JP5397932B2

JP5397932B2 - Ｎｕｆ２蛋白質抗体とその製造方法、抗原、検知方法

Info

Publication number: JP5397932B2
Application number: JP2008133885A
Authority: JP
Inventors: 徳子原口; 尚子荒神; 泰平岡
Original assignee: National Institute of Information and Communications Technology
Current assignee: National Institute of Information and Communications Technology
Priority date: 2008-05-22
Filing date: 2008-05-22
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2028-05-22
Also published as: JP2009280520A

Description

本発明は、細胞核に局在するNuf2蛋白質に特異的に反応する抗体と、それを含有するNuf2蛋白質免疫試薬、Nuf2蛋白質抗体の製造方法、Nuf2蛋白質抗体製造用の抗原、Nuf2蛋白質の検知方法、Nuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質の検知方法に関する。

特定の蛋白質に特異的に結合する抗体は、ライフサイエンス分野の研究ツールなどとして頻用されている。細胞核に関する研究が活発になり、細胞核に局在する蛋白質に結合する抗体の需要が高まっている。
細胞核を構成するセントロメアタンパク質にNuf2があることが既に知られている（非特許文献１など）。
Human NUF2 interacts with centromere-associated protein Eand is essential for a stable spindle microtubule-kinetochore attachment. Liu Det al., J Biol Chem 282:21415-24 (2007)

生物種を越えて共通に、体細胞分裂から減数分裂に移行すると、染色体の配置が、セントロメアが束ねられた構造からテロメアが束ねられた構造へと、核内で劇的に変化する。
本発明者らは、分裂酵母細胞を用いて、体細胞分裂期にセントロメアをSPB に留める分子や減数分裂前期にテロメアをSPB に留める分子の検索を行い、分裂酵母とヒトで共通に存在するセントロメアタンパク質Nuf2およびテロメアタンパク質Rap1 を同定した。Nuf2蛋白質の働きを解析した結果、染色体の分離に必須の働きをもつことが明らかになった。

Nuf2蛋白質に特異的に結合する抗体には、市販されているものがあるが（ABCAM社製品、http://www.abcam.co.jp/index.html?datasheet=17058）、特異性の程度が高くなく、研究用試薬としての信頼性が十分高くはなかった。
抗体やその製法に関する従来技術には、特許文献１〜７などもあるが、Nuf2蛋白質の抗体に関しての開示はなかった。

特開２００６−３１２６２１「３，４−ＤＧＥに由来するＡＧＥｓに特異的に反応する抗体」特開平１１−２７９２００「ジチロシンポリクローナル抗体とその製造方法並びにこれに用いる抗原及びその製造方法」特開平１０−２１８８９６「ポリクローナル抗体とその製造法並びにこれに用いる抗原及びその製造法」特開平１０−７２４９９「ポリクローナル抗体および製造方法」特開２００８−２９３５３「抗ヒト可溶性フィブリンモノクローナル抗体の製造方法」特開２００７−３１４４９３「モノクローナル抗体、その製造方法、及び用途」特開２００７−２４４２６８「イヌの造血前駆細胞を認識するモノクローナル抗体の製造方法」

そこで、本発明は、特異性の高いNuf2蛋白質抗体と、それを含有するNuf2蛋白質免疫試薬、Nuf2蛋白質抗体の製造方法、Nuf2蛋白質抗体製造用の抗原、Nuf2蛋白質の検知方法、Nuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質の検知方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、本発明は次の構成を備える。
すなわち、本発明のNuf2蛋白質抗体は、Nuf2蛋白質に特異的に反応する抗体であって、Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFMSをエピトープ（抗原決定基）として有する抗原を用いて、宿主動物を免疫感作した後、その宿主動物の体液より単離精製することによって得られたことを特徴とする。

ここで、宿主動物をウサギとし、宿主動物の体液を血清としてもよい。

抗体をポリクローナル抗体としてもよい。

抗体をモノクローナル抗体としてもよい。

本発明のNuf2蛋白質免疫試薬は、上記Nuf2蛋白質抗体を含有する免疫試薬であることを特徴とする。

本発明のNuf2蛋白質抗体の製造方法は、Nuf2蛋白質に特異的に反応する抗体の製造方法であって、Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFMSをエピトープとして有する抗原を用いて、宿主動物を免疫感作し、宿主動物による抗体の産出が略最大になった時に、その宿主動物の体液を抽出し、その体液から抗体を単離精製することを特徴とする。

本発明のNuf2蛋白質抗体製造用抗原は、Nuf2蛋白質に特異的に反応する抗体の製造に用いる抗原であって、Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFMSをエピトープとして有することを特徴とする。

本発明のNuf2蛋白質の検知方法は、Nuf2蛋白質を検知する方法であって、上記Nuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、免疫染色法によって、抗原の局在を顕微鏡下で検知することを特徴とする。

