JP5372876B2 - 核酸分析デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸分析デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析方法に関する。

核酸分析方法として、ＤＮＡやＲＮＡを含む核酸試料の塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。

従来、通常用いられてきた電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。

近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法（パラレル解析法）が実現されている。この方法では、従来の電気泳動を利用した方法に比べて桁違いの配列をパラレルに処理できるため、ＤＮＡの配列決定の処理速度向上に貢献している。パラレル解析法の中で、試料のＤＮＡ断片を増幅せずに、１分子のまま配列決定を行う方法（１分子シーケンス法）が提案されている。

特許文献１では、１分子シーケンス法としてリアルタイム方式の配列決定方法の例が開示されている。この特許文献１には、次のような（１）〜（３）が開示されている。

（１）平滑基板の上に接着パッドを規則正しく、格子状に形成する。接着パッドと微粒子は、線状分子を介して化学結合により結ばれている。線状分子の末端の官能基と、接着パッドとは化学的相互作用により結合している。

（２）核酸を捕捉するプローブ分子には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基と同様に予め修飾しておき、微粒子と反応させておく。一つの微粒子に一分子のプローブ分子を固定するためには、微粒子の粒径が小さいほど好ましい。接着パッドの直径ｄが微粒子の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッドに１個の微粒子を固定できる。

（３）プローブ分子により特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。

以上のように、平滑基板上に、核酸試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。

特開２０１０−１７２２７１号公報

本願発明者がパラレル解析法の１分子シーケンス法において、配列決定可能な核酸試料の長さ（断片長）について鋭意検討した結果、次のような知見を得るに至った。

パラレル解析法の１分子シーケンス法のうち、特許文献１にて開示されているような、ＤＮＡ断片を基板に固定する方式では、蛍光色素１分子の発する微弱な蛍光を測定する必要がある。そのため、少しでも背景光信号を低減するために、これらの方法では、励起光照射方式としてエバネッセント光などの局所照明可能な方式を用いる。エバネッセント光によれば、励起光は平滑基板表面の１００〜２００ｎｍの狭い空間を局所的に照明できるため、周囲の物質に由来する背景光信号を抑えることができる。しかし、試料ＤＮＡ断片は基板上にその一端で固定されているため、他方の末端を含む他の部分は自由に動くことができる。そのため、試料ＤＮＡ断片が長くなると、ＤＮＡ断片の一部分がエバネッセント光で照明される空間から外れてしまう可能性がある。すると、その部分に取り込まれた蛍光色素付き塩基への励起光が弱くなり、発せられる蛍光測定のＳＮ比が低下してしまう。そのため、配列決定可能なＤＮＡ断片を長くできないという問題があった。

本発明の目的は、塩基配列を決定する装置において、より長い核酸試料の配列決定を可能実現することに関する。

本発明の核酸分析デバイスは、支持基体の表面には核酸試料を固定する複数の領域を有し、該領域の少なくとも一つには核酸試料が１分子固定されており、前記固定した核酸試料の伸長反応を行うことで配列決定を行う核酸分析デバイスにおいて、前記核酸試料１分子と支持基体との固定は２点以上でなされる。

本発明により、核酸試料と支持基体表面との距離を小さくすることが可能となり、支持基体近傍への局所照明中に核酸試料を留めることが可能となる。これによって、核酸合成酵素によって取り込まれた蛍光色素つき塩基を、常に十分な強度で励起することが可能となる。よって、より長い核酸試料の塩基配列を決定することが可能になる。

核酸分析装置の構成の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための図。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。

また、以下に示す図では、理解しやすくするために模式的な図を用いるため、寸法等において実際とは異なる場合がある。

基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ均等間隔で捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、取り込まれた蛍光標識を１分子ごと検出して塩基配列を決定する装置，方法について説明する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたｄＮＴＰ誘導体を蛍光検出等で検出する工程、及びｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。

蛍光色素１分子の発する微弱な蛍光を測定する必要がある。そのため、少しでも背景光信号を低減するために、これらの方法では、励起光照射方式としてエバネッセント光などの局所照明可能な方式を用いる。エバネッセント光によれば、励起光は平滑基板表面の１００〜２００ｎｍの狭い空間を局所的に照明できるため、周囲の物質に由来する背景光信号を抑えることができる。なお、本操作は単分子蛍光検出を行うため、測定はＨＥＰＡフィルタなどを介したクリーンルーム様の環境にて行うのが望ましい。

なお、ここでＤＮＡ断片や試料ＤＮＡという際のＤＮＡとは、ＤＮＡやＲＮＡ，ＰＮＡ（ペプチド核酸）およびこれらの誘導体を含んだ核酸の代表であり、ＤＮＡのみに限定されるものではない。同じく、塩基，蛍光付き塩基として、ｄＮＴＰ，ｄＮＴＰ誘導体を用いるが、ＮＴＰやＮＴＰ誘導体等を用いても同様の効果を得ることができる。

