JP5400764B2 - 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 - Google Patents
中皮腫特異的プロモータおよびその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5400764B2 JP5400764B2 JP2010507188A JP2010507188A JP5400764B2 JP 5400764 B2 JP5400764 B2 JP 5400764B2 JP 2010507188 A JP2010507188 A JP 2010507188A JP 2010507188 A JP2010507188 A JP 2010507188A JP 5400764 B2 JP5400764 B2 JP 5400764B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mesothelioma
- gene
- promoter
- cri1
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 title claims description 98
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 63
- 108050005167 EP300-interacting inhibitor of differentiation 1 Proteins 0.000 claims description 61
- 102100037250 EP300-interacting inhibitor of differentiation 1 Human genes 0.000 claims description 40
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 23
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 19
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 14
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 14
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 8
- 201000005282 malignant pleural mesothelioma Diseases 0.000 description 8
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 5
- 206010035603 Pleural mesothelioma Diseases 0.000 description 5
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010028326 Calbindin 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 4
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 4
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 4
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 4
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 3
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 101150056981 BID gene Proteins 0.000 description 2
- 102000051485 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 2
- 108700038897 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 2
- 102000016843 Calbindin 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000014861 EP300-interacting inhibitor of differentiation 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 2
- 102000055104 bcl-X Human genes 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 238000010176 18-FDG-positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 2-deoxy-2-((18)F)fluoro-alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H]([18F])[C@@H](O)[C@@H]1O ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058354 Bronchioloalveolar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010063599 Exposure to chemical pollution Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 1
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000016992 lung adenocarcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000024407 malignant pericardial mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 201000004266 pericardial mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 201000002513 peritoneal mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 238000011470 radical surgery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータに関する。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００８−１０４０７０号優先権を請求する。
胸部の肺あるいは心臓などの臓器や胃腸・肝臓などの腹部臓器は、それぞれ、胸膜・腹膜・心膜などという膜に包まれている。これらの膜の表面をおおっているのが「中皮」である。中皮腫とは、中皮細胞由来の腫瘍の総称をいい、悪性および良性の双方がある。発生場所は胸膜が多く、他に腹膜や心膜などがあり、それぞれ胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫という。中皮腫はアスベスト（石綿）との関連で論じられることが多いが、この場合の中皮腫は、ほとんどが悪性胸膜中皮腫のことをいう。
中皮腫は、アスベストの曝露が多いほど、また曝露歴が長いほど、リスクが高くなり、アスベストに曝露してから中皮腫が発生するまでの期間が長いのが特徴である。発生までに、早い場合で２０年前後、平均で約４０年程度の時間がかかるといわれている。アスベスト暴露と喫煙のリスクを併せ持つ人の肺癌の罹患率が数倍〜５０倍になることが指摘されているが、中皮種と喫煙の関連はほとんどないといわれている。