ここで、上記Nuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、ウエスタンブロット法によって、抗原の存在を検知してもよい。

上記Nuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、免疫沈降法によって、抗原の存在を検知してもよい。

本発明のNuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質の検知方法は、Nuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質を検知する方法であって、上記Nuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、共免疫沈降法によって、抗原と特異的に複合体を形成する別の蛋白質を検知することを特徴とする。

本発明は、上記構成を備えることにより次の効果を奏する。
すなわち、Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFMSをエピトープとして有する抗原を用いて抗体を生成することにより、特異性の高いNuf2蛋白質抗体を得ることができ、それを用いてNuf2蛋白質の検知や、Nuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質の検知を行える。

以下、本発明の実施形態を、図面に示す実施例を基に説明する。なお、実施形態は下記の例示に限らず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、前記特許文献など従来公知の技術を用いて適宜設計変更可能である。
従来はNuf2蛋白質を特異的に結合する有効な抗体はなかったが、本発明者らは、Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうちCGGDYSAKIDEKTAELKRKMFMSを抗原のエピトープとして有する抗原を用いて、ウサギを免疫感作し、その抗体の産出が略最大になった時に血清を抽出し、抗体を単離精製することに成功した。

抗体の調製方法は、宿主動物への免疫感作を行うことにより抗体を産生する従来公知の方法を適宜利用できる。
免疫感作させる宿主動物の種類は、特に制限されず、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、モルモット等の哺乳類、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類などが使用できる。
抗原の投与方法も、特に制限されず、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与などが適宜利用できる。

ポリクローナル抗体を調製する場合には、免疫感作させた宿主動物の血清や腹水液等の体液を回収し、抗体を単離精製すればよい。
モノクローナル抗体を調製する場合には、例えば、免疫感作させた宿主動物における脾臓細胞やリンパ球様細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、そのハイブリドーマを増殖させ、特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離精製すればよい。

ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の精製方法も、特に制限されず、例えば、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などが適宜利用できる。

抗体の産生をスクリーニングする方法も、特に制限されず、例えば、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法などが適宜利用できる。

このようにして得られる抗体は、それ自体を抗体として使用してもよいし、酵素処理等を施して得られる抗体の活性フラグメントとして使用してもよいし、他の薬剤等と混合させて試薬等として使用してもよい。

実施例：
図１は、抗原の精製を確認したマススペクトルである。
抗原の調整は常法によって行い、ペプチドは、Hisタグを付けて蛋白質を発現、精製、Hisタグの切り離し、精製、という過程で行った。グラフのピークにより目的の分子イオンが示され、得られた抗原ペプチドの品質の良さが確認された。

図２は、ウサギへの免疫スケジュールを示した表であり、図３は、その免疫による抗体力価の変化を示した表である。
抗原の溶液を、等量のフロイント完全アジュバントと混合してエマルジョン化させ、ウサギの背部皮下20箇所に投与した。投与量は、蛋白質量で2mgとした。
隔週投与し、２次免疫以降では、等量のフロイント不完全アジュバントと混合したエマルジョンを用い、投与量は、蛋白質量で1mgとした。

初回の免疫開始時より経時的に採血を行い、ELISA法により抗体力価を測定した。
採血は、耳静脈から行い血清量で2mlとした。７週後に全採血を、頸動脈から行い血清量で78mlを得た。抗体力価は、４回の免疫で十分な上昇が確認された。

図４は、本発明のNuf2蛋白質抗体を用い、免疫染色法によって、抗原の局在を顕微鏡下で検知した写真である。
培養細胞の細胞核にある染色体を染めるDAPI染色（ピンク色）と共に、Nuf2蛋白質（緑色）の局在が示された。図４（ａ）は、細胞周期がprometaphase、図４（ｂ）は、細胞周期がmetaphaseのものである。

図５は、本発明のNuf2蛋白質抗体を用い、ウエスタンブロット法によって、抗原の存在を検知した写真である。
図示の例では、５００倍、１０００倍、５０００倍に希釈したものを示した。５０００倍に希釈したものでも、Nuf2蛋白質の分子量を示す５０KDaで特異的なバンドを確認できた。

本発明では、従来公知の免疫染色法やウエスタンブロット法や免疫沈降法を適宜利用して、Nuf2蛋白質を検知することができる。
免疫染色法は、抗体を用いて試料中の抗原を検出する組織化学的手法であり、本来不可視である免疫反応を可視化するために発色操作を伴う。また、電気泳動した蛋白質分子を特定の膜に転移させ、抗体で免疫染色する方法がウェスタンブロッティング法である。

免疫反応には、抗原に直接反応する一次抗体を標識し、免疫反応を1度しか行わない直接法も、標識していない一次抗体を用いて1度目の免疫反応を行い、一次抗体を抗原とする別の二次抗体を標識し、さらに免疫反応させる間接法も利用できる。なお、一般に免疫反応を反復するほど増幅されるので検出感度を高めることができるが、特異性が低下する。