（装置構成）
図１は、本発明の核酸分析デバイスを使った核酸分析装置の構成図である。装置は顕微鏡に類似する装置の構成であり、基板８に捕捉する試料ＤＮＡの伸長反応を蛍光検出にて測定する。

核酸分析デバイスは、図２に示すような構造をしている。基板８は少なくともその一部が透明材質でできており、材質としては合成石英などが使用できる。基板８には反応領域８ａがあり、この部分は透明材質であり、この部分にＤＮＡ伸長反応に必要な試薬などが接触する。

反応領域８ａ内にＤＮＡが固定される領域８ｉｊが１つ以上形成されている。領域８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下が好ましい。この領域にはＤＮＡを２箇所以上で捕捉するための表面処理を施す。その表面処理と捕捉するＤＮＡ断片の修飾３０３として、適切な組み合わせを選ぶことで、ＤＮＡ断片を領域８ｉｊに捕捉することができる。また、ＤＮＡ断片を固定化する際、ＤＮＡ断片濃度を適当に制御することで、個々の領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡのみが入るようにすることができる。なお、領域８ｉｊをより小さくしていくことで、領域内に捕捉できる分子が１個になるようにすることができる。

以後このような状態の基板を計測する。このような基板では、すべての領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡが捕捉されている場合、領域８ｉｊの一部のみＤＮＡが捕捉されている場合がある。一部のみＤＮＡが捕捉されている場合は、残りの領域８ｉｊには捕捉されておらず、空きの状態となる。領域８ｉｊはこのように、格子構造（２次元の格子構造）を形成し、その格子点の位置に領域８ｉｊが配置される。

領域８ｉｊの表面処理としては、特異的な相互作用を示すタンパク質，反応性の官能基，核酸分子，金属などを用いることができる。より具体的には、特異的な相互作用を示すタンパク質としては、アビジン，ストレプトアビジン，ニュートラアビジンなどのビオチン結合性タンパク質や、抗体、１本鎖結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質等を用いてよい。反応性の官能基としては、チオール基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。核酸分子としては、ＤＮＡ，ＲＮＡやその誘導体のほか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を用いてよい。また、金属として、金，銀，アルミ，クロム，チタン，タングステン，白金，ニッケルを用いてよい。

表面処理の方式としては、基板との共有結合により結ばれていてもよい。共有結合を用いることで、核酸試料を強固に固定できるため分析過程での核酸試料の解離を避けられるため好ましい。また、化学的または物理的な吸着により基板に固定されていてもよい。また、基板表面を直接改質するのでもよい。例えば、基板として合成石英を用いた際には、アミノシランで処理することでアミノ基の表面処理を導入することができるし、石英に吸着する性質を持つＢＳＡ（牛血清アルブミン）にビオチンを導入した、ＢＳＡ−ビオチンを石英表面に吸着させたものでも良い。また、両者を組み合わせて、石英表面に吸着したＢＳＡ−ビオチンの上に、アビジンを介して、ビオチン化ＤＮＡ結合タンパク質を固定することもできる。

捕捉するＤＮＡ断片３０１の修飾３０３としては、ビオチン，抗原，チオール基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基，金などの金属微粒子等を用いることができる。

また、領域８ｉｊの表面処理として核酸分子やＤＮＡ結合タンパク質を用いる際には、ＤＮＡ断片と直接ハイブリダイゼーションすることにより捕捉できるため、核酸分子やＤＮＡ結合タンパク質が結合するＤＮＡ配列そのものが修飾３０３となる。例えば、表面処理としてポリＴ配列を持つ核酸分子をプローブＤＮＡとして領域８ｉｊに固定しておくことで、一端をポリＡ化処理したＤＮＡ断片、または元々３′末端付近にポリＡ配列を有するｍＲＮＡ分子を捕捉することができる。このように、試料ＤＮＡに新たに加えた配列や元々持っていた配列を修飾３０３として用いることができる。

さらに、例えばヒストンのように結合するＤＮＡ配列の選択性が低いＤＮＡ結合タンパク質を表面処理として用いる場合は、ＤＮＡ断片３０１全体が修飾３０３として機能することとなる。

捕捉するＤＮＡ断片３０１中の修飾３０３の位置としては、とくに限定は無いものの、５′末端，３′末端、またはそれらの近傍が好ましい。これらの位置でＤＮＡ断片を捕捉することで、ＤＮＡ断片の配列決定できる領域を広く取ることができる。

１つの捕捉するＤＮＡ断片３０１の中の２つ以上の位置に２つの修飾３０３，３０２を導入することで、ＤＮＡ断片を２点以上で基板上に捕捉することができる。例えば、ＤＮＡ断片の５′末端と３′末端を共にビオチン化しておき、領域８ｉｊにストレプトアビジンを結合させておくことで、ＤＮＡ断片の５′末端と３′末端の２点で基板に捕捉できる。これによって、１点で捕捉されていた時に比べて、ＤＮＡ断片、特にＤＮＡ断片中の捕捉されていた点から最も遠い部位が、基板８の表面から近い空間に位置することとなる。

