JP5437378B2 - ヒャッポダ由来のヘモコアグラーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、セリンプロテアーゼに関し、特に蛇毒ヘモコアグラーゼ及びそれを単離及び精製する方法に関する。
多くのマムシ亜科（Ｃｒｏｔａｌｉｎａｅ）蛇毒に、通常、「トロンビン様酵素」（ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ、「ＴＬＣ」と略称する）と呼ばれる血液凝固に関連するプロテアーゼが存在することは国内外の文献で報告されている。トロンビン様酵素は、トロンビンと類似する効果を果たし、両者は、血漿におけるフィブリノーゲンをフィブリンに転化させて、「凝固」することができる。現在、３０種類以上の蛇毒にトロンビン様酵素成分が発見され、単離し精製されたのは２０種類以上であり、そのうち、１０種類以上のトロンビン様酵素の全部又は一部のアミノ酸配列が解明されている。発見されたＴＬＣの分子量の多くは２９ｋＤａ〜４５ｋＤａであり、ほとんどは酸性糖蛋白質である。
従来発見された蛇毒ＴＬＣの蛋白質１次構造は一本鎖の場合が多い。カイサカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ）蛇毒から単離されたトロンビンであるその代表的な製品「レプチラーゼ（Ｒｅｐｔｉｌａｓｅ）」は、そのトロンビンの前駆体が２５５個のアミノ酸からなり、Ｎ端には２４個のアミノ酸からなるリーダーペプチドを有し、活性酵素は、２３１個のアミノ酸を含む。また、相対分子質量が３９ｋＤａ〜４３ｋＤａの一本鎖糖蛋白質である。
マムシ亜科蛇毒がジスルフィドで鎖間を結合する二本鎖構造を有するかもしれないことは、ここ十年の研究により発見された。また、１９９９年に、Ｘｉｎ Ｃｈｅｎｇなど（中国科技大学所員）は、ヒャッポダ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ）から「Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ」と命名された「トロンビン様酵素」が単離されたことを報告した。この蛋白質は２本のペプチド鎖からなり、αサブユニットの分子量が１５ｋＤａ、βサブユニットの分子量が１４ｋＤａである。Ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎは、フィブリノーゲンのα鎖を加水分解することができる。２００４年に肖昌華（中科院昆明動物研究所の研究者）は、２種類の「トロンビン様酵素」をヒャッポダから単離した。これら酵素の分子構造はともに二本鎖構造である。そのうち、ＴＬＣＩのＡサブユニットは１３２個のアミノ酸を含み、分子量が１６ｋＤａであり、Ｂサブユニットは１２３個のアミノ酸を含み、分子量が１４ｋＤａであり、ＴＬＣＩの酵素比活性（ＥＳＡ）が１６０ｕ／ｍｇである。ＴＬＣＩＩのＡサブユニットは１２２個のアミノ酸を含み、分子量が１５ｋＤａであり、Ｂサブユニットは１２０個のアミノ酸を含み、分子量が１３ｋＤａであり、ＴＬＣＩＩの酵素比活性（ＥＳＡ）が７０ｕ／ｍｇである。薬理学の試験を行った結果、この２種類のＴＬＣのいずれもが止血の効果を持っていることが確認されている。
中国には、蛇毒研究資源が豊かである。本発明者は中国のヒャッポダから、今まで発見されていなかった高活性のヘモコアグラーゼを単離及び精製することを図る。
本発明は、ヒャッポダの蛇毒から単離されたトロンビン様酵素である蛇毒ヘモコアグラーゼを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ヘモコアグラーゼを単離及び精製する方法を提供することを目的とする。
本発明は、ヒャッポダの蛇毒から単離されたトロンビン様酵素である蛇毒ヘモコアグラーゼを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ヘモコアグラーゼを単離及び精製する方法を提供することを目的とする。
本発明にかかるヘモコアグラーゼは、中国のヒャッポダの蛇毒から単離された高活性ヘモコアグラーゼである。この酵素は、以下の特性を有する。
（１）前記酵素は、２５２個のアミノ酸を含み、分子量が２９．３ｋＤａ〜２９．５ｋＤａであり、等電点ｐＩが５．５である。
（２）前記酵素は、αサブユニットとβサブユニットとからなり、これらサブユニットの鎖間は７つのジスルフィドで結合されている。
（３）前記αサブユニットが１２９個のアミノ酸を含み、分子量が１５ｋＤであり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、前記βサブユニットが１２３個のアミノ酸を含み、分子量が１４．５ｋＤであり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。
（４）酵素活性をフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）によって完全に抑制することができ、これは、前記酵素がセリンプロテアーゼであることを示している。
（５）前記酵素は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を加水分解することができる。
（１）前記酵素は、２５２個のアミノ酸を含み、分子量が２９．３ｋＤａ〜２９．５ｋＤａであり、等電点ｐＩが５．５である。
