JP5472864B2 - Method for labeling undifferentiated cells using mortalin binding substance - Google Patents
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Description
本発明は、モータリン結合物質を用いた未分化細胞の標識方法に関する。本発明は、特に、量子ドットを標識物質として用いる未分化細胞の標識方法に関する。本発明の方法によれば、未分化細胞が安定に標識される。 The present invention relates to a method for labeling undifferentiated cells using a mortalin-binding substance. The present invention particularly relates to a method for labeling undifferentiated cells using a quantum dot as a labeling substance. According to the method of the present invention, undifferentiated cells are stably labeled.
モータリンはＨｓｐ７０ファミリータンパク質の一種であり、熱非応答性タンパク質である。このタンパク質は、大腸菌のＤｎａｋや酵母のＳＳＣ１ｐ、ラット細胞で細胞質画分に恒常的に発現しているＨｓｐ７０、Ｈｓｃ７０、ラット細胞で小胞体に存在するＢｉＰなどのＨｓｐファミリータンパク質と非常に高い相同性を有する。まず、マウス由来の正常線維芽細胞の細胞質画分からモータリン１（ｍｏｔ−１）が単離され（非特許文献１）、続いてマウスの不死化細胞ｃＤＮＡの免疫クローニング及び正常細胞からの配列との比較から、モータリン２（ｍｏｔ−２）が単離された（非特許文献２）。モータリン２は、カルボキシル末端の２アミノ酸のみでモータリン１と異なる配列を有する。モータリン１は正常細胞で発現しているが、モータリン２は不死化細胞で発現する。ヌードマウスを用いたアッセイによれば、モータリン１の発現は細胞老化様の表現型を引き起こすのに対し、モータリン２の過剰発現は悪性化を引き起こす（非特許文献３）。ヒトでは、マウスモータリンとアミノ酸レベルで９５％の高い相同性を有し、マウスモータリン２と同様の機能的特徴を有する１遺伝子（ヒトモータリン２）のみしか単離されていない。本明細書中では、特に断らない限り、モータリン２を単に「モータリン」と称する。ヒトモータリン２は、６７９アミノ酸からなる分子量７３，９１３ダルトンのタンパク質であり、その前駆体タンパク質は４６アミノ酸からなるミトコンドリア移行シグナルペプチドを含む。モータリン２はカルシウム依存的な自己リン酸化を経て、細胞内の様々な場所で種々のタンパク質と結合し、ミトコンドリア輸送、細胞内輸送、シャペロニン機能、ストレス応答、腫瘍形成などの多岐にわたる機能に関与すると考えられている。
Mortalin is a kind of Hsp70 family protein and is a heat non-responsive protein. This protein is highly homologous to Hsp family proteins such as Dnak of E. coli and SSC1p of yeast, Hsp70 and Hsc70 that are constitutively expressed in the cytoplasmic fraction in rat cells, and BiP present in the endoplasmic reticulum in rat cells. Have First, mortalin 1 (mot-1) was isolated from the cytoplasmic fraction of normal fibroblasts derived from mice (Non-Patent Document 1), followed by immunocloning of mouse immortalized cell cDNAs and sequences from normal cells. From the comparison, mortalin 2 (mot-2) was isolated (Non-patent Document 2). Mortalin 2 has a different sequence from
本発明者らは、モータリンの発現量の増加と発癌との関連を調べる過程で、癌細胞に対して内在化機能を有する抗モータリン抗体を見出し、この抗体並びに当該抗体を用いた癌治療用医薬組成物及び薬剤キャリアなどに関する特許出願を行った（特許文献１及び２）。癌細胞に対する内在化機能を有する抗モータリン抗体は、それ自身が抗体医薬として使用可能であり、さらに、免疫毒などを腫瘍細胞に輸送する薬剤キャリアとして用いることができる。
The present inventors have found an anti-mortalin antibody having an internalizing function against cancer cells in the course of investigating the relationship between an increase in the expression level of mortalin and carcinogenesis, and this antibody and a drug for cancer treatment using the antibody Patent applications relating to compositions and drug carriers were filed (
本発明者らはまた、該抗モータリン抗体を量子ドットとコンジュゲート化させ、癌化細胞株のイメージングに用い得ることを見出した（非特許文献４）。 The present inventors have also found that the anti-mortalin antibody can be conjugated with quantum dots and used for imaging cancerous cell lines (Non-patent Document 4).
Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体を用いた癌細胞のイメージング、及び該抗体を用いた細胞への核酸送達を報告している（非特許文献５）。Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体の内在化による核酸の送達が、正常細胞では効率的に起こらず、癌細胞特異的に起こったことを報告している。 Shiota et al. Reported imaging of cancer cells using an anti-mortalin antibody and nucleic acid delivery to cells using the antibody (Non-patent Document 5). Shiota et al. Reported that nucleic acid delivery by internalization of anti-mortalin antibodies did not occur efficiently in normal cells but occurred specifically in cancer cells.
一方、再生医療の分野では、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び最近開発されたｉＰＳ細胞などによる移植医療の実用化が期待されている。しかしながら、生体外で培養したこれら未分化細胞の安全性には疑問が残るため、安全性の確認のために、生体内に移植した後の移植細胞の挙動のモニタリングの重要性が高まっている。 On the other hand, in the field of regenerative medicine, practical application of transplantation medicine using mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells (ES cells), and recently developed iPS cells is expected. However, since the safety of these undifferentiated cells cultured in vitro remains questionable, the importance of monitoring the behavior of transplanted cells after transplanted in vivo is increasing for safety confirmation.
この目的で、既存の細胞標識方法を用いることが考えられる。そのような方法としては、例えば、未分化細胞に核酸を導入して、該核酸からのレポーター遺伝子の発現に頼る方法がある。また、クロモス・モレキュラー・システムズ社らの方法（特許文献３）では、核酸自体を標識し、標識核酸を細胞に導入することにより、細胞を標識することが提案されている。しかし、レポーター遺伝子の発現、又は導入核酸の標識に頼る既存の方法では、効率よい安定な細胞の可視化が実現されているとは言えない。 For this purpose, it is possible to use an existing cell labeling method. As such a method, for example, there is a method of introducing a nucleic acid into an undifferentiated cell and relying on expression of a reporter gene from the nucleic acid. In addition, in the method (Patent Document 3) of Cromos Molecular Systems, et al., It is proposed to label a cell by labeling the nucleic acid itself and introducing the labeled nucleic acid into the cell. However, existing methods that rely on expression of a reporter gene or labeling of an introduced nucleic acid cannot achieve efficient and stable cell visualization.
上述したとおり、未分化細胞の効率よい安定な可視化が可能になれば、移植細胞のモニタリングが容易になり、再生医療の発展に寄与することができる。しかしながら、生体内での移植細胞のモニタリングを可能にする程度に、未分化細胞を効率よく安定に標識する方法は、現在のところ報告されていない。 As described above, if efficient and stable visualization of undifferentiated cells becomes possible, monitoring of transplanted cells becomes easy, which can contribute to the development of regenerative medicine. However, a method for efficiently and stably labeling undifferentiated cells to the extent that enables monitoring of transplanted cells in vivo has not been reported at present.
上記課題を解決するために、本発明者らは、未分化細胞を効率よく安定に標識する方法を開発した。具体的には、本発明は、内在化機能を有するモータリン結合性物質を用いて標識物質を細胞内に導入することにより、未分化細胞の安定な標識化を可能にするという知見に基づいて完成された。 In order to solve the above problems, the present inventors have developed a method for efficiently and stably labeling undifferentiated cells. Specifically, the present invention has been completed based on the finding that stable labeling of undifferentiated cells is possible by introducing a labeling substance into cells using a mortalin-binding substance having an internalization function. It was done.
より具体的には、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を用いることを含む、未分化細胞を標識する方法。
〔２〕前記モータリン結合性物質が、モータリンに対する抗体である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記抗体が、全長モータリンを抗原として用いて作製された抗体である、上記〔２〕に記載の方法。
More specifically, the present invention is as follows.
[1] A method for labeling undifferentiated cells, comprising using a labeling complex comprising a mortalin-binding substance having an internalizing function and a labeling substance bound thereto.
[2] The method according to [1] above, wherein the mortalin-binding substance is an antibody against mortalin.
