JP5352761B2 - 抗体ジスルフィド異性体、その使用及びその分析法 - Google Patents

Description

本出願は、米国特許法１１９条３５項に基づいて、２００２年３月２０日出願の米国仮出願第６０／３６６，３５０号に対して優先権を主張する。
（技術分野）
本発明は組換えタンパク質ジスルフィド異性体及びそのジスルフィド異性体及びその抗体の酸化されたメチオニル形を検出する分析法に関する。より具体的には、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の抗原決定基に特異性を有する抗体のジスルフィド異性体に関する。本発明はまた、ＴＮＦα抗体ジスルフィド異性体及びＴＮＦα抗体の酸化されたメチオニル形の検出の分析方法にも関する。本発明はまた、その異性体を含む組成物及びその抗体の治療上の使用にも関する。

抗体分子には、２つの重鎖と２つの軽鎖がある。それぞれの重鎖と軽鎖はそのＮ末端に可変領域を有する。各可変領域は３つの相補的な決定領域（ＣＤＲｓ）とともに変化する４つのフレームワーク領域（ＦＲｓ）で形成されている。可変領域中の残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号が付けられている。このシステムは、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（以後「Ｋａｂａｔら（上記参照）」）の「免疫学的に重要なタンパク質の配列、１９８７」に規定されている。この番号システムは、特に断らない限り、本明細書中で使用している。

Ｋａｂａｔの残基の名称はアミノ酸残基の直線的な番号と直接対応していない。実際の直線的なアミノ酸配列は、フレームワークとＣＤＲを問わず、基本的な可変領域構造の構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔの番号に比べてより少ないか、又はアミノ酸を多く含む可能性がある。正確なＫａｂａｔの残基の番号は、与えられた抗体について、「標準」のＫａｂａｔの番号配列を有する抗体の配列中の相同性の残基配列によって決定してよい。

重鎖可変領域のＣＤＲｓはＫａｂａｔの番号付に従って、残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、残基５０−５６（ＣＤＲＨ２）及び残基９５−１０２（ＣＤＲＨＩ）に位置している。

軽鎖可変領域のＣＤＲｓはＫａｂａｔの番号付に従って、残基２４−３４（ＣＤＲＨ１）、残基５０−５６（ＣＤＲＨ２）及び残基８９−９７（ＣＤＲＨＩ）に位置している。

ＣＤＲがグラフトされた抗体の構造はＥＰ−Ａ−０２３９４００に記載されており、それはマウスモノクロナール抗体のＣＤＲｓが、長いオリゴヌクレオチドを用いて、部位指向変異誘発によって、ヒト免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域にグラフトされることを開示している。ＣＤＲｓは抗体の抗原結合特異性を決定し、可変領域のフレームワーク領域上に担持されている、比較的短いペプチド配列である。

ＣＤＲグラフトによるヒト化モノクロナール抗体に関する初期の研究はＮＰのような合成抗原を認識するモノクロナール抗体について行われた。

しかしながら、リゾチームを認識するマウスモノクロナール抗体及びヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットモノクロナール抗体が、ＣＤＲグラフトによってヒト化された実施例が、それぞれＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４，１９８８）によって記載されている。

Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらは、Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲｓ単独（Ｋａｂａｔら（上記参照）及びＷｕら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３２，２１１−２５０，１９７０）によって記載されている）の転移はＣＤＲフラフト製品中に満足な抗原結合活性を与えるのに十分でないことを見出した。フレームワーク残基の数がドナーのフレームワーク残領域の数に対応するように、フレームワーク残基の数を変えなければならないことが見出された。変更を要するフレームワーク残基の選択基準の提案が国際出願番号ＷＯ９０／０７８６１に記載されている。

Ｖａｕｇｈａｍら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８）を含め、ＣＤＲをグラフトした抗体について考察した多くの総説が公表されている。

ＴＮＦαは免疫系の細胞によって遊離され、又は免疫系の細胞と相互作用する催炎症性サイトカインである。従って、ＴＮＦαはグラム陰性細菌のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって活性化されたマクロファージによって遊離される。従って、ＴＮＦαは、細菌性敗血症に関連したエンドトキシンショックの発症と発生機序に関与する特に重要な内因性メディエーターと思われる。ＴＮＦαはまた、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症のような慢性疾患を含む多数のヒトの疾患でアップレギュレートされていることも示されている。ヒトＴＮＦαの遺伝子移植マウスは本質的にＴＮＦαの濃度を高め、関節リウマチに似た自発的な、破壊的な多発関節炎を発症する（Ｋａｆｆｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，４０２５，４０３１，１９９１）。ＴＮＦαは従って、催炎症性サイトカインと呼ばれる。

ＴＮＦαに対するモノクロナール抗体は従来の技術に記載されている。Ｍｅａｇｅｒら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，３０５−３１１，１９８７）は組換えＴＮＦαに対するネズミのモノクロナール抗体を記載している。Ｆｅｎｄｌｅｙら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，３５９−３７０，１９８７）はＴＮＦ上の中和エピトープを定義するにおいて組換えＴＮＦαに対するネズミのモノクロナール抗体の使用を記載している。Ｓｈｉｍａｍｏｔｏらは（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７，３１１−３１８，１９８８）はＴＮＦ７に対するネズミのモノクロナール抗体の使用を記載し、マウスにおけるエンドトキシンショックの予防におけるそれらの使用を記載している。更に、国際出願番号ＷＯ９２／１１３８３には、ＣＤＲグラフト抗体を含む、ＴＮＦαに特異的な組換え抗体が開示されている。Ｒａｉｋｉｎら（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３４，３３４−３４２，１９９５）は関節リウマチの治療における、そのようなＣＤＲグラフト抗体の使用を記載している。米国特許第５，９１９，４５２号は抗ＴＮＦキメラ抗体と５ＴＮＦの存在に関連した病理の治療におけるその使用を開示している。

