JP5407042B2 - Use of seselnin-1, method for predicting prognosis of synovial sarcoma, and reagent kit for testing - Google Patents
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Description
本発明は、セセルニン−１の使用、セセルニン−１を使用する滑膜肉腫の予後予測方法、及び、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットに関する。 The present invention relates to the use of seselnin-1, a prognostic method for synovial sarcoma using seselnin-1, and a test reagent kit for predicting the prognosis of a patient suffering from synovial sarcoma.
滑膜肉腫（synovial sarcoma）は、四肢関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍であり、組織学的には上皮性細胞と紡錘形細胞とからなる二相型biphasic typeと紡錘形細胞からなる単相型monophasictypeとに分類される。 Synovial sarcoma is a malignant soft tissue tumor that frequently occurs near the limb joints. Histologically, it is a biphasic type consisting of epithelial cells and spindle cells and a monophasic type consisting of spindle cells. are categorized.
滑膜肉腫は、一般的には極めて悪性度が高く、軟部腫瘍の中では悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫に次いで発生頻度が高い腫瘍である。５年生存率は３０〜５０％、１０年生存率は１５〜３０％とする報告も有り、局所再発・転移ともに治療から時間が立ってから発生する症例も存在し、長期にわたる経過観察が必要な腫瘍である。 Synovial sarcoma is generally highly malignant and is the most frequently occurring soft tissue tumor after malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, and rhabdomyosarcoma. There are reports that the 5-year survival rate is 30-50%, the 10-year survival rate is 15-30%, and there are cases of local recurrence and metastasis that occur after treatment, and long-term follow-up is required. Tumor.
滑膜肉腫は、男女間の発生率に大きな性差は見られないものの、傾向として男性に若干多く発生する。発生年代としては、１０〜４０歳代に多く発生し、特に比較的若年者の１０〜２０代の若い人に発生しやすい。発生部位としては、大腿、膝関節部を主として下肢に好発し、関節包、滑液包、腱鞘、腱等に接して発生するものが多いが、これらの組織と関係しない頸部、体幹等にも発生することもある。 Synovial sarcoma is slightly more common among men, although there is no significant gender difference in the incidence between men and women. As the age of occurrence, it occurs frequently in the 10s and 40s, and is particularly likely to occur in young people in their 10s and 20s who are relatively young. As for the occurrence site, the thigh and knee joints are mainly found in the lower limbs and often occur in contact with the joint capsule, bursa, tendon sheath, tendon, etc., but the neck, trunk, etc. not related to these tissues May also occur.
滑膜肉腫は、約半数の患者で痛みを伴い、その他は無症状であるが腫瘍はゆっくりと大きくなる。腫瘍は、比較的軟らかいものから硬いものまでまちまちである。 Synovial sarcoma is painful in about half of patients and the others are asymptomatic, but the tumor grows slowly. Tumors vary from relatively soft to hard.
治療には広範切除術（腫瘍をできるだけ広めに正常組織で包むようにして切除する手術）を施すが、大関節付近に生じた症例では切離断術が適応とされる。また、神経や血管及び重要な筋肉の腱の周囲に発生することが多いため、これらをいっしょに切除しなければならないことが多く、機能を再建する手術が同時に必要となる。 Treatment is extensive resection (surgery to remove the tumor by wrapping it in normal tissue as widely as possible), but amputation is indicated for cases that occur near the large joint. Moreover, since it often occurs around nerves, blood vessels and tendons of important muscles, these often have to be removed together, and surgery for reconstructing the function is required at the same time.
また、遠隔転移の可能性があるため、腫瘍の手術切除の他に、補助化学療法が治療に用いられることが通例であり、一般的に３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。 In addition to the possibility of distant metastasis, in addition to surgical excision of the tumor, adjuvant chemotherapy is usually used for treatment, and three- or four-drug combination therapy is generally attempted. .
滑膜肉腫には、悪性増殖する予後不良群と、機構は不明ながら自然退縮する予後良好群とが存在する。滑膜肉腫には、局所再発・転移とも緩徐な例がしばしばあるため、術後最低でも１０年間の長期にわたる外来followが必要となることが通例であるが、予後を的確に予測できれば、より正確にfollow upの治療方針をたてることができる。 There are two types of synovial sarcoma: a poor prognosis group that proliferates malignantly and a good prognosis group that regresses spontaneously, although the mechanism is unknown. Since synovial sarcoma often has a slow local recurrence and metastasis, it is common to require a long-term follow-up of at least 10 years after surgery, but more accurately if the prognosis can be accurately predicted Can follow up treatment policy.
また、予後を正確に予測できれば、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となる。特に滑膜肉腫細胞は抗がん剤に対する感受性が低く、上記の化学療法の併用療法をもってしても著効が示されるには至っていない上に、化学療法は一定の割合で奏効性を示す一方で重篤な副作用も引き起こすことが報告されている。そのため、予後良好又は予後不良となる症例を事前に見極めることができれば、不必要な化学療法を避けることが可能となる利益は大きく、また患者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）に資する。 In addition, if the prognosis can be accurately predicted, unnecessary radiotherapy and chemotherapy can be avoided. Synovial sarcoma cells, in particular, have low sensitivity to anticancer drugs, and have not yet been shown to be effective even with the above-mentioned chemotherapy combination therapy, while chemotherapy shows a response at a certain rate. It has also been reported to cause serious side effects. Therefore, if a case with good prognosis or poor prognosis can be identified in advance, the benefit of avoiding unnecessary chemotherapy is great, and contributes to the patient's quality of life (QOL).