（２）前記酵素は、αサブユニットとβサブユニットとからなり、これらサブユニットの鎖間は７つのジスルフィドで結合されている。
（３）前記αサブユニットが１２９個のアミノ酸を含み、分子量が１５ｋＤであり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、前記βサブユニットが１２３個のアミノ酸を含み、分子量が１４．５ｋＤであり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。
（４）酵素活性をフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）によって完全に抑制することができ、これは、前記酵素がセリンプロテアーゼであることを示している。
（５）前記酵素は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を加水分解することができる。
本発明における前記ヘモコアグラーゼを単離及び精製する方法は、
蛇毒を前処理する工程（１）と、
前処理した蛇毒溶液を前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出液を収集する工程（２）と、
前記収集した溶出液を、適当に濃縮した後に透析して前記ＮａＣｌを除くか又は数回希釈してから限外濾過処理して前記ＮａＣｌを除く工程（３）と、
透析後の溶液を再度、前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速クロマトグラフィーカラムに注入して、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の第２溶出ピーク際の溶出液を収集する工程（４）と、
前記溶出液を適当に濃縮した後、蒸留水で透析し、又はセファデックス−Ｇ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５）カラムにより脱塩する工程（５）と、を含む。
蛇毒を前処理する工程（１）と、
前処理した蛇毒溶液を前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出液を収集する工程（２）と、
前記収集した溶出液を、適当に濃縮した後に透析して前記ＮａＣｌを除くか又は数回希釈してから限外濾過処理して前記ＮａＣｌを除く工程（３）と、
透析後の溶液を再度、前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速クロマトグラフィーカラムに注入して、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の第２溶出ピーク際の溶出液を収集する工程（４）と、
前記溶出液を適当に濃縮した後、蒸留水で透析し、又はセファデックス−Ｇ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５）カラムにより脱塩する工程（５）と、を含む。
そのうち、工程（１）における蛇毒の前処理は、蛇毒を予冷された適量な０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶解し、溶液を遠心分離し、得られた上清液を透析し（分画分子量が７，０００Ｄ〜１０，０００Ｄである透析袋を使用）、又は接線流れ限外濾過する（限外濾過膜の分画分子量が５，０００Ｄ〜１０，０００Ｄ）方法を利用して、前記上清液を何度も繰り返し希釈し、限外濾過濃縮することにより行われる。このような前処理によって、不溶性の不純物及び低分子のポリペプチドを除去し、溶液のイオン強度を下げることができる。
具体的には、下記の通りに蛇毒を前処理する。
数グラムの蛇毒を採取し、前記蛇毒の質量の５倍〜１０倍の体積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに４℃〜８℃温度のクロマトグラフィーの装置内で３０分間〜６０分間攪拌しながら前記蛇毒を溶解させ、４℃〜８℃で遠心力５，０００ｇ〜１０，０００ｇで１０分間〜２０分間遠心分離し、得られた上清液を透析袋に入れ、蛇毒質量の５倍〜１０倍体積の予冷されたＰＢＳを沈殿物に加え、攪拌した後、再度遠心分離する。低分子のポリペプチドの除去及び溶液のイオン強度を低減するため、このように２回の遠心分離により得られた上清液を透析袋（分画分子量７，０００Ｄ〜１０，０００Ｄ）に集め、４℃〜８℃のクロマトグラフィー装置において０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで１２時間〜２４時間透析し、その間、２回〜４回のＰＢＳ換液を行う。
数グラムの蛇毒を採取し、前記蛇毒の質量の５倍〜１０倍の体積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに４℃〜８℃温度のクロマトグラフィーの装置内で３０分間〜６０分間攪拌しながら前記蛇毒を溶解させ、４℃〜８℃で遠心力５，０００ｇ〜１０，０００ｇで１０分間〜２０分間遠心分離し、得られた上清液を透析袋に入れ、蛇毒質量の５倍〜１０倍体積の予冷されたＰＢＳを沈殿物に加え、攪拌した後、再度遠心分離する。低分子のポリペプチドの除去及び溶液のイオン強度を低減するため、このように２回の遠心分離により得られた上清液を透析袋（分画分子量７，０００Ｄ〜１０，０００Ｄ）に集め、４℃〜８℃のクロマトグラフィー装置において０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで１２時間〜２４時間透析し、その間、２回〜４回のＰＢＳ換液を行う。