[3] The method according to [2] above, wherein the antibody is an antibody produced using full-length mortalin as an antigen.
〔４〕前記標識物質が蛍光物質である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の方法。
〔５〕前記標識物質が量子ドットである、上記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記標識物質が、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａからなる群より選択される、上記〔４〕に記載の方法。
〔７〕それぞれが異なる標識物質を含む２種以上の標識複合体で標識する、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の方法。
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the labeling substance is a fluorescent substance.
[5] The method according to [4] above, wherein the labeling substance is a quantum dot.
[6] The method according to [4] above, wherein the labeling substance is selected from the group consisting of FITC, rhodamine, Cy3, Cy5 and Alexa.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the labeling is performed with two or more kinds of labeling complexes each containing a different labeling substance.
〔８〕前記未分化細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞、滑膜由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、ｉＰＳ細胞由来間葉系細胞からなる群より選択される間葉系細胞様細胞である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載の方法。
〔９〕前記間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞である、上記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記モータリン結合性物質と前記標識物質とが、アビジン−ビオチン反応を用いて結合している、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１１〕前記標識複合体を前記未分化細胞と接触させることを含む、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の方法。
〔１２〕内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を含む、未分化細胞標識用試薬。
[8] The undifferentiated cells are bone marrow-derived mesenchymal stem cells, synovial-derived mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, mesenchymal cells differentiated from mesenchymal stem cells, iPS cell-derived mesenchymal cells The method according to any one of [1] to [7] above, which is a mesenchymal cell-like cell selected from the group consisting of cells.
[9] The method according to [8] above, wherein the mesenchymal cells differentiated from the mesenchymal stem cells are osteoblasts, chondrocytes or adipocytes.
[10] The method according to any one of [1] to [9], wherein the mortalin-binding substance and the labeling substance are bound using an avidin-biotin reaction.
[11] The method according to any one of [1] to [10] above, which comprises contacting the labeled complex with the undifferentiated cells.
[12] A reagent for labeling undifferentiated cells, comprising a labeling complex comprising a mortalin-binding substance having an internalizing function and a labeling substance bound thereto.
本発明によれば、未分化細胞の効率よい安定な標識化が可能になり、これにより移植細胞のモニタリングを実現することができる。このことは、移植医療の安全性の確認を容易にし、再生医療の発展に大きく寄与する。 According to the present invention, efficient and stable labeling of undifferentiated cells becomes possible, thereby enabling monitoring of transplanted cells. This facilitates confirmation of the safety of transplantation medicine and greatly contributes to the development of regenerative medicine.
本発明は、内在化機能を有するモータリン結合物質を利用して、未分化細胞を標識する方法に関する。本発明によれば、間葉系幹細胞などの未分化細胞の効率よい安定な標識が可能になる。 The present invention relates to a method for labeling undifferentiated cells using a mortalin-binding substance having an internalizing function. The present invention enables efficient and stable labeling of undifferentiated cells such as mesenchymal stem cells.
前述のように、内在化機能を有する抗モータリン抗体を用いた癌細胞の標識化は既に報告されている（Ｋａｕｌら（Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００７，８５（１）：１３３−４０）及びＳｈｉｏｔａら（Ｓｈｉｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００７，１８（１１）：１１５３−６０））。モータリンタンパク質が不死化細胞で特異的に細胞表面に発現しているという、モータリンの特徴的な局在パターンを考えれば、このような技術の適用は癌細胞に限られると考えるのが当然である。事実、Ｓｈｉｏｔａらは、抗モータリン抗体を用いる核酸の導入が、正常細胞では効率的に起こらなかったことを報告している（Ｓｈｉｏｔａら，２００７、上掲）。しかしながら、本発明者らは、癌細胞で内在化する抗モータリン抗体が、間葉系幹細胞などの未分化細胞でも同様に内在化を示すことを見出し、本発明を完成させた。この本発明者らの知見は、上述のモータリンの特異的局在パターンからは予想し得ず、驚くべきものである。再生医療での未分化細胞の多大な応用可能性を考えれば、本発明の技術が医療分野においてなし得る功績は大きいと予想される。 As described above, labeling of cancer cells using an anti-mortalin antibody having an internalizing function has already been reported (Kaul et al. (Kaul et al., Biochem. Cell Biol., 2007, 85 (1): 133). -40) and Shiota et al. (Shiota et al., Hum. Gene Ther., 2007, 18 (11): 1153-60)). Given the characteristic localization pattern of mortalin that mortalin protein is specifically expressed on the cell surface in immortalized cells, it is natural that such a technique is limited to cancer cells. is there. In fact, Shiota et al. Reported that the introduction of nucleic acids using anti-mortalin antibodies did not occur efficiently in normal cells (Shiota et al., 2007, supra). However, the present inventors have found that anti-mortalin antibodies that are internalized in cancer cells also show internalization in undifferentiated cells such as mesenchymal stem cells, and completed the present invention. This finding of the present inventors is surprising and unexpected from the above-mentioned specific localization pattern of mortalin. Considering the great applicability of undifferentiated cells in regenerative medicine, it is expected that the achievement of the technology of the present invention in the medical field is great.
本明細書中、「モータリン結合性物質」とは、モータリン（モータリン２）に特異的に結合する能力を有するいずれかの物質を意味する。そのようなものとしては、限定するものではないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））、モータリン結合タンパク質断片などが挙げられる。 In the present specification, the “mortalin-binding substance” means any substance having the ability to specifically bind to mortalin (mortalin 2). Such as, but not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, antibody fragments (Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and single chain Fv (scFv)), mortalin binding Examples include protein fragments.
好ましいモータリン結合性物質は、モータリンに対する特異的ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体である。特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８などに詳細に記載されている。この場合、抗原としては、全長モータリンタンパク質、又はモータリン部分ペプチドを用いることができる。 Preferred mortalin-binding substances are specific polyclonal and monoclonal antibodies against mortalin. Specific polyclonal and monoclonal antibody production methods are described in detail in, for example, Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, and the like. In this case, a full-length mortalin protein or a mortalin partial peptide can be used as the antigen.
本明細書中、「標識物質」とは、顕微鏡などによりその局在を検出可能ないずれかの物質を意味する。そのようなものとしては、限定するものではないが、蛍光物質（量子ドット及びその他の蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａなど））、金コロイド、発光物質などが挙げられる。好ましい標識物質は量子ドット及びその他の蛍光物質である。 In the present specification, the “labeling substance” means any substance whose localization can be detected by a microscope or the like. Examples of such materials include, but are not limited to, fluorescent materials (quantum dots and other fluorescent materials (FITC, rhodamine, Cy3, Cy5, Alexa, etc.)), colloidal gold, and luminescent materials. Preferred labeling materials are quantum dots and other fluorescent materials.
好ましい標識物質である量子ドットとして、当技術分野で公知の量子ドットであれば任意のものを用いることができる。例えば、半導体シェル（ＺｎＳ）で被覆された半導体素材（ＣｄＳｅ）のナノクリスタルである、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５及びＱｄｏｔ（登録商標）８００（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを利用することが可能である。 As a quantum dot which is a preferable labeling substance, any quantum dot known in the art can be used. For example, Qdot (registered trademark) 525, Qdot (registered trademark) 565, Qdot (registered trademark) 585, Qdot (registered trademark) 605, which are nanocrystals of a semiconductor material (CdSe) coated with a semiconductor shell (ZnS), Qdot (registered trademark) 655, Qdot (registered trademark) 705, Qdot (registered trademark) 800 (all manufactured by Invitrogen) and the like can be used.
本発明においては、上述した標識物質の１つを単独で使用してもよいし、あるいはそれぞれが異なる標識物質を含む２種以上の標識複合体を用いて、細胞を多重標識（マルチカラーラベリング）することも可能である。 In the present invention, one of the above-mentioned labeling substances may be used alone, or cells are multi-labeled (multi-color labeling) using two or more kinds of labeling complexes each containing a different labeling substance. It is also possible to do.