中皮腫の診断方法としては、画像所見、胸水の細胞診、組織生検および腫瘍マーカーの検出などが挙げられる。画像所見では多くの場合、Ｘ線では胸膜外徴候 (extrapleural sign)や胸水貯留を認める。通常は片側性である。胸部ＣＴでも同様の所見を得ることができる。またFDG-PETでは、集積像を認める。胸水の細胞診では腫瘍細胞を認める場合がある。組織生検はきわめて重要で確定診断をする最大の根拠となる。中皮腫のマーカーとして、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)（非特許文献１〜３）、Calretinin（非特許文献４、５）、Mesothelin（非特許文献５）、ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)（非特許文献６）の発現が認められることが報告されている。 なお、ＣＲＩ１は、CarimらのEST cluster解析によりC15ORF13として同定されたことが報告され（非特許文献７）、Gordonらの解析により中皮腫に有意に発現することが報告されている（非特許文献６）が、病原性に関する報告はない。ＣＲＩ１をコードする遺伝子の配列は、GenBank Accession No. NM_014335に登録されており、別名EP300 interacting inhibitor of differentiation 1（ＥＩＤ１）ともいう。
中皮腫の治療方法は、病期、例えば限局型胸膜中皮腫（I期）または進展型胸膜中皮腫（II、III、IV期）によっても異なる。例えば限局型胸膜中皮腫（I期）の場合には、治療は胸膜の１部とその周囲の組織を除去する外科療法が行われる。腫瘍が胸膜のより広い範囲にあれば、治療は症状を軽減するために胸膜とその近傍の組織を取り除く外科療法を行い、場合によっては放射線療法や化学療法を行う場合もある。進展型胸膜中皮腫（II 、III、IV期）の場合は、その病期によっても異なるが、例えば胸部から液体を除去する胸腔穿刺や、外科療法、放射線療法、化学療法が行われる。中皮腫は、臓器転移を起こすことはほとんどないものの、診断時にすでに広範囲に進展し、根治手術が不可能であることが多い。予後はきわめて不良で、１年生存率が５０％、２年生存率が２０％であるといわれている。
近年、疾患に対する治療方法の一つとして、遺伝子治療の試みが多くなされている。このような遺伝子治療のために使用可能なベクターについても各種報告があり、抗腫瘍剤として応用されることが期待されている（特許文献１、２）。遺伝子治療に用いられるベクターの１種として、アデノウイルスベクター（「Ａｄベクター」ともいう。）が挙げられる。現在、遺伝子治療用ベクターとして用いられるＡｄベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトＡｄを基盤としている。
Ａｄベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。しかしながら、Ａｄベクターを腫瘍局所へ投与した場合、一部のＡｄベクターは腫瘍から全身循環に漏出する場合がある。目的とする疾患部位以外で遺伝子が発現すると、好ましくない副作用が生じることが懸念される。例えば、遺伝子発現細胞に対して毒性を示すような遺伝子を用いる場合は、中皮腫である腫瘍のみならず腫瘍ではない組織に対しても毒性を示してしまう場合がある。目的とする細胞や組織のみで所望の遺伝子を発現させることができれば、副作用を伴うことなく、効果的な遺伝子治療が行うことができると考えられる。
Differentiation, 65: 89-96, 1999 Cancer Research, 61: 921-925, 2001 J. Pathol., 199: 479-487, 2003 Human Pathology, 34: 994-1000, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 136-140, 1996 Am. J. Pathol., 166: 1827-1840, 2005 Cytogenet. Cell Genet., 88: 330-332, 2000 特開２００７−２０９３２８号公報
特開２００７−１９００２２号公報
Differentiation, 65: 89-96, 1999 Cancer Research, 61: 921-925, 2001 J. Pathol., 199: 479-487, 2003 Human Pathology, 34: 994-1000, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 136-140, 1996 Am. J. Pathol., 166: 1827-1840, 2005 Cytogenet. Cell Genet., 88: 330-332, 2000
本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータを提供することを課題とする。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中皮腫マーカーに着目し、中皮腫マーカーに関するプロモータであって、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞や中皮を含む正常細胞では転写活性を示さないプロモータを見出すことに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする新規プロモータ。
２．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、ＣＲＩ１遺伝子の-2586〜+84の領域から選択される配列である、前項１に記載の新規プロモータ。
３．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、配列表の配列番号１〜１１に記載のいずれかである、前項１または２に記載の新規プロモータ。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の新規プロモータを搭載してなるウイルスベクター。
５．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである前項４に記載のウイルスベクター。
６．アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである前項５に記載のウイルスベクター。
７．さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
８．前項４〜７のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
９．前項８に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
１０．さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
１１．マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である前項１０に記載のウイルスベクター。
１２．前項１０または１１に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
１３．前項１２に記載の中皮腫診断用ウイルスベクターを用い、マーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法。
１．ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする新規プロモータ。
２．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、ＣＲＩ１遺伝子の-2586〜+84の領域から選択される配列である、前項１に記載の新規プロモータ。
