JP5447546B2 - 細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞を計数する方法に関し、特に浮遊細胞を培養する場合において、培養中の細胞数を、増殖効率を損ねることなく、正確に計数するための細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラムに関する。

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞の大量培養にあたり、浮遊細胞を培養する場合、培養中の細胞数を計数して、細胞数の経時変化や、増殖効率の変化を把握したいという要請がある。ところが、培養中の細胞数を正確に計数することには、従来様々な問題があった。

すなわち、浮遊細胞の増殖では、細胞が立体的に集合して形成された細胞塊と、個別に分離している単独細胞とが存在する。
従来は、これらの培養細胞を上方または下方から撮影し、得られた画像における培養細胞の投影面積に基づいて、細胞塊の投影面積を一個あたりの平均細胞面積により除算し、細胞数を計数することが行われていた。
しかしながら、細胞塊は立体的であるため、このようにして得られた細胞数は、細胞塊の実際の細胞数よりも少なく計数されてしまう。また、単独細胞が平面的に密集して連なっている場合、単独細胞の投影面積を一個あたりの平均細胞面積により除算して得られた細胞数は、単独細胞の実際の細胞数よりも多く計数されてしまう。このため、培養細胞の投影面積にもとづき計数された細胞数は、正確な値ではないという問題があった。

一方で、正確な細胞数を得るために、細胞塊を完全に崩して計数することも考えられる。
しかしながら、一般的に細胞塊の崩し過ぎは、細胞の増幅効率の低下を招くというさらなる問題がある。このため、従来は培養途中に正確な計数を行うことができず、細胞回収時のみにしか正確な計数を行うことができなかった。
ここで、培養細胞の細胞数を計数する従来の方法として、例えば特許文献１に記載の細胞数計測方法を挙げることができる。この方法では、培養容器内に存在する培養細胞の観察画像を取得し、取得された観察画像内において培養細胞の占有する面積の比率を占有面積率として算出し、算出された占有面積率と所定の関係式とから培養容器内に存在する培養細胞の細胞数を算出している。

特開２００７−１２４９１３号公報

しかしながら、この方法は、細胞数を占有面積率から算出する方法であるため、上述した通り、正確な計数を行うことはできない。一方、正確な計数を行うために、細胞塊を崩すと、増殖効率の低下を招いてしまう。
本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、培養中の培養細胞の画像を取得し、この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離し、細胞塊の画像と単独細胞の画像を別個に画像処理して、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数をそれぞれ算出することで、細胞塊が存在していてもこれを崩すことなく、正確に細胞数を計数することが可能な細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラムの提供を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の細胞計数方法は、培養細胞を計数する方法であって、培養中の培養細胞の画像を取得し、この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離し、細胞塊の画像と単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数を算出する方法としてある。

また、本発明の細胞計数装置は、培養細胞を計数するための細胞計数装置であって、培養中の培養細胞の画像を取得する手段と、この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離する手段と、細胞塊の画像と単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数を算出する手段とを備えた細胞計数装置としてある。

また、本発明の細胞計数プログラムは、培養細胞を計数するための細胞計数プログラムであって、コンピュータに、培養中の培養細胞の画像を入力させ、この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離させ、細胞塊の画像と単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数を算出させることを実行させるものとしてある。

本発明によれば、培養中の細胞数を、増殖効率を損ねることなく、正確に計数することが可能となる。

培養容器で培養中の浮遊細胞を、培養容器の底面方向から撮影して得られた画像を示す図である。 培養容器で培養中の浮遊細胞を、培養容器の底面方向から撮影して得られた画像における細胞の投影面積を示す図である。 培養容器で培養中の浮遊細胞を、培養容器の底面方向から撮影して得られた画像を用いて、単独細胞と細胞塊を分離し、細胞塊の投影面積を表した図である。 培養容器で培養中の浮遊細胞を、培養容器の底面方向から撮影して得られた画像を用いて、単独細胞と細胞塊を分離し、単独細胞の投影面積を表した図である。 培養中の浮遊細胞における単独細胞の直径の変化を示す図である。 培養中の浮遊細胞における細胞塊の体積の補正係数を示す図である。 本発明の細胞計数装置の構成を示すブロック図である。 本発明の細胞計数装置により実行される細胞計数プログラムによる処理手順を示すフローチャートである。 本発明の細胞計数方法と従来の細胞計数方法による培養容器で培養中の浮遊細胞の計数結果を比較したグラフを示す図である。

以下、本発明の細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラムの好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

