JP5397484B2 - 観察装置及び観察方法 - Google Patents

Description

生体試料などの観察対象をタイムラプス撮影する観察装置及び観察方法に関する。

従来、細胞を培養容器中で培養しながらタイムラプス撮影する生体試料観察装置が知られている（特許文献１）。

その一方で近年、再生医療分野や創薬分野等の様々な分野では、体細胞に分化した培養細胞からｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cell）を作製・分化誘導する技術が注目されており、各種の研究が行われている。

培養細胞からｉＰＳ細胞を作製する代表的な方法としては、山中因子（Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ）と呼ばれる外来性遺伝子をレトロウイルスやプラスミド等のベクターで培養細胞へ導入し、数週間培養するという方法が知られている。外来性遺伝子の導入された細胞は、リプログラミング（初期化）され、様々な点においてＥＳ細胞と同等の性質（コロニー状の形態で増殖し、多分化能を持つような性質）を有するようになる。このようにして初期化された細胞は、Ｎａｎｏｇ遺伝子のような、ｉＰＳ細胞特有の内在性遺伝子が発現する。また、導入された外来性遺伝子は、細胞内のサイレンシングという機構により、細胞の初期化と同時にその発現が停止する。

この方法では、ｉＰＳ細胞の評価、機能解明という観点から、外来性遺伝子が発現してからサイレンシングにより発現が停止する過程（１）と、ｉＰＳ細胞特有の内在性遺伝子が初期化により発現する過程（２）とをモニタリングすることが重要となる。

これらの過程（１）、（２）は可視化することが可能であり、例えば、過程（１）を可視化する場合は、上述した外来性遺伝子（Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ）の発現とともに発現し、かつその外来性遺伝子のサイレンシングと共にサイレンシングする蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ遺伝子）を、その外来性遺伝子と共に培養細胞へ導入しておけばよい。また、過程（２）を可視化する場合は、実験動物における内在性遺伝子（Ｎａｎｏｇ遺伝子）を、蛍光タンパク質を伴う遺伝子（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ遺伝子）に予め組み替えておけばよい。

特開２００４−３０９７１９号公報

しかしながら、現在のところｉＰＳ細胞の作製効率は低いので、培養容器中のごく一部の箇所でしかｉＰＳ細胞は発現しない。また、ｉＰＳ細胞の発現する箇所を予測することも現状では不可能である。このため、ｉＰＳ細胞が初期化される過程（１）（２）を上述した生体試料観察装置で効率的に観察することは困難であった。

本発明の目的は、観察領域内で不規則的に出現する特定の物質を効率良く観察することのできる観察装置及び観察方法を提供することにある。

本発明を例示する観察装置は、所定の観察領域のタイムラプス撮影を行う第１観察手段と、前記第１観察手段が取得する画像に基づき、前記観察領域内で第１物質が発現したか否かを判別する第１判別手段と、前記観察領域内に前記第１物質が発現したタイミングで、その第１物質の発現した箇所に関するタイムラプス撮影を開始する第２観察手段とを備え、前記第２観察手段によるタイムラプス撮影の撮影頻度は、前記第１観察手段によるタイムラプス撮影の撮影頻度よりも高い。

本発明を例示する観察方法は、所定の観察領域のタイムラプス撮影を行う第１観察ステップと、前記第１観察ステップで取得した画像に基づき、前記観察領域内で第１物質が発現したか否かを判別する第１判別ステップと、前記観察領域内に前記第１物質が発現したタイミングで、その第１物質の発現した箇所に関するタイムラプス撮影を開始する第２観察ステップとを含み、前記第２観察ステップによるタイムラプス撮影の撮影頻度は、前記第１観察ステップによるタイムラプス撮影の撮影頻度よりも高い。

本発明によれば、観察領域内で不規則的に出現する特定の物質を効率良く観察することのできる観察装置及び観察方法が実現する。

生体試料観察装置の全体構成を示す正面図。 観察ユニット２７の正面図。 観察ユニット２７の側面図。 培養容器１５（ウェルプレート）の上面図。 制御ユニット３１による観察処理のフローチャート。 観察処理における各画像の取得タイミングを示すタイミングチャート。 互いに異なる複数の細胞コロニーの蛍光強度の時間変化と、詳細観察期間Ｔ１、猶予期間Ｔ２との関係を説明する図。 非重要ＲＯＩの設定タイミングと、非重要ＲＯＩの個数との関係を示すグラフ。 重要ＲＯＩの移行タイミングと、重要ＲＯＩの個数との関係を示すグラフ。

［実施形態］
以下、本発明の実施形態として生体試料観察装置を説明する。

図１は、生体試料観察装置の全体構成を示す正面図である。なお、図１において、実線は外観に表れる部位の構造を示し、破線は外観に表れない内部の部位の構造を示している。

図１に示すように、生体試料観察装置１は、細胞を収めた培養容器を収容する第１筐体１１と、制御装置を構成する第２筐体１２とを有する。第１筐体１１は、第２筐体１２の上に載せられた状態で使用される。

第１筐体１１の内部には、断熱材で覆われた恒温室２１が形成されている。この恒温室２１は、第１筐体１１の正面に形成された正面開口２３（正面扉２２）と、第１筐体１１の正面からみて左側面に形成された搬出入口２４とによって外部と連絡している。

恒温室２１には、例えば、ペルチェ素子が用いられる温度調節装置等からなる温度制御機構、霧を噴出する噴霧装置等からなる湿度制御機構、外部の二酸化炭素ボンベに接続されるガス導入部等からなるガス制御機構、内部空間における培養容器の環境を検出する環境センサ等（いずれも不図示）が設けられている。これにより、恒温室２１の中は、培養容器の環境を維持するために密封され、例えば空気を循環させることにより一定の温度に保たれることで、温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度５％等に維持される。

また、第１筐体１１の恒温室２１内には、ストッカ２５、容器搬送機構２６、及び観察ユニット２７が収納されている。

ストッカ２５は、複数の棚で上下に区画されており、培養容器１５（図２、図３）を水平に収納できる。

容器搬送機構２６には、ホルダを支持する搬送アーム部や、培養容器１５を搬送するための各種の機構（不図示）が設けられている。容器搬送機構２６は、搬送アーム部に支持されたホルダを、垂直方向（Ｚ方向）又は水平方向（Ｘ及びＹ方向）に移動させたり、Ｚ軸を中心として１８０度回転させたりすることができる。

図２、図３は、観察ユニット２７の構成を示す図である。図２には観察ユニット２７の正面図が示されており、図３には観察ユニット２７の側面図が示されている。

図２、図３に示すように、観察ユニット２７は、透過光照明部４１、蛍光落射照明部４２、試料台４３、及び観察部４４から構成される。

透過光照明部４１は、試料台４３の側部から上方向に延びた後に、試料台４３に載置される培養容器１５の上部に延びるようなアーム状に形成される。透過光照明部４１の内部には、透過光用ＬＥＤ（Light Emitting Diode）５１と透過光用光学系５２とが収納される。透過光用ＬＥＤ５１は、所定の波長域の光を発光する。透過光用ＬＥＤ５１からの光は、透過光用光学系５２を介して、試料台４３に載置される培養容器１５に上側から照射される。なお、透過光照明部４１による照明（透過照明）は、透明な培養容器１５と、培養容器１５内に存在する透明の位相物体（細胞など）とを可視化するのに適した照明（暗視野照明など）であることが望ましい。