本発明において、モータリン結合性物質と標識物質との結合（コンジュゲート化）は、例えば、ビオチン−アビジン法、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤（ＥＤＣなど）を用いた架橋反応、イオン結合などにより行われ、好ましくはビオチン−アビジン法により行われる。例えば、抗体と量子ドットとの結合は、Ｑｄｏｔ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いて製造業者の取扱説明書に従い行うことができる。このようにして、モータリン結合性物質とそれに結合した標識物質とを含む標識複合体を調製することができる。 In the present invention, the binding (conjugation) between the mortalin-binding substance and the labeling substance is, for example, a biotin-avidin method, a method using an existing chemical linker, a cross-linking reaction using a cross-linking agent (EDC, etc.), an ionic bond Etc., preferably by the biotin-avidin method. For example, the antibody and the quantum dot can be bound according to the manufacturer's instructions using Qdot (registered trademark) Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) or the like. In this way, a labeled complex containing a mortalin-binding substance and a labeling substance bound thereto can be prepared.
本明細書中、物質の「内在化機能」とは、物質が細胞表面に接触した際に、その細胞の細胞膜により取り込まれて、細胞内に侵入する機能を意味する。物質の内在化機能は、該物質を細胞に接触させた後に、細胞膜を透過性にし、該物質を特異的に標識する別の物質で該物質の局在を確認することにより試験することができる。例えば、抗体の内在化機能は、抗体を細胞に接触させた後に、固定剤を用いて細胞を固定し、細胞膜を透過性にし、続いて適切な二次抗体を用いて該抗体を標識して、顕微鏡を用いて抗体複合体を検出することにより試験することができる。又は、被験物質を直接標識して、これを細胞と接触させた後に直接検出してもよい。本発明では、好ましくは、モータリン結合性物質は未分化細胞に対する内在化機能を有し、特に好ましくは間葉系幹細胞に対する内在化機能を有し、最も好ましくは骨髄由来間葉系幹細胞に対する内在化機能を有する。 In the present specification, the “internalization function” of a substance means a function that is taken in by the cell membrane of the cell and enters the cell when the substance contacts the cell surface. The internalization function of a substance can be tested by contacting the substance with cells and then permeabilizing the cell membrane and confirming the localization of the substance with another substance that specifically labels the substance. . For example, the internalization function of an antibody can be achieved by contacting the antibody with the cell, fixing the cell with a fixative, permeabilizing the cell membrane, and then labeling the antibody with an appropriate secondary antibody. It can be tested by detecting the antibody complex using a microscope. Alternatively, the test substance may be directly labeled and detected directly after contacting the cell. In the present invention, the mortalin-binding substance preferably has an internalization function for undifferentiated cells, particularly preferably has an internalization function for mesenchymal stem cells, and most preferably internalization for bone marrow-derived mesenchymal stem cells. It has a function.
量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ；ＱＤ）は、一般的には３次元すべての方向から移動が制限された電子の状態を指す。主に半導体において、結晶成長や微細加工により、電子の持つド・ブロイ波長（数ｎｍ〜２０ｎｍ）の粒子状構造を作り出すと、電子はその領域内に閉じ込められ、電子の状態密度は離散化される。３次元すべての方向から電子を閉じ込めたものが、量子ドットと呼ばれる。 A quantum dot (QD) generally indicates an electron state in which movement is restricted from all three dimensions. Mainly in semiconductors, when a particle structure with de Broglie wavelength (several nm to 20 nm) of electrons is created by crystal growth or microfabrication, electrons are confined in that region, and the density of states of electrons is discretized. The A device in which electrons are confined from all three directions is called a quantum dot.
特に、ＣｄＳｅから作られる量子ドットは、新しい蛍光性材料として期待され、蛍光色素としてバイオ研究に応用されている。バイオ研究などに応用される量子ドットには、水中で使用し易いように、ポリマーコーティングが施される。このようなコーティングされた量子ドットは、二次抗体やストレプトアビジンとコンジュゲート化され、蛍光染色用試薬として使用されている。細胞などの染色に量子ドットを用いる利点は、長時間の励起光照射によっても量子ドットがほとんど退色しないことにある。このことは、特に、１つの細胞について複数の画像スライスを撮影する必要がある共焦点イメージングなどにおいては、非常に有利である。 In particular, quantum dots made from CdSe are expected as new fluorescent materials and are applied to bioresearch as fluorescent dyes. Quantum dots applied to bio research and the like are provided with a polymer coating so that they are easy to use in water. Such coated quantum dots are conjugated with secondary antibodies or streptavidin and used as fluorescent staining reagents. An advantage of using quantum dots for staining cells or the like is that the quantum dots hardly fade even when irradiated with excitation light for a long time. This is very advantageous particularly in confocal imaging where a plurality of image slices need to be taken for one cell.
さらに、粒径によって、様々な励起−発光スペクトルを有する量子ドットを取得可能である。例えば、単一の励起波長（ＵＶ領域）によって異なる波長で発光する量子ドットを作製することが可能であり、そのような量子ドットを組み合わせれば、単一励起波長で複数の発光シグナルを得ることもできる。また、ストークスシフト（励起波長と発光波長の差）が大きい量子ドットも作製されており、これを用いるとバックグラウンドが低く抑えられる。 Furthermore, quantum dots having various excitation-emission spectra can be obtained depending on the particle diameter. For example, it is possible to produce quantum dots that emit light at different wavelengths depending on a single excitation wavelength (UV region), and by combining such quantum dots, multiple emission signals can be obtained at a single excitation wavelength. You can also. In addition, quantum dots having a large Stokes shift (difference between excitation wavelength and emission wavelength) have been produced, and the background can be suppressed to a low level by using this quantum dot.
本明細書中、「未分化細胞」とは、分化能を有する細胞を意味し、具体的には、限定するものではないが、骨髄由来間葉系幹細胞、滑膜由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、ｉＰＳ細胞由来間葉系細胞からなる群より選択される間葉系細胞様細胞である。これらの具体的な細胞の単離は、Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ．Ｂｏｎｅ １９９２，１３：８１−８８；Ｙｏｏ ＪＵ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．１９９８，８０：１７４５−１７５７；Ｏｈｙａｂｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｏｔａｔｉｎｇ ｗａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ （ＲＷＶ） ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６，９５（５）：１００３−８などに記載されている。 In the present specification, the term “undifferentiated cell” means a cell having differentiation ability, and specifically includes, but is not limited to, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, synovial-derived mesenchymal stem cells, fat It is a mesenchymal cell-like cell selected from the group consisting of tissue-derived mesenchymal stem cells, mesenchymal cells differentiated from mesenchymal stem cells, and iPS cell-derived mesenchymal cells. Isolation of these specific cells is described in Haynesworth SE et al. , Characterization of cells with osteogenic potential human marlow. Bone 1992, 13: 81-88; Yoo JU et al. , The chronic potential of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. J. et al. Bone Joint Surg. 1998, 80: 1745-1757; Ohyabu Y et al. , Cartilative tissue formation from bone cell using cells rotating wall vessel (RWV) bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 2006, 95 (5): 1003-8.
本明細書中、「間葉系細胞様細胞」とは、間葉系組織（骨組織、軟骨組織、脂肪組織など）に存在する体性幹細胞、それらの組織に分化し得る体性幹細胞、その特徴から間葉系組織に分化し得る細胞であると考えられる細胞（間葉系幹細胞）、及び間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞を意味する。具体的には、上記で挙げた細胞である。特に好ましい未分化細胞は、各種の組織由来の間葉系幹細胞であり、最も好ましい未分化細胞は骨髄由来間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、間葉系組織を構成する細胞への分化能を有する。すなわち、骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞、腱細胞、脂肪細胞などに分化する能力を有する。そのため、骨、血管、心筋などの再構築をはじめとする再生医療への応用が期待されている。最近では、間葉系幹細胞が、グリア細胞（外胚葉由来）、肝細胞（内胚葉由来）などの中胚葉性でない細胞にまで分化する可能性も示されている。また、間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞としては、限定されるものではないが、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞が挙げられる。 In the present specification, “mesenchymal cell-like cell” means somatic stem cells present in mesenchymal tissues (bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, etc.), somatic stem cells that can differentiate into those tissues, It means a cell (a mesenchymal stem cell) that is considered to be a cell that can differentiate into mesenchymal tissue from the characteristics, and a mesenchymal cell differentiated from a mesenchymal stem cell. Specifically, the cells mentioned above. Particularly preferred undifferentiated cells are mesenchymal stem cells derived from various tissues, and the most preferred undifferentiated cells are bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into cells that constitute mesenchymal tissue. That is, it has the ability to differentiate into bone cells, chondrocytes, cardiomyocytes, tendon cells, fat cells and the like. Therefore, application to regenerative medicine including reconstruction of bones, blood vessels, myocardium, etc. is expected. Recently, mesenchymal stem cells have also been shown to differentiate into non-mesoderm cells such as glial cells (derived from ectoderm) and hepatocytes (derived from endoderm). In addition, examples of mesenchymal cells differentiated from mesenchymal stem cells include, but are not limited to, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, muscle cells, and nerve cells.