このように、各透析処理の代わりに接線流れ限外濾過（限外濾過膜の分画分子量が５，０００Ｄ〜１０，０００Ｄ）方法を利用し、ＰＢＳ希釈、限外濾過濃縮、再度希釈、及び限外濾過することで、溶液が脱塩されると共に、低分子のポリペプチドが除去され、イオン強度を低減することができる。
また、工程（２）及び工程（４）において、まず、ＤＥＡＥ−セファロース高流速クロマトグラフカラムを０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで前平衡させ、そして、試料を注入する。
また、工程（３）及び工程（５）において、溶液中のＮａＣｌを除去することを目的とする。溶出液の濃縮は、限外濾過濃縮方法を利用する。少量の濃縮液の場合は、直接透析してもよく、あるいは別法として、ＰＢＳ希釈、限外濾過濃縮、再度希釈、及び再度限外濾過濃縮することにより少量の濃縮液を処理して、蛋白質を濃縮し、ＮａＣｌを除去してもよい。最終的に、精製された酵素濃縮液は、セファデックス−Ｇ２５カラムで直接に脱塩できる。
脱塩後の溶液を直接凍結乾燥させてもよく、又は抗凍結剤を添加し凍結乾燥させてもよい。前記抗凍結剤としては、例えば低分子量のデキストラン、マンニット、スクロース、グリセリン、ゼラチン、ヒト血漿アルブミンなどが挙げられる。抗凍結剤の添加量は、１％〜５％（ｗ／ｖ）である。
本発明の方法で精製されたヘモコアグラーゼにおいては、比活性が１８０ｕ／ｍｇ蛋白質以上であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）方法で１本の蛋白質のバンドが検出され、還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）方法で２本のバンドが検出される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析の精度は、９５％以上であり、蛇毒原料の重量に対する収率は、０．７％〜０．８％である。
本発明のヘモコアグラーゼは、良好な凝集活性を有するため、様々な止血薬物の製造に適用できる。例えば、本発明のヘモコアグラーゼを所定の酵素活性ユニットになるように希釈してから、抗凍結剤（低分子量のデキストラン２０又はヒト血漿アルブミン）を添加し、ウィルス膜で濾過した後、凍結乾燥し、外科手術及び他の臨床出血症状に用いる止血用凍結乾燥粉末状注射薬を製造することができる。本発明のヘモコアグラーゼはまた、外用止血貼り薬、粉剤又は液状噴霧剤に製造してもよい。
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例に限定されたものではない。本発明の趣旨及び実質を逸脱しない限り、本発明の方法、工程又は条件に対しての修正又は取り換えることも、全て本発明の範囲に属する。
特に指定しない限り、実施例における技術手段は、すべて当業者が公知的な技術手段である。
特に指定しない限り、実施例における技術手段は、すべて当業者が公知的な技術手段である。
特に説明しない限り、本明細書において「％」は質量％であるが、溶液の百分率とは、特に指定しない限り、１００ｍＬの溶液に含まれる溶質の質量を示す。各液体間の百分率とは、２０℃での各容量の比率である。本明細書において、「蛇毒の質量の１０倍体積」という用語について、その質量と体積の単位はそれぞれｇ及びｍＬである。
実施例１ ヘモコアグラーゼの精製
ヒャッポダ由来の蛇毒粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）３０ｇを、蛇毒質量の１０倍体積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに４℃のクロマトグラフィーの装置中で３０分間攪拌しながら溶解させ、４℃で遠心力１０，０００ｇで１０分間遠心分離を行い、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に蛇毒重量の１０倍体積の予冷されたＰＢＳを加え、再度攪拌した後、再び遠心分離した。２回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋（分画分子量７，０００Ｄ）に集め、４℃のクロマトグラフィーの装置中で０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳを利用して２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を３回行った。前処理された蛇毒溶液を、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳで溶出し、次いでそれぞれ０．０２Ｍ、０．０６Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集した。
