JP5349293B2

JP5349293B2 - 即効型核酸送達用キャリアー組成物

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Publication number: JP5349293B2
Application number: JP2009506363A
Authority: JP
Inventors: 洋文竹内; 安幸平; 浩士中野; 秀一豊福
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2028-03-26
Also published as: JPWO2008117828A1; CN101646443A; MY151450A; AU2008230379A1; PL2140870T3; AU2008230379B2; WO2008117828A1; CN101646443B; MX2009010336A; BRPI0809634A2; CA2682490A1; SI2140870T1; US9315828B2; HK1139041A1; IL201116A0; ES2542864T3; PT2140870E; ZA200906576B; HUE027053T2; EP2140870A4

Description

本発明は、核酸を動物由来細胞又は生物に投与した場合に、効率的に細胞内へ送達させることができ、低毒性で安全性が高い核酸送達用キャリアー組成物、及び核酸送達用組成物に関する。

近年のバイオテクノロジーの発展により、細胞内で生理活性機能を発揮する核酸が種々明らかにされている。例えば、siRNA （small interfering RNA）は、細胞に存在する標的遺伝子のmRNAの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害すること (RNA interference, RNA干渉)が知られている。このRNA干渉による標的遺伝子の発現阻害機能は、特定の遺伝子又は遺伝子群の異常な発現が原因となって生じる疾患症状を軽減乃至治療する上で有用であり、siRNAは治療薬としての開発が期待されている。しかしながらsiRNAを初めとする核酸を治療薬として利用するためには、標的細胞内でsiRNAの機能を発揮することが重要であり、このためには核酸を標的細胞内に効率的に送達させる技術を確立することが必要不可欠である。

外来性核酸分子あるいは遺伝子を細胞内に送達する技術として、キャリアー（ベクター）の利用が知られている。ベクターはウイルス性と非ウイルス性のベクターに分けられる。ウイルス性ベクターは高い遺伝子導入効率を示すが、病原性、免疫原生、細胞毒性等の安全性の面で不明点が多く、より安全性の高い非ウイルスベクターの開発が望まれている。

これまでに、siRNA等の核酸の細胞内への送達を促進する非ウイルス性核酸送達用キャリアーとして、例えば特許文献１には、特定構造のカチオン性脂質が報告されている。しかしながら、特許文献１で報告されているカチオン性脂質では、培養細胞又は生体に投与した場合には毒性を示すという欠点があった。また、特許文献２には、比較的毒性が低くsiRNAを細胞内に送達可能なキャリアー組成物として、両親媒性化合物及びポリカチオンを含む組成物が開示されている。しかしながら、特許文献２に報告されている組成物でも、十分量のsiRNAを細胞内に導入する場合には、細胞に対する毒性が顕在化するため、安全性の点で依然として問題があった。

このような従来技術を背景として、低毒性であり、siRNAを初めとする核酸を効率的に細胞内へ送達させることができる核酸送達用キャリアー組成物の開発が切望されていた。
特表２００２−５２９４３９号公報特表２００５−５０８３９４号公報

そこで、本発明は、上記従来技術の課題を解決することを目的とする。具体的には、本発明の目的は、siRNA等の核酸を動物由来細胞又は動物に投与した場合に、核酸を効率的に細胞内へ送達させることができ、低毒性で高い安全性を示す核酸送達用キャリアー組成物、並びに該キャリアー組成物と核酸を含有する核酸送達用組成物を提供することにある。また、本発明の別の目的は、高い安全性をもって核酸を効率的に細胞内へ送達させることができる、細胞内への核酸の導入方法を提供することにある。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、(A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及び／又はその誘導体、並びに(C)脂肪族第１級アミンを組み合わせて含有する組成物は、毒性が低く高い安全性を示し、しかも核酸を効率的に細胞内へ送達させることができ、核酸送達用キャリアーとして有用であることを見出した。特に、上記(A)〜(C)成分を含む組成物を、リポソーム形態に調製して使用することにより、より一層優れた安全性及び核酸導入性を併せ持たせることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する：
項１． (A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及びその誘導体よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(C)脂肪族第１級アミンを含有することを特徴とする、核酸送達用キャリアー組成物。
項２． (A)成分が、アシル基部分の炭素数が４〜２３のジアシルホスファチジルコリンである、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項３． (B)成分が、コレステロールである、項１又は２に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項４． (C)成分が、炭素数が１０〜２０のアルキルアミンである、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項５． (A)成分が、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンよりなる群から選択される少なくとも１種であり、(B)成分が、コレステロールであり、且つ(C)成分がステアリルアミンである、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項６． (A)成分：(B)成分：(C)成分のモル比が、５〜９：１〜５：１である、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項７． siRNA送達用キャリアーである、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項８． (A)〜(C)成分によりリポソーム膜が形成されたリポソーム製剤である、項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物。
項９．核酸、及び項１に記載の核酸送達用キャリアー組成物を含有する、核酸送達用組成物。
項１０．核酸がsiRNAである、項９に記載の核酸送達用組成物。
項１１．リポソーム製剤である、項９に記載の核酸送達用組成物。
項１２．項９に記載の核酸送達用組成物を細胞に接触させることにより、核酸を細胞内に導入させる工程を含む、核酸導入方法。
項１３．細胞が、培養細胞、生体から分離した細胞、又は生体内に存在する細胞である、項１２に記載の核酸導入方法。
項１４．核酸送達用キャリアーの製造のための、(A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及びその誘導体よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(C)脂肪族第１級アミンを含有する組成物の使用。
項１５．核酸送達用キャリアーが、siRNA送達用キャリアーである、項１４に記載の使用。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物及び核酸送達用組成物は、細胞内に効率的に核酸を送達して、細胞内で核酸の有用機能を有効に発揮させることができ、しかも毒性が低く、安全性が高いという利点がある。従って、上記核酸送達用キャリアー組成物及び核酸送達用組成物は、核酸の導入による各種疾患の治療、特に、低分子化合物等では治療困難な難治性疾患治療に有用である。