蛍光落射照明部４２は、蛍光用ＬＥＤ５３ａ、５３ｂ、５３ｃ、及び、蛍光用光学系５４を備える。蛍光用ＬＥＤ５３ａ、５３ｂ、５３ｃは、互いに異なる波長の光を発光する。蛍光用ＬＥＤ５３ａ、５３ｂ、５３ｃから発せられた光は、蛍光用光学系５４を介して、試料台４３に下側から照射される。

試料台４３は、透光性の材質により構成されており、透過光照明部４１から発せられ培養容器１５を透過した光や、蛍光落射照明部４２から発せられた励起光に応じて培養容器１５で発した蛍光を、殆ど妨げることなく観察部４４へ入射させる。

試料台４３にはまた、培養容器１５から観察部４４へと向かう光を集光する対物レンズ５５や、培養容器１５を垂直方向又は水平方向に移動させるステージ５６などが設けられる。

試料台４３の対物レンズ５５は、倍率の異なる複数の対物レンズ（例えば、２倍の対物レンズ、４倍の対物レンズ、１０倍の対物レンズ、２０倍の対物レンズ、４０倍の対物レンズ等）から構成されており、観察ユニット２７の観察倍率を適宜に切り替えることが可能である。

観察部４４は、撮影部５７及び画像処理部５８から構成される。撮影部５７は、結像光学系と、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）等の撮像素子とを有している。観察部４４の結像光学系は、撮像素子の撮像面上に、培養容器１５を透過した光による像（透過像）や、培養容器１５から発せられた蛍光による像（蛍光像）を形成する。

ここで、蛍光用光学系５４は、その内部の所定位置に配置されたダイクロイックミラーを挿脱することにより、培養容器１５を照射する光の種類（観察ユニット２７の照明方式）を、蛍光落射照明部４２による照明（落射照明）と、透過光照明部４１による照明（透過照明）との間で切り替えることができる。

例えば、観察ユニット２７の照明方式が透過照明に設定され、かつ上述した４つのＬＥＤのうち透過光用ＬＥＤ５１のみが点灯された状態では、撮影部５７は、培養容器１５の透過画像を取得することができる。

また、観察ユニット２７の照明方式が落射照明に設定され、かつ上述した４つのＬＥＤのうち蛍光用ＬＥＤ５３ａ、５３ｂ、５３ｃの何れかが点灯された状態では、撮影部５７は、培養容器１５の蛍光画像を取得することができる。

また、観察ユニット２７の照明方式が落射照明に設定された状態で、３つの蛍光用ＬＥＤ５３ａ、５３ｂ、５３ｃのうち点灯するものが切り替われば、培養容器１５を照射する光の波長（観察ユニット２７の励起波長）が切り替わる。

また、観察ユニット２７の照明方式が落射照明に設定された状態で、蛍光用光学系５４の内部の所定位置に配置された蛍光フィルタが切り替われば、撮影部５７に入射可能な光の波長帯域（観察ユニット２７の検出チャンネル）が切り替わる。

画像処理部５８は、撮影部５７が取得した画像（アナログ画像信号）に対し、増幅処理等を含むアナログ信号処理を適用した後、そのアナログ画像信号をＡ／Ｄ（Analog/Digital）変換し、ディジタル画像信号を得る。このディジタル画像信号は、制御ユニット３１へ送られる。

図１に戻り、第１筐体１１が載せられた第２筐体１２の内部には、上述した観察ユニット２７の一部の他に、制御ユニット３１も収納される。

制御ユニット３１は、生体試料観察装置１の各部の動作を制御する。具体的には、制御ユニット３１は、観察スケジュール又はユーザの操作による直接の指示にしたがって、恒温室２１内の環境条件の調整、恒温室２１内外への培養容器１５の搬出入、培養容器１５内の生体試料の観察、恒温室２１内での培養容器１５の搬送などを実行する。

また、制御ユニット３１は、第２筐体１２の前面などに設けられた表示パネル３２上に必要な情報を表示することにより、培養容器ごとの観察スケジュールをユーザに入力させることができる。なお、ユーザから制御ユニット３１への情報入力は、制御ユニット３１に接続されたキーボード等の入力器（不図示）を介して行われる。

また、制御ユニット３１内には、観察情報記憶部３３が設けられており、この観察情報記憶部３３は、観察ユニット２７から供給されるディジタル画像信号を逐次に格納する。これによって、観察情報記憶部３３には、複数の画像の画像データ（以下、単に「画像」と称す。）が蓄積されることになる。

また、制御ユニット３１は、観察情報記憶部３３に蓄積された複数の画像を培養容器毎かつ日時毎に管理するため、個々の画像に対して、その画像の取得元となった培養容器１５の番号（容器番号）やその画像の取得日時などのインデックス情報を付加する。また、観察情報記憶部３３には、恒温室２１内での環境条件（温度、湿度、二酸化炭素濃度等）の変化履歴等も記録できる。

画像解析部３４は、観察情報記憶部３３に蓄積されている画像に対し、必要に応じて画像解析処理を施す。

観察制御部３５は、観察スケジュール又はユーザの操作による直接の指示にしたがって、観察ユニット２７を制御する。また、観察制御部３５は、画像解析部３４による画像解析処理の結果に基づき観察ユニット２７の制御内容を適宜に変更する。

なお、制御ユニット３１は、所定の無線又は有線の通信規格に準拠した通信手段（図不示）を備えており、ネットワークを介して外部のパーソナルコンピュータ等の機器とのデータ送受信を行うことが可能である。したがって、ユーザは、培養容器の観察、観察ユニット２７の設定変更、恒温室２１の設定変更を遠隔地に設置されたコンピュータから行うこともできる。

ここで、本実施形態では、培養容器１５として図４に示すようなウェルプレートを想定する。培養容器１５のウェル数は、例えば６であり、個々のウェル１５Ａの径は、約３０ｍｍである。個々のウェル１５Ａには、ｉＰＳ細胞の作製に必要な各種の要素、すなわち、培養液、フィーダー細胞、体細胞に分化した培養細胞（マウス繊維芽細胞）、山中因子を培養細胞へ導入するためのベクターなどが適当なタイミングで収容されており、特に、培養細胞には、上述した過程（１）、（２）を可視化するための処理（ＤｓＲｅｄ遺伝子の導入、Ｎａｎｏｇ遺伝子からＮａｎｏｇ−ＧＦＰ遺伝子への遺伝子組み換え）も予め施されているものとする。