エンドトキシンショックの予防と治療に、ＴＮＦαに対する抗体が提案されている（Ｂａｕｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，４７０−４７４，１９８５）。Ｂｏｄｍｅｒら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１，Ｓ４４１−Ｓ４４６，１９９３）及びＷｈｅｒｒｙら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１，Ｓ４３６−Ｓ４４０，１９９３）は敗血症ショックの治療における抗ＴＮＦα抗体の治療の可能性を考察している。敗血症ショックの治療における抗ＴＮＦα抗体の使用は、Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６，１６２５−１６２６，１９９８）も考察している。コラーゲン誘発関節炎は、抗ＴＮＦαモノクロナール抗体を使用して効果的に治療できる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（ＰＮＡＳ−ＵＳＡ，８９，９７８４−９７８８，１９９２））。

関節リウマチ患者の滑液及び抹消血の両方で、ＴＮＦαの濃度の増加が見られた。関節リウマチ患者にＴＮＦα遮断剤を投与すると、炎症が低減し、症状が改善し、関節の障害が遅れた（ＭｃＫｏｗｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４２，１２０４−１２０８，１９９９）。

関節リウマチと２０名のクローン病の治療における抗ＴＮＦα抗体の使用がＦｅｌｄｍａｎら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３０，４１２６−４１２７，１９９８）、Ａｄｏｒｉｎｉら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１８，２０９−２１１，１９９７）及びＦｅｌｄｍａｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６４、２８３−３５０、１９９７））によって考察されている。そのような治療で使用されるＴＮＦαに対する抗体は、一般に米国特許第５９１９４５２号に記載されているようなキメラ抗体である。

現在、２つのＴＮＦα遮断剤が関節リウマチの治療に許可されている。エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔｂ）と云う第一の製品は、Ｉｍｍｕｎｅｘ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがＥｎｂｒｅｌの商標名で販売している。これはヒト免疫グロブリンに結合した２つのｐ７５可溶性ＴＮＦ受容体領域を含む組換え融合タンパク質である。ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂと云う第二の製品は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがＲｅｍｉｃａｄｅの商標名で販売している。これはネズミの抗ＴＮＦα可変領域とヒトＩｇＧＩ不変領域を有するキメラ抗体である。

従来の技術の組換え抗ＴＮＦα抗体分子は一般に、それからその可変領域又はＣＤＲｓが誘導される抗体に比べて、ＴＮＦαに対する親和性が低く、一般に哺乳動物細胞中で作られねばならず、製造コストが高い。従来の技術の抗ＴＮＦα抗体はＳｔｅｐｈｅｎｓらがＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８−６７４，１９９５，ＧＢ−Ａ−２ ２４６ ５７０及びＧＢ−Ａ−２ ２９７ １４５に記載している。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はＴＮＦαに対して高親和性を有し、ヒトの免疫原性が低い抗体分子を記載し、これは慢性炎症性疾患の治療に繰り返し使用でき、容易に且つ効率的に製造できる。

混合有機−水溶媒系におけるタンパク質分解の方法が記載されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＷＫら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２６８２−２６８５、２００１）。しかしながら、Ｆａｂｓのような抗体断片のタンパク質分解には特有の問題がある。本発明の方法とＲｕｓｓｅｌらの方法の差は、溶媒の添加順序の違いである。本方法では、Ｆａｂはアセトニトリルに直接溶解され、次いで消化緩衝液と酵素が添加された。Ｒｕｓｓｅｌｌらの方法では、先ず有機溶媒と緩衝液を混合し、ついでタンパク質と酵素がその溶液に添加された。しかしながら、Ｒｕｓｓｅｌｌらの方法では、Ｆａｂが折り込まれた構造であるために、Ｆａｂは効率的に消化されない。

（発明の要約）
本発明は組換えタンパク質ジスルフィド、好ましくは、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に特異性を有する抗体のジスルフィド異性体を含む。本発明はまた、抗体を有機溶媒で前処理し、抗体をプロテアーゼで消化し、その断片を分離する（ｒｅｓｏｌｖｅ）段階を含む抗体のジスルフィド異性体を検出する方法も含む。本発明はまた、ＴＮＦα抗体のジスルフィド異性体及び酸化されたメチオニル形を検出する分析法にも関する。本発明はまた、異性体を含む組成物と抗体の治療上の使用に関する。

ＣＤＰ８７０の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列、分子内ジスルフィドペアリング、軽鎖と重鎖間の顕著なジスルフィドペアリング及びＰＥＧ接合のシステインを示す。 ＣＤＰ８７０のデザインされたジスルフィドペアＬｙｓ−Ｃ断片及びＣＤＰ８７０の異性体のジスルフィドペアＬｙｓ−Ｃ断片を示し、重要な残基（軽鎖ｃｙｓ−２１４、重鎖ｃｙｓ−２２１及び重鎖ｃｙｓ−２２７が強調されている。）矢印Ｌｙｓ−Ｃの開裂パターンを示す。 ＣＤＰ８７０のメチオニンを含むトリプシンの断片を緑色で示す。 ＣＤＰ８７０のメチオニンの酸化のトリプシンマップを示す。メチオニル残基が酸化されたトリプシン断片は、Ｏ１−Ｏ５と記載されている。例えば、トリプシン断片Ｍ１は、酸化されると、Ｏ２等としてＯ１、Ｍ２として記載される。 ＣＤＰ８７０についてのジスルフィド異性体Ｌｙｓ−Ｃを示す。１４１１．６ａｍｕに対して相対的に１２６０．５ａｍｕがより多いことが明らかである。