また、特に、本発明の核酸送達用キャリアー組成物及び核酸送達用組成物は、siRNAの副作用であるインターフェロンの発現誘導を効果的に抑制できるので、siRNAを細胞内に導入するのに特に好適である。

更に、本発明の核酸送達用組成物は、凍結乾燥処理が可能であるので、凍結乾燥状態で保存できるという利点もある。

試験例１の結果、即ち、核酸送達用組成物の細胞安全性を評価した結果を示す図である。試験例２において、各核酸送達用組成物におけるsiRNAの細胞内への取り込みを評価した結果を示す図である。図２の縦軸は、１細胞当たりの蛍光強度の平均値を示す。試験例２において、核酸送達用組成物中で、核酸送達用キャリアーの構成脂質（DSPC、コレステロール及びステアリルアミン）の濃度を変化させて、siRNAの細胞内への取り込みを評価した結果を示す図である。試験例３において、siRNAを含む核酸送達用組成物のインターフェロン誘導抑制を評価した結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
核酸送達用キャリアー
本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、(A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及び／又はその誘導体、及び(C)脂肪族第１級アミンを含有することを特徴とするものである。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、核酸を細胞内に送達（導入）するための核酸のキャリアーとして使用される。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物が適用される核酸は、細胞内への送達が必要とされているものであれば、その種類や構造については特に制限されない。当該核酸の具体例として、siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA (マイクロRNA)、リボザイム、アンチセンスオリゴ、デコイオリゴヌクレオチド、プラスミドDNA、ペプチド核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド (Triplex Forming Oligonucleotide, TFO)、アプタマー、遺伝子等が例示される。中でも、特に、本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、siRNAの副作用であるインターフェロンの発現誘導を抑制するという有利な特徴があり、siRNAの細胞内への送達用として有用である。本発明の核酸送達用キャリアーが適用される核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルス等に由来するものであってもよく、また化学合成により製造されたものであってもよい。更に、これらの核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれでもよく、更にその分子量についても特に制限されない。また、本発明において、核酸は化学物質、酵素又はペプチドで修飾されたものであってもよい。本発明において、核酸は、１種のものを単独で使用してもよく、また２種以上のものを適宜組み合わせて使用してもよい。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物に使用されるジアシルホスファチジルコリン（以下、「(A)成分」と表記することもある）としては、薬理学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、アシル基部分の炭素数が４〜２３のものが挙げられる。なお、当該ジアシルホスファチジルコリンを構成する２つのアシル基の炭素数は同一又は異なっていても良い。