一般に試料ＤＮＡ断片が基板上にその一端で捕捉されている場合、他方の末端を含む他の部分は自由に動くことができる。そのため、試料ＤＮＡ断片が長くなると、時としてＤＮＡ断片の一部分がエバネッセント光で照明される空間から外れてしまう。すると、その部分に取り込まれた蛍光色素付き塩基への励起光が弱くなり、発せられる蛍光測定のＳＮ比が低下してしまう。しかし、前記のようにＤＮＡ断片を２点で基板に捕捉することで、ＤＮＡ断片の蛍光測定が行われている部位がエバネッセント光の範囲から外れることを防ぐことができる。

これによって、ＤＮＡ断片が長くなった際にＳＮ比が低下することを防止できる。そのため、より長いＤＮＡ断片の配列決定が可能となる。

なお、ＤＮＡ断片３０１の固定に用いる領域８ｉｊの表面処理が、ＤＮＡ断片３０１とハイブリダイゼーションする核酸分子を固定したもので、かつＤＮＡ伸長反応のプライマーを兼ねる場合には、伸長反応は５′末端から３′末端方向へ進むため、５′末端で該核酸分子を基板に固定することが好ましい。または、該核酸分子の少なくとも３′末端がフリーである必要がある。

また、３点以上の位置でＤＮＡ断片３０１を捕捉することで、ＤＮＡ断片を基板表面に留める効果をさらに高めることができる。これは例えば、ゲノム中の繰り返し配列など、長いＤＮＡ断片中に複数回出現する配列を修飾３０３とし、これと相補的な配列を持つＤＮＡ断片を表面処理しておくことで、３点以上での捕捉が可能となる。また、一本鎖結合タンパク質を表面処理として用いて、ＤＮＡ断片全体を捕捉対象とする場合も同じ効果を得ることができる。

また、図３（ａ）のように、２つ目以降の修飾３０２を捕捉できるような異なる表面処理を施した領域３０４を領域８ｉｊと隣接または分離された別の領域として設けても良い。また、このような領域３０４は、反応領域８ａの領域８ｉｊ以外の部分のうち、図３（ｄ）のようにその全体でも良く、図３（ｅ）のように一部分でも良い。この場合、領域８ｉｊの面積を小さく保ったまま、２箇所の修飾３０３，３０２が捕捉される位置の距離を長くすることができる。領域８ｉｊの面積を小さくすることで、領域８ｉｊにＤＮＡ断片３０１が１分子のみ捕捉される確率を高められる。領域３０４と領域８ｉｊの距離に制限は無いが、好ましくは、捕捉するＤＮＡ断片３０１の平均的な長さ、または領域８ｉｊ同士の間隔の寸法ｄｘ，ｄｙよりは短い。

また、図３（ｂ）のように、領域８ｉｊの中に、異なる２種表面処理を混在させることで、ＤＮＡ断片３０１の２種の修飾３０２，３０３を、共に領域８ｉｊに捕捉しても良い。このような表面処理は、例えば、配列の異なる２種のプローブＤＮＡを混合して固定することで実現できる。

このような、領域８ｉｊを均等間隔に設けた基板の作成法は、例えば、特開２００２−２１４１４２号公報に記載の手法などで、作成する。なお、ｄｘ，ｄｙは領域８ｉｊの個々の大きさより大きく、０.２〜１０マイクロメータ以下、さらには０.５〜６マイクロメータ程度が好ましい。

格子点位置の領域（スポット，格子点の領域）の大きさは１００ｎｍ径以下が好ましい。少なくとも、隣接する最短の格子点の間隔の１／３以下が好ましい。これにより、光学的に解像しやすくなり、識別が容易になる。なお、格子構造は正方格子構造，長方格子構造，三角格子構造などにしてもよい。基板の反応領域８ａは１mm×１mmの大きさとする。反応領域８ａの大きさは、それより大きくても可であるし、０.５mm×０.５mmの大きさのものを一定間隔で、１次元または２次元に複数個並べたようなものでもよいし、長方形，丸型，三角形，六角形の形状などでもよい。以下では、これらの可能性のうち、ｄｘ，ｄｙを２マイクロメートルとした場合について説明する。

なお、図３（ｃ）のように、領域８ｉｊには接着用パッド３０６を配置してもよい。接着用パッド３０６は前記の表面修飾を施せる材料であればよく、例えば金属構造体を用いることができる。金属構造体は半導体プロセスにて作成することもできる。電子線描画，光リソグラフィー，ドライエッチング，ウェットエッチングなどの手法にて作製できる。金属構造体は、金，銀，アルミ，クロム，チタン，タングステン，白金，ニッケル等で、励起光の波長以下の大きさを有する形状であり、直方体，円錐，円柱，三角柱，一部が突起状のものを有する構造、あるいは、これらを２個または複数個近接して並べた構造など、また金属微粒子なども使用可能である。たとえば、直径１０ｎｍから１００ｎｍ程度の大きさの金の膜状のドットを上記ｄｘ，ｄｙの間隔、たとえば、１×１，１×２，１×３，２×３，２×４，３×５，３×６（マイクロメータ×マイクロメータ）などの間隔の格子上に構築できる。