最初の態様において、本発明はジスルフィド結合が相互の向きを有する組換えタンパク質ジスルフィドを提供する。「抗体ジスルフィド異性体」は、優先的なジスルフィド対以外の軽鎖と重鎖上のシステイン間のジスルフィド対を有する抗体と定義される。好ましくは、ジスルフィド異性体はヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の抗原決定基に特異性を有する抗体のジスルフィド異性体である。好ましくは、ＴＮＦα抗体は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５に開示されたＴＮＦα抗体である。好ましくは、抗体はＣＤＰ８７０である。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５は、可変領域が、ＣＤＲＨ１に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１）の図３にＨ１として示した配列、ＣＤＲＨ２に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号２）の図３にＨ２’として、又は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号７）の図３にＨ２として示した配列、ＣＤＲＨ３に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号３）の図３にＨ３として示した配列を有するＣＤＲ（Ｋａｂａら（上記参照）による定義）を含む重鎖を含む、ＴＮＦαに特異性を有する抗体分子を提供する。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、重鎖の可変領域にＨ１、Ｈ２’又はＨ２及びＨ３（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１；配列番号２；配列番号７及び配列番号３）から選ばれた少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは、抗体分子は重鎖の可変領域に少なくとも２つ、より好ましくは、３つのすべてのＣＤＲｓを含む。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５には、可変領域が、ＣＤＲＬ１に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号４）の図３にＬ１として示した配列、ＣＤＲＬ２に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号５）の図３にＬ２として示した配列、ＣＤＲＬ３に対して、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号６）の図３にＬ３として示した配列を有するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら（上記参照）による定義）を含む軽鎖を含む、ＴＮＦαに特異性を有する抗体分子を提供する。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、軽鎖の可変領域にＬ１、Ｌ２及びＨ３（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号４から配列番号６）から選ばれた少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは、抗体分子は軽鎖の可変領域に少なくとも２つ、より好ましくは、３つのすべてのＣＤＲｓを含む。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を有する。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、可変領域が、ＣＤＲＨ１に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１）の図３にＨ１として示した配列、ＣＤＲＨ２に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号２又は配列番号７）の図３にＨ２’又はＨ２として示した配列、ＣＤＲＨ３に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号３）の図３にＨ３として示した配列を有するＣＤＲ（Ｋａｂａら（上記参照）による定義）を含む重鎖、及び可変領域が、ＣＤＲＬ１に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号４）の図３にＬ１として示した配列、ＣＤＲＬ２に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号５）の図３にＬ２として示した配列、又はＣＤＲＬ３に対して国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号６）の図３にＬ３として示した配列を有するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら（上記参照）による定義）を含む軽鎖を含む。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１及び３から７及び国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図３に示したＣＤＲｓはマウスモノクロナール抗体ｈＴＮＦ４０から誘導される。しかしながら、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号２はハイブリッドＣＤＲから構成される。ハイブリッドＣＤＲはマウスモノクロナール抗体ｈＴＮＦ４０（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号７）からの重鎖ＣＤＲ２の一部及びヒト群３の生殖細胞系Ｖ領域の配列からの重鎖ＣＤＲ２の一部を含む。

マウスモノクロナール抗体ｈＴＮＦ４０の可変領域の完全な配列を国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（軽鎖）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号９９）の図６及び国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（重鎖）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１００）の図７に示す。このマウスの抗体は「ドナー抗体」と云う。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の最初の別の態様は、それぞれ国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（軽鎖）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号９９）の図６及び国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５（重鎖）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１００）の図７に示した軽鎖と重鎖の可変領域配列を有するマウスモノクロナール抗体ｈＴＮＦ４０である。ｈＴＮＦ４０の軽鎖の不変領域はカッパであり、重鎖の不変領域はＩｇＧ２ａである。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の第二の別の態様は、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の第一又は第二の態様のいずれかによる抗体がマウス／ヒトのキメラ抗体分子であり、本明細書でキメラｈＴＮＦ４０抗体分子と云う。キメラ抗体分子はマウスモノクロナール抗体ｈＴＮＦ４０（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号９９及び１００）の可変領域とヒト不変領域を含む。好ましくは、キメラｈＴＮＦ４０抗体分子は軽鎖にヒトＣカッパ領域（Ｈｉｅｔｅｒら、Ｃｅｌｌ，２２，１９７−２０７，１９８０）を含み、重鎖にヒトガンマ４領域（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３００，７０９−７１３、１９８２）を含む。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の第三の別の態様は、抗体分子がＣＤＲグラフト抗体分子である。用語「ＣＤＲグラフト抗体分子」は、本明細書に使用されているように、軽鎖及び／又は重鎖が、アクセプター（例えばヒト抗体）の軽鎖及び／又は重鎖の可変領域のフレームワークにグラフトされた１つ又はそれ以上のドナー抗体からのＣＤＲｓ（望むならばハイブリッドＣＤＲを含む）を含む抗体分子を意味する。

好ましくは、そのようなＣＤＲグラフト抗体は、ヒトのアクセプターフレームワーク領域を含む可変領域及び１つ又はそれ以上の上記のドナーのＣＤＲｓを含む。

ＣＤＲｓがグラフトされる時、ＣＤＲｓが、それから誘導されるドナー抗体のクラス／型に関して、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域を有する、すべての適切なアクセプターの可変領域のフレームワーク配列を用いてよい。国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のヒトのフレームワークの例はＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら（上記参照））である。例えば、ＫＯＬとＮＥＷＭは重鎖に使用でき、ＲＥＩは軽鎖に使用でき、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖両方に使用できる。軽鎖に対する好適なフレームワーク領域は図１（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号８３、８５、８７及び８９）に示すヒト群１のフレームワーク領域である。重鎖に対する好適なフレームワーク領域は図２（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号９１、９３、９５及び配列番号１０６、１０７、１０８及び１０９）に示す、ヒト群１及び３のフレームワーク領域である。

また、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のＣＤＲグラフト抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体の鎖と相同性の鎖を有する抗体を使用するのが好適である。アクセプターの重鎖及び軽鎖は同じ抗体から誘導される必要はなく、所望であれば、異なった鎖から誘導されるフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のＣＤＲグラフト抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のそれらと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、普通でない残基はそのアクセプター鎖のクラス又は型に対してより頻繁に生じる残基に変えてよい。代わりに、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基はドナー抗体中の同じ位置に見られる残基に対応するように、変えてよい。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最低限に留めるべきである。変更が必要な可能性があるアクセプターフレームワーク領域における、残基の選択のためのプロトコールは、国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７に規定されている。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のＣＤＲグラフト抗体分子中で、アクセプター重鎖がヒト群１のフレームワーク領域（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図２に示す）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号９１、９３、９５及び９７）を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は１つ又はそれ以上のドナーＣＤＲｓに加えて、位置２８、６９及び７１でドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上記参照）による）。