本発明で使用されるジアシルホスファチジルコリンの具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン、ジブチロイルホスファチジルコリン、ジヘキサノイルホスファチジルコリン、ジヘプタノイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジフタノイルホスファチジルコリン、ジドデシルホスファチジルコリン、ジイコセノイルホスファチジルコリン、ジヘニコサノイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルコリン、ジアラキドノイルホスファチジルコリン、ビス(トリコサジノイル)ホスファチジルコリン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、アシル基部分の炭素数が１２〜１８のジアシルホスファチジルコリンが挙げられ；更に好ましくは、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、及びパルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のアシル基部分の炭素数が１３〜１７のジアシルホスファチジルコリンが挙げられ；特に好ましくはジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられ；最も好ましくはジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。これらのジアシルホスファチジルコリンは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物に使用されるコレステロール及び／又はその誘導体（以下、「(B)成分」と表記することもある）としては、薬理学的に許容されることを限度として特に制限されない。コレステロールの誘導体とは、コレステロール骨格を有するカチオン性脂質であり、具体的には、３β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル］コレステロール(DC-Chol)、３β-［N’,N’,N’-トリメチルアミノエタン］ヨウ化コレステロール(TC-Chol)、ビス(グアニジウム)-トレン-コレステロース(BGTC)、N-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノナン-1,9-ジアミン、β-アラニン-ジエタノールアミン-コレステロール、N⁴-スペルミンコレステリルカルバメート（GL-67; N⁴-spermine cholesteryl carbamate）、N［N⁴-3-アミノプロピルスペルミジン］コレステリルカルバメート（GL-78; N[N⁴-3-aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate）、N⁴-スペルミンコレステリルカルボキシアミド（GL-90; N⁴-spermine cholesteryl carboxamide）、N¹,N⁸-ビス（アルギニックカルボキシアミド）-N4-スペルミジンコレステリルカルバメート（GL-95; N¹,N⁸-Bis(argininc carboxamide)-N⁴-spermidine cholestery carbamate）、N-[N¹,N⁴,N⁸-トリス(3-アミノプロピル)スペルミジン] コレステリルカルバメート（GL-96; N-[N¹,N⁴,N⁸-Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesteryl carbamate）が例示される。本発明において、好適な(B)成分として、コレステロールが挙げられる。本発明では、(B)成分として、コレステロール及びその誘導体の中から、１種のものを単独で使用してもよく、また２種以上のものを組み合わせて使用してもよい。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物に使用される脂肪族第１級アミン（以下、「(C)成分」と表記することもある）としては、薬理学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、アルキル基部分の炭素数が１０〜２０のアルキルアミンが挙げられる。

本発明で使用される脂肪族第１級アミンの具体例としては、ラウリルアミン、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ステアリルアミン、オレイルアミン、デカノイルアミン、フタノイルアミン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、アルキル基部分の炭素数が１２〜１８のアルキルアミンが挙げられ；更に好ましくは、ステアリルアミン、オレイルアミン、及びパルミトイルアミンが挙げられ、特に好ましくはステアリルアミンが挙げられる。これらの脂肪族第１級アミンは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、上記(A)〜(C)成分を組み合わせて含有していればよいが、下記の組み合わせ態様を採用することによって、核酸の細胞内への送達効率、及び低毒性をより一層高めるという観点から、以下に例示する組み合わせが好適である；(A)アシル基部分の炭素数が４〜２３のジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及び／又はその誘導体、並びに(C)炭素数が１０〜２０のアルキルアミンの組み合わせ；更に好ましくは(A)ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び／又はジステアロイルホスファチジルコリン、(B)コレステロール、並びに(C)ステアリルアミンの組み合わせ。

また、本発明の核酸送達用キャリアー組成物において、(A)〜(C)成分の配合比率については、特に制限されないが、例えば、(A)成分：(B)成分：(C)成分のモル比が、５〜９：１〜５：１、好ましくは６〜９：１〜４：１、更に好ましくは７〜８：２〜３：１が例示される。このような比率を充足することにより、核酸の細胞内への送達効率、及び低毒性をより一層向上せしめることができる。

また、本発明の核酸送達用キャリアーの総量に対する(A)〜(C)成分の合計量としては、例えば１〜１００重量％、好ましくは２０〜９０重量％、更に好ましくは３０〜７０重量％が挙げられる。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、上記(A)〜(C)成分に加えて、更に、他のカチオン性脂質を含んでいても良い。このようなカチオン性脂質として、具体的には、スクアラミン（Squalamine）、3a, 7a, 12a-トリス(3-アミノプロポキシ)-5β-コラン-24-(N,N-ビス(3-アミノプロピル)アミン（3a, 7a, 12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N,N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a, 7a, 12a-トリス(3-アミノプロポキシ)-5β-コラン-24-(N-(N-(3-アミノプロピル))-3-アミノプロピル)-アミン（3a, 7a, 12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine）、3a,7a,12a-トリス(3-アジドプロポキシ)-5β-コラン-24-(N,N-ビス(2-シアノエチル)アミン)（3a, 7a, 12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N,N-bis(2-cyanoethyl)amine)）、3a, 7a, 12a-トリス(3-アジドプロポキシ)-5β-コラン-24-(N-(ベンジルオキシカルボニル)-N-(ヒドロキシプロピル)-アミン)（3a, 7a, 12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine)）等のステロイドが結合しているカチオン性脂質；アンブレラ−スペルミン複合体（Umbrella-spermine conjugates）等のコール酸が結合しているカチオン性脂質；ステロールグリコシドが結合しているカチオン性脂質；ステロイドサポニンが結合しているカチオン性脂質；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド塩(DDAB)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンメチル硫酸塩、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、N-(1-(2,3-ビス(オレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩酸塩(DOTMA)、ジミリストイルオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド塩(DMRIE)、ジオレオイルオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(DORIE)、ジメチルジドデシルアンモニウムブロマイド、N-(a-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタミン塩酸塩、N-(a-トリメチルアンモニオアセチル)-O, O’-ビス-(1H, 1H, 2H, 2H-パーフルオロデシル)-L-グルタミン塩酸塩、O, O’-ジドデカノイル-N-(a-トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミン塩酸塩、メチルアリルジドデシルアンモニウムブロマイド、N-{p-(w-トリメチルアンモニオブチルオキシ)-ベンゾイル}-ジドデシル-L-グルタミン塩酸塩、9-(w-トリメチルアンモニオブチル)-3, 6-ビス(ドデカノイル)カルバゾールブロマイド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩酸塩、N-w-トリメチルアンモニオデカノイル-ジヘキサデシル-D-グルタミンブロマイド、N-{p-(w-トリメチルアンモニオヘキシルオキシ)-ベンゾイル}-ジテトラデシル-L-グルタミンブロマイド、p-(w-トリメチルアンモニオデシルオキシ)-p’-オクチルオキシアゾベンゼンブロマイド塩 (MC-1-0810)、p-{w-(b-ヒドロキシエチル)ジメチル-アンモニオ-デシルオキシ}-p’-オクチルオキシアゾベンゼンブロマイド塩 (MC-3-0810)、O,O’,O’’-トリドデカノイル-N-(w-トリメチル-アンモニオデカノイル)-トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンブロマイド塩(TC-1-12)、1,2-ジラウリル-グリセロ-3-エチルホスフォコリン、1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-エチルホスフォコリン、1,2-ジパルミトイル-グリセロ-3-エチルホスフォコリン、1,2-ジステアロイル-グリセロ-3-エチルフォスフォコリン、1,2-ジオレオイル-グリセロ-3-エチルホスフォコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-エチルホスフォコリン等の第４級アンモニウム塩型のカチオン性脂質等が挙げられる。