本発明においては、未分化細胞と上述の標識複合体とを接触させることによって、標識複合体が未分化細胞内に内在化し、未分化細胞が標識される。そのような接触としては、特に限定されるものではないが、標識複合体を含有する溶液に未分化細胞を浸漬すること、標識複合体を含有する培地中で未分化細胞を培養することが挙げられる。 In the present invention, by bringing an undifferentiated cell into contact with the above-described labeled complex, the labeled complex is internalized in the undifferentiated cell, and the undifferentiated cell is labeled. Such contact is not particularly limited, and includes immersing undifferentiated cells in a solution containing the labeled complex, and culturing undifferentiated cells in a medium containing the labeled complex. It is done.
また、本発明に係る標識複合体による標識を、慣用の細胞標識手法（蛍光、放射線、酵素などを用いる方法）と組み合わせてもよい。例えば、細胞染色に一般的に用いられているヘキスト３３２５８、ＤＩＣなどから選択される１種以上の細胞標識手法と組み合わせることが可能である。 In addition, labeling with the labeling complex according to the present invention may be combined with a conventional cell labeling method (method using fluorescence, radiation, enzyme, etc.). For example, it can be combined with one or more cell labeling techniques selected from Hoechst 33258, DIC, etc., which are generally used for cell staining.
上述のとおり標識された細胞における標識シグナルは、当技術分野で公知の蛍光検出方法及び手段を用いて検出することができる。例えば、蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。使用する励起フィルター及び蛍光フィルター、検出条件などは、使用する標識物質（量子ドットなど）の種類に応じて適宜選択することができる。 The labeled signal in the cells labeled as described above can be detected using fluorescence detection methods and means known in the art. For example, detection and quantification can be performed using a fluorescence microscope, a plate reader, or the like. The excitation filter and fluorescence filter to be used, detection conditions, and the like can be appropriately selected according to the type of labeling substance (quantum dot or the like) to be used.
また本発明は、内在化機能を有するモータリン結合性物質と、それに結合した標識物質とを含む標識複合体を含む、未分化細胞標識用試薬に関する。本発明の標識用試薬において、モータリン結合性物質は抗モータリン抗体であることが好ましい。また、標識物質は、蛍光物質、例えば量子ドット及びその他の蛍光物質、金コロイド、発光物質などであるが、量子ドットであることが好ましい。標識用試薬には、前記標識複合体の他、未分化細胞の標識及び標識の検出を実施するために有用な成分が含まれてもよい。そのような成分としては、例えば、未分化細胞を処理するための試薬、未分化細胞を培養するための培地、他の標識などが挙げられる。本発明の標識用試薬を用いることによって、上述した未分化細胞の標識を容易かつ簡便に行うことができる。 The present invention also relates to a reagent for labeling undifferentiated cells, comprising a labeling complex comprising a mortalin-binding substance having an internalizing function and a labeling substance bound thereto. In the labeling reagent of the present invention, the mortalin-binding substance is preferably an anti-mortalin antibody. The labeling substance is a fluorescent substance, such as a quantum dot and other fluorescent substances, a gold colloid, a luminescent substance, etc., and is preferably a quantum dot. In addition to the label complex, the labeling reagent may contain components useful for labeling undifferentiated cells and detecting the label. Examples of such components include a reagent for treating undifferentiated cells, a medium for culturing undifferentiated cells, other labels, and the like. By using the labeling reagent of the present invention, the above-described labeling of undifferentiated cells can be performed easily and simply.
本発明の好ましい実施形態である、抗モータリン抗体と量子ドットとの組み合わせを用いると、以下の実施例に詳細に述べるとおり、未分化細胞の効率よい安定な標識が可能であった。驚くべきことに、標識化した細胞は、種々の組織型に正常に分化する能力を保持し、生体内に移植すれば、検出可能な標識を維持しながら、生体組織の一部を構成することができた。 When a combination of an anti-mortalin antibody and quantum dots, which is a preferred embodiment of the present invention, was used, efficient and stable labeling of undifferentiated cells was possible as described in detail in the following examples. Surprisingly, labeled cells retain the ability to differentiate normally into various tissue types and, when transplanted in vivo, form part of living tissue while maintaining a detectable label. I was able to.
したがって、本発明の方法を用いて標識化した細胞は、再生医療における移植に用いることができ、さらに、これらは標識化されているために、生体内での移植細胞の挙動を追跡することを可能にする。 Therefore, cells labeled using the method of the present invention can be used for transplantation in regenerative medicine, and furthermore, since they are labeled, it is necessary to follow the behavior of transplanted cells in vivo. to enable.
本明細書中で引用する特許文献及び非特許文献は、参照により本明細書中にその全文が組み入れられる。 Patent documents and non-patent documents cited in this specification are incorporated herein in their entirety by reference.
以下に、本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
材料と実験操作
１．ＱＤをコンジュゲートしたモータリン抗体の作製
ＱＤ−抗モータリン抗体の作製はＫａｕｌら（Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００７，８５（１）：１３３−４０）及びＳｈｉｏｔａら（Ｓｈｉｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００７，１８（１１）：１１５３−６０）に従った。
[Example 1]
Materials and experimental operations
1. Production of mortalin antibodies conjugated with QD Production of QD-antimortalin antibodies was performed by Kaul et al. (Kaul et al., Biochem. Cell Biol., 2007, 85 (1): 133-40) and Shiota et al. (Shiota et al. Hum. Gene Ther., 2007, 18 (11): 1153-60).
簡単に説明すると、モノクローナル抗体作製のために、組換え発現させたヒトモータリンタンパク質全長を抗原としてマウスを免疫した。標準的なプロトコールに従いハイブリドーマを作製した（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい）。抗モータリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、１０％低ＩｇＧ ＦＢＳ及び１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。培養した培地を１２００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。プロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の取扱説明書に従い使用して、抗体を精製した。なお、ここで得られたハイブリドーマ細胞は、Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３７−６として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００９年１０月１３日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１８５４が付与されている。 Briefly, for the production of monoclonal antibodies, mice were immunized with the whole recombinant human mortalin protein as an antigen. Hybridomas were generated according to standard protocols (see, eg, Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Hybridoma cells producing anti-mortalin antibody were cultured in RPMI 1640 medium (Sigma) supplemented with 10% low IgG FBS and 1% antibiotics-antimycotics (Sigma). The cultured medium was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected. The antibody was purified using a protein G column (GE Healthcare Life Science) according to the manufacturer's instructions. The hybridoma cells obtained here were used as Mouse hybridoma 37-6 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, October 6th, 2009). And has been given the receipt number FERM AP-21854.
抗モータリン抗体の内在化機能は、量子ドットとコンジュゲート化した抗モータリン抗体を細胞培養培地に添加し、細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより評価した。これにより、内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体クローンを選択した。 The internalization function of the anti-mortalin antibody was evaluated by adding an anti-mortalin antibody conjugated with quantum dots to the cell culture medium and observing the cells with a fluorescence microscope. Thereby, an anti-mortalin monoclonal antibody clone having an internalization function was selected.
モータリン抗体をコンジュゲートするＱＤにはＱｄｏｔ（登録商標）６５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＺｎＳの殻で被覆されたＣｄＳｅナノクリスタル）を用いた。ＱＤと抗体との結合は、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ２２０２１ＭＰ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従い行った。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体（ｉＱＤ）を作製した。 Qdot (registered trademark) 655 (Invitrogen; CdSe nanocrystals coated with a ZnS shell) was used as the QD for conjugating the mortalin antibody. The QD was bound to the antibody using Qdot (registered trademark) 655 Antibody Conjugation Kit (Invitrogen, Q22021MP) according to the manufacturer's instructions. Thereby, a QD-antimortalin antibody complex (iQD) was produced.