代わりに、アクセプター重鎖が群１のフレームワーク領域を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は１つ又はそれ以上のドナーＣＤＲｓに加えて、位置２８、３８、４６、６７、６９及び７１にドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上記参照）による）。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のＣＤＲグラフト抗体分子中で、アクセプター重鎖がヒト群３のフレームワーク領域（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図２に示す）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１０６、１０７、１０８及び１０９）を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は１つ又はそれ以上のドナーＣＤＲｓに加えて、位置２７、２８、３０、４８、４９、６９、７１、７３、７６及び７８にドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上記参照）による）。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５のＣＤＲグラフト抗体分子中で、アクセプター軽鎖がヒト群１のフレームワーク領域（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図１に示す）（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号８３、８５、８７及び８９）を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は位置４６と６０にドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上記参照）による）。

ドナー残基はドナー抗体、即ちＣＤＲｓがそれから始めに誘導された抗体である。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂又はＦｖ断片のようなその断片、軽鎖及び重鎖のモノマー又はダイマー、例えば重鎖及び軽鎖の可変領域がペプチドリンカーで結合されている単鎖Ｆｖのような単鎖抗体を含む。同様に、重鎖及び軽鎖の可変領域は適宜他の抗体領域と結合してよい。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子はＦａｂ断片である。好ましくは、Ｆａｂ断片は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１１で示される重鎖及び国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１３で示される軽鎖を有する。国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１１と配列番号１１３で示されるアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれ国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１０と配列番号１１２で示されるヌクレオチド配列でコード化される。

代わりに、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、その修飾が重鎖のＣ末端に、１つ又はそれ以上のアミノ酸を付加することにより、エフェクター又はリポータ分子の付着を可能にする修飾されたＦａｂ断片であることが好適である。追加のアミノ酸は、それにエフェクター又はリポータ分子が付着できる１つ又は２つのシステイン残基を含む修飾された蝶番領域を形成する。そのようなＦａｂ断片は、好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１５で示される配列を有する重鎖及び国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１３で示される配列を有する軽鎖を有する。国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１５で示されるアミノ酸配列は、好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１４で示されるヌクレオチド配列によってコード化される。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の好適なエフェクター群はポリマー分子であり、それはインビボでの半減期を増加するために修飾したＦａｂ断片に付着してよい。

ポリマー分子は一般に、合成又は天然のポリマー、例えばオプションで置換された直鎖又は分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、又は、例えばホモ又はヘテロポリサッカライドのような分枝鎖又は非分枝鎖のポリサッカライドであってよい。

オプションで上記合成ポリマー上に存在してよい、特別な置換基には、１つ又はそれ以上のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特別な例には、オプションで置換された直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特にオプションで置換された、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体のようなポリ（エチレングリコール）である。特別な天然由来のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が含まれる。本明細書で使われているように、「誘導体」は例えば、マレイミド類及び類似物のようなチオール選択性反応基のような反応性誘導体を含むことを意図している。反応基はポリマーに直接又はリンカー部分を介して結合してよい。そのような群の残基は、ある実施例では、抗体断片とポリマー間の結合基として、製品の一部を形成する。

ポリマーの大きさは所望によって変え得るが、一般的に平均分子量は５００Ｄａから５００００Ｄａの範囲であり、好ましくは、５０００から４００００Ｄａ、より好ましくは、１５０００から４００００Ｄａの範囲である。ポリマーの大きさは、特にその製品の意図されている用途に基づいて選択される。従って、例えば、製品が循環を離れて組織に浸透する場合、例えば腫瘍の治療に用いる場合は、例えば、約５０００Ｄａの小さな分子量のポリマーを使用するのが有利である。製品が循環に留まるような用途の場合は、例えば、１５０００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量を使うのが有利である。

特に好適なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）又は、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及び特に約１５０００Ｄａから４００００Ｄａの分子量範囲のポリアルキレンポリマーが含まれる。

修飾抗体断片に付着した各ポリマー分子は、断片中のシステイン残基の硫黄原子に共有結合してよい。共有結合は一般にジスルフィド結合又は特に硫黄−炭素結合である。

所望の場合は、抗体断片はそれに付着した１つ又はそれ以上のエフェクター又はレポーター分子を有してよい。エフェクター又はレポーター分子は、例えばすべての遊離のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基又は５カルボキシ基のような断片中に位置する利用できるアミノ酸側鎖又はアミノ酸機能性基を介して抗体断片に付着してよい。

上記の様に、ポリマー修飾抗体断片の調製において、出発物質として活性化ポリマーを使用してよい。活性化ポリマーは例えばインドアセタミドの様なα−ハロカルボン酸、例えばマレイミドのようなイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドのようなチオール反応性基を含むすべてのポリマーであってよい。そのような出発物質は商業的に（例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）入手できるか、又は商業的に入手できる物質から従来の化学的手順を用いて調製できる。

付着しているポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関しては、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，“Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ． Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ． Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ ａｎｄ “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

エフェクター又はレポーター分子と結合した抗体断片を得ることを望む場合は、抗体断片が、活性化ポリマーとの反応前又は反応後に、エフェクター又はレポーター分子と直接又はカプリング剤を介して結合される標準的な化学手順又は組換えＤＮＡ手順によって適宜調製してよい。特別な化学手順には、例えば国際公開番号ＷＯ９３／６２３３１、国際公開番号ＷＯ９２／２２５８３、国際公開番号ＷＯ９０／００１９５及び国際公開番号ＷＯ８９／０１４７６に記載されたものが含まれる。代わりに、エフェクター又はレポーター分子がタンパク質又はポリペプチドの場合は、結合は、例えば国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ−Ａ ３９２ ７４５に記載されている組換えＤＮＡ手順を用いて達成してよい。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の修飾Ｆａｂ断片は、ＥＰ−Ａ９４８５４４に記載の方法に従ってＰＥＧ化（即ち共有結合でそれに付着したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する）される。好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図１３に示したように、ＰＥＧ化した修飾Ｆａｂ断片である。国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図１３に示したように、修飾Ｆａｂ断片は、修飾した蝶番領域中の単一のチオール基に共有結合で結合したマレイミド基を有する。リジン残基がマレイミド基に共有結合で結合している。リジン残基上のアミン基のそれぞれに分子量が約２０，０００Ｄａのメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付着している。従って、エフェクター分子全体の全分子量は約４０，０００Ｄａである。これらのリジンが結合したＰＥＧｓは米国特許第６，１１３，９０６号、米国特許第５，９１９，４５５号、米国特許第５，６４３，５７５号及び米国特許第５，９３２，４６２号に開示されているように、「分枝ＰＥＧ」又は「Ｕ−ＰＥＧ」と云われる。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図１３に示した化合物において、抗体部分の重鎖は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１５として示されている配列を有し、軽鎖は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１３として示されている配列を有する。この化合物は国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の中で、ＣＤＰ８７０と云われている。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子に不変領域がある場合は、提案された抗体分子の機能、特に要求されるエフェクター機能に関連して選択してよい。例えば、不変領域はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ領域であってよい。特にヒトのＩｇＧ不変領域を使用してよく、抗体分子が治療用に意図され、抗体エフェクター機能が要求される場合は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソタイプを使用する。代わりに、抗体分子が治療目的に意図され、抗体エフェクター機能が要求されない場合、例えば単にＴＮＦα活性を遮断するような場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してよい。