滑膜肉腫では、染色体転座t（X；18）（p11.2；q11.2）が高頻度に認められることが報告されている。切断点近傍のゲノムDNAの単離から、t（X；18）が染色体18q11.2に位置するSYT遺伝子と染色体Xp11.2に位置するSSX遺伝子を融合させ、これによりキメラタンパク質SYT-SSXが発現することが明らかになっている。SYT-SSXの発現は滑膜肉腫症例のほぼ全例で観察されているため、これは腫瘍発生において中心的な役割を果たすものと考えられる。SYT-SSX1やSYT-SSX2融合と、腫瘍の形態及び５年生存率との間には、ある程度の関連性があることが特許文献１に記載されている。
In synovial sarcoma, chromosomal translocation t (X; 18) (p11.2; q11.2) has been reported to occur frequently. Isolation of genomic DNA in the vicinity of the breakpoint fused the SYT gene with t (X; 18) located on chromosome 18q11.2 and the SSX gene located on chromosome Xp11.2, thereby expressing the chimeric protein SYT-SSX It has become clear to do. Since SYT-SSX expression has been observed in almost all synovial sarcoma cases, this is thought to play a central role in tumor development.
また、非特許文献１には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、滑膜肉腫４５例(単相性３３人及び二相性１２人)のSYT-SSX融合転写物を分析し、関連する臨床及び病理データと比較した結果、SYT-SSX1及びSYT-SSX2融合転写物はそれぞれ、腫瘍の２９例（64%）及び１６例（36%）に検出され、局所腫瘍を有する患者３９人のKaplan-Meier法による分析では、SYT-SSX2を有する患者１５人は、SYT-SSX1を有する患者２４人より無転移生存率が有意に良好であることを示す（多変量解析によりP=0.03;相対危険度3.0）ことが記載されている。
また、非特許文献２には、凍結材料サンプル３３例について、SYT-SSX1/SSX2 融合遺伝子を検索したところ、SYT-SSX1は、SYT-SSX2に比し有意な予後不良因子（５年無転移生存率：SYT-SSX1 42％ VS SYT-SSX2 89％）であることが記載されている。
In
上述の転座遺伝子SYT-SSXは、滑膜肉腫の９０％以上で特異的に発現することが知られているが、発現しない場合もある。 The above-mentioned translocation gene SYT-SSX is known to be specifically expressed in 90% or more of synovial sarcomas, but may not be expressed.
本発明は、新規で的確な滑膜肉腫の予後予測方法を提供するとともに、滑膜肉腫の予後を簡易且つ的確に予想できるセセルニン−１の使用を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel and accurate method for predicting the prognosis of synovial sarcoma, and to provide use of seselnin-1 that can easily and accurately predict the prognosis of synovial sarcoma.
本発明の第１の観点に係るセセルニン−１の使用は、滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとしての使用である。 The use of seselnin-1 according to the first aspect of the present invention is a use as a biomarker for predicting the prognosis of synovial sarcoma.
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。 The prognosis is, for example, after treatment including at least one of surgery, chemotherapy, radiation therapy, hyperthermia, and immunotherapy.
本発明の第２の観点に係る滑膜肉腫の予後予測方法は、セセルニン−１の発現量を測定し、前記セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする。 The method for predicting the prognosis of synovial sarcoma according to the second aspect of the present invention measures the expression level of seselnin-1 and, when the expression level of seselnin-1 is increased, the prognosis for synovial sarcoma is good. It is characterized by prediction.
前記セセルニン−１の発現量の測定は、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることが好ましい。 The expression level of selcernin-1 is preferably measured by an immunological method using a selcernin-1-specific antibody.
前記免疫学的方法は、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ドットブロット法、スロットブロット法、及びELISA法から選ばれるいずれかの方法である。 The immunological method is, for example, any method selected from Western blotting, immunoprecipitation, dot blotting, slot blotting, and ELISA.
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。 The prognosis is, for example, after treatment including at least one of surgery, chemotherapy, radiation therapy, hyperthermia, and immunotherapy.
本発明の第３の観点に係る検査用試薬キットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含むことを特徴とする。 A test reagent kit according to a third aspect of the present invention is a kit for predicting the prognosis of a patient suffering from synovial sarcoma, wherein the expression level of sesernin-1 in a sample obtained from the patient is detected or detected. It includes means for quantifying.
本発明によれば、簡易かつ的確に、滑膜肉腫の予後を予測できる。そのため、術後の治療方針を正確にたてることで、follow upの治療期間を短縮することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。また、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となり、更には滑膜肉腫の新規治療法の開発に有益である。 According to the present invention, the prognosis of synovial sarcoma can be predicted easily and accurately. Therefore, it is possible to shorten the follow-up treatment period by accurately establishing a post-operative treatment policy, and to enable precise and optimized individualized medicine. In addition, unnecessary radiotherapy and chemotherapy can be avoided, and further, it is useful for development of a novel treatment method for synovial sarcoma.