２．ＱＤを用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の安定的なｉｎ ｖｉｔｒｏラベリング
２．１ 間葉系幹細胞の作製及びラベリング
各動物種由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、７週齢のＦｉｓｈｅｒ３４４雌ラット、１０日齢の雌日本白色家兎、胎齢１００日の雌カニクイザル、およびヒトの長管骨より骨髄を採取し、各々に適した培養液にて増殖させることにより作製した。ウサギＭＳＣには１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ、その他ＭＳＣには１０％ＦＢＳを含むＡｌｐｈａＭＥＭを用いた。具体的には、適切な針を用いて陰圧又はフラッシュアウトにより各々の動物から骨髄を採取し、培地に懸濁し、細胞培養用プラスチックディッシュ（必要な場合には、細胞接着のためにタンパク質でのコーティングを施してある）上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて３〜４日間インキュベートした。接着した細胞を単離して、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とした。このように作製した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などに分化することが可能であることが示されている（Ｂｉａｎｃｏ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９８８，６８：４０１−４１１；Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４：１４３−１４７）。
2. Stable in vitro labeling of mesenchymal stem cells (MSC) using QD
2.1 Preparation and Labeling of Mesenchymal Stem Cells Mesenchymal stem cells (MSC) derived from each animal species are 7-week-old Fisher 344 female rats, 10-day-old female Japanese white rabbits, 100-day-old female cynomolgus monkeys, In addition, bone marrow was collected from human long bones and grown in a culture medium suitable for each. DMEM containing 15% FBS was used for the rabbit MSC, and AlphaMEM containing 10% FBS was used for the other MSC. Specifically, bone marrow is collected from each animal by negative pressure or flashout using an appropriate needle, suspended in media, and plastic dishes for cell culture (if necessary with protein for cell adhesion). And incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 3-4 days. Adhered cells were isolated and used as mesenchymal stem cells (MSC). It has been shown that the mesenchymal stem cells (MSCs) thus prepared can be differentiated into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, etc. (Bianco P et al., Alkaline phosphatase positive precursors of adipocytes in the human bone marlow.Br.J.Haematol., 1988, 68: 401-411; Pittinger M et al., Multilineage offensive humans.
初代培養においてＭＳＣが８０％コンフルエントに達したら、培養液中にＱＤ−抗モータリン抗体（〜０．２−０．４ｍｇ／ｍｌ）を加えて２４時間培養することにより、ＭＳＣにＱＤラベルを施した。 When MSC reached 80% confluence in the primary culture, QD-antimortalin antibody (˜0.2-0.4 mg / ml) was added to the culture and cultured for 24 hours to give the MSC a QD label. .
２．２ 細胞分化
その後、骨分化誘導培養液：１０％ＦＢＳと骨分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、骨分化誘導サプリメント［１０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０ｍｇ／ｍｌ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、及び１０−８Ｍ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ］、軟骨分化誘導培養液：軟骨分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、軟骨分化誘導サプリメント［５０ｍｇ／ｍｌ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、４０ｍｇ／ｍｌ Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、ＩＴＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１０−７Ｍ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β］、及び脂肪分化誘導培養液：１０％ＦＢＳと脂肪分化誘導サプリメントを含むＤＭＥＭ、脂肪分化誘導サプリメント［０．５ｍＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、１０−５Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０−６Ｍ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及び２×１０２Ｍ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ］の３種類の分化誘導培養液中での、二次元培養、あるいはペレット培養による三次元培養により、骨芽細胞、脂肪細胞、又は軟骨細胞への分化誘導を行った。二次元培養又は三次元培養による細胞の分化は、例えば、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４：１４３−７；Ｍａｃｋａｙ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｒｏｗ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １９９８，４：４１５−２８などに詳細に記載されている。
2.2 Cell differentiation, then bone differentiation-inducing culture medium: DMEM containing 10% FBS and bone differentiation-inducing supplement, bone differentiation-inducing supplement [10 mM β-glycophosphate, 50 mg / ml ascorbate 2-phosphate, and 10 −8 M dexamethasone] , Cartilage differentiation-inducing culture medium: DMEM containing cartilage differentiation-inducing supplement, cartilage differentiation-inducing supplement [50 mg / ml ascorbate 2-phosphate, 40 mg / ml L-proline, ITS culture supplement, 10 −7 M dexamethone, and 10 ng / ml TGF -Β], and fat differentiation-inducing culture medium: DMEM containing 10% FBS and fat differentiation-inducing supplement, fat differentiation-inducing supplement [0 5mM Isobutyl-methylxanthine (IBMX), 10 -5 M Insulin, 10 -6 M Dexamethasone, and 2 × 10 2 M Indomethacin] in three differentiation inducing culture medium of the three-dimensional by two-dimensional culture, or pellet culture Differentiation into osteoblasts, adipocytes, or chondrocytes was induced by culturing. Differentiation of cells by two-dimensional culture or three-dimensional culture is described in, for example, Pittenger MF et al. , Multilineage potential of adult human cells cells. Science 1999, 284: 143-7; Mackay AM et al. , Chondrogenic differentiation of cultivated human mesenchymal stem cells from marlow. Tissue Eng. 1998, 4: 415-28 and the like.
３．ＱＤを用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の安定的なｉｎ ｖｉｖｏラベリング
生体内でのＱＤラベルされたＭＳＣの分化への影響を確認するために、骨移植モデル及び軟骨移植モデルを利用した。骨移植モデルには、７週齢のＦｉｓｈｅｒ３４４雌ラットを用いた。大腿骨の末端部に立方状欠損２×２×２ｍｍ３を作製し、あらかじめ骨分化を誘導したＱＤ標識ＭＳＣを播種したβ−ＴＣＰをその欠損に移植して、３週間飼育した。また、軟骨移植モデルには１０日齢の雌日本白色家兎を用いた。大腿骨の膝蓋骨に円筒状欠損φ５×４ｍｍを作製した。あらかじめ軟骨分化を誘導したＱＤラベルＭＳＣを、ＲＷＶバイオリアクターで三次元培養により凝集させて２週間培養した。培養組織を欠損部に移植して、４〜８週間飼育した。
3. Stable in vivo labeling of mesenchymal stem cells (MSC) using QD In order to confirm the influence on the differentiation of QD-labeled MSC in vivo , a bone transplant model and a cartilage transplant model were used. Seven-week-old Fisher 344 female rats were used for the bone graft model. A
４．各種分化誘導後の細胞・組織評価
４．１ 組織学的評価（定性評価）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ二次元培養細胞は、１０％中性ホルマリン緩衝液にて３０分４℃で固定し、蒸留水で洗浄した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ三次元培養細胞は、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて一晩４℃で固定してパラフィンで包埋したのち、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＲＭ２２５５）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ｉｎ ｖｉｖｏ骨移植組織は、４％ＣＭＣを用いて凍結ブロックを作製したのち、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ｉｎ ｖｉｖｏ軟骨移植組織は、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて１週間、４℃で固定して、ＥＤＴＡにて１ヵ月間４℃で脱灰し、パラフィンで包埋したのち、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＲＭ２２５５）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。骨芽細胞には、二次元培養細胞の場合にはアリザリンレッド染色、移植組織の場合にはヘマトキシリン−エオジン染色、脂肪細胞にはオイルレッドＯ染色、そして軟骨細胞にはサフラニンＯ染色を行った。
4). Cell / tissue evaluation after various differentiation induction
4.1 Histological evaluation (qualitative evaluation)
In vitro two-dimensional cultured cells were fixed with 10% neutral formalin buffer for 30 minutes at 4 ° C., and washed with distilled water. In vitro three-dimensional cultured cells were fixed in 4% paraformaldehyde-phosphate buffer overnight at 4 ° C., embedded in paraffin, and then 5 μm thick sections were prepared using a microtome (Leica, RM2255). did. The in vivo bone graft tissue was prepared as a frozen block using 4% CMC, and then a 5 μm-thick section was prepared using a frozen microtome (Leica, CM3050S). The in vivo cartilage transplanted tissue was fixed with 4% paraformaldehyde-phosphate buffer for 1 week at 4 ° C, decalcified with EDTA for 1 month at 4 ° C, embedded in paraffin, and then microtome ( Leica, RM2255) was used to produce 5 μm thick sections. Osteoblasts were stained with alizarin red for two-dimensional cultured cells, hematoxylin-eosin for transplanted tissues, oil red O for fat cells, and safranin O for chondrocytes.