仮に、観察ユニット２７の対物レンズ５５を２倍の対物レンズに設定した場合、培養容器１５のうち１ショットで画像化できる範囲（観察ユニット２７の視野５５Ａ）のサイズは、例えば４ｍｍ×４ｍｍとなる。よって、１つのウェル１５Ａのほぼ全体を観察するには、図４にグリッド線で示すとおり、観察ユニット２７の視野５５Ａを培養容器１５上で移動させながら８×８ショット分の撮像を行い、取得された８×８＝６４枚の画像を繋ぎ合わせれば（タイリングすれば）よい。

また、観察ユニット２７の対物レンズ５５を２０倍の対物レンズに設定した場合、培養容器１５のうち１ショットで画像化できる範囲（観察ユニット２７の視野）のサイズは、例えば４００μｍ×４００μｍとなる。このサイズは、培養容器１５内で生じた細胞コロニー１つ分を詳細に観察するのに適している。

また、本実施形態の観察ユニット２７の蛍光用ＬＥＤ５３ａの発光波長は、ＤｓＲｅｄの励起波長（５５８ｎｍ）に設定されており、蛍光用ＬＥＤ５３ｂの発光波長は、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの励起波長（４８８ｎｍ）に設定されているものとする。この場合、観察ユニット２７の励起波長は、ＤｓＲｅｄの励起波長（５５８ｎｍ）と、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの励起波長（４８８ｎｍ）との間で切り替えることが可能になる。

また、観察ユニット２７の検出チャンネルは、ＤｓＲｅｄの蛍光波長帯域（５８３ｎｍの近傍。以下「赤色チャンネル」という。）と、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの蛍光波長帯域（５２０ｎｍの近傍。以下「緑色チャンネル」という。）との間で切り替えることが可能であるとする。

この場合、観察ユニット２７の照明方式を落射照明に設定し、かつ観察ユニット２７の励起波長を５５８ｎｍに設定し、かつ観察ユニット２７の検出チャンネルを赤色チャンネルに設定すると、培養容器１５内に存在するＤｓＲｅｄの蛍光強度分布（ＤｓＲｅｄ画像）を取得することができる。

また、観察ユニット２７の照明方式を落射照明に設定し、かつ観察ユニット２７の励起波長を４８８ｎｍに設定し、かつ観察ユニット２７の検出チャンネルを緑色チャンネルに設定すると、培養容器１５内に存在するＮａｎｏｇ−ＧＦＰの蛍光強度分布（ＧＦＰ画像）を取得することができる。

図５は、制御ユニット３１による観察処理のフローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。なお、フローの開始時点では、上述した培養容器１５が生体試料観察装置へ既に収容済みである（容器番号が付与されストッカ２５へ収容済みである）と仮定する。

ステップＳ１１：制御ユニット３１は、培養容器１５の観察スケジュールをユーザに入力させる。ここで、本実施形態の観察処理には、インターバルの長いタイムラプス撮影（粗観察）と、インターバルの短いタイムラプス撮影（低頻度詳細観察）と、インターバルの更に短いタイムラプス撮影（高頻度詳細観察）とがあるので、本ステップの制御ユニット３１は、粗観察のインターバルΔＴ１と、低頻度詳細観察のインターバルΔＴ２と、高頻度詳細観察のインターバルΔＴ３とをそれぞれユーザに設定させる。ユーザは、インターバルΔＴ１、ΔＴ２、ΔＴ３の組み合わせを以下の関係を満たすような組み合わせに設定する。

・ΔＴ３＜ΔＴ２＜ΔＴ１
・ΔＴ２＝ｎ×ΔＴ３（但し、ｎは整数）
・ΔＴ１＝ｍ×ΔＴ２（但し、ｍは整数）
よって、例えば、ΔＴ１＝８ｈ、ΔＴ２＝２ｈ、ΔＴ３＝１ｈなどと設定される。

なお、粗観察、低頻度詳細観察、高頻度詳細観察の各々の１ラウンド当たりの所要時間は、これらのインターバルΔＴ１、ΔＴ２、ΔＴ３と比較して十分に短いので、ここでの説明ではゼロとみなす。

また、制御ユニット３１は、ＤｓＲｅｄの発現の有無を検知するための輝度閾値Ａ１と、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの発現の有無を検知するための輝度閾値Ａ２とをそれぞれユーザに設定させる。ユーザは、ＤｓＲｅｄの発現の有無を高感度に検知する必要のある場合には輝度閾値Ａ１を低く設定し、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの発現の有無を高感度に検知する必要のある場合には輝度閾値Ａ２を低く設定する（因みに、通常は、輝度閾値Ａ１よりも輝度閾値Ａ２の方を低くする必要性が高い。）。

また、制御ユニット３１は、粗観察で使用すべき対物レンズの倍率ｍ_Ｌをユーザに設定させる。以下、倍率ｍ_Ｌは「２」に設定されたと仮定する。

制御ユニット３１は、設定された倍率ｍ_Ｌに応じて、粗観察で培養容器１５の全てのウェルを撮像するのに必要なショットパターンＰ_Ｌ（ステージ５６の移動パターン及び撮影部５７の駆動タイミング）を算出する。なお、ここでは倍率ｍ_Ｌが「２」に設定されたので、図４に示すとおりウェル１つ分を８×８ショットで撮像するようなショットパターンがショットパターンＰ_Ｌとして算出される。

また、制御ユニット３１は、低頻度詳細観察で使用すべき対物レンズの倍率ｍ_Ｈと、ＲＯＩのサイズＳ_ＲＯＩとをユーザに設定させる。なお、ＲＯＩは、低頻度詳細観察の対象となるべき領域のことである。以下、倍率ｍ_Ｈは「２０」に設定され、サイズＳ_ＲＯＩは、細胞コロニー１つ分に相当するサイズ「３００μｍ×３００μｍ」に設定されたと仮定する。

制御ユニット３１は、設定された倍率ｍ_Ｈ及びサイズＳ_ＲＯＩの組み合わせ応じて、低頻度詳細観察でＲＯＩ１つ分を撮像するのに必要なショットパターンＰ_Ｈを算出する。なお、ここでは倍率ｍ_Ｈが「２０」に設定され、かつサイズＳ_ＲＯＩが「３００μｍ×３００μｍ」に設定されたので、ＲＯＩ１つ分を１ショットで撮像するようなショットパターンがショットパターンＰ_Ｈとして算出される。

また、制御ユニット３１は、低頻度詳細観察及び高頻度詳細観察を継続すべき期間（詳細観察期間）Ｔ１をユーザに設定させる。詳細観察期間Ｔ１は、図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおり、細胞コロニーにＤｓＲｅｄが発現してから、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰが発現した後に、その細胞コロニーがｉＰＳ細胞コロニーになったか否かを確認するまでに必要な期間に設定される。例えば、詳細観察期間Ｔ１は５０４ｈ（３週間）に設定される。