３．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、配列表の配列番号１〜１１に記載のいずれかである、前項１または２に記載の新規プロモータ。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の新規プロモータを搭載してなるウイルスベクター。
５．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである前項４に記載のウイルスベクター。
６．アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである前項５に記載のウイルスベクター。
７．さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
８．前項４〜７のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
９．前項８に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
１０．さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４〜６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
１１．マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である前項１０に記載のウイルスベクター。
１２．前項１０または１１に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
１３．前項１２に記載の中皮腫診断用ウイルスベクターを用い、マーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法。
本発明の新規プロモータは、中皮腫に有意な転写活性を示し、他種癌細胞および中皮腫を含む正常細胞での活性は低値であった。このことより、当該プロモータを搭載した細胞死誘導型または細胞融解誘導型ベクターを利用することで、効果的に中皮腫特異的に細胞死または細胞融解作用を誘導することができる。また、また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。in vitroおよびin vivoでの確認の結果、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合に、本発明のプロモータとともに、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子として組み込むことで、中皮腫特異的にＡｄが増殖し、中皮腫を消滅させることができる。上記により、中皮腫にとって効果的な治療剤を提供することができる。
本発明のＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)は、背景技術の欄に示すとおり、非特許文献６および７に報告されたもの (GenBank Accession No. NM_014335)であるが、本発明のＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータは、染色体１５ｑ２１(Chromosome 15 q21, GenBank Accession No. NW_925884.1）に示す塩基配列より選択される。
具体的には、配列表のGenBank Accession No. NW_925884.1に示す塩基配列のうち、ＣＲＩ１遺伝子の上流部分であり、ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1とした場合に、-2586〜+84（配列番号１）の領域より選択される。より詳しくは、-1849〜+84（配列番号２）より選択され、さらには-1674〜+84（配列番号３）より選択され、-1587〜+84（配列番号４）より選択され、-1083〜+84（配列番号５）より選択され、-766〜+84（配列番号６）より選択され、-567〜+84（配列番号７）より選択され、-366〜+84（配列番号８）より選択され、-296〜+84（配列番号９）より選択され、最も好ましくは、-138〜+84で示される塩基配列（配列番号１０）からなるプロモータである。また、-74〜+84（配列番号１１）で示される塩基配列からなるプロモータであってもよい。配列表の配列番号１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-2586/+84、配列番号２に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1849/+84、配列番号３に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1674/+84、配列番号４に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1587/+84、配列番号５に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1083/+84、配列番号６に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-766/+84、配列番号７に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-567/+84、配列番号８に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-366/+84、配列番号９に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-296/+84、配列番号１０に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-138/+84、配列番号１１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-74/+84、と表すことができる。
本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする。本発明のプロモータは、悪性胸膜中皮腫細胞株、例えば２１１Ｈ細胞やＨ２４５２細胞では有意に転写活性を認めるが、肺癌由来細胞株、例えばヒト扁平上皮肺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト細気管支肺胞上皮癌由来Ｈ３２２細胞では殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。また本発明のプロモータは、正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞や正常中皮細胞においても殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。
本発明の新規プロモータを搭載してなるベクターは、使用の目的に応じて適宜選択することができるが、ウイルスベクターが好適に用いられる。また、ウイルスベクターとしては、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターが好適に用いられる。本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、チンパンジーＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。Ａｄは、特定の細胞でのみ増殖するもの、例えば、Ｅ１欠損型Ａｄや制限増殖型Ａｄであってもよい。Ｅ１欠損型Ａｄは、２９３細胞（細胞内にＥ１を有する）でのみ繁殖することができ、制限増殖型Ａｄは、例えば特定の癌細胞でのみ増殖することができる。
本発明のプロモータを、中皮腫特異的に発現させたい遺伝子とともに発現可能なベクターに組み込み、搭載することができる。プロモータの塩基配列は、例えば配列番号１〜１１のいずれかに示す塩基配列からなるもの選択することができる。組み込むプロモータの数は、ベクターに組み込み可能な長さであればよく、特に制限されず、複数個のプロモータを組み込んでも良い。また、本発明において、ベクターに搭載しうる中皮腫特異的に発現させたい遺伝子を、導入遺伝子という。
