JP5423965B2 - 非特異吸着防止剤 - Google Patents

Description

本発明は、例えば、臨床診断薬、臨床診断装置、バイオチップなどに用いられる各種タンパク等の非特異吸着を防止する非特異吸着防止剤に関する。

近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。ポリスチレンプレートや磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出方式として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつあるが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相や器具・容器などへ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面や器具・容器に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質を非特異吸着防止剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。

しかしながら、従来法による非特異吸着防止剤を添加しても、なお、非特異的な吸着が残り、さらに、生体由来の非特異吸着防止剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能の非特異吸着防止剤の開発が望まれている。

化学合成による非特異吸着防止剤としては、特開平１０−１５３５９９号公報や特開平１１−３５２１２７号公報にポリオキシエチレンを有するポリマー、ならびに、特許第３４４３８９１号に特定のメタクリル系共重合体が提案されているが、これらの非特異吸着防止効果は不十分であった。

本発明の目的は、広い温度領域で固化することなく、化学発光免疫診断測定等において使用する固相表面や器具・容器などへのタンパクなどの非特異吸着を防止することができる非特異吸着防止剤を提供することである。

本発明者らは、この課題を解決するために、特定の組成の共重合ポリマーが高い非特異吸着防止効果を有することを見いだし、本発明を完成した。

本発明の一態様に係る非特異吸着防止剤は、
常圧の水溶液で８０℃以下に下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマーを形成しうるモノマー（Ａ）と、
常圧の水溶液でＬＣＳＴを有さない非イオン性水溶性ホモポリマーを形成しうるモノマー（Ｂ）と、
を含むモノマー部を重合することにより得られる水溶性ポリマーを含む。

上記非特異吸着防止剤において、前記モノマー（Ａ）は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドであることができる。

上記非特異吸着防止剤は、上記モノマー（Ａ）と上記モノマー（Ｂ）とを含むモノマー部を重合することにより得られる水溶性ポリマーを含むことにより、広い温度領域で固化することなく、化学発光免疫診断測定等において使用する固相表面や器具・容器などへのタンパクなどの非特異吸着を防止することができる。

以下、本発明の一実施形態に係る非特異吸着防止剤について、具体的に説明する。

１．非特異吸着防止剤
１．１．非特異吸着防止剤の構成および製造
本実施形態に係る非特異吸着防止剤は、ホモポリマー重合により常圧の水溶液で８０℃以下に下限臨界溶解温度（lowercritical solution temperature：ＬＣＳＴ）を有するポリマーを形成しうるモノマー（Ａ）と、ホモポリマー重合により常圧の水溶液でＬＣＳＴを有さない非イオン性水溶性ホモポリマーを形成しうるモノマー（Ｂ）とを含むモノマー部を重合することにより得られる水溶性ポリマーを含む。

まず、この水溶性ポリマーを製造するために使用するモノマー部の組成について説明する。

１．１．１．モノマー（Ａ）
上述したように、モノマー（Ａ）は、ホモポリマー重合により常圧の水溶液で８０℃以下にＬＣＳＴを有するポリマーを形成しうるモノマーである。

保存下のタンパクが変性を生じると分子内コンフォメーションが変化し、本来親水性の状態から、疎水性の状態へ変化し、その疎水性部分を起点として、さらに他のタンパクの変性を誘発させる。常圧の水溶液で８０℃以下にＬＣＳＴを有するポリマーは、その親水性／疎水性バランスにより変性タンパクの凝集を阻止して分散状態を保つ働きを有すると考えられる。常圧の水溶液で８０℃以下にＬＣＳＴを有するポリマーを形成しうるモノマーは、非特異吸着防止効果を発現するための必須成分である。

モノマー（Ａ）は、１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。

モノマー（Ａ）としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ノルマルプロピルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ビニルメチルエーテルなどが挙げられる。

モノマー（Ａ）としては、共重合性が良好である点で、好ましくはアクリルアミド誘導体を含むアクリル系モノマーであり、非特異吸着防止効果が高い点で、より好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドである。

１．１．２．モノマー（Ｂ）
上述したように、モノマー（Ｂ）は、ホモポリマー重合により常圧の水溶液でＬＣＳＴを有さない非イオン性水溶性ホモポリマーを形成しうるモノマーである。モノマー（Ｂ）は、１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。

モノマー（Ｂ）としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドなどの置換または非置換のアクリルアミド類；ヒドロキシエチルアクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート類；酢酸ビニル、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテルなど重合後に加水分解することにより水溶性ポリマーとなるモノマー；Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ―ビニルピロリドン、アリルアルコールなどその他のモノマーを挙げることができる。