本発明において、(A)〜(C)成分以外の他のカチオン性脂質を含有する場合、該カチオン性脂質の割合としては、本発明の効果を妨げない限り特に制限されないが、上記(A)〜(C)成分の総量１００重量部に対して、該カチオン性脂質が１〜１０重量部、好ましくは２〜８重量部、更に好ましくは４〜６重量部となる割合が例示される。

更に、本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、必要に応じて、油性基剤を含んでいても良い。油性基剤を配合して、その特性を利用することによって、核酸送達用キャリアー組成物による核酸の導入効率の制御が可能になる。例えば、油性基剤を配合して核酸送達用キャリアー組成物の比重を調整することにより、細胞と核酸送達用キャリアー組成物の接触性を制御し、in vitroでの導入効率を改善することが可能になる。また、例えば、油性基剤として温度感受性機能を有するものを配合することによって、所定の温度条件下で核酸キャリアー組成物のコアを崩壊させて細胞表面での揺らぎを誘引し、核酸の導入効率を向上させることが可能になる。更に、例えば、油性基剤として外部刺激崩壊性を有するものを配合することによって、外部刺激により核酸キャリアー組成物のコアを崩壊させて細胞表面での揺らぎを誘引し、核酸の導入効率を向上させることが可能になる。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物に配合される油性基剤としては、例えば、パーフルオロカーボン、パーフルオロペンタン、パーフルオロオクチルブロマイド、パーフルオロヘキサン、パーフルオロトリブチルアミン、大豆油、精製大豆油、ダイズ硬化油、大豆油不けん化物、スクアレン、ひまし油、チョウジ油、トリオレイン酸ソルビタン、テレビン油、サフラワー油、サフラワー油脂肪酸、オレイン酸、ヤシ油、ナタネ油、フーゼル油、オリブ油、アマニ油、ゴマ油、クロロフィル油、ハズ油、ベルガモット油、シーダー油、オレンジ油、ウイキョウ油、ユーカリ油、トウモロコシ油、ラベンダー油、マヨナラ油、レモン油、綿実油、卵黄油、ローズ油、パインオイル、アルモンド油、ラッカセイ油、ツバキ油、樟脳白油、カミツレ油、ケイヒ油、ハッカ油、エステル化トウモロコシ油、ショウキョウ油、ローマカミツレ油、蛇油、スペアミント油、ヒマワリ油、カカオ脂、小麦胚芽油、チンク油、硬化油、水素添加植物油、軽質流動パラフィン、流動パラフィン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ミンク油、トウヒ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油100、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油20、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油5、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシル35ヒマシ油、プロセス油等が挙げられる。これらの油性基剤の内、パーフルオロペンタンには温度感受性があり、２９．５℃で沸騰によりガス化する特性がある。また、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクチルブロマイド、及びパーフルオロトリブチルアミンには、外部刺激崩壊性があり、超音波照射による刺激等の外部からの刺激により、キャリアー組成物のコアにキャビテーションを発生させて崩壊させるという特性がある。