２つ目以降の修飾３０２を捕捉できるような異なる表面処理を施した領域３０４を領域８ｉｊとは別に設けるには、図３（ｅ）のように反応領域８ａの領域８ｉｊ以外の部分の一部分を領域３０４とする場合、例えば前記の半導体プロセスを２回繰り返すことで作製できる。

また、反応領域８ａのうち領域８ｉｊ以外の全面を領域３０４とする場合、例えば、基板８として合成石英を用い、領域８ｉｊとして、金の接着用パッド３０６を配置する。反応領域８ａの石英にアミノシランを反応させることでアミノ基を導入した後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させる。これによって、領域８ｉｊの表面処理として金、反応領域８ａ全面の表面処理としてビオチンを有する基板を作製できる。

図３（ｆ）のように、領域８ｉｊの上に、表面処理を施した微粒子３０５を固定しても良い。この場合の領域８ｉｊも、前述の接着用パッド３０６を配置してよい。微粒子としては、例えば表面にストレプトアビジンを固定したポリスチレンビーズを用いることができる。この場合、接着用パッド３０６の直径を微粒子の直径以下にすることで、１分子固定を容易にすることができる。例えば、前記の直径２０ｎｍ程度のドットに、大きさ２０ｎｍ程度の蛋白や蛍光物質，リンカーをその上部に捕捉すれば、確率的にその大きさからドットあたり１分子を捕捉し、格子状に単一分子を配置することが可能になる。また、周知の手法でドットに選択的なリンカーを結合させ、それにオリゴヌクレオチド，たんぱく質などを捕捉することで、ドットに目的の分子を捕捉することが可能であり、これを使うことができる。

基板８上に金属構造物を形成している場合、構造物の光ルミネセンス，光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用でき、効果的である。

ｄＮＴＰの蛍光標識として種々の蛍光体を使うことができる。たとえば、Bodipy−ＦＬ−５１０，Ｒ６Ｇ，ＲＯＸ，Bodipy−６５０を使用し、これらそれぞれ異なる４種の蛍光体で標識された３′末端がアリル基で修飾された４種のｄＮＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＧＴＰ−ＰＣ−Bodipy−ＦＬ−５１０，３′−Ｏ−allyl−ｄＴＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ，３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−ＲＯＸ，３′−Ｏ−allyl−ｄＣＴＰ−ＰＣ−Bodipy−６５０）を使用する。これ以外の蛍光体で修飾したｄＮＴＰを使用することもできる。

蛍光励起用のレーザ光源１０１ａ（Ａｒレーザ、４８８ｎｍ：Bodipy−ＦＬ−５１０，Ｒ６Ｇ励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ａを通して円偏光とする。蛍光励起用のレーザ光源１０１ｂ（Ｈｅ−Ｎｅレーザ，５９４.１ｎｍ：ＲＯＸ，Bodipy−６５０励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ｂを通して円偏光とする。両レーザ光をミラー１０４ｂとダイクロイックミラー１０４ａ（５２０ｎｍ以下を反射）で重ね合わせ、ミラー５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、ＤＮＡ分子を捕捉する基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８はマッチングオイル（無蛍光グリセリン等）を介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板８表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント照明となる。エバネッセント照明は基板８表面のごく近傍（励起光波長程度の距離）のみを照明し、基板からの距離に対して指数関数的にその強度が減少する。これにより、背景光の影響を抑え、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。

なお、基板の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明，ＬＥＤ照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。

また、レーザ光源１０１ａ，１０１ｂとは別にレーザ装置１００（ＹＡＧレーザ、３５５ｎｍ）を配置し、ダイクロイックミラー１０３（４００ｎｍ以下を反射）でレーザ光源１０１ａ，１０１ｂのレーザ光と重ね合わせ同軸にして照射できるようにする。本レーザは、取り込まれたｄＮＴＰ誘導体の蛍光検出後、ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程に使用するものである。

基板８の上部には、試薬などを流し、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。チャンバには導入口１２があり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５，試薬保管ユニット２７，チップボックス２８により、目的の試薬液の注入などを行う。試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ，ｄＮＴＰ誘導体溶液容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ（２７ｃ，２７ｄ，２７ｅは予備）及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、チャンバ導入口から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ＰＣ２１により自動的に行われる。

フローチャンバは、蛍光検出を行うため、光軸方向に透明な材料で形成される。蛍光１３は、自動ピントあわせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、不必要な波長の光を除去するフィルタユニット１５を透過する蛍光はダイクロイックミラー３２により、波長ごとに異なる比率で分割された光束に分離される。分離された光束をそれぞれ、補助フィルタ１７ａ，１７ｂを通し、その像を結像レンズ１８ａ，１８ｂで、ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に結像させ、検出する。カメラの露光時間の設定，蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０ａ，２０ｂを介して制御ＰＣ２１が行う。なお、フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のノッチフィルタ２種（４８８ｎｍ，５９４.１ｎｍ）、検出する波長帯を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５１０−７００ｎｍ）を組み合わせて用いる。

なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。

図２にあるように、基板８には位置きめマーカ３０，３１が刻印されている。位置きめマーカ３０，３１は領域８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカを検出することで、領域８ｉｊの位置を計算することができる。

ＣＭＯＳカメラ等の２次元センサカメラ一般を使ってよい。本実施例で使用は、ＣＣＤエリアセンサを使用するが、２次元センサカメラを使うことができる。種々の画素サイズ，画素数のＣＣＤエリアセンサを使うことができる。たとえば、画素サイズが７.４×７.４マイクロメータで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、ＣＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型，正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。

反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出してもいいし、分割することもできる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ−Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動，光照射，蛍光像検出を制御する。本例ではＸ−Ｙ移動機構部は図示していない。

（核酸試料の捕捉工程）
まず、核酸試料の調製方法を述べる。ゲノムＤＮＡを周知の方法で断片化する。両末端にアダプターＤＮＡをライゲーションする。アダプターＤＮＡは、２本のオリゴＤＮＡをハイブリダイゼーションしたものを用いる。２本のオリゴＤＮＡは互いに相補的な配列を持ち、一方は５′末端、他方は３′末端をビオチン化してある。アダプターＤＮＡをライゲーションした断片化ゲノムＤＮＡを熱変性させ、１本鎖に解離させる。これによって、両末端をビオチン化した１本鎖ＤＮＡからなる核酸試料を作ることができる。同様に、２本のオリゴＤＮＡの一方を３′チオール修飾、もう一方を５′アミノ基修飾等とすることで、両末端に異なる修飾を持つ核酸試料を調製できる。

核酸分析デバイスの領域８ｉｊには、前記の方法により金属構造体にビオチンを導入したものを配置してある。ストレプトアビジンを加えたバッファを導入口１２よりチャンバに導入し、ストレプトアビジンを金属構造体に捕捉されているビオチンに結合させ、ビオチン−アビジン複合体を形成させる。これにより、核酸試料の両末端を基板８に固定できる。核酸試料であるビオチン修飾一本鎖鋳型ＤＮＡにプライマをハイブリさせ、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体と大過剰のビオチンを加えたバッファをチャンバへ導入し、ビオチン−アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を格子点に配置された金属構造体に捕捉する。捕捉反応後に、余剰な鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体およびビオチンを洗浄用バッファにてチャンバより洗い流す。

（反応の工程）
段階的伸長反応の工程を以下に示す。反応工程はProc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100, pp3960, 2003、およびProc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.102, pp5932, 2005を参考に行った。

それぞれ異なる４種の蛍光体で標識された３′末端がアリル基で修飾された４種のｄＮＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＧＴＰ−ＰＣ−Bodipy−ＦＬ−５１０，３′−Ｏ−allyl−ｄＴＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ，３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−ＲＯＸ，３′−Ｏ−allyl−ｄＣＴＰ−ＰＣ−Bodipy−６５０）およびThermo Sequenaseポリメラーゼを加えたThermo Sequenase Reactionバッファを導入口１２よりチャンバへ導入し、伸長反応を行う。鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰは、３′末端はアリル基で修飾されているため、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に１塩基以上取り込まれることはない。伸長反応後、未反応の各種ｄＮＴＰおよびポリメラーゼを洗浄用バッファで洗い流し、Ａｒレーザ光源１０１ａ，Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源１０１ｂのそれぞれの光源から発振するレーザ光を同時にチップに照射する。レーザ照射により鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を励起し、そこから発する蛍光を検出する。鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体の蛍光波長を特定することにより、前記ｄＮＴＰの塩基種を特定できる。なお、エバネッセント照射であり、反応領域表面近傍のみが励起光照射領域となるため、前記表面以外の領域に存在する蛍光体を励起することは無く、背景光の少ない測定ができる。そのため、上記では、伸長反応後洗浄しているが、蛍光標識ｄＮＴＰ濃度が小さい場合、洗浄不要で測定が可能になる場合もある。すなわち、リアルタイム方式による塩基配列の決定が可能となる。

次に、ＹＡＧレーザ光源１００より発振するレーザ光をチップへ照射し、前記複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を光切断により取除く。次いで、パラジウムを含んだ溶液を流路内に導入し、パラジウム触媒反応により、前記複合体に取り込まれたｄＮＴＰの３′末端のアリル基を水酸基に変える。前記３′末端のアリル基を水酸基に変えることにより、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体の伸長反応が再開可能となる。前記触媒反応後に、洗浄用バッファにてチャンバを洗浄する。これを繰り返すことにより、捕捉された一本鎖鋳型ＤＮＡの配列を決定する。

本システムでは、反応領域８ａの複数の領域８ｉｊからの発光を同時計測できるため、領域８ｉｊにそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを捕捉する場合、前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。すなわち、パラレル解析方式による塩基配列の決定が可能となる。