モノマー（Ｂ）は、非特異吸着防止効果を維持または強化しつつ、広い温度領域、とりわけ高温域で非特異吸着防止剤の析出・固化を防止するための必須成分である。モノマー（Ｂ）としては、より好ましくは、置換または非置換のアクリルアミド類であり、さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドである。

１．１．３．モノマー部の組成および重合
その他のモノマー（Ｃ）として、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのカルボキシル基を有するアニオン性モノマー；スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのスルホン基を有するアニオン性モノマー；アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのメチルクロライド４級塩などの１級〜４級アミノ基を有するカチオン性モノマー；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンなどの疎水性モノマーを、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）と共重合して水溶性ポリマーを製造することができる。

また、その他のモノマー（Ｃ）として、１〜１０重量％のアニオン性モノマー、特に、スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などを、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）と共重合して水溶性ポリマーを製造することにより、免疫診断薬の希釈液として用いた場合に非特異検体のシグナル抑制効果が得られる場合がある。

本実施形態に係る非特異吸着防止である水溶性ポリマーを製造するためのモノマー部の組成は、全モノマーを１００重量％として、好ましくは、モノマー（Ａ）３０〜９９重量％、モノマー（Ｂ）１〜７０重量％、およびその他のモノマー（Ｃ）０〜４９重量％であり、より好ましくは、モノマー（Ａ）４０〜９５重量％、モノマー（Ｂ）５〜６０重量％、およびその他のモノマー（Ｃ）０〜２０重量％である。

モノマー（Ａ）が３０重量％未満であると、非特異吸着防止効果が不十分である場合があり、モノマー（Ｂ）が１重量％未満であると、高温域で非特異吸着防止剤が析出・固化する場合がある。

モノマー部として使用するモノマーは、工業用原料として入手することができるものを精製して、あるいは、未精製のまま、共重合に使用することができる。

モノマー部の重合は、例えば、ラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合など公知の重合法で行うことができ、製造が容易であることから、好ましくはラジカル重合である。

また、モノマー部の重合は、公知の溶媒、開始剤、連鎖移動剤などと共に攪拌・加熱することにより実施される。重合時間は、通常３０分〜２４時間、重合温度は、０〜１２０℃程度である。

なお、開始剤として、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「ＶＡ−０６７」）などのカチオン性開始剤を使用することにより、非特異吸着防止剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、非特異吸着防止効果を高めることが可能である。このような開始剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．２〜５質量部である。また、連鎖移動剤として、２−メルカプトエチルアミン（システアミン）、３−メルカプトプロピルアミン、２−メルカプトプロピルアミンなどのカチオン性分子量調節剤を使用することにより、上記のカチオン性開始剤と同様に非特異吸着防止剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、非特異吸着防止効果を高めることが可能である。このような分子量調節剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．１〜１０質量部である。

１．２．非特異吸着防止剤の物性および用途
本発明の非特異吸着防止剤の数平均分子量は、通常１，０００〜１，０００，０００であり、好ましくは２，０００〜１００，０００であり、さらに好ましくは３，０００〜５０，０００である。本実施形態に係る非特異吸着防止剤（水溶性ポリマー）の分子量分布は、典型的には、重量平均分子量／数平均分子量が１．５〜３である。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤であるところの共重合ポリマーは水溶性である。本発明において、「水溶性である」とは、２５℃で１％のポリマー固形分となるように水に共重合ポリマーを添加・混合したときに、目視で透明に溶解することをいう。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤は例えば、容器・器具などへコーティングする方法や、診断薬の希釈剤・反応溶媒・保存剤へ添加する方法によりタンパクなどの非特異吸着を強力に防止する効果を有する。

また、本実施形態に係る非特異吸着防止剤は、免疫診断薬の希釈液として用いることにより、非特異検体のシグナルを抑制することができる。

さらに、本実施形態に係る非特異吸着防止剤は例えば、臨床診断薬として使用される標識抗体、標識抗原、酵素、一次抗体、一次抗原の安定化剤；血漿製剤に含まれるタンパクの安定化剤；コンタクトレンズの洗浄に使用される酵素などの安定化剤などとして、タンパク溶液中に添加することにより、タンパクの活性を長期間にわたり維持させる効果を有する。

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

２．１．実施例１
モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド７０ｇ、モノマー（Ｂ）としてジメチルアクリルアミド３０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩２ｇを水９００ｇに混合して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら、７０℃まで昇温し、開始剤として２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド１ｇを添加した後、２時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して３時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた共重合体溶液を透析により精製し、さらに凍結乾燥することにより、本実施例の非特異吸着防止剤（Ｎ−１）６９ｇを得た。