ヒャッポダ由来の蛇毒粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）３０ｇを、蛇毒質量の１０倍体積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに４℃のクロマトグラフィーの装置中で３０分間攪拌しながら溶解させ、４℃で遠心力１０，０００ｇで１０分間遠心分離を行い、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に蛇毒重量の１０倍体積の予冷されたＰＢＳを加え、再度攪拌した後、再び遠心分離した。２回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋（分画分子量７，０００Ｄ）に集め、４℃のクロマトグラフィーの装置中で０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳを利用して２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を３回行った。前処理された蛇毒溶液を、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳで溶出し、次いでそれぞれ０．０２Ｍ、０．０６Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集した。
酵素活性測定（添付の配列表を参照）及び電気泳動分析によって、目的物が０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピークに現れたことが分かる。溶出液を集め、合計で２，２２０ｍＬの溶出液を得た。ミリポアペリコン２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐｅｌｌｉｃｏｎ２）の接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２の分画分子量５ｋＤａの膜）で前記２，２２０ｍＬ溶液を２２０ｍＬに限外濾過濃縮した。この２２０ｍＬ限外濾過濃縮液を透析袋（分画分子量７，０００Ｄ）に注入し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ５，０００ｍＬを用いて４℃で２４時間透析し、その間、換液を３回行った。透析後の酵素溶液を前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入して、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで溶出した。そして、それぞれ０．０２Ｍ、０．０４Ｍ、０．０６Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで段階的に溶出して、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の第２溶出ピークでの溶出液２を収集して１，０５０ｍＬの溶出液を得た。酵素活性測定とＰＡＧＥ方法で１本の蛋白質バンドが検出されたので、精製されたことがわかる。ミリポアペリコン２接線流れ限外濾過機（０．１Ｍ２で分画分子量５ｋＤａの膜）で前記１，０５０ｍＬ溶出液を限外濾過して１３５ｍＬに濃縮した。この１３５ｍＬ濃縮液を透析袋に移し、純水で２４時間透析し、その間、５ｍＬの換液を３回行った。透析後の酵素溶液においては、体積が１５９ｍＬであり、総蛋白質が合計２４０ｍｇであり、酵素の比活性が１９５ｕ／ｍｇ蛋白質であることが測定され、最終収率は０．８％である。ＨＰＬＣ分析により検出された純度が９８．２％で、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２本の蛋白質の分子量がそれぞれ約１５ｋＤａ及び１４．５ｋＤａであることがわかった。等電点電気泳動により検出されたこの酵素の等電点ｐＩは５．５である。
Ｄｅ ｎｏｖｏ法で測定されたアミノ酸配列において、上記２つのバンドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示される。αサブユニット（配列番号１）は、１２９個のアミノ酸を含んで、アミノ酸だけで計算すると分子量が１４６６０．７ダルトンとなる。βサブユニット（配列番号２）は、１２３個のアミノ酸を含み、アミノ酸だけで計算すると分子量が１４，５５１．８ダルトンとなる。αサブユニットとβサブユニットのいずれもが７つのシスチン残基を含む。
実施例２ 蛇毒ヘモコアグラーゼの精製
ヒャッポダ蛇毒粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）３０ｇを３００ｍＬの予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに、４℃のクロマトグラフィーの装置で６０分間攪拌しながら溶解させた。得られた溶液を４℃で遠心力１，０００ｇで１５分間遠心分離を行って、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に３００ｍＬの予冷されたＰＢＳを添加し、再度攪拌し懸濁させた後、再び遠心分離した。２回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋（分画分子量１０，０００Ｄ）に集め、４℃のクロマトグラフィーの装置で０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳを利用して２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を３回行った。