４．２ 定量評価
軟骨細胞・組織に関しては、ＢｌｙｃｃａｎＴＭ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｂ１０００）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って硫酸化グリコサミノグリカンを測定した。測定サンプルとしては、細胞をサンプリングして直ちに凍結乾燥を行ったのち、０．５ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで６０℃、１６時間抽出した溶液を使用した。脂肪細胞に関しては、オイルレッドＯ染色して十分乾燥したのち、イソプロパノールを加えて色素を溶出した。その溶出液をマイクロプレートリーダー、５４０ｎｍにて測定した。
4.2 Quantitative Evaluation Regarding chondrocytes / tissues, sulfated glycosaminoglycans were measured according to the manufacturer's instructions using a Blycan ™ Sulfated Glycosaminoglycan Assay (Biocolor, B1000). As a measurement sample, cells were sampled and immediately lyophilized, and then a solution extracted with 0.5 mg / ml Proteinase K at 60 ° C. for 16 hours was used. Regarding the adipocytes, after oil red O staining and drying sufficiently, isopropanol was added to elute the dye. The eluate was measured with a microplate reader at 540 nm.
４．３ 蛍光イメージング
カバーバラスに播種されたＱＤラベルした各種細胞は、メタノール：アセトン（１：１，ｖ／ｖ）固定液にて氷上で５分間固定した。ＱＤフィルターセットＸＦ ３０５−１（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ４２５ＤＦ４５，ｄｉｃｈｒｏｉｃ ４７５ＤＣＬＰ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ６５５ＤＦ２０）（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を装備した蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００ Ｍ）で観察を行い、解析ソフトＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．４（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して解析を行った。
4.3 Various QD-labeled cells seeded on the fluorescent imaging cover ballast were fixed on ice with a methanol: acetone (1: 1, v / v) fixative solution for 5 minutes. QD filter set XF 305-1 (excitation filter 425DF45, dichromic 475DCLP, emission filter 655DF20) (Omega Optical, Inc.) was observed with a fluorescence microscope (Carl Zeiss, Axiovert 200 M). Analysis was performed using 4 (Carl Zeiss).
結果
上記のとおり、ＭＳＣを単離してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて十分増殖させたのち、ＱＤをラット、ウサギ、サル、およびヒトの各々のＭＳＣに導入すると、使用したＱＤの励起−発光波長に適したフィルターを用いた蛍光顕微鏡観察において、蛍光像が観察された（図１〜４）。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて、各種間葉系幹細胞にＱＤが導入されたことが示された。Ｚ軸スタックイメージを観察すると、ＱＤは細胞内部にほぼ均等に導入されていた（図５）。したがって、抗モータリン抗体を用いて、ラットからヒトまで種の壁を越えてＱＤをＭＳＣに効率よく導入することができた。次に、ＱＤラベルされたＭＳＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化誘導培養した後にも、ＱＤの存在が確認された（図６〜１０）。
Results As described above, after MSCs were isolated and sufficiently grown in vitro, when QD was introduced into each rat, rabbit, monkey, and human MSC, a filter suitable for the excitation-emission wavelength of the QD used was obtained. In the fluorescence microscope observation used, the fluorescence image was observed (FIGS. 1-4). Thereby, it was shown that QD was introduced into various mesenchymal stem cells using the QD-antimortalin antibody complex. When the Z-axis stack image was observed, QD was almost uniformly introduced into the cells (FIG. 5). Therefore, using anti-mortalin antibody, QD could be efficiently introduced into MSCs across species walls from rats to humans. Next, the presence of QD was confirmed even after QD-labeled MSCs were induced to differentiate into osteoblasts, chondrocytes or adipocytes in vitro (FIGS. 6 to 10).
また、分化誘導したのち、ＱＤラベルされたＭＳＣとラベルしていないＭＳＣを比較して、増殖及び分化に違いが生じているか検討した。この結果を図１１に示す。図１１に示されるように、＊３週間（３Ｗｋ）培養後の分化（骨形成）した細胞でのＱＤ−モータリン抗体複合体（ｉＱｄｏｔ）全体は、２週間（２Ｗｋ）のものと比較するとやや少なかった。しかし、個々の細胞中のｉＱｄｏｔの蛍光は同じであった。この結果から、同様の細胞播種密度で分化誘導培養したが、標識・非標識で細胞の増殖に著しい違いは見られなかった。しかし、骨分化誘導３週間後の細胞でのＱＤの存在量が、２週間の細胞と比較すると減少していたために、蛍光強度の低下がみられた（図１１）。 In addition, after differentiation induction, MSCs labeled with QD were compared with unlabeled MSCs to examine whether there was a difference in proliferation and differentiation. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 11, * The total number of QD-mortalin antibody complexes (iQdot) in differentiated (osteogenic) cells after 3 weeks (3 Wk) of culture is slightly less than that of 2 weeks (2 Wk). It was. However, iQdot fluorescence in individual cells was the same. From this result, differentiation induction culture was performed at the same cell seeding density, but no significant difference was observed in cell proliferation between labeled and unlabeled. However, since the abundance of QD in cells after 3 weeks of induction of bone differentiation was decreased compared to cells in 2 weeks, a decrease in fluorescence intensity was observed (FIG. 11).
分化への影響は、骨分化においてはバイオミネラリゼーションを確認するためのアリザリンレッド染色（図１２）、軟骨分化においては軟骨基質を染色するサフラニンＯ染色（図１３）、および脂肪分化においては油滴を染色するオイルレッド染色（図１４）により確認した。ＱＤ標識による分化への著しい影響は見られなかった。このことは、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて標識した未分化細胞を分化させることにより、移植材料を作製することが可能であることを示す。 The effects on differentiation are as follows: Alizarin red staining to confirm biomineralization in bone differentiation (FIG. 12), safranin O staining to stain cartilage matrix in cartilage differentiation (FIG. 13), and oil in fat differentiation This was confirmed by oil red staining (FIG. 14) for staining the droplets. There was no significant effect on differentiation by QD labeling. This indicates that it is possible to produce a transplant material by differentiating undifferentiated cells labeled with the QD-antimortalin antibody complex.
軟骨分化では、標識・非標識いずれの試料においても、培養時間の経過により硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生量が同様に増加していた（図１５）。脂肪分化においても、染色観察と同様、標識・非標識の違いに有意差は見られなかった（図１６）。 In cartilage differentiation, the amount of sulfated glycosaminoglycan (GAG) produced increased in the same manner in both labeled and unlabeled samples over the course of the culture time (FIG. 15). In fat differentiation, as in the staining observation, no significant difference was observed in the difference between labeled and unlabeled (FIG. 16).
さらに、ＱＤラベルされたＭＳＣを分化誘導して作製した移植材料（骨・軟骨様組織）を移植したのち、ｉｎ ｖｉｖｏにおける移植組織内でのＱＤの挙動を確認した。この結果を図１７に示す。図１７は、（Ａ）培養骨移植ラットモデル、（Ｂ）培養軟骨凝集物移植ウサギモデルの結果を示している。いずれの場合にも、組織化学的結果により示されるように正常な骨構造が形成され（Ａ−ａ、Ｂ−ｇ及びＢ−ｊ）、また分化後にも実質的なＱＤ蛍光シグナルが残っていた（Ａ−ｂ、Ａ−ｃ、Ｂ−ｄ、Ｂ−ｈ及びＢ−ｋ）。β−リン酸トリカルシウム（β−ＴＣＰ）ブロック中のラット骨芽細胞（Ａ−ｂ）、及びβ−ＴＣＰブロックに支持された骨芽細胞の移植から形成された骨（Ａ−ｃ）の顕微鏡像、並びに移植軟骨から形成されたウサギ軟骨内組織（２６日：Ｂ−ｇ、Ｂ−ｈ及びＢ−ｉ；８週：Ｂ−ｊ、Ｂ−ｋ及びＢ−ｌ）の低倍率及び高倍率像を示す。移植の２６日後及び８週間後で、サフラニン−Ｏ染色（Ｂ−ｇ及びＢ−ｊ）により確認された再生骨組織において、強いＱＤ蛍光シグナルが観察された（Ｂ−ｄ、Ｂ−ｈ、Ｂ−ｉ、Ｂ−ｋ及びＢ−ｌ）。このように、８週間にわたる長期においても移植組織内にＱＤの存在が確認された（図１７）。このことは、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いて標識した細胞から作製した移植材料を用いると、移植後の長期間にわたって、生体内での移植物の追跡が可能であることを示している。 Furthermore, after transplanting a transplant material (bone / cartilage-like tissue) prepared by inducing differentiation of MSC labeled with QD, the behavior of QD in the transplanted tissue in vivo was confirmed. The result is shown in FIG. FIG. 17 shows the results of (A) a cultured bone transplanted rat model and (B) a cultured cartilage aggregate transplanted rabbit model. In either case, normal bone structure was formed as shown by histochemical results (Aa, Bg, and Bj) and a substantial QD fluorescence signal remained after differentiation. (Ab, Ac, Bd, Bh and Bk). Microscope of rat osteoblasts (A-b) in β-tricalcium phosphate (β-TCP) block and bone formed from transplantation of osteoblasts supported by β-TCP block (A-c) Low magnification and high magnification of images and rabbit endochondral tissue formed from transplanted cartilage (26 days: Bg, Bh and Bi; 8 weeks: Bj, Bk and B-1) Show the image. Strong QD fluorescence signals were observed (Bd, Bh, B) in regenerated bone tissue confirmed by safranin-O staining (Bg and Bj) at 26 days and 8 weeks after transplantation. -I, Bk and B-1). Thus, the presence of QD was confirmed in the transplanted tissue even for a long period of 8 weeks (FIG. 17). This indicates that when a transplant material prepared from cells labeled with a QD-antimortalin antibody complex is used, the transplant can be traced in vivo over a long period of time after transplantation. .