また、制御ユニット３１は、低頻度詳細観察の開始から中断までに設けるべき猶予期間Ｔ２をユーザに設定させる。猶予期間Ｔ２は、図７（Ｄ）に示すとおり、細胞コロニーにＤｓＲｅｄが発現してから、これ以上待ってもその細胞コロニーにＮａｎｏｇ−ＧＦＰが発現しないとみなすまでに必要な期間（詳細観察期間Ｔ１より短い）に設定される。例えば、猶予期間Ｔ２は３３６ｈ（２週間）に設定される。

ステップＳ１２：制御ユニット３１は、インターバルΔＴ１によって定まる粗観察のスケジュールと、現在の日時とを比較することにより、粗観察の撮影時期が到来したか否かを判別し、到来した場合にはステップＳ１３へ移行し、到来していない場合にはステップＳ１６へ移行する。

ステップＳ１３：制御ユニット３１の観察制御部３５は、培養容器１５を観察ユニット２７へ配置するよう容器搬送機構２６に対して指示を出す。容器搬送機構２６は、培養容器１５をストッカ２５から取り出し、観察ユニット２７のステージ５６上の所定位置へ配置する。但し、２回目以降のステップＳ１３では、培養容器１５がステージ５６に既に配置済みであった場合には、培養容器１５の搬送は省略される。

続いて、制御ユニット３１の観察制御部３５は、倍率ｍ_Ｌ及びショットパターンＰ_Ｌの情報と、粗観察の撮影指示とを、観察ユニット２７へ入力する。これを受けた観察ユニット２７は、以下の手順（ａ）〜（ｄ）により、２種類のウェル画像Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｒを全てのウェルについて取得する。

（ａ）観察ユニット２７は、対物レンズの倍率を倍率ｍ_Ｌ（ここでは２倍）に設定し、照明方式を透過照明に設定する。

（ｂ）観察ユニット２７は、上述した４つのＬＥＤのうち透過光用ＬＥＤ５１のみを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｌでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、培養容器１５の全てのウェルに関する透過画像（ここでは８×８×６枚の透過画像）を取得する。これらの透過画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｃ）観察ユニット２７は、照明方式を落射照明に切り替える。

（ｄ）観察ユニット２７は、検出チャンネルを赤色チャンネルに設定した状態で、蛍光用ＬＥＤ５３ａを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｌでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、培養容器１５の全てのウェルに関するＤｓＲｅｄ画像（ここでは８×８×６枚のＤｓＲｅｄ画像）を取得する。これらのＤｓＲｅｄ画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

続いて、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｂ）で取得された透過画像（ここでは８×８×６枚の透過画像）のうち、取得元となったウェルが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、ウェル毎の透過画像（６枚のウェル画像Ｉ_Ｐ）を作成する。これら６枚のウェル画像Ｉ_Ｐの各々は、各々の取得元となったウェルの番号（ウェル番号）と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

また、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｄ）で取得されたＤｓＲｅｄ画像（ここでは８×８×６枚のＤｓＲｅｄ画像）のうち、取得元となったウェルが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、ウェル毎のＤｓＲｅｄ画像（６枚のウェル画像Ｉ_Ｒ）を作成する。これら６枚のウェル画像Ｉ_Ｒの各々は、各々の取得元となったウェルのウェル番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

ステップＳ１４：制御ユニット３１の画像解析部３４は、直前のステップＳ１３で取得されたウェル画像Ｉ_Ｒ（６枚のウェル画像Ｉ_Ｒ）の各々を輝度閾値Ａ１と比較し、６枚のウェル画像Ｉ_Ｒの中で輝度閾値Ａ１を超過している１又は複数の高輝度領域を、ＲＯＩの設定先として探索する。そして、高輝度領域が１つでも検出された場合、制御ユニット３１はステップＳ１５へ移行し、高輝度領域が１つも検出されなかった場合、制御ユニット３１はステップＳ１６へ移行する。なお、２回目以降のステップＳ１４では、６枚のウェル画像Ｉ_Ｒのうち、それ以前のステップＳ１４にてＲＯＩ（又は後述する重要ＲＯＩ）が既に設定済みである領域は、探索の範囲から除外される。

ステップＳ１５：制御ユニット３１の画像解析部３４は、ステップＳ１４で検出された１又は複数の高輝度領域の各々に対して以下の手順（ｅ）〜（ｇ）でＲＯＩを設定する。

（ｅ）画像解析部３４は、高輝度領域の検出元となったウェル画像Ｉ_Ｒ上で、その高輝度領域の中心（又は輝度の重心）に相当する座標を算出する。

（ｆ）画像解析部３４は、手順（ｅ）で算出した座標と、そのウェル画像Ｉ_Ｒのウェル番号とに基づき、培養容器１５上で高輝度領域の中心に相当する座標を算出する。

（ｇ）画像解析部３４は、手順（ｆ）で算出した座標を中心とした、サイズＳ_ＲＯＩの領域に対してＲＯＩを設定する。

そして、制御ユニット３１の画像解析部３４は、培養容器１５上に設定した１又は複数のＲＯＩの各々に対して設定日時の情報を付与すると共に、それらＲＯＩの各々に対して設定順に番号（ＲＯＩ番号）を付与する。但し、ＲＯＩ番号の付与は、培養容器１５毎ではなく培養容器１５のウェル毎に行われるものとし、２回目以降のステップＳ１５において或るウェルの最初のＲＯＩに付与されるＲＯＩ番号は、それ以前のステップＳ１５において同じウェルの最後のＲＯＩに付与されたＲＯＩ番号に続く番号である。

ステップＳ１６：制御ユニット３１は、インターバルΔＴ２によって定まる低頻度詳細観察のスケジュールと、現在の日時とを比較することにより、低頻度詳細観察の撮影時期が到来したか否かを判別し、到来した場合にはステップＳ１７へ移行し、到来しない場合にはステップＳ２３へ移行する。

ステップＳ１７：制御ユニット３１は、培養容器１５にＲＯＩが１つでも設定されているか否かを判別し、設定されている場合にはステップＳ１８へ移行し、設定されていなかった場合にはステップＳ２３へ移行する。

ステップＳ１８：制御ユニット３１の観察制御部３５は、培養容器１５を観察ユニット２７へ配置するよう容器搬送機構２６に対して指示を出す。容器搬送機構２６は、培養容器１５をストッカ２５から取り出し、観察ユニット２７のステージ５６上の所定位置へ配置する。但し、培養容器１５がステージ５６に既に配置済みであった場合には、培養容器１５の搬送は省略される。

そして、制御ユニット３１の観察制御部３５は、倍率ｍ_Ｈ及びショットパターンＰ_Ｈの情報と、設定中のＲＯＩの座標情報と、低頻度詳細観察の撮影指示とを、観察ユニット２７へ入力する。これを受けた観察ユニット２７は、以下の手順（ａ’）〜（ｋ’）により、３種類のＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’、Ｉ_Ｒ’、Ｉ_Ｇ’を設定中の全てのＲＯＩについて取得する。