染色には、抗体に色素や蛍光色素を結合させる方法の他、標識として放射性同位元素を結合させておき印画紙に感光させるオートラジオグラフィーや、金銀粒子を結合させておき電子顕微鏡等で観察する金コロイド法や金コロイド銀増感法や、特定の酵素を結合させておき色素生成物の呈色を光学顕微鏡で観察する酵素抗体法や免疫ペルオキシダーゼ法などが適宜利用できる。

また、免疫沈降法により、抗原と抗体を特異的に反応させ沈殿させることで、抗原を検出してもよい。通常は抗体をセファロースビーズなどの担体に結合させて沈殿しやすくする。なお、ポリクローナル抗体は、複数の部位を認識するため、モノクローナル抗体よりも適しているが、非特異的吸着も起こりやすい。

本発明では、共免疫沈降法によって、Nuf2蛋白質と特異的に複合体を形成する別の蛋白質を検知、蛋白質間の相互作用に関する知見を得ることも可能である。
共免疫沈降法は、免疫沈降法により、目的の蛋白質と特異的に複合体を形成する別の蛋白質との複合体を回収する方法である。これに、質量分析等を組み合わせて、既知の蛋白質と相互作用する未知の蛋白質の特定に利用してもよい。

本発明によると、細胞核に局在するNuf2蛋白質に対して特異性の高い抗体が得られるので、ライフサイエンス分野の研究に寄与する。例えば、生殖医療研究において問題になっている生殖細胞の形成異常など様々な生殖分裂や体細胞分裂の異常に由来する疾患の研究において、そのメカニズムを究明するのに有用であり、産業上利用価値が高い。

抗原のマススペクトルウサギへの免疫スケジュールを示した表免疫による抗体力価の変化を示した表本発明のNuf2蛋白質抗体を用い、免疫染色法によって抗原の局在を顕微鏡下で検知した写真（ａ）は、細胞周期がprometaphase、（ｂ）は、細胞周期がmetaphase 本発明のNuf2蛋白質抗体を用い、ウエスタンブロット法によって抗原の存在を検知した写真

Claims

Nuf2蛋白質のエピトープCGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSに特異的に反応するポリクローナル抗体であって、
Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSを唯一のエピトープとして有する抗原を用いて、宿主動物（ヒトを除く）を免疫感作した後、その宿主動物（ヒトを除く）の体液より単離精製することによって得られた
ことを特徴とするNuf2蛋白質抗体。
Nuf2蛋白質のエピトープCGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSに特異的に反応するモノクローナル抗体であって、
Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSを唯一のエピトープとして有する抗原を用いて、宿主動物（ヒトを除く）を免疫感作した後、その宿主動物（ヒトを除く）の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離精製することによって得られた
ことを特徴とするNuf2蛋白質抗体。
宿主動物（ヒトを除く）がウサギであり、宿主動物（ヒトを除く）の体液が血清である
請求項１または２に記載のNuf2蛋白質抗体。
抗体を含有する免疫試薬であって、
抗体が請求項１ないし３に記載のNuf2蛋白質抗体である
ことを特徴とするNuf2蛋白質免疫試薬。
Nuf2蛋白質のエピトープCGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSに特異的に反応する抗体の製造方法であって、
Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSを唯一のエピトープとして有する抗原を用いて、宿主動物（ヒトを除く）を免疫感作し、
宿主動物（ヒトを除く）による抗体の産出が略最大になった時に、その宿主動物（ヒトを除く）の体液を抽出し、
その体液から抗体を単離精製する
ことを特徴とするNuf2蛋白質抗体の製造方法。
Nuf2蛋白質に特異的に反応する抗体の製造に用いる抗原であって、
Nuf2蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、CGGDYSAKIDEKTAELKRKMFKMSを唯一のエピトープとして有する
ことを特徴とするNuf2蛋白質抗体製造用抗原。
Nuf2蛋白質を検知する方法であって、
請求項１ないし３に記載のNuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、
免疫染色法によって、抗原の局在を顕微鏡下で検知する
ことを特徴とするNuf2蛋白質の検知方法。
Nuf2蛋白質を検知する方法であって、
請求項１ないし３に記載のNuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、
ウエスタンブロット法によって、抗原の存在を検知する
ことを特徴とするNuf2蛋白質の検知方法。
Nuf2蛋白質を検知する方法であって、
請求項１ないし３に記載のNuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、
免疫沈降法によって、抗原の存在を検知する
ことを特徴とするNuf2蛋白質の検知方法。
Nuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質を検知する方法であって、
請求項１ないし３に記載のNuf2蛋白質抗体と、細胞または組織の蛋白質画分を有する試料を用い、
共免疫沈降法によって、抗原と特異的に複合体を形成する別の蛋白質を検知する
ことを特徴とするNuf2蛋白質と相互作用する別の蛋白質の検知方法。