本発明における導入遺伝子として、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。例えば、本発明のプロモータとともに、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子をベクターに組み込むことで、中皮腫特異的に細胞死や細胞融解を誘導させることができ、正常細胞には影響を及ぼすことなく、効果的に中皮腫治療に使用することができる。
また、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合には、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子とし、本発明のプロモータとともに導入することができる。これにより、中皮腫特異的にＡｄが増殖することで、中皮腫細胞のＡｄ感染により中皮腫細胞を消滅させることができる。
本発明のベクターの作製は、作製工程において１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。
本発明のベクター、例えばＡｄベクターは以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程；
３）Ａｄゲノムを準備する工程；
４）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをＡｄゲノムにライゲーションする工程。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程；
３）Ａｄゲノムを準備する工程；
４）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをＡｄゲノムにライゲーションする工程。
本発明は、プロモータを組み込んだベクターにも及び、具体的には該プロモータと、該プロモータの下流に導入遺伝子を搭載してなる組換えベクターにも及ぶ。導入遺伝子とは具体的には、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。
本発明のプロモータの下流に上記導入遺伝子を搭載したベクターを中皮腫治療剤として利用することができる。本発明は、該導入遺伝子を組み込みこんだ組換えベクターを有効成分とする中皮腫治療剤にも及ぶ。
さらに、本発明のプロモータを組み込んだベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。具体的には、マーカー遺伝子を該プロモータの下流に搭載してなるウイルスベクターを用いることによる。本発明のプロモータは中皮腫に有意な転写活性を有することから、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現し、中皮腫を検査することができる。マーカー遺伝子としては、検査に使用可能なタンパク質を発現しうるものであれば良く、特に限定されないが、例えば蛍光タンパク質が挙げられ、より具体的にはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）が挙げられる。本発明は、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現しうる中皮腫検査用ウイルスベクターにも及び、該中皮腫検査用ウイルスベクターを用いてマーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法にも及ぶ。
以下に、本発明のプロモータおよび該プロモータを組み込んだ組換えベクターについて、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）各種プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
中皮腫マーカーとしてＣＲＩ１、Calretinin、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)およびMesothelinについて、各マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ(Luciferase)遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図１に示した。ここで、Calretinin遺伝子由来プロモータは、染色体１６ｑ２１．１(Chromosome 16 q21.1, GenBank Accession No. NT_010498.15）、ＷＴ１遺伝子由来プロモータは、染色体１１ｐ３(Chromosome 11 p3, GenBank Accession No. NT_079237.17）、Mesothelin遺伝子由来プロモータは、染色体１６(Chromosome 16, GenBank Accession No. NT_037887.4）の各配列から選択される。各マーカー遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータ領域の配列は、配列表の配列番号２または１２〜１４のいずれかで表され、具体的には以下に示される。
ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84 （配列番号２）
Calretinin遺伝子プロモータ：-2179/+70 （配列番号１２）
ＷＴ１遺伝子プロモータ：-1887/+39 （配列番号１３）
Mesothelin遺伝子プロモータ：-2310/+44 （配列番号１４）
１）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
中皮腫マーカーとしてＣＲＩ１、Calretinin、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)およびMesothelinについて、各マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ(Luciferase)遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図１に示した。ここで、Calretinin遺伝子由来プロモータは、染色体１６ｑ２１．１(Chromosome 16 q21.1, GenBank Accession No. NT_010498.15）、ＷＴ１遺伝子由来プロモータは、染色体１１ｐ３(Chromosome 11 p3, GenBank Accession No. NT_079237.17）、Mesothelin遺伝子由来プロモータは、染色体１６(Chromosome 16, GenBank Accession No. NT_037887.4）の各配列から選択される。各マーカー遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータ領域の配列は、配列表の配列番号２または１２〜１４のいずれかで表され、具体的には以下に示される。
ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84 （配列番号２）
Calretinin遺伝子プロモータ：-2179/+70 （配列番号１２）
ＷＴ１遺伝子プロモータ：-1887/+39 （配列番号１３）
Mesothelin遺伝子プロモータ：-2310/+44 （配列番号１４）
２）各プロモータの中皮腫または肺癌細胞における転写活性の確認
ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、上記各プロモータを挿入した発現コンストラクトを作製した(pGL3 Luciferase Reporter Vectors, Promega社, Technical Manual No.033参照）。悪性胸膜中皮腫細胞株４株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ、Ｈ２０５２、Ｈ２８）および肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）の各細胞を、６ウェルプレートに、細胞数薬４×１０６を３ウェルずつ播種し、各細胞について生着を確認後、形質導入試薬Lipofectin(R)（Invitrogen社）を用いて、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、上記各プロモータを挿入した発現コンストラクトを作製した(pGL3 Luciferase Reporter Vectors, Promega社, Technical Manual No.033参照）。悪性胸膜中皮腫細胞株４株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ、Ｈ２０５２、Ｈ２８）および肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）の各細胞を、６ウェルプレートに、細胞数薬４×１０６を３ウェルずつ播種し、各細胞について生着を確認後、形質導入試薬Lipofectin(R)（Invitrogen社）を用いて、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
その結果、各マーカー遺伝子由来のプロモータは、中皮腫細胞特異的に転写活性を示し、肺癌細胞には低い転写活性を示す傾向であった。特に、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84の場合は、他のプロモータに比べて、中皮腫細胞特異的に転写活性を認め、肺癌細胞では低い転写活性しか認めなかった（図２）。
３）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの正常細胞における転写活性の確認
上記２）と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に各プロモータ領域を挿入した各発現コンストラクトを作製した。正常中皮細胞、正常胸膜細胞（ラット胸膜由来の4/4RM-4細胞）および正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞の各細胞を上記２）と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
上記２）と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に各プロモータ領域を挿入した各発現コンストラクトを作製した。正常中皮細胞、正常胸膜細胞（ラット胸膜由来の4/4RM-4細胞）および正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞の各細胞を上記２）と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
その結果、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84（ＣＲＩ１-2586/+84）の場合は、正常細胞に対して低い転写活性であったが、その他の各マーカー由来のプロモータは、正常細胞でも転写活性を認めた（図３）。
以上の結果により、ＣＲＩ１-2586/+84は、正常細胞および肺癌細胞に対しては低い転写活性であったが、中皮腫に対しては高い転写活性を認め、中皮腫特異的に転写活性を発揮することが確認された。
（実施例２）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分について、長さの異なる各領域を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図４に示した。
ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータは、以下に示す配列番号に示す塩基配列よりなる。
ＣＲＩ１-2586/+84（配列番号１）
ＣＲＩ１-1849/+84（配列番号２）
ＣＲＩ１-1674/+84（配列番号３）
ＣＲＩ１-1587/+84（配列番号４）
ＣＲＩ１-1083/+84（配列番号５）
ＣＲＩ１-766/+84（配列番号６）
ＣＲＩ１-567/+84（配列番号７）
ＣＲＩ１-366/+84（配列番号８）
ＣＲＩ１-296/+84（配列番号９）
ＣＲＩ１-138/+84（配列番号１０）
ＣＲＩ１-74/+84（配列番号１１）
１）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分について、長さの異なる各領域を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図４に示した。
ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータは、以下に示す配列番号に示す塩基配列よりなる。
ＣＲＩ１-2586/+84（配列番号１）
ＣＲＩ１-1849/+84（配列番号２）
ＣＲＩ１-1674/+84（配列番号３）
ＣＲＩ１-1587/+84（配列番号４）
ＣＲＩ１-1083/+84（配列番号５）
ＣＲＩ１-766/+84（配列番号６）
ＣＲＩ１-567/+84（配列番号７）
ＣＲＩ１-366/+84（配列番号８）
ＣＲＩ１-296/+84（配列番号９）
ＣＲＩ１-138/+84（配列番号１０）
ＣＲＩ１-74/+84（配列番号１１）
２）各プロモータの各細胞における転写活性の確認
上記実施例１と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータを挿入した各発現コンストラクトを作製した。悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）を実施例１と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
上記実施例１と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータを挿入した各発現コンストラクトを作製した。悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）を実施例１と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
その結果、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータは、全てについて悪性胸膜中皮腫細胞で強い転写活性を認めたのに対し、肺癌細胞および正常細胞では、低い転写活性であった。特に、ＣＲＩ１-296/+84、ＣＲＩ１-138/+84、ＣＲＩ１-74/+84の各プロモータを用いた場合に、より中皮腫特異性が認められ、特にはＣＲＩ１-138/+84において最も中皮腫特異性が認められた（図５）。
（実施例３）治療型遺伝子組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの作製
導入遺伝子およびその上流にＣＲＩ１遺伝子プロモータ（ＣＲＩ１-138/+84）を搭載したＡｄベクターを作製した。導入遺伝子として、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）またはＡｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。
導入遺伝子およびその上流にＣＲＩ１遺伝子プロモータ（ＣＲＩ１-138/+84）を搭載したＡｄベクターを作製した。導入遺伝子として、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）またはＡｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトの構築