当該油性基剤を含有する場合、該油性基剤の割合としては、本発明の効果を妨げない限り特に制限されないが、上記(A)〜(C)成分の総量１００重量部に対して、該油性基材が０．１〜５０重量部、好ましくは１〜３０重量部、更に好ましくは５〜２０重量部となる割合が例示される。

更に、本発明の核酸送達用キャリアー組成物には、必要に応じて膜融合性脂質（ヘルパー脂質）を含んでいてもよい。かかる膜融合性脂質を含有することにより、細胞内への核酸の送達効率を一層向上させることが可能になる。このような膜融合性脂質としては、例えば、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、トランスフォスファチジルフォスファチジルエタノールアミン、1,2-ビス(10, 12-トリコサジノイル)-フォスフォエタノールアミン、1,2-ジエライドイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジヘキサデシルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジヘキサノイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジラウロイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジリノレオイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジミリストイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジパルミトオレオイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジフィタノイルフォスフォエタノールアミン、1,2-ジステアロイルフォスフォエタノールアミン、1-パルミトイル-2-オレオイルフォスフォエタノールアミン、1-パルミトイル-2-(10,12-トリコサジノイル)フォスフォエタノールアミン、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-カプロイルアミン、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-カプロイルアミン、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N,N-ジメチル、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N,N-ジメチル、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-ドデカノイル、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-ドデカノイル、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-ドデカニルアミン、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-ドデカニルアミン、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-グルタリル、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-グルタリル、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-ラクトース、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-[4(p-マレイミドメチル)サイクロヘキサン-カルボン酸塩、ジパルミトリルフォスフォエタノールアミン-N-[4(p-マレイミドメチル)サイクロヘキサン-カルボン酸塩、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-[4(p-マレイミドフェニル)ブチラミド、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-[4(p-マレイミドフェニル)酪酸塩]、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-メチル、ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-メチル、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸塩、1,2-ジオレオイルフォスフォエタノールアミン-N-(サクシニル)、1,2-ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン-N-(サクシニル)等が挙げられる。中でも、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンは、本発明の核酸送達用キャリアー組成物において好適に使用される。

当該膜融合性脂質を含有する場合、該膜融合性脂質の割合としては、本発明の効果を妨げない限り特に制限されないが、上記(A)〜(C)成分の総量１００重量部に対して、該膜融合性脂質が１〜５００重量部、好ましくは１０〜２５０重量部、更に好ましくは２５〜１００重量部となる割合が例示される。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、使用形態に応じて、等張化剤、賦形剤、希釈剤、増粘剤、安定化剤、緩衝剤、保存剤等の種々の添加剤；精製水、糖水溶液、緩衝液、生理食塩水、高分子水溶液、RNase free水等の水性担体を含有することができる。これらの添加剤や水性担体の配合量は、核酸送達用キャリアーの使用形態に応じて適宜設定することができる。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、細胞内に送達する対象となる核酸を包含できる限り、その形態については特に制限されないが、リポソームの形態であることが望ましい。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物をリポソームの形態にする場合、上記(A)〜(C)成分及び必要に応じて添加される他の脂質は、リポソーム膜を形成する。リポソームの形態にする場合、小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar. vesicles: SUV）、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: LUV）、及び多重層リポソーム（multilamellar vesicles: MLV）のいずれであってよい。また、その粒子径については、送達対象の細胞の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、SUVでは２０〜１００ｎｍ、LUVでは２００〜１０００ｎｍ、MLVでは４００〜３５００ｎｍ程度が例示される。リポソームの粒子径は、動的光散乱法によって測定される。

リポソームの製造及びその粒子径の調節は、当業界で公知の方法に従って実施される。即ち、上記(A)〜(C)成分を含む油相と、水相（水性担体）とを用い、薄膜法、逆相蒸発法、エーテル注入法、界面活性剤法、加温法等により、リポソームを形成させることができる。また、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等により、粒子径を調節することができる。

本発明の核酸送達用キャリアー組成物は、上記(A)成分、(B)成分、及び必要に応じて他成分を混合し、目的とする形態に応じて適宜製剤化することにより調製される。

核酸送達用組成物
本発明の核酸送達用組成物は、上記の核酸送達用キャリアー組成物と核酸を含有するものである。即ち、当該核酸送達用組成物は、該組成物内に含まれる核酸を送達対象となる細胞内に導入するために使用されるものである。

核酸送達用キャリアー組成物がリポソーム形態である場合、当該核酸送達用組成物において、リポソームの内水相に核酸が封入された状態で存在していても、またリポソーム膜の内側又は外側にイオン結合若しくは疎水結合により結合して存在していてもよい。また、核酸送達用キャリアー組成物がリポソーム以外の形態である場合であれば、当該核酸送達用組成物において、核酸は核酸送達用キャリアー組成物の配合成分とイオン結合若しくは疎水結合により複合体を形成していればよい。