非特異吸着防止剤（Ｎ−１）のＧＰＣによる数平均分子量は８，０００であり、重量平均分子量１６，０００であった。

非特異吸着防止剤（Ｎ−１）の０．５％水溶液をポリスチレン製９６穴プレートに満たし、３７℃で３０分間インキュベートした後、交換水で５回洗浄した。次に、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製「ＡＰ１２４Ｐ」）水溶液を前記処理プレートに満たし、室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン）／過酸化水素水／硫酸で発色させて４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度は０．０５８と低値であり、マウスＩｇＧ抗体の非特異吸着を防止できたことが確認された。なお、３７℃でのインキュベート中にポリマーの析出・固化はなかった。

２．２．実施例２
実施例１において、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド７０ｇおよびモノマー（Ｂ）としてジメチルアクリルアミド３０ｇを用いた代わりに、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド８５ｇおよびモノマー（Ｂ）としてアクリルアミド１５ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、共重合ポリマー（Ｎ−２）を得た。

共重合ポリマー（Ｎ−２）のＧＰＣによる数平均分子量は７，２００であり、重量平均分子量は１５，０００であった。

また、実施例１と同様の方法にて、共重合ポリマー（Ｎ−２）の吸光度を測定した結果、該吸光度は０．０７６であり、マウスＩｇＧ抗体の非特異吸着を防止できたことが確認された。なお、３７℃でのインキュベート中にポリマーの析出・固化はなかった。

２．３．実施例３
実施例１において、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド７０ｇを用いた代わりに、モノマー（Ａ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド７０ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、共重合ポリマー（Ｎ−３）を得た。

共重合ポリマー（Ｎ−３）のＧＰＣによる数平均分子量は６，８００であり、重量平均分子量は１３，０００であった。

また、実施例１と同様の方法にて、共重合ポリマー（Ｎ−３）の吸光度を測定した結果、該吸光度は０．１８であり、マウスＩｇＧ抗体の非特異吸着を防止できたことが確認された。なお、３７℃でのインキュベート中にポリマーの析出・固化はなかった。

２．４．比較例１
実施例１において、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド７０ｇ、モノマー（Ｂ）としてジメチルアクリルアミド３０ｇを用いた代わりに、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド１００ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、ポリマー（Ｘ−１）を得た。

ポリマー（Ｘ−１）のＧＰＣによる数平均分子量は７，８００であり、重量平均分子量１６，０００であった。

また、実施例１と同様の方法にて、ポリマー（Ｘ−１）の吸光度を測定した結果、該吸光度は０．２１であり、実施例１の非特異吸着防止剤（Ｎ−１）の吸光度と比較してやや高い値が得られた。また、３７℃でのインキュベート中にポリマーが析出・固化した。

２．５．比較例２
実施例１において、モノマー（Ａ）としてジエチルアクリルアミド７０ｇおよびモノマー（Ｂ）としてジメチルアクリルアミド３０ｇを用いた代わりに、モノマー（Ａ）としてジメチルアクリルアミド１００ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、ポリマー（Ｘ−２）を得た。

ポリマー（Ｘ−２）のＧＰＣによる数平均分子量は８，４００であり、重量平均分子量は１７，０００であった。

また、実施例１と同様の方法にて、ポリマー（Ｘ−２）の吸光度を測定した結果、該吸光度は１．８であり、実施例１の非特異吸着防止剤（Ｎ−１）の吸光度と比較して著しく高い値が得られた。なお、３７℃でのインキュベート中にポリマーの析出・固化は確認されなかった。

２．６．比較例３
実施例１において、非特異吸着防止剤（Ｎ−１）の代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して、実施例１と同様の方法にて、ポリマー（Ｘ−２）の吸光度を測定した結果、該吸光度は、０．２０であり、実施例１の非特異吸着防止剤（Ｎ−１）の吸光度と比較してやや高い値が得られた。なお、３７℃でのインキュベート中にＢＳＡの析出・固化は確認されなかった。

Claims (4)

1. Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ノルマルプロピルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、およびビニルメチルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、モノマー（Ａ）と、
   アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、酢酸ビニル、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、およびアリルアルコールから選ばれる少なくとも１種である、モノマー（Ｂ）と、
   を含むモノマー部を重合することにより得られる水溶性ポリマーを含み、
   前記モノマー部の組成が、全モノマーを１００重量％として、モノマー（Ａ）３０〜９９重量％、モノマー（Ｂ）１〜７０重量％であり、
   前記水溶性ポリマーの数平均分子量が、通常１，０００〜１，０００，０００である、非特異吸着防止剤。
2. 前記モノマー（Ａ）は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドおよびＮ−イソプロピルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の非特異吸着防止剤。
3. 請求項１または２に記載の非特異吸着防止剤を用いて、容器または器具をコーティングする、非特異吸着防止剤の使用方法。
4. 請求項１または２に記載の非特異吸着防止剤を、診断薬の希釈剤、反応溶媒または保存剤に添加する、非特異吸着防止剤の使用方法。