（蛍光検出と蛍光体識別）
基板上に捕捉された上記蛍光体の蛍光を検出して蛍光体の種類つまりは塩基の種類を識別して強度を測定する方式について説明する。

図１では、ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂへの結像倍率を１４.８倍とし、ＤＮＡが捕捉されるべき複数の領域８ｉｊ（格子点）を蛍光計測する。この場合、ｄｘ＝２マイクロメータの距離を４分割してＣＣＤ画素で検出する。波長ごとに異なる比率で分割するダイクロイックミラーを使用し、ひとつの輝点の蛍光強度を分割し、それらを異なる画素にて検出することで、４種の蛍光体を識別し、蛍光検出することができる。制御ＰＣ２１では、各ＣＣＤカメラの画像から、領域８ｉｊからの蛍光輝点を抽出し、その強度の比を算定し、蛍光輝点がどの蛍光体の蛍光なのかを判定することで、塩基の種類が識別でき、配列解析ができる。

なお、使用できる蛍光体は本実施例に示すものに限らず、所定の励起光をつかい、異なる蛍光特性を有する蛍光体の組み合わせであれば同様に使用できる。一般には、蛍光極大波長が各々異なる種類の組み合わせであればよい。

本例では、ダイクロイックミラー３２として、指定の波長範囲において、透過率が、実質的にほぼ０からほぼ１００％までのほぼ線形的な特性を有する２色性ミラーを使用するが、ほぼ１０からほぼ８０％までのほぼ線形的な特性であってもよい。また使用する複数の蛍光体の各蛍光極大波長ごとに透過率・反射率が異なる特性の分割ミラーであってもよい。たとえば、蛍光極大波長ごとに階段状に変化する特性のミラーでも同様に可能である。対象とする複数の蛍光体の蛍光極大波長または最大ピークを示す波長ごとに異なる比率に分割できる効能を有していればよい。

なお、蛍光測定では、背景光が存在するが、上記では、背景光成分を差し引いた信号成分での説明である。

また、石英製プリズム７に対してレーザ光をその入射面に垂直つまり入射角度０度で入射している。これにより、基板８とプリズムを一体化して移動させても、対物レンズ観察視野からレーザ照射位置がずれないため、基板とプリズムを一体化することができ、プリズムと基板とのカップリング方式を種々選ぶことが可能になる。オイルカップリングのほか、光学接着も可能になり、装置構成を容易に選ぶことができる。

なお、本実施例では、基板８の各々の領域８ｉｊに結合している蛍光分子が１分子であり、複数の異なる蛍光分子が同じ位置にいないため、本発明のような装置及び方法で効率よく蛍光体種つまりは塩基種が識別でき、しかも高密度な基板に対応できる。

本実施例によれば、複数の測定対象物を精密配置し、複数の検出画素を備えた複数の検出器の特定画素に各測定対象物をそれぞれ結像させ、検出器ごとの強度比を測定することで、より多い種類の蛍光体を識別し、その蛍光強度を算定することができる。特に検出器である２次元ＣＣＤカメラを１台または２台で、標識物である蛍光体３種、または４種以上を識別検出することができる。これにより、装置コストを抑えることができる。１分子ごとに検出することもできる。

なお、本実施例では、検出する波長帯域が５００−７００ｎｍであるが、これに制限されることはない。波長範囲４００−６００ｎｍとか、４００−７００ｎｍの範囲など任意に対応できる。使用する蛍光体種の中で、一番短い蛍光極大波長を有する蛍光体種の蛍光極大波長付近から、一番長い蛍光極大波長を有する蛍光体種の蛍光極大波長付近までの範囲で調整することができる。厳密に蛍光極大波長間とする必要はない。蛍光体種ごとの蛍光極大波長付近でそれぞれ異なる比率に分割できればよい。また、特定の蛍光体を受光するときの蛍光強度比が、ほかの蛍光体の蛍光強度比と異なることで、複数の蛍光体を識別することができる。

実施例では、オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が分子中の２点以上において捕捉される基板８に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元センサカメラに結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する。基板８は実質的に透明な基板であり、分子が捕捉されうる領域８ｉｊが複数設けられ、それらが格子構造の格子点位置に配置されている。該基板上で必要な試薬や試料などを反応させ、全反射照明のための光励起用の光源と、照射光学系により該基板上の蛍光体を励起し、発する蛍光を蛍光集光系で集光し、その光束を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分光部により分割し、結像光学系で各々検出器に結像し、複数の検出画素を備えた検出器により検出する。さらにデータ処理部では、分割された蛍光像の相対応する輝点の強度を算定し、その強度比から蛍光体種を判定する。これにより、簡便に多種の蛍光体種を識別検出することができる。

また、本例では、一定間隔の格子状に捕捉領域８ｉｊを配置する基板を使用する例を示した。格子状に配置することで、透過像と反射像内の相対応する輝点の識別が容易になる。捕捉位置が、ランダムに分散する場合は、両方の画像を比較し、パターン解析し、または基準マーカを参照して、相対応する輝点を判定すればよい、これによっても同様の効果が得られる。