本発明の核酸送達用組成物は、上記の核酸送達用キャリアー組成物と核酸とを混合し所望の形態に調製する、又は、核酸及び上記の核酸送達用キャリアー組成物の配合成分を任意の順で混合し所望の形態に調製することによって製造される。

本発明の核酸送達用組成物において、核酸と核酸送達用キャリアー組成物との配合比率としては、使用する核酸や核酸送達用キャリアーの種類や核酸の送達対象となる細胞の種類等によって異なるが、例えば、核酸送達用キャリアー組成物に含まれる(A)〜(C)成分の総量１００重量部に対して、核酸が1.0×10^-5〜1.0重量部、好ましくは1.0×10^-4〜1.0×10^-1重量部、更に好ましくは1.0×10^-3〜1.0×10^-2重量部となる割合が挙げられる。

また、核酸送達用組成物に含まれる(A)〜(C)成分の合計量としては、該組成物の総量に対して、例えば１０〜９０重量％、好ましくは３０〜８０重量％、更に好ましくは４０〜６０重量％が挙げられる。

本発明の核酸送達用組成物は、使用形態に応じて、等張化剤、賦形剤、希釈剤、増粘剤、安定化剤、緩衝剤、保存剤等の種々の添加剤；精製水、グルコース水溶液、緩衝液、生理食塩水等の水性担体を含有することができる。これらの添加剤や水性担体の配合量は、核酸送達用組成物の使用形態に応じて適宜設定することができる。

本発明において、核酸が送達される細胞としては、培養細胞、生体から抽出した細胞（株化した細胞を含む）、ヒト等の生体内に存在する細胞等が挙げられる。

本発明の核酸送達用組成物の使用態様としては、当該核酸送達用組成物の適当量が核酸導入対象となる細胞に接触するように適用される限り特に制限されない。例えば、ヒト等の生体内の細胞に核酸を送達する場合であれば、例えば、組織への直接注入；静脈、皮下、筋肉、腹腔、眼内、消化器官内、歯内等への注射；鼻腔、口腔、肺等への吸入投与；経口投与；皮膚を介した経皮投与；及び口腔粘膜、膣粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜を介した経粘膜投与等が例示される。また、培養細胞や生体から抽出した細胞に核酸を送達する場合であれば、培養時に予め適当量の核酸送達用組成物を存在させた状態で細胞を培養する方法が例示される。なお、培養細胞や生体から抽出した細胞に核酸を送達する場合、血清の存在下でも核酸の細胞内への送達が可能である。

また、核酸導入対象となる細胞に対して、本発明の核酸送達用組成物が適用される量については、使用する核酸の種類、該核酸送達用組成物の種類、対象となる細胞の種類等に応じて適宜設定される。例えば、核酸の送達対象がヒト中の細胞である場合、核酸の投与によって治療効果が期待される患者に、治療有効量の本発明の核酸送達用組成物を投与すればよい。

以下、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下の実施例等において、ジステアロイルホスファチジルコリンを「DSPC」、ジパルミトイルホスファチジルコリンを「DPPC」、ジミリストイルホスファチジルコリンを「DMPC」と表記する。また、以下の試験例１及び２では、siRNAとして、GL3-siRNA (ホタルルシフェラーゼに対するsiRNA；Dharmacon社, Boulder, CO, USA；sense：5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT、antisense：5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)を用いた。また、試験例３には、siRNAとして、Human MMP-9-siRNA (Samchully Pharm. Co., Ltd, Korea; Sense 5'-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3', antisense: 5'-UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT-3')を用いた。

実施例１ DSPCを含む核酸送達用キャリアー組成物の調製
モル比でDSPC：コレステロール：ステアリルアミン＝7:3:1となるように秤量し、これらをナス型フラスコでクロロホルム中に溶解させた。ロータリーエバポレーターにより減圧乾燥させ、脂質薄膜を形成した。これにDSPC濃度で30mg/mLとなるようにDEPC-treated water(Ambion社製；Rnase free水)を加えた後、エクストルーダーを用いて孔径100nmの膜に通し粒子径を揃え、カチオン性リポソーム形態である核酸送達用キャリアー組成物を調製した。

実施例２ DPPCを含む核酸送達用キャリアー組成物の調製
DSPCの変わりにDPPCを使用すること以外は、上記実施例１と同様の方法で、カチオン性リポソーム形態の核酸送達用キャリアー組成物を調製した。

実施例３ DMPCを含む核酸送達用キャリアー組成物の調製
DSPCの変わりにDMPCを使用すること以外は、上記実施例１と同様の方法で、カチオン性リポソーム形態の核酸送達用キャリアー組成物を調製した。

実施例４ DSPCを含む核酸送達用組成物の調製
20×Tris-EDTA(TE)緩衝液 (Invitrogen社製)をDEPC-treated water(Ambion社製；Rnasefree水)で２０倍希釈した溶液を用いて、2μＭの濃度でsiRNAを含む溶液（siRNA溶液）を調製した。次いで、実施例１の核酸送達用キャリアー組成物と、siRNA溶液を等量混合し、リポプレックス（複合体）を形成させ、核酸送達用組成物を調製した。