また、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、それに付着したエフェクター又はレポーター分子を有してよい。例えば、重金属原子をキレートするためのマクロサイクル(ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ)又は、それに共有結合によって付着したリシンのようなトキシンを有してよい。代わりに、完全な免疫グロブリン分子のＦｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３及び蝶番領域）、ＣＨ２とＣＨ３領域、又はＣＨ３領域が、酵素又はトキシン分子のような、機能性非免疫グロブリンタンパク質で置換され、又はペプチド結合で、酵素又はトキシン分子のような、機能性非免疫グロブリン分子に結合した抗体分子を作るために、組換えＤＮＡ技術の手順を用いてよい。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、好ましくは、少なくとも０．８５ｘ１０⁻¹⁰Ｍ、より好ましくは、少なくとも０．７５ｘ１０⁻¹⁰Ｍ、最も好ましくは、少なくとも０．５ｘ１０⁻¹⁰Ｍ（下記のように、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の好適なヒト化抗体は少なくとも０．５ｘ１０⁻¹⁰Ｍの親和性を有し、これは、それが由来するネズミのモノクロナール抗体の親和性よりもよいことに留意することは有意義である。）ネズミの抗体の親和性は約０．８５ｘ１０⁻¹⁰Ｍである。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子は、軽鎖の可変領域ｈＴＮＦ４０−ｇｈ３ｈ（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号８）及び重鎖の可変領域ｇｈ３ｈＴＮＦ４０．４（国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の配列番号１１）を含む。これら軽鎖及び重鎖の可変領域の配列をそれぞれ国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の図８と１１に示す。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はまた、ＴＮＦαへの親和性が改善された抗体分子の変種にも関する。そのような変種はＣＤＲｓの変異(ＹａｎｇらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５)、チェインシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉのミューテ−ター（ｍｕｔａｔｏｒ）菌株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８，７２４‐７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）及び性別（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む多くの親和性変異プロトコールで得られる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記参照）は親和性成熟のこれらの方法について考察している。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はまた、抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖をコード化しているＤＮＡ配列を提供する。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はまた、１つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。好ましくは、クローニング又は発現ベクターは、抗体分子の軽鎖及び重鎖をコード化している２つのＤＮＡを含む。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はまた、抗体分子をコード化しているＤＮＡ鎖の発現に用いられる宿主細胞／ベクター系にも関する。Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)₂断片、特にＦｖ断片、及び例えば単鎖Ｆｖｓのような単鎖抗体断片の発現に、例えばＥ．ｃｏｌｉのようなバクテリア及び他の微生物系を一部使用してよい。完全な抗体分子を含む、大きな抗体分子の生産に、例えば哺乳類のような真核宿主細胞発現系を用いてよい。適した哺乳類の宿主細胞にはＣＨＯ、メラノーマ又はハイブリドーマ細胞が含まれる。

国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５はまた、ベクターを含む宿主細胞を、抗体分子をコード化するＤＮＡからタンパク質の発現に導くのに適した条件下で培養すること、及び抗体分子を単離することを含む抗体分子の生産方法を提供する。

好ましくは、国際公開番号ＷＯ０１／９４５８５の抗体分子の生産方法はＤＮＡ配列を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉを、ＤＮＡ配列からタンパク質の発現に導くのに適した条件下で培養すること、及び抗体分子を単離することを含む。抗体分子は細胞から分泌され、又は適したシグナル配列によってペリプラズムに標的化されてよい。代わりに、抗体分子は細胞の細胞質に蓄積してよい。好ましくは、抗体分子はペリプラズムに標的化されてよい。生産されている抗体分子と使用される方法によって、抗体分子が再び折りたたまれ、機能的な形状を採るようにすることが望ましい。抗体分子を再び折りたたむようにする手順は当業者には周知である。

抗体分子は単に重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを含んでよく、その場合、配列をコード化している重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを宿主細胞をトランスフェクトするために用いる必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む製品の生産のために、軽鎖のポリペプチドをコード化している第一のベクターと重鎖のポリペプチドをコード化している第二のベクターの２つのベクターで細胞系をトランスフェクトしてよい。代わりに、軽鎖と重鎖のポリペプチドをコード化している配列を含む単一のベクターを用いてよい。

本発明の好適な態様は、軽鎖のＣｙｓ２１４と重鎖のＣｙｓ２２７の間にジスルフィド結合を有するＣＤＰ８７０のジスルフィド異性体である。ＣＤＰ８７０の重鎖と軽鎖を連結する主な結合は軽鎖のＣｙｓ２１４と重鎖のＣｙｓ２２７の間に生じる。ＣＤＰ８７０中に予期しない位置のジスルフィド異性体が同定され、それは軽鎖のＣｙｓ２１４と重鎖のＣｙｓ２２７の間にジスルフィド結合を含む。