［細胞計数方法］
まず、本実施形態の細胞計数方法について、図１〜図６を参照して説明する。
本実施形態の細胞計数方法は、培養容器中の培養細胞数を計数する方法であって、培養容器中の所定の領域の画像を取得し、この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離し、細胞塊の画像と単独細胞の画像を別個に画像処理して、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数をそれぞれ算出するものであれば良く、実施形態及び実施例の具体的な構成により限定されるものではないが、例えば以下の工程を備えたものとすることができる。

（Ａ）培養細胞の画像の取得
まず、培養容器中の所定の領域を撮影して、画像を取得する。具体的には、例えば透明の培養容器の上方から光を照射し、下方から顕微鏡を介してカメラにより、自動的に培養細胞を撮影して、培養容器中の所定の領域の画像を取得することができる。以下、この画像を「観察画像」と称する場合がある。図１は、このようにして得られた培養容器中の浮遊細胞を撮影して得られた観察画像を示している。同図には、細胞塊１、単独細胞２が、培養液３に存在しているようすが示されている。
なお、培養容器中の所定の領域のみを撮影して、この領域における細胞数を計数した後に、培養容器全体における当該領域の割合に基づいて、培養容器全体の培養細胞数を算出することができる。

ここで、従来は、この観察画像を用いて、図２に示すような細胞の投影面積画像を作成し、細胞の投影面積１１を、細胞一個当たりの平均面積で除算することで、細胞数を算出していた。しかしながら、このような方法で得られた細胞数は、細胞塊１が立体的であるため、細胞塊１に対応する部分については、実際の細胞数よりも少なくなっている。また、単独細胞２に対応する部分については、単独細胞２が平面的に連なっている部分も細胞投影面積１１に含まれる結果、実際の細胞数よりも多く計数されてしまう。したがって、このような従来の方法では、培養細胞数を正確に計数することができなかった。

（Ｂ）細胞塊と単独細胞の画像分離
次に、観察画像における細胞塊１と単独細胞２の画像を分離して、細胞塊の画像と、単独細胞の画像をそれぞれ作成する。
具体的には、まず図３に示すように、細胞塊１のみの細胞投影面積２１を表す細胞塊の画像を作成する。そして、この細胞塊の画像を用いて、細胞塊１の細胞投影面積２１を計測する。

また、図４に示すように、観察画像から細胞塊１を削除して、単独細胞の画像を作成する。そして、この単独細胞の画像を用いて、単独細胞２を個別にカウント可能なように、単独細胞２を円形で近似してそれぞれを区別する円形近似処理を行う。これにより、単独細胞の画像において、円形近似された単独細胞２２が示される。そして、この単独細胞の画像を用いて、単独細胞２の個数を計測すると共に、単独細胞２の平均面積を計測する。

ここで、図５に示すように、培養中の培養細胞の大きさは、培養時間によって変化する場合がある。同図は、ヒトのリンパ球細胞を増殖した場合の細胞直径の変化を示している。
同図に示すように、培養の初期には、培養細胞の直径が次第に増加するが、一定時間経過後は、反対に直径が小さくなる傾向が見られる。したがって、単独細胞の平均面積は、観察時間により変化するため、上記の通り、培養細胞を計数するタイミングで、単独細胞の平均面積を計測することが好ましい。
一方、例えばある種の腫瘍細胞のように、培養細胞の種類によっては、培養中の大きさがあまり変化しないものもある。このような培養細胞の場合には、培養細胞を計数するタイミングで単独細胞の平均面積を計測する必要はない。すなわち、単独細胞の平均面積は、後述する細胞塊の細胞数の算出に用いられるが、このような培養細胞の場合は、平均面積の計測に変えて、単独細胞の体積を予め設定しておき、これを培養細胞の計数に使用することも好ましい。

（Ｃ）細胞塊の体積の計算
次に、細胞塊の画像にもとづき得られた細胞投影面積２１を用いて、細胞塊１の体積を球形として算出する。そして、このようにして算出された細胞塊１の球形の体積を、補正係数を用いて補正する。具体的には、この球形の体積を補正係数で除算して、より実際の値に近い細胞塊１の体積を得ることができる。

図６に、細胞塊の投影面積と補正係数の関係を表すグラフを示す。同図は、細胞塊の投影面積と実際に測定した細胞塊の体積の関係をプロットし、これに基づいて、細胞塊の投影面積と補正係数の関係を式に示したものである。すなわち、本実施形態においては、補正係数を決定する式は、次の通りである。
［補正係数］＝1.1003×［細胞塊の投影面積（×10^−５cm^２）］−0.1885
ただし、細胞塊の投影面積が、1.0802×10^−５cm^２未満の場合は、補正係数は１となる。