導入遺伝子として、（Ａ）細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子配列を結合したもの、と（Ｂ）Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。（Ａ）または（Ｂ）の上流領域に、ＣＲＩ１-138/+84を直列で４つ連結したものを結合し、各発現コンストラクトを作製した。
導入遺伝子として、（Ａ）細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子配列を結合したもの、と（Ｂ）Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。（Ａ）または（Ｂ）の上流領域に、ＣＲＩ１-138/+84を直列で４つ連結したものを結合し、各発現コンストラクトを作製した。
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターの構築
上記１）で構築した発現コンストラクトを含むシャトルベクターをTong-Chuan Heら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2509-2514, 1998に記載の方法にしたがって構築した。
上記１）で構築した発現コンストラクトを含むシャトルベクターをTong-Chuan Heら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2509-2514, 1998に記載の方法にしたがって構築した。
３）Ａｄベクターの作製
Ｅ１欠損型の５型Ａｄゲノムを準備し、Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターを、He らの方法に従い相同組換え(homologous recombination) を行うことで、上記各種発現コンストラクトを搭載したＡｄ（Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ）を得た。本実施例においてＢＩＤ発現コンストラクトにＨＡタグを結合したのは、内在性のＢＩＤと識別するためである。
Ｅ１欠損型の５型Ａｄゲノムを準備し、Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターを、He らの方法に従い相同組換え(homologous recombination) を行うことで、上記各種発現コンストラクトを搭載したＡｄ（Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ）を得た。本実施例においてＢＩＤ発現コンストラクトにＨＡタグを結合したのは、内在性のＢＩＤと識別するためである。
（実験例１）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤの中皮腫細胞に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤについて中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照として、同手法にて作製したＧＦＰ(green fluorescent protein)を発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、いずれのＡｄベクターもＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型であるが、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）を含むか、非毒性のＧＦＰ遺伝子を含む点において相違する。
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤについて中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照として、同手法にて作製したＧＦＰ(green fluorescent protein)を発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、いずれのＡｄベクターもＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型であるが、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）を含むか、非毒性のＧＦＰ遺伝子を含む点において相違する。
得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ｈ３２２、Ａ５４９）、正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）および肺癌以外の癌細胞株２株（肝癌細胞：Ｈｅｐ３Ｂ、乳癌細胞：ＭＣＦ７）に感染させた。Ａｄ感染後の各細胞における細胞死について、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）染色後のフローサイトメトリー法による定量を行った。
その結果、図７に示すように、細胞死誘導遺伝子を含むＡｄを感染した悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）では、細胞周期Ｇ１とＧ０の間にピークが出現するsubＧ０／Ｇ１ポピュレーションの増加を認め、アポトーシスが起こっていることが確認された。一方、肺癌細胞、正常細胞およびその他の癌細胞では、細胞死誘導遺伝子を含む場合と含まない場合で、フローサイトメトリーのパターンに違いは認められなかった。以上の結果より、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤは、中皮腫細胞特異的に発現することが確認された。
（実験例２）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫細胞に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、中皮腫細胞に及ぼす効果を調べた。実験例１と同様に対照としてＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能であるが、ＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターは中皮腫細胞において非増殖型である点において相違する。
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、中皮腫細胞に及ぼす効果を調べた。実験例１と同様に対照としてＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能であるが、ＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターは中皮腫細胞において非増殖型である点において相違する。
得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）、および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）に導入し、生存細胞数を測定した。生存細胞の測定は、ＭＴＳアッセイ（生細胞内においてテトラゾリウム塩 (MTS* [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt]) がホルマザンへ変換される反応に基づき、培養液中に放出された水溶性ホルマザンを490 nmで測定するアッセイ）により行った。
その結果、図８に示すようにＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて中皮腫細胞は明らかに減少することが確認されたが、正常細胞ではＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳの場合と差が認められなかった。以上の結果より、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａによっても、中皮腫細胞特異的に殺細胞効果を有することが確認された。