（ａ’）観察ユニット２７は、対物レンズの倍率を倍率ｍ_Ｈ（ここでは２０倍）に設定し、照明方式を透過照明に設定する。

（ｂ’）観察ユニット２７は、設定中のＲＯＩのうち最も端に位置するＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｃ’）観察ユニット２７は、上述した４つのＬＥＤのうち透過光用ＬＥＤ５１のみを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、そのＲＯＩに関する透過画像（ここでは１枚の透過画像）を取得する。この透過画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｄ’）観察ユニット２７は、光軸上に配置されるＲＯＩを変更しながら手順（ｃ’）を繰り返すことで、全てのＲＯＩに関する透過画像を取得する。

（ｅ’）観察ユニット２７は、照明方式を落射照明に切り替える。

（ｆ’）観察ユニット２７は、設定中のＲＯＩのうち最も端に位置するＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｇ’）観察ユニット２７は、検出チャンネルを赤色チャンネルに設定した状態で、蛍光用ＬＥＤ５３ａを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、そのＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像（ここでは１枚のＤｓＲｅｄ画像）を取得する。このＤｓＲｅｄ画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｈ’）観察ユニット２７は、光軸上に配置されるＲＯＩを変更しながら手順（ｇ’）を繰り返すことで、全てのＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像を取得する。

（ｉ’）観察ユニット２７は、設定中のＲＯＩのうち最も端に位置するＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｊ’）観察ユニット２７は、検出チャンネルを緑色チャンネルに設定した状態で、蛍光用ＬＥＤ５３ｂを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、そのＲＯＩに関するＧＦＰ画像（ここでは１枚のＧＦＰ画像）を取得する。このＧＦＰ画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｋ’）観察ユニット２７は、光軸上に配置されるＲＯＩを変更しながら手順（ｊ’）を繰り返すことで、全てのＲＯＩに関するＧＦＰ画像を取得する。

続いて、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｂ’）〜（ｄ’）で取得された透過画像のうち、取得元となったＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、ＲＯＩ毎の透過画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’）を作成する（但し、ここでは１つのＲＯＩに関する透過画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、透過画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’の各々は、各々の取得元となったＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

また、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｆ’）〜（ｈ’）で取得されたＤｓＲｅｄ画像のうち、取得元となったＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、ＲＯＩ毎のＤｓＲｅｄ画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’）を作成する（但し、ここでは１つのＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、ＤｓＲｅｄ画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’の各々は、各々の取得元となったＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

また、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｉ’）〜（ｋ’）で取得されたＧＦＰ画像のうち、取得元となったＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、ＲＯＩ毎のＧＦＰ画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’）を作成する（但し、ここでは１つのＲＯＩに関するＧＦＰ画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、ＧＦＰ画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’の各々は、各々の取得元となったＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

ステップＳ１９：制御ユニット３１の画像解析部３４は、直前のステップＳ１８で取得した１又は複数のＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’の輝度平均値を輝度閾値Ａ２と比較することにより、設定中のＲＯＩの中から輝度閾値Ａ２より明るいもの（高輝度なＲＯＩ）を見出す。そして、高輝度なＲＯＩが１つでも見出された場合、制御ユニット３１はステップＳ２０へ移行し、高輝度なＲＯＩが１つも見出されなかった場合、制御ユニット３１はステップＳ２３へ移行する。

ステップＳ２０：制御ユニット３１の画像解析部３４は、ステップＳ１９で見出された１又は複数の高輝度なＲＯＩを、重要ＲＯＩに移行させる。なお、重要ＲＯＩとは、高頻度詳細観察の対象となるべき領域のことである（以下、単なるＲＯＩを重要ＲＯＩと区別するために「非重要ＲＯＩ」と称す。）。また、画像解析部３４は、本ステップで非重要ＲＯＩから重要ＲＯＩへと移行した重要ＲＯＩに対して、その移行日時の情報を付与する。

ステップＳ２１：制御ユニット３１の画像解析部３４は、全ての非重要ＲＯＩの各々の設定日時（最初に非重要ＲＯＩに設定された日時）と現在の日時とを比較し、その設定日時から猶予期間Ｔ２が経過している非重要ＲＯＩ（期限切れのＲＯＩ）を見出す。そして、期限切れのＲＯＩが１つでも見出された場合、制御ユニット３１はステップＳ２２へ移行し、期限切れのＲＯＩが１つも見出されなかった場合、制御ユニット３１はステップＳ２３へ移行する。

ステップＳ２２：制御ユニット３１の画像解析部３４は、ステップＳ２１で見出された１又は複数の期限切れのＲＯＩを解消する。

ステップＳ２３：制御ユニット３１は、インターバルΔＴ３によって定まる高頻度詳細観察のスケジュールと、現在の日時とを比較することにより、高頻度詳細観察の撮影時期が到来したか否かを判別し、到来した場合にはステップＳ２４へ移行し、到来しない場合にはステップＳ２８へ移行する。

ステップＳ２４：制御ユニット３１は、培養容器１５に重要ＲＯＩが１つでも設定されているか否かを判別し、設定されている場合にはステップＳ２５へ移行し、設定されていなかった場合にはステップＳ２８へ移行する。

ステップＳ２５：制御ユニット３１の観察制御部３５は、培養容器１５を観察ユニット２７へ配置するよう容器搬送機構２６に対して指示を出す。容器搬送機構２６は、培養容器１５をストッカ２５から取り出し、観察ユニット２７のステージ５６上の所定位置へ配置する。但し、培養容器１５がステージ５６に既に配置済みであった場合には、培養容器１５の搬送は省略される。

そして、制御ユニット３１の観察制御部３５は、倍率ｍ_Ｈ及びショットパターンＰ_Ｈの情報と、設定中の重要ＲＯＩの座標情報と、高頻度詳細観察の撮影指示とを、観察ユニット２７へ入力する。これを受けた観察ユニット２７は、以下の手順（ａ”）〜（ｋ”）により、３種類のＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’、Ｉ_Ｒ’、Ｉ_Ｇ’を設定中の全ての重要ＲＯＩについて取得する。

（ａ”）観察ユニット２７は、対物レンズの倍率を倍率ｍ_Ｈ（ここでは２０倍）に設定し、照明方式を透過照明に設定する。

（ｂ”）観察ユニット２７は、設定中の重要ＲＯＩのうち最も端に位置する重要ＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｃ”）観察ユニット２７は、上述した４つのＬＥＤのうち透過光用ＬＥＤ５１のみを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、その重要ＲＯＩに関する透過画像（ここでは１枚の透過画像）を取得する。この透過画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｄ”）観察ユニット２７は、光軸上に配置される重要ＲＯＩを変更しながら手順（ｃ”）を繰り返すことで、全ての重要ＲＯＩに関する透過画像を取得する。