本実施形態においては、患者のセセルニン−１（secernin-1）の発現量を測定する。セセルニンには１〜３までのタイプがあるが、本発明では、セセルニン−１の発現量に着目する。 In the present embodiment, the expression level of the patient's selernin-1 (secernin-1) is measured. There are 1 to 3 types of selcernin. In the present invention, attention is paid to the expression level of selcernin-1.
そして、セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測する。 And when the expression level of seselnin-1 is rising, it is estimated that the prognosis with respect to synovial sarcoma is favorable.
セセルニン−１の発現量の測定は、特に限定されるものではなく、単にセセルニン−１の有無を検出するものであってもよく、またセセルニン−１の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。セセルニン−１の発現量の測定は、免疫学的手法によるのが好適であり、例えば、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。本実施形態では、患者から生体組織を採取し、その生体組織内に含有されるタンパク質について電気泳動を行い、蛍光色素によりセセルニン−１の有無及び量を測定することによりなされる。
The measurement of the expression level of selcernin-1 is not particularly limited, and it may be simply detecting the presence or absence of selcernin-1, and the expression level of selcernin-1 is determined relative or absolute. It may be a thing. The expression level of seselnin-1 is preferably measured by an immunological technique. For example, a combination of separation by electrophoresis and detection or quantification by fluorescence, enzyme, radioisotope, etc. (Western blotting,
予後を予測できる治療は、特に限定されるものではないが、例えば外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、又は免疫療法である。 The treatment that can predict the prognosis is not particularly limited, and is, for example, surgery, chemotherapy, radiation therapy, hyperthermia, or immunotherapy.
滑膜肉腫の外科手術は、広範切除術が通例である。滑膜肉腫では、肉眼的に確認できる腫瘤の周囲に腫瘍細胞がしみこんでいるため、一見正常な周囲の組織を含めて大きく切除する必要があるためである。なお、広範切除術を行ったため、皮膚が大量になくなると、化学療法や放射線療法ができなくなるので、体の他の部分から血管をつけた皮膚を持って来る皮弁形成術を行う必要がある。 The surgical procedure for synovial sarcoma is usually extensive resection. This is because in synovial sarcoma, tumor cells are soaked around a tumor that can be visually confirmed, and it is necessary to excise a large amount of tissue including normal surrounding tissue. In addition, because extensive resection has been performed, if there is a large amount of skin, chemotherapy and radiation therapy cannot be performed. Therefore, it is necessary to perform flap surgery to bring skin with blood vessels from other parts of the body. .
滑膜肉腫の化学療法は、一般的には、３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。３剤併用療法の代表例は、例えばMAID療法（Mesna：副作用軽減剤、Adriacin：アドリアマイシン、Ifomide：イフォスファミド、Dacarbazine：ダカルバジン）である。また、４剤併用療法の代表例は、例えばCyVADIC療法（Cyclophosphamide：シクロフォスファミド、Vincristine：ビンクリスチン、Adriacin：アドリアマイシン、dacarbazine：ダカルバジン）である。 In general, three-drug combination therapy or four-drug combination therapy has been tried as chemotherapy for synovial sarcoma. A typical example of triple combination therapy is, for example, MAID therapy (Mesna: side effect reducing agent, Adriacin: adriamycin, Ifomide: ifosfamide, Dacarbazine: dacarbazine). A representative example of the four-drug combination therapy is, for example, CyVADIC therapy (Cyclophosphamide: cyclophosphamide, Vincristine: vincristine, Adriacin: adriamycin, dacarbazine: dacarbazine).
滑膜肉腫の放射線療法は、一般の放射線療法と同様に、照射体積の大きさにより、同じ照射線量でも生体反応（耐容線量）が全く異なり、放射線療法が単独で実施されるか、化学療法と併用されるか、手術の前か後かは治療医の判断によって調節される。腫瘍制御に必要な線量は、腫瘍の感受性により異なり、用量は例えば60〜70Gyである。用量としては、小線量を１日１回、週４〜５回照射する分割照射が多く行われ、分割照射の場合は、一回線量は例えば1.8〜2Gyである。 As with general radiotherapy, synovial sarcoma radiotherapy differs in biological response (tolerated dose) even with the same irradiation dose depending on the size of the irradiation volume. Whether it is used together or before or after surgery is controlled by the judgment of the treating physician. The dose required for tumor control depends on the sensitivity of the tumor, and the dose is, for example, 60-70 Gy. As the dose, divided irradiation in which a small dose is irradiated once a day and 4 to 5 times a week is often performed. In the case of divided irradiation, the amount of one line is, for example, 1.8 to 2 Gy.