細胞塊の体積をこのように補正するのは、細胞塊が小さいときは、ほぼ球形の状態で存在しているが、細胞塊が大きくなるにしたがって細胞塊は縦につぶれ、縦断面が楕円形の形状となるためである。すなわち、細胞投影面積が大きくなるにつれて、細胞塊は、より縦につぶれた形状となるため、これを補正係数によって、補正している。なお、補正係数は、細胞の種類や培養条件によって異なる場合があるため、これらに応じて予め決定することが望ましい。

（Ｄ）細胞塊の細胞数の算出
次に、補正して得られた細胞塊１の体積を、単独細胞２の体積で除算して、細胞塊１の細胞数を算出する。単独細胞２の体積は、単独細胞２の平均面積にもとづき算出できる。

（Ｅ）培養細胞の細胞数の算出
以上のようにして、単独細胞２の細胞数と、細胞塊１の細胞数を得ることができ、これらを加算することで、観察画像の領域における細胞数を算出することができる。そして、得られた細胞数に、観察画像の領域に対する培養液の体積の比率を乗算することで、培養細胞の細胞数を算出することができる。

［細胞計数装置、及び細胞計数プログラム］
次に、本実施形態の細胞計数装置、及び細胞計数プログラムについて、図７〜図８を参照して説明する。図７は、本発明の一実施形態に係る細胞計数装置の構成を示すブロック図であり、図８は、この細胞計数装置により実行される細胞計数プログラムによる処理手順を示すフローチャートである。
まず、図７に示されるように、本実施形態の細胞計数装置１００は、画像入力手段１０１、画像記憶手段１０２、画像分離手段１０３、単独細胞計測手段１０４、細胞塊体積算出手段１０５、細胞塊細胞数算出手段１０６、及び細胞数出力手段１０７を備えている。この細胞計数装置１００は、スマートフォン、タブレットコンピュータ、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバーなどの各種コンピュータを用いて構成でき、上記各構成は、コンピュータにおけるＣＰＵ及びメモリー等から構成することができる。また、このような各構成を備えた専用の計数装置として構成することもできる。

画像入力手段１０１は、培養中の培養細胞をカメラで自動撮影して得られた画像（観察画像）を入力して、画像記憶手段１０２に記憶させる。
画像分離手段１０３は、観察画像における細胞塊と単独細胞を分離して、細胞塊画像と、単独細胞画像を作成し、それぞれ画像記憶手段１０２に記憶させる。

単独細胞計測手段１０４は、単独細胞画像を用いて、単独細胞の円形近似を行い、単独細胞数を計測する。また、単独細胞計測手段１０４は、単独細胞の平均面積も計測する。
細胞塊体積算出手段１０５は、細胞塊画像を用いて、細胞塊の投影面積を計測する。また、細胞塊体積算出手段１０５は、細胞塊の体積を、球形として、細胞塊の投影面積にもとづき算出する。さらに、細胞塊体積算出手段１０５は、算出された球形の体積に補正係数を用いて、補正後の細胞塊の体積を算出する。

細胞塊細胞数算出手段１０６は、細胞塊細胞数算出手段１０５により算出された細胞塊の体積を、単独細胞の体積で除算して、細胞塊の細胞数を算出する。このとき、細胞塊細胞数算出手段１０６は、単独細胞の体積を、単独細胞計測手段１０４により計測された単独細胞の平均面積にもとづき算出する。

細胞数出力手段１０７は、観察画像上の領域における細胞数として、単独細胞計測手段１０４により計数された単独細胞の細胞数と、細胞塊細胞数算出手段１０６により算出された細胞塊の細胞数の和を算出する。また、細胞数出力手段１０７は、この観察画像上の領域における細胞数に、観察画像上の領域に対する培養液の体積の比率を乗算し、培養液中の細胞数を算出することができる。
そして、細胞数出力手段１０７は、観察画像上の領域における細胞数、及び／又は、培養液中の細胞数を、細胞計数装置１００に接続されたディスプレイなどの表示装置（図示していない）に出力する。

次に、細胞計数装置１００における処理手順について、図８を参照して説明する。同図は、本発明の一実施形態に係る細胞計数装置１００により実行される細胞計数プログラムによる処理手順を示すフローチャートである。すなわち、本実施形態の細胞計数プログラムは、コンピュータなどの細胞計数装置１００に、以下の処理を実行させる。