（ｅ”）観察ユニット２７は、照明方式を落射照明に切り替える。

（ｆ”）観察ユニット２７は、設定中の重要ＲＯＩのうち最も端に位置する重要ＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｇ”）観察ユニット２７は、検出チャンネルを赤色チャンネルに設定した状態で、蛍光用ＬＥＤ５３ａを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、その重要ＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像（ここでは１枚のＤｓＲｅｄ画像）を取得する。このＤｓＲｅｄ画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｈ”）観察ユニット２７は、光軸上に配置される重要ＲＯＩを変更しながら手順（ｇ”）を繰り返すことで、全ての重要ＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像を取得する。

（ｉ”）観察ユニット２７は、設定中の重要ＲＯＩのうち最も端に位置する重要ＲＯＩの中心が対物レンズ５５の光軸上に位置するようにステージ５６の座標をセットする。

（ｊ”）観察ユニット２７は、検出チャンネルを緑色チャンネルに設定した状態で、蛍光用ＬＥＤ５３ｂを点灯しながら、ショットパターンＰ_Ｈでステージ５６及び撮影部５７を駆動することにより、その重要ＲＯＩに関するＧＦＰ画像（ここでは１枚のＧＦＰ画像）を取得する。このＧＦＰ画像は、制御ユニット３１の観察情報記憶部３３に格納される。

（ｋ”）観察ユニット２７は、光軸上に配置される重要ＲＯＩを変更しながら手順（ｊ”）を繰り返すことで、全ての重要ＲＯＩに関するＧＦＰ画像を取得する。

続いて、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｂ”）〜（ｄ”）で取得された透過画像のうち、取得元となった重要ＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、重要ＲＯＩ毎の透過画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’）を作成する（但し、ここでは１つの重要ＲＯＩに関する透過画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、透過画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ’の各々は、各々の取得元となった重要ＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

また、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｆ”）〜（ｈ”）で取得されたＤｓＲｅｄ画像のうち、取得元となった重要ＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、重要ＲＯＩ毎のＤｓＲｅｄ画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’）を作成する（但し、ここでは１つの重要ＲＯＩに関するＤｓＲｅｄ画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、ＤｓＲｅｄ画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ’の各々は、各々の取得元となった重要ＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

また、制御ユニット３１の画像解析部３４は、手順（ｉ”）〜（ｋ”）で取得されたＧＦＰ画像のうち、取得元となった重要ＲＯＩが共通であるもの同士を画像取得順に繋ぎ合わせることにより、重要ＲＯＩ毎のＧＦＰ画像（ＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’）を作成する（但し、ここでは１つの重要ＲＯＩに関するＧＦＰ画像の枚数が１であるので、繋ぎ合わせを省略し、ＧＦＰ画像をそのままＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’とすればよい。）。作成されたＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’の各々は、各々の取得元となった重要ＲＯＩのＲＯＩ番号と、各々の画像の取得日時と共に、観察情報記憶部３３へ格納される。

ステップＳ２６：制御ユニット３１の画像解析部３４は、全ての重要ＲＯＩの各々の設定日時（最初に重要ＲＯＩに設定された日時）と現在の日時とを比較し、設定日時からの経過時間が詳細観察期間Ｔ１を超過している重要ＲＯＩ（観察済みのＲＯＩ）を見出す。そして、観察済みのＲＯＩが１つでも見出された場合、制御ユニット３１はステップＳ２７へ移行し、観察済みのＲＯＩが１つも見出されなかった場合、制御ユニット３１はステップＳ２８へ移行する。

ステップＳ２７：制御ユニット３１の画像解析部３４は、ステップＳ２６で見出された１又は複数の観察済みのＲＯＩを解消する。

ステップＳ２８：制御ユニット３１は、培養容器１５をストッカ２５へ収納するよう容器搬送機構２６に対して指示を出す。容器搬送機構２６は、培養容器１５を観察ユニット２７から取り出し、ストッカ２５の所定位置へ収納する。但し、この時点で培養容器１５がストッカ２５に既に収納済みであった場合は、培養容器１５の搬送は省略される。

ステップＳ２９：制御ユニット３１は、培養容器１５上に重要ＲＯＩ及び非重要ＲＯＩの何れもが設定されなくなってから一定の期間（猶予期間Ｔ３）が経過したか否かを判別し、経過した場合にはフローを終了し、経過しない場合にはステップＳ１２に戻る。但し、培養容器１５上に非重要ＲＯＩの設定された経験が一度も無かった場合には、制御ユニット３１は、その判別を省略してステップＳ１２へ戻る（以上、フローの説明）。

図６は、以上の観察処理における各画像の取得タイミングを示すタイミングチャートである。なお、図６では簡単のため、培養容器１５の或る１つのウェルの画像のみに着目した。

観察処理が開始されると、先ず、図６の上段に示すとおり粗観察が開始される。粗観察の各ラウンドで取得される画像は、ウェル画像Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｒの２種類であり、粗観察のインターバルは比較的長いインターバルΔＴ１である。

その後、図６（Ａ）に示すとおり、粗観察で取得されるウェル画像Ｉ_Ｒの中に輝度閾値Ａ１を超過した高輝度領域が出現すると、その領域に非重要ＲＯＩ（第１の非重要ＲＯＩ）が設定される。

その後、図６（Ｂ）に示すとおり、粗観察で取得されるウェル画像Ｉ_Ｒの中に輝度閾値Ａ１を超過した別の高輝度領域が出現すると、その領域に非重要ＲＯＩ（第２の非重要ＲＯＩ）が設定される。

また、第１の非重要ＲＯＩが設定されると（図６（Ａ））、図６（Ａ’）に示すとおり、その第１の非重要ＲＯＩに関する低頻度詳細観察が開始される。

また、第２の非重要ＲＯＩが設定されると（図６（Ｂ））、図６（Ｂ’）に示すとおり、その第２の非重要ＲＯＩに関する低頻度詳細観察が開始される。

低頻度観察の各ラウンドで取得される画像は、ＲＯＩ画像Ｉ _Ｐ、Ｉ_Ｒ、Ｉ_Ｇの３種類であり、低頻度詳細観察のインターバルは短いインターバルΔＴ２である。

そして、第１の非重要ＲＯＩの低頻度詳細観察で取得されるＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’の平均輝度が輝度閾値Ａ２を超過すると、図６（Ｃ）に示すとおり、第１の非重要ＲＯＩは重要ＲＯＩへと移行する。

また、第２の非重要ＲＯＩの低頻度詳細観察で取得されるＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ’の平均輝度が輝度閾値Ａ２を超過すると、図６（Ｄ）に示すとおり、第２の非重要ＲＯＩは重要ＲＯＩへと移行する。

そして、第１の非重要ＲＯＩが重要ＲＯＩに移行すると（図６（Ｃ））、その重要ＲＯＩに関する高頻度詳細観察が開始される。

また、第２の非重要ＲＯＩが重要ＲＯＩに移行すると（図６（Ｄ））、その重要ＲＯＩに関する高頻度詳細観察が開始される。

高頻度詳細観察の各ラウンドで取得される画像は、ＲＯＩ画像Ｉ _Ｐ、Ｉ_Ｒ、Ｉ_Ｇの３種類であり、高頻度詳細観察のインターバルは、さらに短いインターバルΔＴ３である。