実施例５ DPPCを含む核酸送達用組成物の調製
20×Tris-EDTA(TE)緩衝液 (Invitrogen社製)をDEPC-treated water(Ambion社製；Rnase free水)で２０倍希釈した溶液を用いて、2μＭの濃度でsiRNAを含む溶液（siRNA溶液）を調製した。次いで、実施例２の核酸送達用キャリアー組成物と、siRNA溶液を等量混合し、リポプレックス（複合体）を形成させ、核酸送達用組成物を調製した。

実施例６ DMPCを含む核酸送達用組成物の調製
20×Tris-EDTA(TE)緩衝液 (Invitrogen社製)をDEPC-treated water(Ambion社製；Rnase free水)で２０倍希釈した溶液を用いて、2μＭの濃度でsiRNAを含む溶液（siRNA溶液）を調製した。次いで、実施例３の核酸送達用キャリアー組成物と、siRNA溶液を等量混合し、リポプレックス（複合体）を形成させ、核酸送達用組成物を調製した。

試験例１細胞安全性の評価試験
MTS試験法を用いて行った。MTS試験は、Promega社製の「CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay」を用いて行った。具体的には、96穴プレートにA594細胞（ATCC, USA）を3.16×10⁴cells/wellで10容量％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）200μＬ中に播種し、37℃下24時間培養した。ハンクスバランスドサルトソリューション（HBSS）で3回洗浄後、FBSを含まないDMEMに替え、上記実施例４〜６の核酸送達用組成物をそれぞれ１穴当たり20μL添加し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした。次いで、穴中の培養上清を10容量％FBS含有DMEMに替え、更に37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした。次いで、各穴にMTS（メタチオネイン）試薬20μL及びFBS10容量％含有DMEM培地100μLを加え、2時間インキュベートした後、492nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。なお、細胞生存率は、核酸送達用組成物を添加せずに上記条件でインキュベートした際に測定された490nmにおける吸光度を100％として算出した。

得られた結果を図１に示す。図１に示すように、実施例４〜６の核酸送達用組成物のいずれでも、細胞毒性が低く、安全性が高いことが明らかとなった。特に、ジアシルホスファチジルコリンとして、DSPC又はDPPCを使用した核酸送達用組成物（実施例４又は５）では、安全性が顕著に高いことが確認された。

試験例２ siRNAの細胞内への送達効率の評価試験
フローサイトメトリーを用いてsiRNAに標識したFITCの蛍光強度を測定することにより細胞内取り込みを評価した。なお、本試験では、siRNAに予めFITC標識をしたものを用いて調製した核酸送達用組成物を利用した。具体的には、24穴プレートにA594細胞（ATCC, USA）を5×10⁵cells/wellで10容量％FBSを含むDMEM 500μL中に播種し、37℃、5％CO₂条件下で24時間培養した。HBSSで3回洗浄後、FBSを含まないDMEMに替え、更に上記実施例４〜６の核酸送達用組成物をそれぞれ１穴当たり0.05mL添加し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした。次いで、穴中の培養上清を10容量％FBS含有DMEMに替え、更に37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした。各穴をHBSSで1回洗浄後、CellScrubBuffer（Gene Therapy Systems, Inc.製）を0.2mL添加し37℃、5％CO₂条件下で15分間インキュベートした。更に、HBSSで2回洗浄後、トリプシンを用いて、穴底部に付着している細胞を剥がし取り、遠心分離により細胞を回収し、得られた細胞をHBSSに懸濁させた。その懸濁液を孔径41μmの膜に通過させた。核酸送達用組成物の添加2時間後及び24時間後の細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーを用いて測定した。また、比較対象として、市販で遺伝子ベクターとして頻用されているLipofectamine2000^TM（Invitrogen社製）をOptiMEM培地で0.1mg/mLに希釈した溶液と、TE緩衝液にsiRNAを2μＭの濃度で希釈したsiRNA溶液とを容量比１：１で混合して得られた比較用核酸送達用組成物を用いて、上記と同様に細胞の蛍光強度を測定した。

得られた結果を図２に示す。この結果から、実施例４〜６の核酸送達用組成物のいずれの場合でも、siRNAが細胞内に効率よく取り込まれていることが確認された。特に、ジアシルホスファチジルコリンとして、DSPC又はDMPCを使用した核酸送達用組成物（実施例４及び６）では、添加2時間後においてsiRNAの細胞内への取り込みが、市販で遺伝子ベクターとして頻用されているLipofectamine^TM2000に比して顕著であり、即効性に優れているという有利な特徴を備えていることも明らかとなった。