本発明の他の態様は、抗体と、抗体の少なくとも１つのジスルフィド異性体とを製剤学的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体との組み合わせで含む治療及び診断用組成物である。好ましくは、組成物はＣＤＰ８７０とＣＤＰ８７０の少なくとも１つのジスルフィド異性体を製剤学的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体との組み合わせで含む。好適な態様では、組成物は、軽鎖のＣｙｓ２１４と重鎖のＣｙｓ２２７の間にジスルフィド結合を含むＣＤＰ８７０ジスルフィド異性体を含む。組成物の好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の１％から６０％を含む。より好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の約１０％から２０％を含む。より好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の約２０％未満を含む。より好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の約１５％未満を含む。好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％を含む。より好適な態様では、ジスルフィド異性体は全体の抗体濃度の約１３％を含む。治療又は診断組成物は、例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮＹ又は抗ＬＰＳ抗体又はキサンチンのような非抗体成分のような他の抗体成分を含む他の活性成分を伴ってよい。

医薬組成物は、好ましくは、本発明の抗体の治療有効量を含むべきである。「治療有効量」と言う用語は、本明細書に用いられているように、標的疾患又は状態を治療し、軽減し、予防し、又は検出可能な治療又は予防効果を示すのに必要な治療剤の量を意味する。すべての抗体について、治療有効量は最初に、細胞培養アッセイ又はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類の動物モデルで推定できる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いてよい。そのような情報はヒトでの有用用量及び投与経路を決定するのに用いることができる。

ヒト対象についての正確な有効量は疾患の重症度、対象の一般的健康、年令、体重、性別、食事、投与時間と回数、併用薬、反応感受性及び治療への忍容性／応答に依存する。この量は日常的な検査で決定でき、医師の判断の範囲内である。一般に、有効用量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約１５ｍｇ／ｋｇである。下記の実施例に示すように、リウマチ患者の治療には、１．５から２０ｍｇ／ｋｇの用量が用いられている。

組成物は患者に単剤で投与してもよく、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて投与してよい。

本発明の抗体分子が投与される用量は、治療される状態の性質、ＴＮＦαがそこまで中和されるべき程度、又は望ましい濃度以上に上昇が期待される濃度の程度、及び抗体分子が予防的に用いられているか、既存の状態を治療するために用いられるかによる。

従って、例えば、製品が、関節リウマチのような慢性炎症疾患の治療又は予防に用いられる場合、本発明の抗体分子の適した用量は０．５と５０ｍｇ／ｋｇの間の範囲、より好ましくは、１と２０ｍｇ／ｋｇの間の範囲、最も好ましくは、約１５ｍｇ／ｋｇである。投与回数は抗体分子の半減期とその効果の持続による。

抗体分子の半減期が短い場合（例えば２から１０時間）は、１日当たり１回又はそれ以上投与する必要がある。代わりに、抗体分子の半減期が長い場合（例えば２から１５日）は、１日１回、１週間又は１月又は２月あたり１回投与するだけでよい。

医薬組成物は抗体の投与のために製剤学的に許容できる担体を含んでよい。担体は、それ自体、組成物を投与されている個体に有害な抗体の産生を誘導してはならないし、また毒性があってはならない。適した担体はタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカライド、ポリアクリル酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子のような、大きな代謝の遅い高分子であってよい。

製剤学的に許容できる塩、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸塩及び硫酸塩又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩のような有機酸の塩を用いることができる。

治療用の組成物中の製剤学的に許容できる担体は更に、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を含んでよい。そのような組成物中に、更に湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤のような助剤があってよい。そのような担体は患者の服用のために医薬組成物を錠剤、ピル、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液に製剤化することを可能にする。

投与のための好適な剤型は非経口投与、例えばボーラス注射又は連続注入のような、注射又は注入による投与に適した剤型を含む。製品が注射又は注入用の場合は、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液又はエマルジオンの剤型を採ってもよく、且つそれは懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤のような製剤用剤を含んでよい。代わりに、抗体分子は使用前に適切な滅菌液で再構成する乾燥剤型であってよい。

一度製剤化されると、本発明の組成物は直接対象に投与できる。対象は動物であることができる。しかしながら、組成物はヒトの対象への投与に適合することが好ましい。

本発明の医薬組成物は経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下、脳室内、経皮（国際公開番号ＷＯ０９８／２０７４３）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、経膣又は直腸経路を含むすべての経路で投与してよい。本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）を用いてよい。通常、治療組成物は液体溶液又は懸濁液のいづれかの注射剤として調製してよい。注射前の液体溶媒中の溶液又は懸濁液に適した固体の剤型も調製してよい。

組成物の直接のデリバリーは一般に皮下、腹腔内、筋肉内の注射によって達成されるか、又は組織の間質空間にデリバリーされる。組成物は病変に投与することもできる。投与は単回投与又は反復投与計画であってよい。

組成物の中の活性成分は抗体分子であることが評価されよう。従って、胃腸管内での分解に敏感であろう。従って、組成物が胃腸管を使う経路によって投与される場合は、組成物には、抗体を分解から保護するが、抗体が胃腸管から一旦吸収されたならば抗体を放出する薬剤が十分含まれる必要があろう。

製剤学的に許容できる担体の完全な考察はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）で得られる。

本発明はまた、ＴＮＦαが介在する疾患の治療に使用する本発明の抗体分子又は組成物を提供する。

本発明は更に、ＴＮＦαが介在する疾患の治療のための医薬品の製造における本発明の抗体分子又は組成物の使用を提供する。

本発明の抗体分子又は組成物はヒト又は動物の体内に存在する生物学的に活性なＴＮＦαの濃度を低減することが望まれるすべての治療に利用してよい。ＴＮＦαは体内を循環していてもよく、又は体内の特別な部位に望ましくない高濃度で存在してよい。

例えば、ＴＮＦαの濃度の上昇は急性及び慢性の免疫及び免疫調整障害、敗血症、エンドトキシン及び心血管ショックを含む感染、炎症性障害、神経変性疾患、悪性疾患アルコール誘発肝炎に関係する。ＴＮＦαの濃度の上昇に関連した多数の障害の詳細は米国特許第５，９１９，４５２号に規定されている。本発明の抗体分子又は組成物はＴＮＦαが介在する疾患の治療に利用してよい。本発明の抗体分子によって治療してよい特に関連した疾患には、敗血症、うっ血性心不全、敗血症及びエンドトキシンショック、悪液質、成人呼吸困難症候群、エイズ、アレルギー、乾癬、ＴＢ、炎症性骨障害、血液凝固障害、火傷、臓器又は組織移植後の拒絶反応、クローン病、甲状腺炎及びリウマチ性関節炎及び骨関節炎のような自己免疫疾患が含まれる。