ヒャッポダ蛇毒粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）３０ｇを３００ｍＬの予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに、４℃のクロマトグラフィーの装置で６０分間攪拌しながら溶解させた。得られた溶液を４℃で遠心力１，０００ｇで１５分間遠心分離を行って、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に３００ｍＬの予冷されたＰＢＳを添加し、再度攪拌し懸濁させた後、再び遠心分離した。２回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋（分画分子量１０，０００Ｄ）に集め、４℃のクロマトグラフィーの装置で０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳを利用して２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を３回行った。
実施例１の方法と同様に、前記の前処理された蛇毒溶液を、第１回目のＤＥＡＥ−セファロース高流速カラムクロマトグラフィー処理した。酵素活性測定及び電気泳動分析によって、目的物が０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピークに現れたことが分かる。溶出された収集液を集め、合計で２，２６２ｍＬの溶出液が得られた。ミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２の分画分子量５ｋＤａの膜）で前記２，２６２ｍＬ溶出液を限外濾過して２００ｍＬに濃縮した。上記２００ｍＬ限外濾過濃縮液を透析袋（分画分子量１０，０００Ｄ）に移し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳを５，０００ｍＬ用いて２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を３回行った。透析後の酵素溶液をＤＥＡＥ−セファロース高流速カラムに注入し、実施例１と同様の方法で第２回のクロマトグラフィー処理を行った。ヘモコアグラーゼは、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の第２溶出ピークに現れ、この溶出ピーク際の溶出液を集めて９５６ｍＬの溶出液を得た。酵素活性測定及びＰＡＧＥ方法で１本の蛋白質バンドが検出されたため、精製されたことがわかる。ミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２の分画分子量５ｋＤａの膜）で前記９５６ｍＬ溶出液を限外濾過して１９２ｍＬに濃縮した。この１９２ｍＬ濃縮液をセファデックス−Ｇ２５カラムに注入して、純水で溶出し脱塩して、溶出ピーク際の３２２ｍＬの溶出液を得た。当該溶出液を直接に凍結乾燥し、総量が２３５ｍｇである蛋白質を得た。得られた蛋白質の比活性が２００ｕ／ｍｇ蛋白質で、最終収率が０．７８％である。ＨＰＬＣ分析により純度が９９％で、クロマトグラムが実施例１と同様であり、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された蛋白質バンドが２本で、その分子量がそれぞれ約１５ｋＤａ及び１４．５ｋＤａである。
実施例３ 蛇毒ヘモコアグラーゼの精製
工程（１）において、ヒャッポダ蛇毒の乾燥粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）１００ｇを４℃〜８℃のクロマトグラフィーの装置に入れ、２，０００ｍＬの予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに６０分間攪拌しながら溶解させた。その蛇毒溶液を４℃で遠心力１０，０００ｇで２０分間遠心分離を行い、得られた上清液を３，０００ｍＬのビーカーに移した。そして、ミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２の分画分子量８ｋＤａの膜）で上清液を限外濾過し、５００ｍＬに濃縮し、さらに、予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１，５００ｍＬを上記の濃縮液に添加し、そして、再度５００ｍＬまで限外濾過した。このように限外濾過濃縮を３回に繰り返した。
工程（１）において、ヒャッポダ蛇毒の乾燥粉末（ロット番号：２００６１００１、中国広西蛇毒研究所製）１００ｇを４℃〜８℃のクロマトグラフィーの装置に入れ、２，０００ｍＬの予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳに６０分間攪拌しながら溶解させた。その蛇毒溶液を４℃で遠心力１０，０００ｇで２０分間遠心分離を行い、得られた上清液を３，０００ｍＬのビーカーに移した。そして、ミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２の分画分子量８ｋＤａの膜）で上清液を限外濾過し、５００ｍＬに濃縮し、さらに、予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１，５００ｍＬを上記の濃縮液に添加し、そして、再度５００ｍＬまで限外濾過した。このように限外濾過濃縮を３回に繰り返した。