反応基板の別の実施例を示す。本実施例では、エバネッセント光の代わりに微小開口に生じる近接場光を用いて背景光を抑える方式を示す。

励起光の波長程度以下の開口が、励起光に対して不透明なマスクに設けられている場合、励起光は微小な開口の内部、またはごく近傍にのみ染み出す近接場光として存在する。反対側へ伝搬する光としては透過しないため、開口から離れた位置にある蛍光色素を励起しない。そのため、エバネッセント光を用いた場合と同様に、背景光を大幅に低減することができる。なお、ここで開口部とは物理的な穴でもよく、光学的に透明な部材による窓でも良い。また、開口の大きさが励起光の波長程度より大きい場合には、近接場光による照明とはならないものの、やはり基板を透過する励起光強度を抑えることで、背景光を低減できる。

本実施例での基板６０の構造を図４（ａ）に示す。基板６０は、反応領域６０ａを有し、その内部に核酸試料を捕捉する反応領域６０ｉｊがピッチｄｓで複数形成されており、さらに複数の反応領域６０ｉｊの周りを光学的に不透明なマスク６０ｂで覆う構造とする。すなわち、マスク６０ｂに設けられた開口６０ｃの中に反応領域６０ｉｊが存在する。マスク材料としては、アルミニウム，クロムなどの金属，炭化シリコンなどが適用でき、蒸着などで、薄膜化する。反応領域６０ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。この開口をマスク６０ｂのなかに作成する方法としては、プロジェクション法での蒸着（蒸着源と基板との間に適当なマスクを配置して蒸着する），電子ビームリソグラフィー，フォトリソグラフィーによる直接描画によって作成できる。ドライエッチング，ウェットエッチングを用いても良い。

反応領域６０ｉｊへＤＮＡ断片３０１を捕捉する方法は、すでに述べたものを使用することができる（図４（ｂ））。基板６０が合成石英である場合は、アミノシランを反応させることでアミノ基を導入した後ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させ、ストレプトアビジンを反応させることにより、修飾３０３としてアビジン修飾することが容易にできる。さらに、修飾３０２として末端をビオチン化した核酸分子を固定することで、核酸試料を２点以上で捕捉することが可能になる。

本実施例では、生体分子周囲の試料液のラマン散乱光と生体分子近傍の金属構造物の光ルミネセンス・光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用できる。

開口中に金属構造体を作成してもよい。実施例１と同様に位置きめマーカ６１，６２，６３を配置することもでき、実施例１と同様の効果が期待できる。

本例によっても、前記実施例１等と同様の効果が得られる。また、反応領域６０ｉｊ以外はマスクされているため、不要な迷光，蛍光が低減でき、より高感度に測定することができるようになる。

蛍光体として別の組み合わせの例を示す。

共鳴による励起エネルギーの移動（いわゆるＦＲＥＴ、Fluoresent Resonance Energy Transfer）を利用した蛍光測定にも適用できる。例えば、ドナーとして、蛍光波長５２５ｎｍのＱｄｏｔ５２５などを使い、アクセプタとしてAlexa Fluor５４６,Alexa Fluor５９４,Alexa Fluor６３３，Alexa Fluor６６０の４種の蛍光体を使うことも可能である。これら５種の蛍光体も、前記実施例と同様に、その蛍光強度比率でそれぞれ識別弁別することができる。ＦＲＥＴの場合は、実施例１などで記載した反応領域の個々のドット（領域８ｉｊなど）に核酸試料を捕捉し、Ｑｄｏｔ標識した核酸合成酵素を供給し、それに対して４種の蛍光付き塩基を個々に反応させる。前記実施例に記載の装置により、蛍光強度検出、各々の検出蛍光強度比率を算定することで、蛍光体の種類を識別することができる。個々の領域の状態は、何も捕捉されていないドット，Ｑｄｏｔのみ捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Alexa Fluor５４６が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Alexa Fluor５９４が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Alexa Fluor６３３が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Alexa Fluor６６０が捕捉されたドット、になる。Ｑｄｏｔが捕捉されたドットからはその蛍光が検出されるが、蛍光強度の比率が異なっており、また、励起エネルギーの移動によりＱｄｏｔからの蛍光強度が低下することにより、蛍光強度比率により、上記組み合わせの状態を識別することが可能である。また、核酸合成酵素により核酸鎖に取り込まれていない未反応の蛍光付き塩基は、Ｑｄｏｔから離れているためＦＲＥＴによる蛍光を発しない。よって、未反応の蛍光付き塩基を洗浄する工程なしに、４種の蛍光付き塩基が核酸鎖に取り込まれる様子をリアルタイムで蛍光検出することも可能である。