温熱療法は、熱を加えることで腫瘍の内部温度を上げ、癌を死滅させることを目的とした治療である。適用される温度は例えば４３℃程度であり、熱が加わった際に血管が拡張し血流が増加する正常な細胞と比べて、腫瘍細胞にはこの血管の拡張が無いため、熱を蓄積しやすい。 Hyperthermia is a treatment aimed at raising the internal temperature of a tumor by applying heat and killing cancer. The applied temperature is, for example, about 43 ° C. Compared with normal cells in which blood vessels dilate and increase blood flow when heat is applied, tumor cells do not dilate the blood vessels, so heat accumulates. Cheap.
免疫療法は、身体が自然に有している疾患への防御機構への働きかけを向上させる治療法であり、通常は局所あるいは全身の免疫系を賦活させることで治療する。具体的には、抗腫瘍効果を持つリンパ球を用いた免疫療法、癌ワクチン療法、癌ワクチンテーラーメード治療、DNAワクチン療法、RNAワクチン療法等である。 Immunotherapy is a treatment method that improves the action of the body's natural defense mechanisms against diseases, and is usually treated by activating the local or systemic immune system. Specifically, immunotherapy using lymphocytes having an antitumor effect, cancer vaccine therapy, cancer vaccine tailor-made treatment, DNA vaccine therapy, RNA vaccine therapy, and the like.
本発明において予後が良好であるとは、５年以上の期間において無転移率又は生存率の統計学的有意差が存在することである。 In the present invention, a favorable prognosis means that there is a statistically significant difference in metastasis-free rate or survival rate in a period of 5 years or longer.
本実施形態に係るキットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットであり、患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含む。免疫学的手法により検査を行う場合には、少なくとも抗セセルニン−１抗体が検査用試薬に含まれる。抗セセルニン−１抗体は、セセルニン−１の発現を検出しうる抗体であればよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体並びにこれらの結合活性断片等が挙げられる。また検査用試薬キットには、上記抗体のほか検出用に用いる標識を含んでいてもよい。キットには、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬を含むことができる。 The kit according to the present embodiment is a test reagent kit for predicting the prognosis of a patient suffering from synovial sarcoma, and includes means for detecting or quantifying the expression level of seselnin-1 in a sample obtained from the patient. When the test is performed by an immunological technique, at least anti-sesernin-1 antibody is included in the test reagent. The anti-sesernin-1 antibody is not particularly limited as long as it can detect the expression of seselnin-1, and for example, monoclonal and polyclonal antibodies, labeled antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and binding activity fragments thereof. Is mentioned. Moreover, the test reagent kit may contain a label used for detection in addition to the antibody. The kit can contain reagents such as a buffer, a chromogenic substrate, a secondary antibody, and a blocking agent.
滑膜肉腫では、病理組織診断目的に原発組織により生検を行うことが普通であり、その際に生体組織を採取すれば、患者に新たな負担を強いることにはならない。 In synovial sarcoma, a biopsy is usually performed with a primary tissue for the purpose of histopathological diagnosis. If a biological tissue is collected at that time, a new burden is not imposed on the patient.
また、本実施形態に係る発明によれば、例えばウェスタンブロット装置の準備さえあれば、セセルニン−１の発現量の測定ができるため、簡易な手法にて滑膜肉腫の予後予測ができる。また、例えばセセルニン−１に特異的に発現する抗体を用いればウェスタンブロット以外の方法、例えば免疫染色によっても鋭敏にセセルニン−１の発現量の測定ができる。 Moreover, according to the invention which concerns on this embodiment, since the expression level of seselnin-1 can be measured, for example, if there is only a Western blot apparatus, the prognosis of synovial sarcoma can be predicted by a simple technique. For example, if an antibody specifically expressed in seselnin-1 is used, the expression level of sesernin-1 can be measured with sensitivity by methods other than Western blotting, such as immunostaining.
（実施例１）
〈患者及び臨床情報〉
滑膜肉腫患者から得られた、１３個の凍結腫瘍組織を検査した。凍結腫瘍組織は、１３の滑膜肉腫の症例にて入手し、プロテオミクス解析にて使用された。診断及び分類は、軟組織腫瘍のＷＨＯ分類システムに基づいた。また、SYT-SSX1及びSYT-SSX2発現の検査も行った。結果を下記表１に示す。
Example 1
<Patient and clinical information>
Thirteen frozen tumor tissues obtained from patients with synovial sarcoma were examined. Frozen tumor tissue was obtained in 13 synovial sarcoma cases and used in proteomic analysis. Diagnosis and classification was based on the WHO classification system for soft tissue tumors. SYT-SSX1 and SYT-SSX2 expression were also examined. The results are shown in Table 1 below.
表１に示すように、滑膜肉腫サンプルは２つのグループに分類された。即ち、滑膜肉腫の予後不良（P-SS）として死亡した患者から採取した５つのサンプル（サンプルナンバーは、1,2,3,4,5である。）と、滑膜肉腫の予後良好（G-SS）として術後５年以内に転移がなかった８つのサンプル（サンプルナンバーは、6,7,8,9,10,11,12,13である。）とに分類された。なお、DOD（dead of disease）は病死、AWD（alive with disease）は病気状態での生存、NED（no evidence disease）は病気確証無しでの生存、CDF（continuous disease free）は無病生存を意味する。 As shown in Table 1, synovial sarcoma samples were divided into two groups. That is, five samples collected from patients who died of poor prognosis of synovial sarcoma (P-SS) (sample numbers are 1,2,3,4,5) and good prognosis of synovial sarcoma ( G-SS) was classified into 8 samples (sample numbers were 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) that had no metastasis within 5 years after surgery. DOD (dead of disease) means disease death, AWD (alive with disease) means survival in disease state, NED (no evidence disease) means survival without disease confirmation, and CDF (continuous disease free) means disease-free survival. .