また、ＭＳＣを単離してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて十分増殖させて骨芽細胞又は軟骨細胞に分化誘導培養した細胞にＱＤラベリングを試みたところ、いずれの細胞にもＱＤの細胞内導入を確認することができた（図１８〜１９）。脂肪細胞に分化誘導した細胞についても同様の結果が得られた（データは示していない）。これにより、ＱＤ−抗モータリン抗体複合体を用いるＱＤラベリングは、分化誘導後の細胞に対してさえ有効であることが示された。 Moreover, when QD labeling was attempted on cells that had been isolated and cultured in vitro after being isolated and cultured in vitro after sufficient isolation of MSC, the intracellular introduction of QD could be confirmed in any cell. (FIGS. 18-19). Similar results were obtained for cells induced to differentiate into adipocytes (data not shown). This indicated that QD labeling using a QD-antimortalin antibody complex is effective even for cells after differentiation induction.
［実施例２］
実施例１と同様にして、ＱＤをコンジュゲートしたモータリン抗体（ＱＤ−モータリン抗体複合体）を作製し、骨芽細胞様樹立細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社 ＥＣ９９０７２８１０）を標識した。簡単に説明すると、ＱＤ−モータリン抗体複合体を含有する培地（ＭＥＭＡｌｐｈａ・ＧＩＢＣＯ・１２５７１−０７１／１５％ＦＢＳ・ＳＩＧＭＡ・Ｆ２４４２）において、３７℃にて１〜２４時間にわたり骨芽細胞を培養した。続いて、培養後１、６、１２及び２４時間において、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）（ベクトン・ディッキンソン株式会社・ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター）を用いて励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大６９５ｎｍにて蛍光を検出し、ＱＤの細胞導入効率を検討した。
[Example 2]
In the same manner as in Example 1, a mortalin antibody (QD-mortalin antibody complex) conjugated with QD was prepared, and an osteoblast-like cell line MC3T3-E1 cell (DS Pharma Biomedical Co., Ltd. EC99072810) was obtained. Labeled. Briefly, osteoblasts were cultured at 37 ° C. for 1 to 24 hours in a medium containing a QD-mortalin antibody complex (MEMAlpha · GIBCO · 12571-071 / 15% FBS · SIGMA · F2442). Subsequently, at 1, 6, 12 and 24 hours after culturing, fluorescence was detected at a maximum excitation wavelength of 482 nm and a maximum fluorescence wavelength of 695 nm using a flow cytometer (FACS) (Becton Dickinson Co., Ltd., BDCASAria cell sorter) The cell transfer efficiency of QD was examined.
この結果を図２０Ａ及びＢに示す。この結果から、２４時間後には９６％の細胞にＱＤが導入されていることがわかった。 The results are shown in FIGS. 20A and 20B. From this result, it was found that QD was introduced into 96% of the cells after 24 hours.
［実施例３］
実施例２と同様にして、ＱＤ−モータリン抗体複合体を用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を標識した。また同時に、細胞内核染色物質を用いて細胞を染色した。簡単に説明すると、細胞を１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬株式会社 ０６２−０１６６１）により４℃、２時間固定して、ＰＢＳで洗浄したのち、細胞に十分浸る適当な容量のＰＢＳを加えて、さらにヘキスト３３２５８（和光純薬株式会社 ３４３−０７９６１）及びＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ． Ｈ−１２００）を加えて、室温で１５分間染色した。染色後は蒸留水で洗浄して封入した。
[Example 3]
In the same manner as in Example 2, MC3T3-E1 cells were labeled using the QD-mortalin antibody complex. At the same time, the cells were stained with an intracellular nuclear staining substance. Briefly, the cells were fixed with 10% neutral buffered formalin (06-2661, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 4 ° C. for 2 hours, washed with PBS, and then an appropriate volume of PBS that was sufficiently immersed in the cells was added. Further, Hoechst 33258 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 343-07961) and DAPI (VECTOR LABORATORIES, INC. H-1200) were added and stained at room temperature for 15 minutes. After dyeing, it was washed with distilled water and sealed.
この結果を図２１に示す。この結果から、ＱＤ−モータリン抗体複合体を他の染色物質と組み合わせて用いることにより、細胞を多重染色することができることが示された。また、ＱＤは細胞質内に比較的均質に存在していることがわかった。 The result is shown in FIG. From this result, it was shown that cells can be multiple-stained by using the QD-mortalin antibody complex in combination with another staining substance. It was also found that QD was present relatively homogeneously in the cytoplasm.
［実施例４］
実施例１と同様にして、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ２２０２１ＭＰ）を使用して、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５−モータリン抗体複合体を作製した。また、同じ手法を用いて、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ１０１６１ＭＰ）を使用して、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５−モータリン抗体複合体を作製した。
[Example 4]
A Qdot® 655-mortalin antibody complex was prepared in the same manner as in Example 1 using the
これらのそれぞれ異なる種類の量子ドットを含む複合体を用いて、実施例２と同様の手順でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を標識した。その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）（ベクトン・ディッキンソン株式会社・ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター）を用いて、Ｑｄｏｔ(登録商標）６５５については励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大６９５ｎｍにて蛍光を検出し、またＱｄｏｔ(登録商標）７０５については励起波長最大４８２ｎｍ及び蛍光波長最大８４５ｎｍにて蛍光を検出した。 MC3T3-E1 cells were labeled in the same procedure as in Example 2 using a complex containing these different types of quantum dots. Thereafter, using a flow cytometer (FACS) (Becton Dickinson Co., Ltd., BDCASAria cell sorter), the fluorescence of Qdot (registered trademark) 655 is detected at an excitation wavelength of 482 nm and a fluorescence wavelength of 695 nm, and Qdot (registered) Regarding the trademark 705, fluorescence was detected at an excitation wavelength of 482 nm and a fluorescence wavelength of 845 nm.
この結果を図２２に示す。図２２に示されるように、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５及びＱｄｏｔ（登録商標）７０５は細胞質内に別個に観察することができる。これにより、複数種の標識物質を利用することでマルチカラーラベリングが可能であることが実証された。
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 22,
［実施例５］
本実施例においては、ＱＤ−モータリン抗体複合体で標識したウサギ間葉系幹細胞からの３次元軟骨の作製と、ウサギ膝関節全層欠損モデルへの移植実験を行った。
[Example 5]
In this example, production of a three-dimensional cartilage from a rabbit mesenchymal stem cell labeled with a QD-mortalin antibody complex and a transplantation experiment into a rabbit knee joint full-thickness model were performed.