まず、細胞計数装置１００における画像入力手段１０１は、カメラから撮影された観察画像を入力し、これを画像記憶手段１０２に記憶させる（ステップ１０）。
次に、細胞計数装置１００における画像分離手段１３は、観察画像を用いて、細胞塊１と単独細胞２の画像を分離し、細胞塊の画像と単独細胞の画像を作成して、これらを画像記憶手段１０２に記憶させる（ステップ１１）。

次に、細胞計数装置１００における単独細胞計測手段１０４は、単独細胞の画像を用いて、単独細胞の円形近似を行い、単独細胞数を計測する。また、単独細胞の平均面積を計測する（ステップ１２）。
また、細胞計数装置１００における細胞塊体積算出手段１０５は、細胞塊の画像を用いて、細胞塊の投影面積を計測し、この投影面積を用いて、細胞塊を球形と仮定した場合の体積を算出する（ステップ１３）。
さらに、この細胞塊体積算出手段１０５は、算出された球形の体積を補正して、より実際に近い細胞塊の体積を算出する（ステップ１４）。

次に、細胞計数装置１００における細胞塊細胞数算出手段１０６は、細胞塊の体積を、単独細胞の体積で除算して、観察画像上の領域における細胞塊の細胞数を算出する（ステップ１５）。
以上によって、細胞塊の細胞数と、単独細胞の細胞数をそれぞれより正確に算出することができるため、培養細胞の細胞数を一層正確に把握することが可能となる。

最後に、細胞計数装置１００における細胞数出力手段１０７は、細胞塊の細胞数と単独細胞の細胞数を合計して、観察画像上の領域における細胞数を算出する。また、得られた細胞数を、培養容器全体における細胞数に換算する。そして、細胞数出力手段１０７は、培養容器中の細胞数等を表示装置に出力する（ステップ１６）。

以上説明したように、従来は、特に一定以上のサイズの細胞塊が形成されると、細胞数を正確に計数することができず、したがって、実質的に培養後にしか計数できないという問題があった。
しかしながら、本実施形態によれば、細胞塊の細胞数を正確に計数することが可能となる。また、単独細胞についても従来に比較してより正確に計数することができる。このため、培養中の細胞数を一層正確に把握することが可能となる。
また、その結果、細胞増殖履歴を記録することができ、培養中の細胞の状態を把握することが可能となる。
さらに、本実施形態の細胞計数装置により培養中の細胞数を把握できるため、目視観察によるバラツキをなくすことができ、継代のタイミングの判断をより正確に行うことが可能となる。

（実施例１）
上述した実施形態の細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラムを用いて、培養容器中の培養細胞を計数した。
具体的には、培養容器として、ＬＬＤＰＥ製バック（厚み１００μｍ，サイズ２３０×６２０ｍｍ）を用いた。培地には、ＡｌｙＳ５０５Ｎ−７（細胞科学研究所）を使用し、播種細胞としてヒト末梢血単核球細胞を６．４×１０^６ｃｅｌｌｓ播種した。そして、培養開始から６６時間後、１０４時間後、１７４時間後、２２２時間後、２３４時間後に、培養細胞数を計数した。
その結果、実施例１により算出された細胞数は、図９に示すように、それぞれ１．６０×１０^８ｃｅｌｌｓ、４．０７×１０^８ｃｅｌｌｓ、８．４１×１０^８ｃｅｌｌｓ、１．１６×１０^９ｃｅｌｌｓ、１．１９×１０^９ｃｅｌｌｓであった。

（比較例１）
実施例１で用いたものと同じ培養容器と培養細胞を使用して、実施例１と同じタイミングで、従来の方法により培養細胞を計数した。すなわち、培養容器中の所定の領域を撮影して得られた培養細胞の観察画像を用い、細胞の投影面積画像を取得した。そして、細胞の投影面積を計測し、得られた投影面積を細胞一個当たりの平均面積で除算して、細胞数を算出した。
その結果、比較例１により算出された細胞数は、図９に示すように、それぞれ１．１２×１０^８ｃｅｌｌｓ、３．７９×１０^８ｃｅｌｌｓ、４．３４×１０^８ｃｅｌｌｓ、１．０８×１０^９ｃｅｌｌｓ、１．１１×１０^９ｃｅｌｌｓであった。