工程（２）において、上記の５００ｍＬ限外濾過濃縮液に０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１，５００ｍＬを添加し、３５ｍＬ／ｍｉｎ〜４０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムに注入した。
工程（３）において、注入後、７０ｍＬ／ｍｉｎ〜８０ｍＬ／ｍｉｎの流量で順次に０．０２Ｍ、０．０６Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳを使用して溶出処理を行った。
工程（４）において、目的蛋白質が０．０６ＭのＮａＣｌ溶出液に出現し、この溶出ピーク際の溶出液６，７５０ｍＬを収集した。
工程（５）において、この６，７５０ｍＬ溶出液をミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２で分画分子量８ｋＤａの膜）で限外濾過し、５００ｍＬに濃縮した。
工程（６）において、前記５００ｍＬの限外濾過濃縮液に０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１，５００ｍＬを添加し、再度５００ｍＬまで限外濾過した。このように限外濾過濃縮を３回に繰り返した。
工程（７）において、前記５００ｍＬ限外濾過濃縮液に０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１，５００ｍＬを添加して、流量３５ｍＬ／ｍｉｎ〜４０ｍＬ／ｍｉｎでＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムに注入した。
工程（８）において、カラムに添加してから、それぞれ０．０２Ｍ、０．０４Ｍ、０．０６Ｍおよび１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液１０Ｌを順次に利用し、流量７０ｍＬ／ｍｉｎ〜８０ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。
工程（９）において、酵素活性測定によって、目的蛋白質が０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の第２溶出ピーク際の溶出液に現われ、この溶出液３，０５０ｍＬを収集した。ＰＡＧＥにより１本の蛋白質バンドが検出されたので、酵素が精製されたことがわかる。
工程（１０）において、前記３，０５０ｍＬ溶出液をミリポアペリコン２接線流れ限外濾過器（０．１Ｍ２で分画分子量８ｋＤａの膜）で限外濾過し、３００ｍＬに濃縮した。当該３００ｍＬの濃縮液をセファデックス−Ｇ２５カラムに注入し、純水で溶出して脱塩させ、溶出ピーク際の溶出液を４９０ｍＬ収集した。この溶出液中の総蛋白質量は７５２ｍｇであり、比活性が１８３ｕ／ｍｇ蛋白質であり、最終収率が０．７５％である。ＨＰＬＣ分析により純度が９８．０％で、クロマトグラムは実施例１と同様である。
工程（１１）において、濾液の体積に対して、抗凍結剤として１％の低分子量のデキストラン２０を添加し、その後、ミリポアビレソルブＮＦＰフィルターオプチスケールー２５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ Ｆｉｌｔｅｒｓ ＯｐｔｉＳｃａｌｅ−２５）ウィルス膜で濾過した。
工程１２において、濾液を直接容器に入れてから、凍結乾燥した。
工程（１３）において、凍結乾燥粉末は、ＰＡＧＥ方法により１本のバンドが検出され、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると２本の蛋白質バンドが検出され、また、各分子量がそれぞれ約１５ｋＤａと１４．５ｋＤａである。
実施例４ 蛇毒ヘモコアグラーゼのセリン蛋白質の属性試験
実施例２で単離されたヘモコアグラーゼをＨＰＬＣで更に精製して、ＨＰＬＣ３次元検査により求めた蛋白質純度が１００％であり、また、酵素活性が１０ｕ／ｍＬであるヘモコアグラーゼ溶液を得た。
生理食塩水で１％の牛フィブリノーゲン（シグマ社製）を調製した。
溶液濃度が４ｍｇ／ｍＬになるようにイソプロパノールでフッ化フェニルメタンススルフォニル（ＰＭＳＦ、メルク社製）を溶解した。
実施例２で単離されたヘモコアグラーゼをＨＰＬＣで更に精製して、ＨＰＬＣ３次元検査により求めた蛋白質純度が１００％であり、また、酵素活性が１０ｕ／ｍＬであるヘモコアグラーゼ溶液を得た。
生理食塩水で１％の牛フィブリノーゲン（シグマ社製）を調製した。
溶液濃度が４ｍｇ／ｍＬになるようにイソプロパノールでフッ化フェニルメタンススルフォニル（ＰＭＳＦ、メルク社製）を溶解した。
試験工程は下記の通りである。
工程（１）において、１％の牛フィブリノーゲン溶液２ｍＬを３７℃恒温で５分間放置した。
工程（１）において、１％の牛フィブリノーゲン溶液２ｍＬを３７℃恒温で５分間放置した。
工程（２）において、３つの試験管をそれぞれ１＃、２＃、３＃のように表記し、蒸留水で１倍に希釈されたヘモコアグラーゼ溶液２００μＬ（５ｕ／ｍＬ）を各試験管に添加した。
工程（３）において、１＃試験管に蒸留水１０μＬを、２＃試験管にイソプロパノール１０μＬを、３＃試験管にＰＭＳＦを１０μＬ添加して、３７℃恒温の水浴で５分間放置した。
工程（４）において、試験管の表記順番に応じて、それぞれ試験管ごとに凝集試験を行い、その結果を観測した。各試験管に恒温された１％の牛フィブリノーゲン２００μＬを添加した直後に計時を始めるとともに、試験管を軽く振り、３７℃の水浴に放置し、試験管内の凝集状況を観測した。溶液が完全に凝固状態になったときに計時を停止した。