〈タンパク質発現のプロファイリング〉
凍結サンプルは、液体窒素で冷却した後、クライオプレス（登録商標、マイクロテック・ニチオン,千葉，日本）で粉状に粉砕された。凍結サンプルは、urea lysis 緩衝液（６Ｍ ウレア, ２Ｍ チオウレア, ３％ CHAPS, １％ Triton X-100）にて調整された。１５,０００rpmにて３０分間遠心分離した後、上澄み液が取り出され、細胞タンパク質のソースとして使用された。
<Profiling protein expression>
The frozen sample was cooled with liquid nitrogen and then pulverized into a powder by a cryopress (registered trademark, Microtech Nichion, Chiba, Japan). Frozen samples were prepared with urea lysis buffer (6M urea, 2M thiourea, 3% CHAPS, 1% Triton X-100). After centrifugation at 15,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed and used as a source of cellular proteins.
その後、2D-DIGE（2 Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoresis）により泳動分離がなされた。2D-DIGE法は、泳動前に比較したいサンプルを異なる蛍光色素でラベルし、このラベル化したサンプルを混合してから電気泳動を行う手法である。図１は、2D-DIGE法の工程を示す工程図である。コントロールサンプル(internal control sample)は、全ての生検検体の一部を混合させて作成したものであり、５μｇ用いた。コントロールサンプルは、図１に示すように、Cy3(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。また、夫々の生検検体は５μｇ用いられ、Cy5(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。 Thereafter, electrophoresis separation was performed by 2D-DIGE (2 Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoresis). The 2D-DIGE method is a method in which samples to be compared before electrophoresis are labeled with different fluorescent dyes, and the labeled samples are mixed and then subjected to electrophoresis. FIG. 1 is a process diagram showing processes of the 2D-DIGE method. The control sample (internal control sample) was prepared by mixing a part of all biopsy specimens, and 5 μg was used. The control sample was labeled with Cy3 (registered trademark, CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) as shown in FIG. Each biopsy specimen was used in an amount of 5 μg and labeled with Cy5 (registered trademark, CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden).
第１次分離は、IPG緩衝液及びDryStripゲル(24 cm length, pI range between 4 and 7, GE Healthcare Biosciences)にて実行された。第２次分離は、大きめのゲル(38 cm length, Bio-craft, Itabashi, Tokyo, Japan)を使用し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE：EttanDalt II GE Healthcare Biosciences)にて実行された。ゲルは、レーザー照射(Tyhoon Trio（登録商標）, GE Healthcare Biosciences)によりスキャンされた。全てのスポットにおいて、Cy5の強度はCy3の強度により初期化され、ゲル間の差はDeCyderイメージソフトウェア（GE Healthcare Biosciences）により補正された。結果を図２に示す。 Primary separation was performed on IPG buffer and DryStrip gel (24 cm length, pI range between 4 and 7, GE Healthcare Biosciences). Secondary separation was performed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE: EttanDalt II GE Healthcare Biosciences) using a large gel (38 cm length, Bio-craft, Itabashi, Tokyo, Japan). It was. The gel was scanned by laser irradiation (Tyhoon Trio®, GE Healthcare Biosciences). In all spots, Cy5 intensity was initialized by Cy3 intensity, and differences between gels were corrected by DeCyder image software (GE Healthcare Biosciences). The results are shown in FIG.
図３は、電気泳動分離実験の再現性を示す。図３に示すように、同一サンプルにつき、３回の独立した電気泳動分離実験(exp1,exp2,exp3)を比較することにより、再現性が存在することが実証された。散乱プロット解析により、スポットの９６％以上の標準強度が、２倍差（2 fold difference）の範囲内であった。 FIG. 3 shows the reproducibility of the electrophoresis separation experiment. As shown in FIG. 3, it was demonstrated that reproducibility exists by comparing three independent electrophoretic separation experiments (exp1, exp2, exp3) for the same sample. According to the scatter plot analysis, the standard intensity of 96% or more of the spots was within the range of 2 fold difference.
〈データ分析〉
タンパク質スポットの強度は統計学的に２グループ間において有意差が認められた（Wilcoxon test P値＜0.01）。階層毎のまとめ、主成分分析、相関マトリクス調査、及びスポットランキングは、発現ソフトウエア（Genedata,Bersel,Swissland）を使用して実行された。
<Data analysis>
The intensity of the protein spot was statistically significantly different between the two groups (Wilcoxon test P value <0.01). Hierarchical summarization, principal component analysis, correlation matrix surveys, and spot ranking were performed using expression software (Genedata, Bersel, Switzerland).