（参考例１）
実施例１と同じ条件で細胞を培養し、培養細胞を計数する際に、細胞塊を崩し、全て単独細胞にしてから計数を行った。このとき、培養容器中の所定の領域を撮影して得られた観察画像を用いて、単独細胞を円形近似し、細胞数を計測した。
なお、培養容器は計数タイミング毎に個別に準備し、それぞれ一回の計数のみに使用した。したがって、本参考例では、細胞塊を崩すことによる培養効率の低下の影響はなく、かつそれぞれの計数タイミングにおいて、比較的現実の細胞数に近い正確な計数結果が得られていると考えられる。
その結果、参考例１により算出された細胞数は、図９に示すように、それぞれ１．４５×１０^８ｃｅｌｌｓ、４．３４×１０^８ｃｅｌｌｓ、８．４８×１０^８ｃｅｌｌｓ、１．２５×１０^９ｃｅｌｌｓ、１．２４×１０^９ｃｅｌｌｓであった。

以上の通り、比較例１に示される従来の細胞計数方法では、計数値が安定せず、正確な計数が行えていないことがわかる。例えば、１７４時間後の計数値は、実施例１及び参考例１の結果よりもかなり低くなっている。これは培養細胞の細胞塊が大きくなっているためであると考えられる。
これに対して、実施例１に示される本実施形態における細胞計数方法、細胞計数装置、及び細胞計数プログラムによれば、細胞塊を崩すことなく細胞数を計数しても、参考例１に示される細胞塊を崩して全て単独細胞にしてから計数を行う場合と、ほぼ同等の正確な計数を行えていることがわかる。

本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施形態では、細胞塊のみの細胞投影面積を計測してから、単独細胞数と平均面積を計測しているが、これらの順番は入れ替えてもよい。また、補正係数を細胞数や培養条件に応じて変更するなど適宜変更することが可能である。

本発明は、大量の細胞を培養する必要のあるバイオ医薬や再生医療、免疫療法等の分野において、好適に利用することが可能である。

１ 細胞塊
２ 単独細胞
３ 培養液
１１ 細胞投影面積
２１ 細胞塊の細胞投影面積
２２ 円形近似された単独細胞
１００ 細胞計数装置
１０１ 画像入力手段
１０２ 画像記憶手段
１０３ 画像分離手段
１０４ 単独細胞計測手段
１０５ 細胞塊体積算出手段
１０６ 細胞塊細胞数算出手段
１０７ 細胞数出力手段

Claims (7)

1. 培養細胞を計数する方法であって、
   前記培養細胞の画像を取得し、
   この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離し、
   前記細胞塊の画像と前記単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、前記細胞塊の細胞数と前記単独細胞の細胞数を算出する
   ことを特徴とする細胞計数方法。
2. 前記単独細胞の画像に基づいて、単独細胞の円形近似を行い、前記単独細胞の細胞数と平均面積を算出することを特徴とする請求項１記載の細胞計数方法。
3. 前記細胞塊の投影面積に基づいて、前記細胞塊の体積を算出し、
   前記単独細胞の平均面積に基づいて、前記単独細胞の体積を算出し、
   前記細胞塊の体積を前記単独細胞の体積で除算することで、前記細胞塊の細胞数を算出する
   ことを特徴とする請求項２記載の細胞計数方法。
4. 前記単独細胞の体積を予め設定しておき、
   前記細胞塊の投影面積に基づいて、前記細胞塊の体積を算出し、
   前記細胞塊の体積を予め設定された前記単独細胞の体積で除算することで、前記細胞塊の細胞数を算出する
   ことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞計数方法。
5. 前記細胞塊の体積は、細胞塊の体積を球状として計算した後、補正係数を乗算して算出することを特徴とする請求項３又は４記載の細胞計数方法。
6. 培養細胞を計数するための細胞計数装置であって、
   前記培養細胞の画像を取得する手段と、
   この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離する手段と、
   前記細胞塊の画像と前記単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、前記細胞塊の細胞数と前記単独細胞の細胞数を算出する手段と、を備えた
   ことを特徴とする細胞計数装置。
7. 培養細胞を計数するための細胞計数プログラムであって、
   コンピュータを、
   前記培養細胞の画像を入力する画像入力手段、
   この画像から、細胞塊の画像と単独細胞の画像を分離させる画像分離手段、及び
   前記細胞塊の画像と前記単独細胞の画像のそれぞれに基づいて、前記細胞塊の細胞数と前記単独細胞の細胞数を算出させる手段、
   として機能させるための細胞計数プログラム。