結果を表１に示す。
結果を表１に示す。
表１の試験結果により、以下の二つの結論に結びつける。
１００ｐｐｍ濃度のＰＭＳＦがヘモコアグラーゼの活性を完全に抑制することにより、上記ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼがセリンプロテアーゼであることがわかる。微量のイソプロパノールは上記凝集反応に影響を与えない。
１００ｐｐｍ濃度のＰＭＳＦがヘモコアグラーゼの活性を完全に抑制することにより、上記ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼがセリンプロテアーゼであることがわかる。微量のイソプロパノールは上記凝集反応に影響を与えない。
実施例５ ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼでヒトフィブリノーゲンの加水分解試験
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液を用いて、４ｍｇ／ｍＬのヒトフィブリノーゲン溶液を調製し、そして、５つの試験管にそれぞれヒトフィブリノーゲン溶液０.５ｍＬを添加した。そのうち、４つの上記試験管に１活性単位の精製ヘモコアグラーゼを加え、３７℃の水浴にそれぞれ４時間、２時間、１時間、及び０．５時間という異なる保温時間で維持した。保温完了した直後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ヒトフィブリノーゲンの加水分解度を観測した。一方、残った１つの０．５ｍＬのヒトフィブリノーゲン溶液を含む試験管を対照サンプルとし、３７℃の水浴中で４時間保温した。
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液を用いて、４ｍｇ／ｍＬのヒトフィブリノーゲン溶液を調製し、そして、５つの試験管にそれぞれヒトフィブリノーゲン溶液０.５ｍＬを添加した。そのうち、４つの上記試験管に１活性単位の精製ヘモコアグラーゼを加え、３７℃の水浴にそれぞれ４時間、２時間、１時間、及び０．５時間という異なる保温時間で維持した。保温完了した直後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ヒトフィブリノーゲンの加水分解度を観測した。一方、残った１つの０．５ｍＬのヒトフィブリノーゲン溶液を含む試験管を対照サンプルとし、３７℃の水浴中で４時間保温した。
図１に示すように、ヘモコアグラーゼで加水分解されなかったフィブリノーゲン対照サンプルの電気泳動スペクトルには、３本のバンドがあり、Ｆ列の３本のバンドは上から順番にαサブユニット、βサブユニット、γサブユニットを示す。フィブリノーゲンをヘモコアグラーゼ（１単位）で０．５時間及び１時間処理すると、αサブユニットのバンドが徐々に薄くなり、２時間又は４時間処理後では、αサブユニットのバンドが完全に消失した。これにより、ヘモコアグラーゼがヒトフィブリノーゲンのαサブユニットを加水分解する効果を有することが確認できる。
付 録
ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ単位の定義及び活性測定方法
ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ単位の定義及び活性測定方法
牛フィブリノーゲン測定法
生理食塩水で調製した１．０％の牛フィブリノーゲン（シグマ社製）１ｍＬを試験管に加え、３７±０．５℃の水浴で３分間保温し、そして、さらに３７±０．５℃の予熱された酵素溶液１ｍＬを添加した直後に計時を始める。試験管を１２０±３０秒間振盪し、牛フィブリノーゲン溶液に白色フロックが発生すると、上記酵素溶液の活性単位が１ｕ／ｍＬであることを確認できる。
生理食塩水で調製した１．０％の牛フィブリノーゲン（シグマ社製）１ｍＬを試験管に加え、３７±０．５℃の水浴で３分間保温し、そして、さらに３７±０．５℃の予熱された酵素溶液１ｍＬを添加した直後に計時を始める。試験管を１２０±３０秒間振盪し、牛フィブリノーゲン溶液に白色フロックが発生すると、上記酵素溶液の活性単位が１ｕ／ｍＬであることを確認できる。
標準ヒト血漿測定法
標準ヒト血漿１ｍＬを試験管に加え、３７±０．５℃の水浴で３分間予熱し、そして、さらに３７±０．５℃の予熱された酵素溶液１ｍＬを前記試験管に添加した直後に計時を始める。試験管を６０±２０秒間振盪し、ヒト血漿に白色フロックが発生すると、この酵素溶液の活性単位が１ｕ／ｍＬであることを確認できる。
標準ヒト血漿１ｍＬを試験管に加え、３７±０．５℃の水浴で３分間予熱し、そして、さらに３７±０．５℃の予熱された酵素溶液１ｍＬを前記試験管に添加した直後に計時を始める。試験管を６０±２０秒間振盪し、ヒト血漿に白色フロックが発生すると、この酵素溶液の活性単位が１ｕ／ｍＬであることを確認できる。
未知の高酵素活性溶液を測定する場合、純水で１ｕ／ｍＬに希釈した後に測定する必要がある。希釈倍数は１ｍＬの原酵素溶液中の酵素活性単位である。
Claims (10)
- ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼであって、
αサブユニットとβサブユニットとにより形成され、前記αサブユニットと前記βサブユニットとが７つのジスルフィドで結合され、