〈質量分析によるタンパク質同定〉
Cy3でラベルされたコントロールサンプルのイメージの少なくとも７５％に表れる１６６３個のタンパク質スポットを選択した。質量分析によりタンパク質スポットに対応する蛋白質が同定された。2D-PAGEにて分離されたCy5でラベルされたタンパク質はゲルプラグにリカバーされ、改良トリプシン（Promega,Madison,WI）にてまとめられた。質量分析は、ナノ・エレクトロスプレイイオン供給源(AMR,東京)を有するFinnigan(登録商標) LTQ(登録商標) linear イオントラップ質量分析装置(Thermo Electron, San Jose, CA)を使用した。マスコットソフトウエア（バージョン2.1,Matrix Science,London,UK）が使用され、SWISS-PROTデータベース（Homo sapiens,12867 sequence in Sprot 47.8 fasta file）に対するペプチドイオンピークの質量調査がなされた。３５又はそれ以上のマスコットスコアは、陽性タンパク質同定を示すものとみなされた。結果を図４に示す。２０個のタンパク質スポットが、２グループ間（P＜0.01）で重要な差異を有していた。
<Protein identification by mass spectrometry>
1663 protein spots appearing in at least 75% of the control sample image labeled with Cy3 were selected. Proteins corresponding to protein spots were identified by mass spectrometry. Proteins labeled with Cy5 separated by 2D-PAGE were recovered in gel plugs and assembled with modified trypsin (Promega, Madison, Wis.). Mass spectrometry used a Finnigan® LTQ® linear ion trap mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, Calif.) With a nanoelectrospray ion source (AMR, Tokyo). Mascot software (version 2.1, Matrix Science, London, UK) was used to perform mass surveys of peptide ion peaks against the SWISS-PROT database (Homo sapiens, 12867 sequence in Sprot 47.8 fasta file). A mascot score of 35 or higher was considered indicative of positive protein identification. The results are shown in FIG. Twenty protein spots had significant differences between the two groups (P <0.01).
〈タンパク質の分類〉
また、同定されたタンパク質の機能分類は、下記表２に示すように、遺伝子オントロジーの分類に基づいた。
<Protein classification>
Moreover, the functional classification of the identified protein was based on the classification of gene ontology as shown in Table 2 below.
質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、表２及び図４に示すように、セセルニン−１というタンパク質に由来するタンパク質スポット（セセルニン−１・スポット）が、２０個のスポット中に３個含まれていた。１２個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では減少しており、８個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では増加していた。 As a result of protein identification using a mass spectrometer, as shown in Table 2 and FIG. 4, three protein spots (sesernin-1 spot) derived from a protein called seselnin-1 are included in 20 spots. It was. The intensity of 12 protein spots decreased with poor prognosis (P-SS), and the intensity of 8 protein spots increased with poor prognosis (P-SS).
滑膜肉腫患者から得られた１３個の凍結腫瘍組織についてセセルニン−１の発現を調べたところ、セセルニン−１・スポットの濃度は、前述の予後不良であった５症例に低発現しており、予後良好であった８症例に高発現していた。 When the expression of cesernin-1 was examined on 13 frozen tumor tissues obtained from patients with synovial sarcoma, the concentration of cesernin-1 spot was low expressed in the 5 cases with the above-mentioned poor prognosis, It was highly expressed in 8 cases with good prognosis.
主成分分析により１３個の滑膜肉腫サンプルを正確に予後良好（G-SS）か予後不良（P-SS）グループに分類した。主成分分析とは、多変量で表されるデータの統計から一次結合で表現される新たな変量を構成し、互いに無相関な主成分に要約する方法である。図５に示すように、１３個のタンパク質スポットのプロファイルは同じグループのサンプル間では同様であったが、２つのグループ間では異なるものであった。以上より、セセルニン−１が滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとして使用できること示された。 Thirteen synovial sarcoma samples were accurately classified into good prognosis (G-SS) or poor prognosis (P-SS) groups by principal component analysis. Principal component analysis is a method of constructing new variables expressed by linear combinations from data statistics expressed in multivariate and summarizing them into uncorrelated principal components. As shown in FIG. 5, the profile of the 13 protein spots was similar between samples of the same group, but different between the two groups. From the above, it was shown that seselnin-1 can be used as a biomarker for predicting the prognosis of synovial sarcoma.
(実施例２)
セセルニン−１の予後予測能をさらに検証する目的で、セセルニン−１に対する特異抗体を新規に作成し、免疫染色を４５症例に対して実施した。
(Example 2)
For the purpose of further verifying the prognostic ability of seselnin-1, a specific antibody against seselnin-1 was newly prepared, and immunostaining was performed on 45 cases.
〈抗体の生成〉
全長セセルニン−１のペプチド長３５４−３７０に対応するペプチドを合成し、そしてウサギを免疫化した。抗血清は、抗原ペプチドを使用する親和性カラムクロマトグラフィにより精製された。セセルニン−１の特異性はウエスタンブロットにより確認された。
<Production of antibodies>
A peptide corresponding to peptide length 354-370 of full-length seselnin-1 was synthesized and rabbits were immunized. The antiserum was purified by affinity column chromatography using the antigenic peptide. The specificity of seselnin-1 was confirmed by Western blot.
