サンプル水調整手段は、前記給水の塩素処理又はクロラミン処理又はオゾン処理によって生じる抗菌性物質を除去することを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の連続水監視システム。
10. 前記生物試薬は、発光バクテリアであることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の連続水監視システム。
11. 前記バクテリアは、生物発光バクテリアであることを特徴とする請求項１０に記載の連続水監視システム。
12. 前記バクテリアは、フォトバクテリウム（Photobacterium）又はビブリオ（Vibrio）又はゼノラブダス（Zenorhabdus）のいずれかの属であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の連続水監視システム。
13. 前記サンプル水を、サンプリングのために分離した量に分割するために、あらかじめ決められた間隔で前記サンプル水に気泡が導入されるように、気体供給手段が前記供給管に結合されていることを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の連続水監視システム。
14. 前記サンプル水又は前記生物試薬のいずれか、又は両方を前記システムに供給するためのポンプ手段を備えていることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の連続水監視システム。
15. 前記発酵槽は、連続培地システムとして動作することを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の連続水監視システム。
16. 前記発酵槽は、恒成分培養槽（ケモスタット，a chemostat）として動作することを特徴とする請求項１５に記載の連続水監視システム。
17. 前記発酵槽は、栄養の供給源の方向に生物膜が成長することを妨げるために、成長防止装置を備えることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の連続水監視システム。
18. 前記発酵槽は、空気の導入管と空気の排出管とを備えることを特徴とする請求項１５から１７のいずれかに記載の連続水監視システム。
19. 前記発酵槽は、発酵槽内の容量を一定にする、培地のオーバーフロー管を備えることを特徴とする請求項１５から１８のいずれかに記載の連続水監視システム。
20. 前記生物試薬を供給するための前記管又は前記手段はバクテリアの成長を抑制する材料で構成されていることを特徴とする請求項１から１９のいずれかに記載の連続水監視システム。
21. 前記システムは光検出機能を妨げるエアポケットを除去するための気泡トラップを少なくとも備えることを特徴とする請求項１から２０のいずれかに記載の連続水監視システム。
22. 前記発酵槽と前記テストチャンバーのいずれか又は両方は、攪拌器を備えることを特徴とする請求項１から２１のいずれかに記載の連続水監視システム。
23. 前記発酵槽内の細胞密度を測定するための前記生物試薬の濁度を測定する濁度系をさらに備えることを特徴とする請求項１から２２のいずれかに記載の連続水監視システム。
24. 前記サンプル水の試験の前に前記サンプル水をろ過するための前ろ過手段が配置されていることを特徴とする請求項１から２３のいずれかに記載の連続水監視システム。
25. 前記サンプル水の試験の前に前記サンプル水を濃縮する事前サンプル水濃縮手段をさらに備えることを特徴とする請求項１から２４のいずれかに記載の連続水監視システム。
26. 前記サンプル水の試験の後に前記サンプル水を濃縮する事後サンプル水濃縮手段をさらに備えることを特徴とする請求項１から２５のいずれかに記載の連続水監視システム。
27. 給水中の汚染物質を検出するための給水を連続的に監視する方法であって、
    ａ）水道または自然給水源からのサンプル水をテストチャンバーへ供給するステップと、
    ｂ）発光生物試薬を前記テストチャンバーへ供給するステップと、
    ｃ）前記サンプル水に接触させる前と後において前記生物試薬からの発光を検出するステップと、
    ｄ）前記生物試薬が前記サンプル水に接触した結果、発光に変化があった場合に、前記サンプル水に汚染物質が存在していることを決定するステップと、
    ｅ）上記ステップを繰り返すために、前記サンプル水と前記生物試薬を前記テストチャンバーから除去するステップとを有することを特徴とする給水を連続的に監視する方法。

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