更に、抗体分子又は組成物は新生物治療中のＴＮＦαの発生に関連した副作用の低減、抗リンパ球抗体の使用による移植片拒絶の治療又は予防に関連したショック関連の症状の排除又は低減、又は多臓器不全の治療に用いてよい。

本発明の抗体分子又は組成物は、好ましくは、リウマチ又は骨関節炎の治療に使用する。

本発明はまた、ＴＮＦαが介在する障害のある又は障害の危険性のあるヒト又は動物対象の治療法を提供し、その治療法は本発明の抗体分子又は組成物の有効量を対象に投与することを含む。

本発明の抗体分子又は組成物は、例えばインビボの診断及び上昇したＴＮＦαの濃度を含む疾患の状態のイメージングのような診断に用いてよい。

本発明の他の態様は、ジスルフィド異性体、メチオニル酸化、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、アスパラギンの脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）誤取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、延長（ｅｘｒｅｎｓｉｏｎ）又は組換えタンパク質中の他の通例のタンパク質分解又はタンパク質不純物を性質決定（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び定量するための分析法である。好ましくは、タンパク質は抗体である。より好ましくは、タンパク質はＴＮＦαに特異性を有する。より好ましくは、ＴＮＦαはＣＤＰ８７０である。

本発明はＰＥＧ抗体断片を分析特性化するために、ＰＥＧ抗体を例えばＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂又はＦｖ断片、軽鎖又は重鎖のモノマー又はダイマー、及びこの場合はＣＤＰ８７０である単鎖抗体（これらに限定されない）に消化する新しい手法である。ＰＥＧが明らかにプロテアーゼのタンパク質骨格への接近を妨げる事実によって、これらの化合物は通常のプロテアーゼで消化することは非常に困難である。これは、反応混合物中に正確な量の有機溶媒の効果の評価によって解決された。アセトニトリル及び他の溶媒が完全な消化を可能にするのに十分な３次元構造を修飾する能力があることが発見された。この発見に基づいて、ＣＤＰ８７０はＬｙｓ−Ｃを含む多数のプロテアーゼによって消化でき、切断されたタンパク質はＨＰＬＣ、質量分析及び他の手段で解析できた。この技術がＣＤＰ８７０に応用され、ジスルフィド異性体は、軽鎖のＣ末端システイン残基が重鎖のシステイン残基２２７に結合した物質を約１０−２０％含むことが見出された。

分析法には、組換えタンパク質を有機溶媒で前処理する段階、有機溶媒の存在下で前処理したタンパク質をプロテアーゼで消化する段階、及びプロテアーゼで消化した断片を分離する手段が含まれる。好ましくは、有機溶媒はアセトニトリルである。好ましくは、プロテアーゼはメチオニル残基とＬｙｓ−Ｃをジスルフィド異性体に酸化するためのトリプシンである。

好ましくは、分離の手段は逆相ＨＰＬＣである。分析法はジスルフィド異性体とメチオニル酸化の分析と定量に用いられたが、それはまた、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、アスパラギンの脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）、誤取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、延長（ｅｘｒｅｎｓｉｏｎ）又は他の通例の（ｃｏｍｍｏｎ）タンパク質分解又はタンパク質不純物の分析に用いることができた。

本開示に引用したすべての出版物、特許及び特許出願の完全な内容を、それぞれの出版物、特許及び特許出願が特別に、且つ個々に参考として組み入れを指示されているかのように、本明細書に組み入れてある。過去の発明は理解を明確にする目的で説明と実施例によって、いくらか詳細に記載してあるが、当業者には、本発明の教示に照らして、本発明の精神と範囲から外れることなく、変更及び修飾ができることは明白であろう。次の実施例は例示のためにのみ提供するもので、上に広義に記載した本発明の範囲を制限することを意図していない。

（実施例１）
ジスルフィド異性体を検出する方法
ストックタンパク質溶液は、５０ｍＭ酢酸塩、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５の緩衝液中で、ＣＤＰ８７０を２０ｍｇ／ｍＬ又はＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を１０ｍｇ／ｍＬに希釈して調製した。Ｌｙｓ−Ｃは１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中で１ｍｇ／ｍＬに調製されたものをＷａｋｏ（大阪、日本）から購入した。

アセトニトリルによる前処理
２０μＬの希釈試料を４０μＬのアセトニトリルと混合し、短時間攪拌し、５分間静置した。

Ｌｙｓ−Ｃの消化
１３０μＬの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を加え、混合し、ついで１０μＬのＬｙｓ−Ｃストック溶液と一緒にした。Ｌｙｓ−Ｃ消化混合物は３７°Ｃで約１２−１６時間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。

逆相ＨＰＬＣ
消化物はクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）せず、５０μＬを流速０．５ｍＬ／分を用いて直接ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ３００オングストローム、５μ、２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入した。検出波長は２１４ｎｍであった。可動相Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液、可動相Ｂは０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液であった。勾配（２成分系）は次の通りであった。

時間 可動相Ｂ
０分 ０％
３分 ６％
８分 １０％
９分 １１％
２１分 １５％
２１．１分 ９５％
２７分 ９５％
２７．１分 ０％

図５はＣＤＰ８７０のジスルフィド異性体Ｌｙｓ−Ｃのマップである。

（実施例２）
メチオニン酸化の検出法
ストックタンパク質溶液は５０ｍＬ酢酸塩、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５の緩衝液中で、ＣＤＰ８７０を２０ｍｇ／ｍＬ又はＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を１０ｍｇ／ｍＬに希釈して調製した。トリプシン溶液は５０ｍＬ酢酸緩衝液中のトリプシン濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）から購入した。

アセトニトリルによる前処理
２００μＬの希釈試料を２００μＬのアセトニトリルと混合し、短時間攪拌し、５分間静置した。

トリプシン消化
５００μＬの消化緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ８．５）を加え、混合し、ついで１００μＬトリプシンのストック溶液と一緒にした。トリプシン消化混合物を３７°Ｃで約１２−１６時間培養した。