５ ミラー
７ プリズム
８，６０ 基板
８ａ，６０ａ 反応領域
８ｉｊ，６０ｉｊ 反応領域
９ フローチャンバ
１０ 廃液チューブ
１１ 廃液容器
１２ 導入口
１３ 蛍光
１４ 集光レンズ（対物レンズ）
１５，４０６ フィルタユニット
１６ 透過光観察用鏡筒
１７ａ，１７ｂ 補助フィルタ
１８ａ，１８ｂ 結像レンズ
１９ａ，１９ｂ ＣＣＤカメラ
２０ａ，２０ｂ ２次元センサカメラコントローラ
２１ 制御ＰＣ
２２，２４ モニタ
２３ ＴＶカメラ
２５ 分注ユニット
２６ 分注ノズル
２７ 試薬保管ユニット
２７ａ 試料液容器
２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ ｄＮＴＰ誘導体溶液容器
２７ｆ 洗浄液容器
２８ チップボックス
２９ 自動ピントあわせ装置
３０，３１，６１，６２，６３ 位置きめマーカ
３２，１０３，１０４ａ ダイクロイックミラー
６０ｂ マスク
６０ｃ 開口
１００，１０１ａ，１０１ｂ レーザ光源
１０２ａ，１０２ｂ λ／４波長板
ｄｘ，ｄｙ 領域８ｉｊの間隔の寸法
３０１ ＤＮＡ断片
３０２，３０３ 結合のための修飾
３０４ 領域
３０５ 微粒子
３０６ 接着用パッド

Claims (22)

1. 支持基体の表面には核酸試料を固定する複数の領域を有し、該領域の少なくとも一つには核酸試料が１分子固定されており、前記固定した核酸試料の伸長反応を行うことで配列決定を行う核酸分析デバイスにおいて、
   前記核酸試料１分子と支持基体との固定は２点以上でなされることを特徴とする核酸分析デバイス。
2. 請求項１に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記領域には、前記核酸試料が固定しうる表面処理が施されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
3. 請求項２に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記領域の少なくともいずれかには、異なる２種以上の表面処理が施されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
4. 請求項２に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   少なくともいずれかの領域間の表面処理が異なることを特徴とする核酸分析デバイス。
5. 請求項１に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記領域上には金属構造体が配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
6. 請求項５に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記金属構造体には微粒子が固定されることを特徴とする核酸分析デバイス。
7. 請求項６に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記金属構造体は平面形状が円形であり、該金属構造体の直径は、前記微粒子の直径よりも小さいことを特徴とする核酸分析デバイス。
8. 請求項５に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記金属構造体は、金，銀，アルミ，クロム，チタン，タングステン，白金，ニッケルのいずれかからなることを特徴とする核酸分析デバイス。
9. 請求項１に記載の核酸分析デバイスにおいて、
   前記領域は、格子状に配列されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
10. 請求項１に記載の核酸分析デバイスにおいて、
    前記核酸試料の少なくとも一端は、３′末端において前記支持基体に固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
11. 請求項２に記載の核酸分析デバイスにおいて、
    前記表面処理は、前記支持基体の表面に固定された核酸分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
12. 支持基体の表面の核酸試料を固定する複数の領域の少なくとも一つに核酸試料を１分子固定し、前記固定した核酸試料の伸長反応を行うことで配列決定を行う核酸分析方法において、
    前記核酸試料１分子と支持基体との固定を２点以上で行うことを特徴とする核酸分析方法。
13. 核酸合成酵素と蛍光色素付き塩基を前記核酸試料に接触させ核酸合成反応を行う工程と、
    局所照明により標識を励起することで生じる蛍光を検出する工程を含む核酸分析方法において、
    支持基体の表面に核酸試料の第１の箇所により１分子固定する工程と、
    支持基体の表面に核酸試料の第２の箇所により固定する工程と、を含むことを特徴とする核酸分析方法。
14. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    局所照明により励起することで生じる蛍光を検出する工程を含む工程を、蛍光色素付き塩基が前記核酸試料の周囲に存在する状態で行うことを特徴とする核酸分析方法。
15. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸合成酵素には蛍光体が結合されていることを特徴とする核酸分析方法。
16. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸試料と前記支持基体との固定は前記核酸試料の１つの鎖の両末端を介してなされていることを特徴とする核酸分析方法。
17. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸試料と前記支持基体との固定は共有結合によってなされることを特徴とする核酸分析方法。
18. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸試料と前記支持基体との固定はタンパク質によってなされていることを特徴とする核酸分析方法。
19. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸試料と前記支持基体との固定は３点以上においてなされていることを特徴とする核酸分析方法。
20. 請求項１３に記載の核酸分析方法において、
    前記核酸試料の両端に修飾を導入する工程を含むことを特徴とする核酸分析方法。
21. 支持基体の表面には核酸試料を固定する複数の領域を有し、該領域の少なくとも一つには核酸試料が１分子固定されている核酸分析デバイスと、
    前記核酸分析デバイスに少なくとも核酸試料を供給する手段と、
    前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    核酸伸長反応により取り込まれた蛍光を検出する検出部を備え、核酸試料の塩基配列を決定する核酸分析装置であって、
    前記核酸試料１分子と支持基体との固定は２点以上でなされることを特徴とする核酸分析装置。
22. 請求項２１に記載の核酸分析装置において、
    前記領域は、格子状に配列されていることを特徴とする核酸分析装置。

Images