すなわち、本実施形態の生体試料観察装置は、ウェル全体を粗観察し、ウェル内にｉＰＳ細胞コロニーとなる可能性の高い細胞コロニーが発生した時点で、その細胞コロニーの低頻度詳細観察を開始する。そして、低頻度詳細観察の対象となった細胞コロニーがｉＰＳ細胞コロニーとなる可能性が更に高まった時点で、その低頻度詳細観察を高頻度詳細観察へと移行させる。

図７（Ａ）〜（Ｄ）は、上述した観察処理において詳細観察の対象となった４つの細胞コロニーの蛍光強度の時間変化を示す図である。なお、図７において「Ｒ」で示すのはＤｓＲｅｄの蛍光強度であり、「Ｇ」で示すのはＮａｎｏｇ−ＧＦＰの蛍光強度である。

このうち図７（Ａ）に示す時間変化は、ＤｓＲｅｄが発現した後にサイレンシングが起こり、そのＤｓＲｅｄの発現が完全に停止する前にＮａｎｏｇ−ＧＦＰが発現してｉＰＳ細胞コロニーとなった細胞コロニーに関するものである。

また、図７（Ｂ）に示す時間変化は、ＤｓＲｅｄが発現した後にサイレンシングが起こり、そのＤｓＲｅｄの発現が停止してからＮａｎｏｇ−ＧＦＰが発現してｉＰＳ細胞コロニーとなった細胞コロニーに関するものである。

また、図７（Ｃ）に示す時間変化は、ＤｓＲｅｄが発現した後にサイレンシングが起こり、そのＤｓＲｅｄの発現が停止してからＮａｎｏｇ−ＧＦＰが発現したものの、その後に何らかの理由でＮａｎｏｇ−ＧＦＰの発現が停止してｉＰＳ細胞コロニーとならなかった細胞コロニーに関するものである。

また、図７（Ｄ）に示す時間変化は、ＤｓＲｅｄが発現した後にサイレンシングが起こったものの、何らかの理由でＮａｎｏｇ−ＧＦＰが発現せずにｉＰＳ細胞コロニーとならなかった細胞コロニーに関するものである。

このうち、ＤｓＲｅｄとＮａｎｏｇ−ＧＦＰとの双方が発現した細胞コロニー（図７（Ａ）〜（Ｃ））については、ＤｓＲｅｄの蛍光強度が輝度閾値Ａ１を超過した時点で低頻度詳細観察が開始され、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの蛍光輝度が輝度閾値Ａ２を超過した時点で高頻度詳細観察に移行し、低頻度詳細観察の開始時点から詳細観察期間Ｔ１が経過した時点で詳細観察が終了する。

よって、ＤｓＲｅｄとＮａｎｏｇ−ＧＦＰとの双方が発現した細胞コロニー（図７（Ａ）〜（Ｃ））については、ＤｓＲｅｄの蛍光強度の時間変化と、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの蛍光強度の時間変化とが、それぞれ適当な頻度で適当な期間に亘って画像化される。

一方、ＤｓＲｅｄとＮａｎｏｇ−ＧＦＰとのうち前者のみが発現した細胞コロニー（図７（Ｄ））については、ＤｓＲｅｄの蛍光強度が輝度閾値Ａ１を超過した時点で低頻度詳細観察が開始され、その開始時点から猶予期間Ｔ２が経過した時点で詳細観察が中断される。

よって、ＤｓＲｅｄとＮａｎｏｇ−ＧＦＰとのうち前者のみが発現した細胞コロニー（図７（Ｄ））については、ＤｓＲｅｄの蛍光強度の時間変化のみが適当な頻度で適当な期間に亘って画像化される。

すなわち、本実施形態の生体試料観察装置は、様々な細胞コロニーの各状態を、それぞれ適当な頻度で適当な期間に亘って画像化する。

以上の結果、本実施形態の生体試料観察装置は、培養容器１５で不規則的に発生するｉＰＳ細胞コロニーを、効率よく観察することができる。

ここで、培養容器１５の細胞を蛍光観察するためには、励起光を照射する必要があり、細胞のダメージを伴うので、なるべく励起光の照射量を抑えるべきである。よって、培養容器１５の狭い範囲を詳細に観察する（ミクロ観察する）タイミングや頻度等を細胞の状態に応じて適切に設定する本実施形態は、細胞のダメージを抑える上で有効である。

さらに、培養容器１５の広い範囲を粗く観察する（マクロ観察する）際には、細胞コロニーからの自家蛍光の影響を受け、見たいコロニーの観察の邪魔となることがあるので、ミクロ観察を適切に行う本実施形態は、有効である。

［実施形態への補足］
なお、上述した実施形態の制御ユニット３１は、図５に示した観察処理の終了後又は観察処理の実行過程において、例えば図８に示すとおり、非重要ＲＯＩの設定タイミングと、設定された非重要ＲＯＩの個数との関係を示すヒストグラムを、ウェル毎又は培養容器毎に作成し、観察情報記憶部３３へ格納してもよい。このヒストグラムは、ＤｓＲｅｄの発現タイミングのヒストグラムである。

また、上述した実施形態の制御ユニット３１は、図５に示した観察処理の終了後又は観察処理の実行過程において、例えば図９に示すとおり、重要ＲＯＩの移行タイミング（非重要ＲＯＩから重要ＲＯＩへの移行タイミング）と、重要ＲＯＩの個数との関係を示すヒストグラムを、ウェル毎又は培養容器毎に作成し、観察情報記憶部３３へ格納してもよい。このヒストグラムは、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰの発現タイミングのヒストグラムである。

また、上述した実施形態の制御ユニット３１は、図５に示した観察処理の終了後又は観察処理の実行過程において、ＲＯＩ番号の共通する複数のＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ（非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ及び重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｒ）を画像取得順に連結することにより、ＲＯＩ番号毎のタイムラプス動画像（ＤｓＲｅｄのタイムラプス動画像）を作成し、観察情報記憶部３３へ格納してもよい。但し、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｒは、重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｒよりもインターバルが広いので、両者を連結する際には、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｒを時間方向に補間することが望ましい。

同様に、上述した実施形態の制御ユニット３１は、図５に示した観察処理の終了後又は観察処理の実行過程において、ＲＯＩ番号の共通する複数のＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ（非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ及び重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｇ）を画像取得順に連結することにより、ＲＯＩ番号毎のタイムラプス動画像（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰのタイムラプス動画像）を作成し、観察情報記憶部３３へ格納してもよい。但し、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｇは、重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｇよりもインターバルが広いので、両者を連結する際には、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｇを時間方向に補間することが望ましい。