また、DSPC、コレステロール及びステアリルアミン（モル比でDSPC：コレステロール：ステアリルアミン＝7:3:1、以下、これらを纏めて「核酸送達用キャリアーの構成脂質」と表記する）を用いて、DSPCの濃度が7.5〜30 mg/mLの核酸送達用キャリアーを実施例１に記載の方法に準じて製造した。次いで、この核酸送達用キャリアーと、200nMのsiRNA含むTE緩衝液とを同量混合し、リポプレックス（複合体）を形成させ、核酸送達用組成物を調製した。斯くして調製した核酸送達用組成物を用いて、上記と同様の方法で、細胞内への取り込みを評価した。結果を図３に示す。この結果から、核酸送達用キャリアーの構成脂質の濃度を変化させると、核酸送達用組成物による核酸の細胞内への取り込み量はそれに応じて変化した。また、核酸送達用キャリアー構成脂質のいずれの濃度の場合においても、24時間後の値は2時間と比較して低い値を示し、24時間後ではsiRNAの消失を開始していることが明らかとなった。即ち、本結果からも、DSPC、コレステロール及びステアリルアミンを組み合わせて核酸送達用キャリアーとして使用することによって、添加２時間後という短時間でsiRNAの細胞内への送達が可能になっており、即効性に優れていることが確認された。

試験例３インターフェロン誘導抑制の評価試験
24穴プレートにA594細胞（ATCC, USA）を5×10⁵cells/wellで10容量％FBSを含むDMEM 500μL中に播種し、37℃、5％CO₂条件下で24時間培養した。HBSSで3回洗浄後、各穴にFBSを含まないDMEM培地450μLを加え、更に各穴に上記実施例４の核酸送達用組成物50μLを添加し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした。次いで、穴中の培養上清を10容量％FBS含有DMEMに替え、更に37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした。更に、HBSSで3回洗浄後、トリプシンを用いて、穴底部に付着している細胞を剥がし取って遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞からRneasy Plus Mini（Qiagen社製）を用いてRNAを抽出し、QutantiTectReverse Transcription（Qiagen社製）を用いて転写してcDNAを得た。得られたcDNAをQutantiTectPrimer Assay（Qiagen社製）とiCycler iQ（Bio-RAD社製）を用いてインターフェロン誘導遺伝子であるIFIT-1のmRNAをリアルタイムPCRにより定量した。比較対象として、市販で遺伝子ベクターとして頻用されているLipofectamine2000^TM（Invitrogen社製）をOptiMEM培地で0.1mg/mLに希釈した溶液と、TE緩衝液にsiRNAを2μＭの濃度で希釈したsiRNA溶液とを容量比１：１で混合して得られた比較用核酸送達用組成物を用いて、上記と同様にIFIT-1のmRNAを定量した。定量の補正をするためのハウスキーピング遺伝子は18rRNAを用いた。また、ブランクとして、核酸送達用組成物を添加することなく上記条件でIFIT-1のmRNAを定量した。

得られた結果を図４に示す。DSPCを使用した実施例４の核酸送達用組成物では、Lipofect^TMamine2000を使用した比較用核酸送達用組成物に比して、顕著に低いインターフェロン誘導を示した。本結果から、本発明の核酸送達用組成物を用いることにより、siRNAの副作用であるインターフェロン誘導を抑制することが可能であることが明らかとなった。

Claims

(A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及びコレステロール骨格を有するカチオン性脂質よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(C)脂肪族第１級アミンを含有することを特徴とする、siRNA送達用キャリアー組成物。
(A)成分が、アシル基部分の炭素数が４〜２３のジアシルホスファチジルコリンである、請求項１に記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
(B)成分が、コレステロールである、請求項１又は２に記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
(C)成分が、炭素数が１０〜２０のアルキルアミンである、請求項１〜３のいずれかに記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
(A)成分が、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンよりなる群から選択される少なくとも１種であり、(B)成分が、コレステロールであり、且つ(C)成分がステアリルアミンである、請求項１〜４のいずれかに記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
(A)成分：(B)成分：(C)成分のモル比が、５〜９：１〜５：１である、請求項１〜５のいずれかに記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
(A)〜(C)成分によりリポソーム膜が形成されたリポソーム製剤である、請求項１〜６のいずれかに記載のsiRNA送達用キャリアー組成物。
siRNA、及び請求項１〜７のいずれかに記載のsiRNA送達用キャリアー組成物を含有する、siRNA送達用組成物。
リポソーム製剤である、請求項８に記載のsiRNA送達用組成物。
請求項８または９に記載のsiRNA送達用組成物を細胞に接触させることにより、siRNAを細胞内に導入させる工程を含む、siRNA導入方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
細胞が、培養細胞、又は生体から分離した細胞である、請求項１０に記載のsiRNA導入方法。
siRNA送達用キャリアーの製造のための、(A)ジアシルホスファチジルコリン、(B)コレステロール及びコレステロール骨格を有するカチオン性脂質よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(C)脂肪族第１級アミンを含有する組成物の使用。