前記αサブユニットは、１２９個のアミノ酸を含有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、
前記βサブユニットが１２３個のアミノ酸を含有し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ。 - セリンプロテアーゼであり、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を加水分解可能であることを特徴とする請求項１に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ。
- 請求項１又は２に記載のヘモコアグラーゼを含むことを特徴とする薬物。
- 凍結乾燥散剤、止血パッチ、又は液状噴霧剤の剤型である請求項３に記載の薬物。
- 請求項１又は２に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼを精製する方法であって、
蛇毒を前処理する工程（１）と、
前処理した蛇毒溶液を前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集する工程（２）と、
前記収集されたＮａＣｌ溶出液を、適当に濃縮するか又は数回希釈してから限外濾過濃縮した後に透析し、ＮａＣｌを除く工程（３）と、
透析後の溶液を前平衡されたＤＥＡＥ−セファロース高流速クロマトグラフィカラムに注入し、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶出し、次いで０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌを含有する０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで段階的に溶出し、０．０６ＭのＮａＣｌ溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集する工程（４）と、
前記収集された溶出液を適当に濃縮した後、蒸留水で透析し、又はセファデックス−Ｇ２５カラムを利用してＮａＣｌを除く工程（５）と、
を備えることを特徴とするヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。 - 工程（１）における蛇毒の前処理が、蛇毒を予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶解し、遠心分離した後、得られた上清液を透析するか、又は数回希釈して限外濾過濃縮する方法である請求項５に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 工程（１）における蛇毒の前処理が、
数グラムの蛇毒を採取する工程と、
蛇毒の質量の５倍〜１０倍相当の容積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに前記蛇毒をクロマトグラフィー箱中で４℃〜８℃で３０分間〜６０分間攪拌しながら溶解させる工程と、
その後、４℃〜８℃で遠心力５，０００ｇ〜１０，０００ｇで１０分間〜２０分間遠心分離する工程と、
得られた上清液を透析袋に入れる工程と、
遠心分離による沈澱物に再び蛇毒質量の５倍〜１０倍の容積の予冷された前記ＰＢＳを加えて攪拌した後、再度遠心分離する工程と、
２回の遠心分離により得られた上清液を透析袋に集め、４℃〜８℃のクロマトグラフィー箱中で、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳを利用して１２時間〜２４時間透析し、その間、ＰＢＳ換液を２回〜４回行う工程；又は、蛇毒を蛇毒質量の１０倍〜２０倍の体積の予冷された０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで溶解し、ＰＢＳを繰り返し加えることにより希釈と分画分子量５，０００Ｄ〜１０，０００Ｄの限外濾過膜での限外濾過とを繰り返す工程と、
によって、工程（１）での蛇毒の前処理を行う請求項６に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。 - 工程（２）及び工程（４）において、ＤＥＡＥセファロース高流速クロマトグラフカラムを０．０１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳで前平衡したものを使用し、試料を注入する請求項５から７のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 工程（５）で得られた脱塩後の溶液を直接凍結乾燥するか、又は坑凍結剤を添加して凍結乾燥する工程を更に含む請求項５から８のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 分画分子量５，０００Ｄ〜１０，０００Ｄの限外濾過膜で限外濾過濃縮して目的蛋白質溶出液の体積を減量してから、透析して脱塩するか；又は、分画分子量５，０００Ｄ〜１０，０００Ｄの限外濾過膜で、溶出液を繰り返して希釈し、そして限外濾過して脱塩と目的蛋白質の濃縮とを行う請求項５から９のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
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