逆相ＨＰＬＣ
消化物を１００μＬの１．０Ｎ ＨＣｌでクエンチし、流速０．５ｍＬ／分を用いて直接ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８（Ｂｏｄｍａｎ；Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）、３．５μ、４．６ｍｍ×１５ｃｍ）に注入した。検出波長は２１４ｎｍであった。可動相Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液、可動相Ｂは０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液であった。勾配（２成分系）は次の通りであった。

時間 可動相Ｂ
０分 １６％
１５分 ２５％ リニアー（Ｌｉｎｅａｒ）
２５分 ２７％ リニアー
５０分 ４２％ リニアー
５２分 ９０％ リニアー
６０分 ９０％ ホールド（Ｈｏｌｄ）
６３分 １６％ リニアー
７８分 １６％ ホールド

図４はＣＤＰ８７０のメチオニン酸化トリプシンのマップである。

（実施例３）
ＴＮＦアフィニティー法
ＴＮＦαアフィニティーカラムは、ヒト組換えＴＮＦα(Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＡ＊)を製品の指示書に従って、ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（商標）Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にカップリングして調製した。ＴＮＦαをカップリング緩衝液、０．６Ｍクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０に溶解した。１ｍＬのカラムを作るために、カップリング緩衝液中で、０．１２６ｇ（乾燥重量）のＵｌｔｒａＬｉｎｋ（商標）Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔを７５０μＬのＴＮＦαとインキュベートした。反応は混合下、室温で７２時間インキュベートした。ビーズを、エッペンドルフ５４１５マイクロチューブを用いて４℃で５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を傾寫し、樹脂を１０ｍＬのクエンチ緩衝液に再懸濁し、先述した緩やかな反転下、室温で、１５ｍＬのスクリュートップコニカル中で２．５時間インキュベートした。クエンチ緩衝液は３Ｍのエタノールアミン、ｐＨ９．０であった。クエンチング後、コニカルを１０分間遠心分離し（上記のように）、上清を傾寫し、樹脂を緩やかな反転下、室温で、２０分間、１０ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁した。洗浄したビーズを１０分間遠心分離し（上記のように）、上清を傾寫し、ビーズを１０ｍＬの１Ｍの塩化ナトリウム中に再懸濁し、緩やかな混合下、室温で２０分間インキュベートした。再度ビーズを遠心分離し、上清を傾寫し、ビーズを１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁した。これを２０分間混合し、この段階をもう一度繰り返した。ビーズをついで４ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁し、ＨＲ５／５カラムに注入した。得られた１ｍカラムを緩衝液Ａの５０カラム容量中で平衡化した。緩衝液Ａは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、ｐＨ７．４である。

カラムを平衡化し、負荷し、洗浄し、溶出し、ＵＶ９００、ｐＨ、温度、及び伝導度メーター及びＵｎｉｃｏｒｎ４．０操作システム及び分析ソフトウェアを装備したＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ Ａｉｒ上のライン（ｌｉｎｅ）において０．５ｍＬ／分で洗浄した。カラムを平衡化し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で洗浄した。カラムに緩衝液Ａで２ｍｇ／ｍｌに希釈したＣＤＰ８７０（３６４２６８０３、２００ｍｇ／ｍｌストック）を負荷し、０．５ｍｌ／回で注入した。カラムを１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３．４で定組成的に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）溶出した。カラムを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で洗浄した。負荷後、流れ通った分画（結合しない）及び溶出した（結合した）分画を集め、また溶出分画（結合した）を集めた。これらの２つの分画及びカラムフィード物質をＬｙｓＣ消化で分析し、質量分光測定を行った。ペプチドマップのプロフィルはすべての試料中で、異性体＃１に対応したペプチドの類似した量を示し、これは異性体＃１種は結合ＴＮＡαに関して未変化体（ｐａｒｅｎｔ）と異ならないことを示唆している。

Claims (10)

1. （ａ）ＰＥＧ化抗体断片を４０％と８０％の間の濃度のアセトニトリルで前処理する段階、
   （ｂ）当該前処理したＰＥＧ化抗体断片を２０％と５０％の間の濃度のアセトニトリルの存在下でＬｙｓ−Ｃ又はトリプシンにて消化する段階、及び
   （ｃ）プロテアーゼで消化した断片を分離する（ｒｅｓｏｌｖｅ）手段、
   を含む、抗体断片ジスルフィド異性体の性質決定と定量のための分析法。
2. 前処理段階（ａ）のアセトニトリル濃度が６７％である、請求項１記載の方法。
3. プロテアーゼ消化段階（ｂ）のアセトニトリル濃度が２０％である、請求項１記載の方法。
4. プロテアーゼ消化断片を分離する手段が逆相ＨＰＣＬである、請求項１記載の方法。
5. 抗体断片が、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂又はＦｖ断片；軽鎖又は重鎖のモノマー又はダイマー；及び単鎖抗体からなる群から選ばれる、請求項１、２、３、又は４に記載の方法。
6. 抗体断片がＦａｂである、請求項５記載の方法。
7. ＦａｂがＣＤ８７０である、請求項６記載の方法。
8. メチオニル酸化、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、アスパラギンの脱アミド化(ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ)、誤取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）から生じる組換えタンパク質中のＰＥＧ化抗体断片分解産物又はＰＥＧ化抗体断片不純物の性質決定又は定量のための分析法であって、
   （ａ）ＰＥＧ化抗体断片を４０％と８０％の間の濃度のアセトニトリルで前処理する段階、
   （ｂ）当該前処理したＰＥＧ化抗体断片を２０％と５０％の間の濃度のアセトニトリルの存在下でＬｙｓ−Ｃ又はトリプシンにて消化する段階、及び
   （ｃ）プロテアーゼで消化した断片を分離する手段、
   を含む、分析法。
   
9. 前処理段階（ａ）中のアセトニトリル濃度が５０％である、請求項８記載の方法。
10. プロテアーゼ消化段階（ｂ）中のアセトニトリル濃度が２０％である、請求項９記載の方法。
    

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