同様に、上述した実施形態の制御ユニット３１は、図５に示した観察処理の終了後又は観察処理の実行過程において、ＲＯＩ番号の共通する複数のＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ（非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ及び重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｐ）を画像取得順に連結することにより、ＲＯＩ番号毎のタイムラプス動画像（透過画像のタイムラプス動画像）を作成し、観察情報記憶部３３へ格納してもよい。但し、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｐは、重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｐよりもインターバルが広いので、両者を連結する際には、非重要ＲＯＩのＲＯＩ画像Ｉ_Ｐを時間方向に補間することが望ましい。

更に、上述した実施形態の制御ユニット３１は、ＲＯＩ番号の共通する、ＤｓＲｅｄのタイムラプス動画像と、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰのタイムラプス動画像とに基づき、それらのタイムラプス動画像に写っている細胞コロニーがｉＰＳ細胞コロニーであるか否かを自動的に判別してもよい。

例えば、制御ユニット３１は、ＤｓＲｅｄのタイムラプス動画像の最新フレームと、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰのタイムラプス動画像の最新フレームとを比較し、前者よりも後者の方が一定以上大きかった場合には、それらのタイムラプス動画像に写っている細胞コロニーをｉＰＳ細胞コロニーであるとみなし、そうでなかった場合には、それらのタイムラプス動画像に写っている細胞コロニーをｎｏｎ−ｉＰＳ細胞コロニーとみなしてもよい。

このような判別方法によると、図７（Ａ）、（Ｂ）のような蛍光強度変化を経た細胞コロニーをｉＰＳ細胞コロニーと判断し、かつ、図７（Ｃ）、（Ｄ）のような蛍光強度変化を経た細胞コロニーをｎｏｎ−ｉＰＳ細胞コロニーと判断することができる。

また、上述した実施形態では、培養容器１５をウェルプレートと仮定したが、ディッシュやフラスコなどの他の培養容器であってもよい。

２７…観察ユニット、３１…制御ユニット、３３…観察情報記憶部、３４…画像解析部、３５…観察制御部

Claims (13)

1. 所定の観察領域のタイムラプス撮影を行う第１観察手段と、
   前記第１観察手段が取得する画像に基づき、前記観察領域内で第１物質が発現したか否かを判別する第１判別手段と、
   前記観察領域内に前記第１物質が発現したタイミングで、その第１物質の発現した箇所に関するタイムラプス撮影を開始する第２観察手段とを備え、
   前記第２観察手段によるタイムラプス撮影の撮影頻度は、前記第１観察手段によるタイムラプス撮影の撮影頻度よりも高い
   ことを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記第２観察手段が取得する画像に基づき、前記第１物質とは異なる第２物質が前記箇所で発現したか否かを判別する第２判別手段を更に備え、
   前記第２観察手段は、
   前記箇所で前記第２物質が発現したタイミングで、前記箇所に関するタイムラプス撮影の撮影頻度を高める
   ことを特徴とする観察装置。
3. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記第２観察手段は、
   前記箇所に関するタイムラプス撮影の終了タイミングを、前記箇所で前記第１物質が発現してから所定時間が経過した時点とする
   ことを特徴とする観察装置。
4. 請求項２又は請求項３に記載の観察装置において、
   前記第２観察手段は、
   前記箇所で前記第１物質が発現してから所定時間が経過しても前記第２物質が発現しなかった場合には、前記箇所に関するタイムラプス撮影を中断する
   ことを特徴とする観察装置。
5. 請求項２〜請求項４の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記第２観察手段によるタイムラプス撮影の各ラウンドでは、
   前記第１物質を観察するための第１画像と前記第２物質を観察するための第２画像との双方が取得され、
   前記第１観察手段によるタイムラプス撮影の各ラウンドでは、
   前記第１画像と前記第２画像とのうち前者のみが取得される
   ことを特徴とする観察装置。
6. 請求項２〜請求項５の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記第２観察手段は、
   前記観察領域内の互いに異なる複数の箇所にて互いに異なるタイミングで前記第１物質が発現した場合には、それら複数の箇所の各々に関するタイムラプス撮影を、各々の発現タイミングで開始する
   ことを特徴とする観察装置。
7. 請求項６に記載の観察装置において、
   前記第１物質の発現タイミングと前記第１物質の発現した箇所の個数との関係を求める統計手段を更に備えた
   ことを特徴とする観察装置。
8. 請求項６又は請求項７に記載の観察装置において、
   前記第２物質の発現タイミングと前記第２物質の発現した箇所の個数との関係を求める統計手段を更に備えた
   ことを特徴とする観察装置。
9. 請求項１〜請求項８の何れか一項に記載の観察装置において、
   前記観察領域は、
   生体試料を培養する培養容器の全部又は一部の領域であり、
   前記培養容器の環境を制御する環境制御手段を更に備えた
   ことを特徴とする観察装置。
10. 請求項２に記載の観察装置において、
    前記観察領域にレーザ光を照射するレーザ光源と、
    前記第１物質および前記第２物質を含む前記観察領域が前記レーザ光で励起されたときに発する蛍光を検出する撮像部とを備え、
    前記第１判別手段は、前記撮像部で検出された前記第１物質の蛍光の光強度を所定のレベルと比較し、前記第１物質が発現したか否かを判別し、
    前記第２判別手段は、前記撮像部で検出された前記第２物質の蛍光の光強度を所定のレベルと比較し、前記第２物質が発現したか否かを判別する
    ことを特徴とする観察装置。
11. 所定の観察領域のタイムラプス撮影を行う第１観察ステップと、
    前記第１観察ステップで取得した画像に基づき、前記観察領域内で第１物質が発現したか否かを判別する第１判別ステップと、
    前記観察領域内に前記第１物質が発現したタイミングで、その第１物質の発現した箇所に関するタイムラプス撮影を開始する第２観察ステップとを含み、
    前記第２観察ステップによるタイムラプス撮影の撮影頻度は、前記第１観察ステップによるタイムラプス撮影の撮影頻度よりも高い
    ことを特徴とする観察方法。
12. 請求項１１に記載の観察方法において、
    前記第２観察ステップが取得する画像に基づき、前記第１物質とは異なる第２物質が前記箇所で発現したか否かを判別する第２判別ステップを更に含み、
    前記第２観察ステップは、
    前記箇所で前記第２物質が発現したタイミングで、前記箇所に関するタイムラプス撮影の撮影頻度を高める
    ことを特徴とする観察方法。
13. 請求項１２に記載の観察方法において、
    前記観察領域にレーザ光を照射する照射ステップと、
    前記第１物質および前記第２物質が含まれる前記観察領域が前記レーザ光で励起されたときに発する蛍光を検出する検出ステップとを備え、
    前記第１判別ステップは、前記検出ステップで検出された前記第１物質の蛍光の光強度を所定のレベルと比較し、前記第１物質が発現したか否かを判別し、
    前記第２判別ステップは、前記検出ステップで検出された前記第２物質の蛍光の光強度を所定のレベルと比較し、前記第２物質が発現したか否かを判別する
    ことを特徴とする観察方法。

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