４５の患者から治療前に４５のパラフィン標本組織を検査した。免疫組織化学で使用された患者の臨床情報は、下記表３及び表４にまとめる。 45 paraffin specimen tissues were examined from 45 patients prior to treatment. The clinical information of patients used in immunohistochemistry is summarized in Table 3 and Table 4 below.
〈セセルニン−１に対する免疫組織化学〉
セセルニン−１の発現は、パラフィン標本組織を使用して免疫組織化学的に調べられた。４μｍ厚の組織切片が、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）にて、１２１℃で３０分間オートクレーブで処理され、セセルニン−１に対する抗体で培養された（1:200希釈）。免疫染色は、ダコ・エンビジョンシステム(エンビジョン・プラス標識:DAKO,CA)のビオチンフリー西洋ワサビペルオキシダーゼにて標識されて実行された。二人の認証病理学者（N.T及びD.K）が、臨床データ（年齢、性別、解剖結果）により陽性染色を決定した。抗セセルニン−１抗体に陽性である腫瘍細胞の２０％以上のケースがセセルニン−１陽性であるとされ、セセルニン−１陽性の２０％以下のケースがセセルニン−１陰性であるとされた。
<Immunohistochemistry for seselnin-1>
Seselnin-1 expression was examined immunohistochemically using paraffin specimen tissue. 4 μm thick tissue sections were autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) at 121 ° C. for 30 minutes and cultured with antibodies against seselnin-1 (1: 200 dilution). Immunostaining was performed by labeling with biotin-free horseradish peroxidase from the DACO Envision System (Envision Plus label: DAKO, CA). Two certified pathologists (NT and DK) determined positive staining by clinical data (age, gender, anatomical results). Cases of 20% or more of the tumor cells positive for the anti-sesernin-1 antibody were considered to be seselnin-1 positive, and cases of 20% or less of the sesernin-1 positive were considered to be sesernin-1 negative.
〈分子分析〉
４５ケースのうちRNAサンプルが利用できる３１のケースにおいて、SYT-SSX1とSYT-SSX2との融合遺伝子を調査した。プライマーSYT 5′CAA CAG CAA GAT GCA TAC CA3′、SSX1 5′GGT GCA GTT GTT TCC CAT CG3′、及びSSX2 5′GGC ACA GCT CTT TCC CAT CA3′を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により、全ての３１のケースが分析された。
<Molecular analysis>
Of the 45 cases, 31 cases where RNA samples were available were investigated for the fusion gene of SYT-SSX1 and SYT-SSX2. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using
上記表３及び表４に示すように、４５症例中、セセルニン−１陽性症例は２７症例（サンプルナンバーは、3,4,9,10,11,17,20,21,22,24,25,27,29,30,32,33,34,35,36,38,39,40,41,42,43,44,45）、セセルニン−１陰性症例は１８症例（サンプルナンバーは、1,2,5,6,7,8,12,13,14,15,16,18,19,23,26,28,31,37）だった。これらの症例について、治療開始後の転移とセセルニン−１の発現の相関を調べた。治療開始後の転移について臨床情報が得られたのは４５症例中全症例である。４５人の患者間で、１５人の患者が継続的に無病で生存し（continuous disease free（CDF)）、５人の患者が病気の確証無く生存し（no evidence disease (NED)）、３人の患者が病気の状態で生存し（alive with disease (AWD)）、２２人の患者が病気のために死亡した（dead of disease (DOD)）。 As shown in the above Table 3 and Table 4, out of 45 cases, seselnin-1 positive cases are 27 cases (sample numbers are 3, 4, 9, 10, 11, 17, 20, 21, 22, 24, 25, 27,29,30,32,33,34,35,36,38,39,40,41,42,43,44,45), 18 cases of selcernin-1 negative cases (sample numbers are 1,2, 5,6,7,8,12,13,14,15,16,18,19,23,26,28,31,37). In these cases, the correlation between metastasis after the start of treatment and the expression of seselnin-1 was examined. Clinical information on metastasis after the start of treatment was obtained in all 45 cases. Among 45 patients, 15 patients continue to survive without disease (continuous disease free (CDF)), 5 patients survive without evidence of disease (NED), 3 Of the patients were alive with disease (AWD), and 22 patients were dead of disease (DOD).
下記表５に示すように、転移はセセルニン−１陽性症例において２７症例中１２症例（４４．４％）であり、陰性症例では１８症例中１５症例（８３．３％）であった。セセルニン−１陽性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陰性腫瘍の患者は、極めて高い比率で転移が観測された（15/18 vs 12/27 cases, χ２:P=0.0140）。
As shown in Table 5 below, metastasis was 12 out of 27 cases (44.4%) in the seselnin-1 positive cases and 15 out of 18 cases (83.3%) in the negative cases. An extremely high rate of metastases was observed in patients with selcernin-1-negative tumors compared to those with selcernin-1-positive tumors (15/18
また、下記表６に示すように、死亡はセセルニン−１陽性症例において２７症例中９症例（３３．３％）、陰性症例では１８症例中１３症例（７２．２％）であった。免疫組織化学により、生存した２３人の患者のうち５人がセセルニン−１陰性であり、生存した２３人の患者のうち１８人がセセルニン−１陽性であった（χ２:P=0.0170）。 Moreover, as shown in Table 6 below, deaths were 9 cases (33.3%) in 27 cases in the seselnin-1 positive cases, and 13 cases (72.2%) in 18 cases in the negative cases. By immunohistochemistry, 5 of the 23 surviving patients were selcernin-1 negative and 18 of the 23 surviving patients were sesernin-1 positive (χ 2 : P = 0.0170).