１２日齢の日本白色家兎（雌）の長管骨から、慣用法を用いて骨髄細胞を採取した。単層培養時に、実施例１で作製した抗モータリン抗体−Ｑｄｏｔ複合体を含む培養液にて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、Ｑｄｏｔを細胞内導入した。軟骨分化誘導下に３次元培養を１週間行い、軟骨様組織を構築した。その組織を、１０週齢の雌ウサギの直径５ｍｍ、深さ４ｍｍで全層欠損させた大腿膝関節部に同種移植した。移植後４週及び８週で評価を行った。 Bone marrow cells were collected from the long bones of 12-day-old Japanese white rabbits (female) using conventional methods. During monolayer culture, mesenchymal stem cells (MSC) were cultured in a culture solution containing the anti-mortalin antibody-Qdot complex prepared in Example 1, and Qdot was introduced into the cells. Three-dimensional culture was carried out for 1 week under the induction of cartilage differentiation to construct a cartilage-like tissue. The tissue was allografted into a 10-week-old female rabbit with a total thickness of 5 mm in diameter and 4 mm in depth, and a femoral knee joint. Evaluation was performed at 4 weeks and 8 weeks after transplantation.
図２３に、単層培養時（Ａ）、３次元培養直前（Ｂ）、及び軟骨分化誘導後（Ｃ）の関節組織の写真を示す。これらの組織内のいずれにおいてもＱｄｏｔは細胞内で安定して観察された。また、図２４に、移植前及び移植後４週における関節部分の写真を示す。移植後４週においては、関節欠損部は白色の組織で覆われていた。 FIG. 23 shows photographs of joint tissues during monolayer culture (A), immediately before three-dimensional culture (B), and after induction of cartilage differentiation (C). In all of these tissues, Qdot was stably observed in the cells. FIG. 24 shows photographs of joints before transplantation and 4 weeks after transplantation. At 4 weeks after transplantation, the joint defect was covered with white tissue.
移植後４週及び８週において、関節組織部から組織を取り出し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液にて一晩４℃で固定して４％ＣＭＣを用いて凍結ブロックを作製したのち、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて５μｍ厚さの切片を作製した。ＰＢＳでＣＭＣを除去したのち、サフラニンＯ染色、コラーゲンＩ、ＩＩ染色を行った。サフラニンＯ染色は、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン染色セット（和光純薬株式会社・２９８−２１７４１）により１０分間、核を染色し、流水で１０分間洗浄し、０．５％塩酸アルコールに浸漬したのち、０．００１％ファストグリーン（ＭＥＲＣＫ・Ｃ．Ｉ． ４２０５３）で室温、５分染色した。そののち、１％酢酸水溶液で１０〜１５秒洗浄して、０．１％サフラニンＯ（Ｃｈｒｏｍａ・１Ｂ４６３）水溶液で室温、５分染色して、蒸留水で洗浄した。コラーゲンＴｙｐｅＩおよびコラーゲンＴｙｐｅＩＩの免疫染色は０．１％プロテアーゼ（シグマ・Ｐ５３８０）含有ＰＢＳ溶液を室温で５分間反応させ、蒸留水で洗浄し、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（ＤＡＫＯ・Ｓ３０２０）を５分間反応させ、蒸留水で洗浄してＴＢＳＴに５分間浸漬させた。そののち、１０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｒｏｃｈｅ・１０９６ １７６）を４℃、１時間反応させて、一次抗体コラーゲンＴｙｐｅＩ（第一ファインケミカル株式会社・Ｆ５６）、コラーゲンＴｙｐｅＩＩ（第一ファインケミカル株式会社・Ｆ５７）、それぞれを４℃で一晩反応させたのち、ＴＢＳＴで洗浄して、二次抗体である抗マウスＩｇＧ（西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ・ＮＡ９３１Ｖ）に１時間、浸漬して蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン（ＤＡＣＯ・Ｓ２０２０）で１分間、室温で染色した。 At 4 and 8 weeks after transplantation, the tissue was removed from the joint tissue part, fixed in 4% paraformaldehyde-phosphate buffer overnight at 4 ° C., and frozen blocks were prepared using 4% CMC, followed by freezing. Sections having a thickness of 5 μm were prepared using a microtome (Leica, CM3050S). After removing CMC with PBS, safranin O staining and collagen I and II staining were performed. Safranin O staining was performed by staining the nucleus for 10 minutes with a Weigert's iron hematoxylin staining set (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 298-214171), washing with running water for 10 minutes, and immersing in 0.5% alcoholic hydrochloric acid. It was stained with 001% fast green (MERCK C.I. 42053) at room temperature for 5 minutes. After that, it was washed with a 1% aqueous acetic acid solution for 10 to 15 seconds, dyed with a 0.1% aqueous solution of safranin O (Chroma · 1B463) at room temperature for 5 minutes, and washed with distilled water. Collagen Type I and Collagen Type II immunostaining was performed by reacting PBS solution containing 0.1% protease (Sigma P5380) at room temperature for 5 minutes, washing with distilled water, and reacting with peroxidase blocking reagent (DAKO S3020) for 5 minutes. It was washed with distilled water and immersed in TBST for 5 minutes. Thereafter, 10% Blocking reagents (Roche · 1096 176) were reacted at 4 ° C. for 1 hour to produce primary antibody collagen Type I (Daiichi Fine Chemical Co., Ltd./F56), collagen type II (Daiichi Fine Chemical Co., Ltd./F57), respectively. Was allowed to react overnight at 4 ° C., washed with TBST, immersed in secondary antibody anti-mouse IgG (horseradish peroxidase-conjugated total antibody) (GE Healthcare NA931V) for 1 hour and washed with distilled water. Stained with hematoxylin (DACO S2020) for 1 minute at room temperature.
この組織学的評価の結果を図２５（移植後４週）及び図２６（移植後８週）に示す。移植後４週では、サフラニンＯ染色では関節表面が赤く染色され、細胞密度は高い組織であることが確認できた。また免疫染色において軟骨部ではＩＩ型コラーゲンにより染色された。また、軟骨下骨部ではＩ型コラーゲンにより染色され、リモデリングも良好であることが確認できた。一方、移植後８週においては、サフラニンＯ染色により軟骨部では軟骨基質が確認され、細胞は軟骨組織に特異的な柱状配列であることが確認できた。免疫染色ではＩＩ型コラーゲンは陽性、Ｉ型コラーゲンは陰性で硝子様軟骨組織での修復が確認できた。 The results of this histological evaluation are shown in FIG. 25 (4 weeks after transplantation) and FIG. 26 (8 weeks after transplantation). At 4 weeks after transplantation, the surface of the joint was stained red with safranin O staining, confirming that the tissue had a high cell density. In the immunostaining, the cartilage was stained with type II collagen. Further, the subchondral bone was stained with type I collagen, and it was confirmed that remodeling was also good. On the other hand, at 8 weeks after transplantation, the cartilage matrix was confirmed in the cartilage portion by safranin O staining, and the cells were confirmed to be columnar arrays specific to the cartilage tissue. By immunostaining, type II collagen was positive, type I collagen was negative, and repair in hyaline-like cartilage tissue was confirmed.
また移植後４週及び８週において、関節組織を蛍光顕微鏡で観察した。その蛍光−位相差観察像を、図２７（移植後４週）及び図２８（移植後８週）に示す。移植後４週では、修復組織の骨髄側を中心にＱｄｏｔが観察された。また移植後８週では、移植部全体にＱｄｏｔが観察された。特に軟骨下骨部ではクラスター形成を伴う蛍光が観察された。 The joint tissues were observed with a fluorescence microscope at 4 weeks and 8 weeks after transplantation. The fluorescence-phase difference observation images are shown in FIG. 27 (4 weeks after transplantation) and FIG. 28 (8 weeks after transplantation). At 4 weeks after transplantation, Qdot was observed mainly on the bone marrow side of the repaired tissue. In addition, at 8 weeks after transplantation, Qdot was observed throughout the transplant site. In particular, fluorescence accompanied with cluster formation was observed in the subchondral bone.
本発明により標識された未分化細胞は、分化誘導したのちに移植治療に用いることが可能であるので、本発明は、再生医療において有用性を有する。 Since the undifferentiated cells labeled according to the present invention can be used for transplantation treatment after induction of differentiation, the present invention has utility in regenerative medicine.
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１８５４（Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３７−６、２００９年１０月１３日付寄託） Receipt Number FERM AP-21854 (Mouse hybridoma 37-6, deposited on Oct. 13, 2009)
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