（実験例３）Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫(in vivo)に対する効果
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、in vivoでの中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照ベクターとして、実験例１および２と同様に、ＧＦＰを発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここで、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）または非毒性のＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターはＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型である。また、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能である。
実施例３で得たＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、in vivoでの中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照ベクターとして、実験例１および２と同様に、ＧＦＰを発現する遺伝子を組み込んだＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここで、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）または非毒性のＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターはＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型である。また、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能である。
中皮腫モデルマウスは、週齢６週の雌BALB/c ヌードマウスの皮下に2.5×106個の２１１Ｈ細胞を接種して作製した。２１１Ｈ細胞接種後８日目の中皮腫モデルマウスに、ＰＢＳ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰ、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ を、5×107 pfu (plaque forming unit)ずつ３日連続局所投与し、接種後５６日間腫瘍の大きさを観察した（各条件についてｎ＝８）。
その結果、図９に示すように、Ａｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ−ＢＩＤまたはＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、対照であるＡｄ−ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて、抗腫瘍効果が認められた。
以上詳述したように、本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を有することが確認された。また、該新規プロモータおよび細胞死誘導遺伝子などを搭載するベクターを細胞に導入することにより、中皮腫特異的にアポトーシスの作用が認められ、殺細胞作用を示すことが確認された。また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、中皮腫特異的に何らかの作用をさせたい場合に利用することができ、例えば上述のような細胞死誘導遺伝子や、細胞融解誘導遺伝子とともに細胞に導入することで、中皮腫特異的に細胞に傷害を与えることができる。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、効果的な中皮腫治療剤となりうる。さらに、本発明の新規プロモータおよびマーカー遺伝子を含むベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。
Claims (11)
- ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列からなり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする中皮腫特異的プロモータ。
- 請求項１に記載の中皮腫特異的プロモータを１〜複数個搭載してなるウイルスベクター。
- 請求項１に記載の中皮腫特異的プロモータを４個搭載してなるウイルスベクター。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求項２または３に記載のウイルスベクター。
- アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである請求項４に記載のウイルスベクター。
- さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項３〜５のいずれか１に記載のウイルスベクター。
- 請求項３〜６のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
- 請求項７に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
- さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項３〜５のいずれか１に記載のウイルスベクター。
- マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である請求項９に記載のウイルスベクター。
- 請求項９または１０に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010507188A JP5400764B2 (ja) | 2008-04-11 | 2009-02-24 | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008104070 | 2008-04-11 | ||
| JP2008104070 | 2008-04-11 | ||
| PCT/JP2009/053256 WO2009125626A1 (ja) | 2008-04-11 | 2009-02-24 | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 |
| JP2010507188A JP5400764B2 (ja) | 2008-04-11 | 2009-02-24 | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2009125626A1 JPWO2009125626A1 (ja) | 2011-08-04 |
| JP5400764B2 true JP5400764B2 (ja) | 2014-01-29 |
Family
ID=41161761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010507188A Expired - Fee Related JP5400764B2 (ja) | 2008-04-11 | 2009-02-24 | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110065117A1 (ja) |
| EP (1) | EP2281884A4 (ja) |
| JP (1) | JP5400764B2 (ja) |