次に、セセルニン-1の発現と、治療開始後５年間の無転移率及び生存率との関係を調べた。 Next, the relationship between the expression of seselnin-1 and the metastasis-free rate and survival rate for 5 years after the start of treatment was examined.
〈統計学的解析〉
初期腫瘍の第１治療から、腫瘍特異的原因又は転移の存在に起因する死亡まで、腫瘍特異的及び転移無しで生存した期間が計算された。死亡発生ごとの生存率はKaplan-Meier法により計算された。ログランクテストを使用する単変量解析により、潜在的予後因子が同定された。独立予後因子が、Cox比例ハザードモデル及びステップワイズ法を使用して評価された。chi-squareテスト値に基づくモデルの一致に重度に貢献している場合にのみ、共分散分析がモデル中に選択された。Ｐ差＜０．０５が重要と判断された。統計学的分析はSPSS統計パッケージを使用して実行された（SPSS,Chicago,Illinois）。
<Statistical analysis>
From the first treatment of the initial tumor to the death due to the presence of a tumor specific cause or metastasis, the duration of survival without tumor specific and metastasis was calculated. Survival rate for each death was calculated by Kaplan-Meier method. Univariate analysis using the log rank test identified potential prognostic factors. Independent prognostic factors were assessed using the Cox proportional hazards model and the stepwise method. Covariance analysis was chosen in the model only if it contributed significantly to model matching based on chi-square test values. A P difference <0.05 was considered important. Statistical analysis was performed using the SPSS statistical package (SPSS, Chicago, Illinois).
図６は、生存率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図６に示すように、セセルニン−１に対する免疫反応性が陽性である患者の５年生存率は７７．６％であり、セセルニン−１に対する免疫反応性が陰性である患者の５年生存率は２１．８％であった（P=0.0015）。 FIG. 6 shows the result of the log rank test for the survival rate. As shown in Table 7 and FIG. 6 below, the 5-year survival rate of patients positive for selcernin-1 immunoreactivity is 77.6% and 5% of patients negative for selsernin-1 immunoreactivity. The annual survival rate was 21.8% (P = 0.0015).
図７は、無転移率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図７に示すように、無転移率はセセルニン−１の発現が陽性症例で６２．８％、陰性症例では１６．７％であった。セセルニン−１陰性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陽性腫瘍の患者は、極めて高い割合で５年無転移生存が観測された（62.8% vs 16.7%; P=0.0012）。 FIG. 7 shows the result of the log rank test for the non-transfer rate. As shown in Table 7 and FIG. 7 below, the metastasis-free rate was 62.8% in the positive case of seselnin-1 expression and 16.7% in the negative case. A very high proportion of patients with seselnin-1 positive tumors compared to those with seselnin-1 negative tumors were observed to survive 5 years without metastasis (62.8% vs 16.7%; P = 0.0012).
以上より、セセルニン−１発現の有無は滑膜肉腫の生命予後に統計学的有意な相関を示しており、セセルニン−１は滑膜肉腫診断時における予後予測バイオマーカーとして有用であることが実証された。臨床現場では滑膜肉腫の診断時にセセルニン−１の発現を調べることで、滑膜肉腫患者の予後を正確に予測し、補助的化学療法の有無等の的確な治療法を選択することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。滑膜肉腫を含めた軟部肉腫では必ず病理組織診断目的に原発組織より生検を行うため、本検査に使用する生検材料は患者に新たな負担をかけることなく採取できる。また、免疫染色はルーチンに行われている検査である。そのため、本発明による滑膜肉腫の予後予測は、臨床検査として実用化が容易であり、本発明によって多くの滑膜肉腫患者が極めて大きな恩恵を受けることが可能である。 From the above, the presence / absence of selsernin-1 expression has a statistically significant correlation with the prognosis of synovial sarcoma, and it is demonstrated that selcernin-1 is useful as a prognostic biomarker in the diagnosis of synovial sarcoma. It was. In clinical practice, by examining the expression of seselnin-1 at the time of diagnosis of synovial sarcoma, it is possible to accurately predict the prognosis of patients with synovial sarcoma, and to select an appropriate treatment method such as the presence or absence of adjuvant chemotherapy, It enables precise and optimized personalized medicine. Since soft tissue sarcomas including synovial sarcomas are always biopsied from the primary tissue for the purpose of histopathological diagnosis, the biopsy material used in this examination can be collected without placing a new burden on the patient. Immunostaining is a routine test. Therefore, the prognosis prediction of synovial sarcoma according to the present invention can be easily put into practical use as a clinical test, and many synovial sarcoma patients can greatly benefit from the present invention.
配列番号１〜３：プライマー Sequence number 1-3: Primer
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