| WO (1) | WO2009125626A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5834306A (en) * | 1994-12-23 | 1998-11-10 | Sri International | Tissue specific hypoxia regulated therapeutic constructs |
| JP4219957B2 (ja) | 2000-02-02 | 2009-02-04 | アンジェスＭｇ株式会社 | 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター |
| US7943373B2 (en) * | 2004-09-29 | 2011-05-17 | Oncolys Biopharma, Inc. | Telomelysin/GFP-expressing recombinant virus |
| US20070161031A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-07-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements |
| JP2007209328A (ja) | 2006-01-13 | 2007-08-23 | Galpharma Co Ltd | ガレクチン−９利用遺伝子治療剤 |
| JP2008104070A (ja) | 2006-10-20 | 2008-05-01 | Sky Kk | カメラ付き携帯機器とカメラ付き携帯機器のためのプログラム |
-
2009
- 2009-02-24 WO PCT/JP2009/053256 patent/WO2009125626A1/ja not_active Ceased
- 2009-02-24 EP EP09731254A patent/EP2281884A4/en not_active Withdrawn
- 2009-02-24 US US12/933,892 patent/US20110065117A1/en not_active Abandoned
- 2009-02-24 JP JP2010507188A patent/JP5400764B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6013036700; Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｖｏｌ． ４８, 200704, ｐ． ７８７ * |
| JPN6013036702; 日本外科学会雑誌 第１０８巻， 臨時増刊号（２）, 200703, ｐ． ６６８ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2281884A1 (en) | 2011-02-09 |
| US20110065117A1 (en) | 2011-03-17 |
| EP2281884A4 (en) | 2011-08-31 |
| WO2009125626A1 (ja) | 2009-10-15 |
| JPWO2009125626A1 (ja) | 2011-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sayed et al. | MicroRNA-21 is a downstream effector of AKT that mediates its antiapoptotic effects via suppression of Fas ligand | |
| JP6396891B2 (ja) | 遺伝子改変コクサッキーウイルス | |
| JP2010539923A (ja) | 組織特異的プロモーターと腫瘍を標的とするトランススプライシングリボザイムとを含む組換えアデノウイルス及びその用途 | |
| JP2016505245A (ja) | 安全性及び抗がん活性が増加された組換えアデノウイルス及びこの用途 | |
| WO2006036004A1 (ja) | テロメライシン-gfp遺伝子含有組換えウイルス | |
| WO2016197592A1 (zh) | 一种长链非编码rna hnf1a-as1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用 | |
| EP2062971A1 (en) | Chimeric adenovirus, method for producing the same and pharmaceutical using the same | |
| JP2021506267A (ja) | 組換えアデノウイルスおよびこれを含む幹細胞 | |
| KR101478869B1 (ko) | 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 | |
| US9222107B2 (en) | REIC-expressing adenovirus vector | |
| JP5645044B2 (ja) | 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター | |
| JP5400764B2 (ja) | 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 | |
| JP5733705B2 (ja) | 特異的プロモーターの活性を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター | |
| KR102471898B1 (ko) | 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
| JP6153205B2 (ja) | Ｖａ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクター | |
| AU2022210147B2 (en) | Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor | |
| JP2002527455A (ja) | 組換え欠失アデノウイルスベクター | |
| CN103243091A (zh) | miRNA-140抑制剂及其用途 | |
| JP2021507718A (ja) | 遺伝子伝達用細胞シート | |
| CN113186172A (zh) | 共表达Apoptin与MEL基因的重组腺病毒及构建方法和应用 | |
| JP5812361B2 (ja) | 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター | |
| Li et al. | Construction of the pEGFP-N1-p53/MAR Vector and Its Effect on HEP3B Cell Morphology | |
| CN116904517A (zh) | 增强肝细胞增殖能力或培养肝细胞的方法及其应用 | |
| CN115651932A (zh) | 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用 | |
| Koelen | Arming ColoAd1 with tumor necrosis factor alpha and lymphotoxin alpha |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120130 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130927 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131015 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131025 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |