JP5480139B2

JP5480139B2 - 食欲制御用化合物

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Publication number: JP5480139B2
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Inventors: ヨハネス・グロース; ヘレン・へフロン; ケイト・デイ
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Description

本発明は、食欲の制御に有用であり、したがって食欲の変化を特徴とする疾患の治療に有用な医薬に関し、この医薬は、ある種の大腸障害の治療にも有用である。

健康な体重の維持は、医学的にも美容上でも有益であり、体重の増減に専念している大きな産業が存在する。摂食障害は、増えつつある流行病と認識され、過剰および不十分な食物摂取は、共に頻度が増加している。一般的な摂食障害は、過食(肥満を起こす)、拒食症および過食症である。悪液質、即ち意図せざる体重減少も、ある種の疾患において大きな問題である。

米国の成人人口の2/3近くが、それぞれ25または30を超える肥満度指数(BMI、即ちキログラム単位の体重割るm単位の身長の2乗)に基づいて、体重超過または肥満である。肥満サブグループは、1964年の13.3%から2004年にその値の2倍超である32.9%に増加した(Ogdenら、Gastroenterology 132巻、2087〜102頁(2007年)およびBray, G. A. & Bellanger, T.、Endocrine 29巻、109〜17頁(2006年))。

拒食症は、低体重と、体重増加に対する過度の不安を示す身体イメージの歪みとを特徴とする。その有病率は、西欧人口の0.3%〜1.3%であり、この発症率は上昇しつつあると思われる(Bulikら、Int J Eat Disord 2005年、37巻、S2〜S9)。

過食症(神経性大食症の名でも知られている)は、嘔吐などの意図的な排出を伴う大食いを特徴とする。その有病率は、西欧成人人口の約1%であるが、若い女性の有病率は、それより有意に高い(Bushnellら、Psychol Med. 1990年8月、20巻(3号)、671〜680頁)。

悪液質は、体重を積極的に減らそうとしていない対象における筋萎縮、体重減少および食欲低下を伴う。悪液質は、後期癌およびAIDSの患者にしばしば見られる。

体重の増加、減少または維持に関わる正確な機構は、理解されていない。摂食障害および悪液質は、精神的要因および生理的要因の組合せに支配されていることが知られている。消化管ホルモンが、食欲の調節に関与していることが知られている。特に、ホルモンのレプチンは、脳に燃料貯蔵量をシグナル伝達する脂肪由来の食欲減退ホルモンであることが知られている(Zhang, Yら、Nature 372巻、425〜32頁(1994年))。即ち、レプチンは食欲を減退させる。他の数種の消化管食欲減退ホルモンが特定された(Drucker, D. J.、J Clin Invest 117巻、24〜32頁(2007年))。

反対に、消化管ホルモンのグレリンは、知られている唯一の食欲増進ホルモン、即ち、食欲を高めることが知られている唯一のホルモンである(Asakawa, A.ら、Gut 52巻、947〜52頁(2003年))。食物摂取に応答して分泌される食欲減退ホルモンとは対照的に、グレリンは、食事の開始前に増加し、食物摂取により抑制される。グレリンの投与は、広範多様な種において食物摂取を刺激する。

食欲および食物摂取に影響するホルモンに対する受容体の特定は、近年における大きな科学研究の課題である。最近、Gタンパク質共役受容体GPR100(GPCR142、レラキシン-3受容体-2およびRXFP4とも称する)が、肥満の調節に関与していると確認された(国際公開第A-2005/124361号)。ペプチドホルモンInsl5が、GPR100の内因性リガンドであると最近確認された(Liuら、J. Biol. Chem.、280巻、1号、292〜300頁、1月7日、2005年)。

国際公開第A-2005/124361号

Ogdenら、Gastroenterology 132巻、2087〜102頁(2007年) Bray, G. A. & Bellanger, T.、Endocrine 29巻、109〜17頁(2006年) Bulikら、Int J Eat Disord 2005年、37巻、S2〜S9 Bushnellら、Psychol Med. 1990年8月、20巻(3号)、671〜680頁 Zhang, Yら、Nature 372巻、425〜32頁(1994年) Drucker, D. J.、J Clin Invest 117巻、24〜32頁(2007年) Asakawa, A.ら、Gut 52巻、947〜52頁(2003年) Liuら、J. Biol. Chem.、280巻、1号、292〜300頁、1月7日、2005年 Devereuxら、1984年、Nucleic Acids Research 12巻、387頁 Atschulら、1990年、J Molec Biol 403〜410頁 Ausubelら、1999年、Nucleic Acids Research、18章 Ausubelら、1999年、Nucleic Acids Research、7-58〜7-60頁 http://www.ncbi.nih.govBLAST/blast help.html Karlin and Altschul、1990年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87巻、2264〜68頁 Karlin and Altschul、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90巻、5873〜7頁 Altschulら(1994年) Nature Genetics 6巻、119〜129頁 Wootton & Federhen (1993年) Computers and Chemistry 17巻、149〜163頁 Claverie & States (1993年) Computers and Chemistry 17巻、191〜201頁 Bednarekら、J. Med. Chem.、43巻(23号)、4370〜4376頁、2000年

レプチンおよびグレリンなどの多くのホルモンが、体重を調節する潜在的治療薬であると確認されてきたが、これまでの臨床結果(少なくともレプチンについて)は、失望的なものであった。したがって、食欲および食物摂取を調節できる更なる作用剤を特定する強い必要性が存在する。

本発明は、Insl5ペプチドが、食欲増進性である、即ち、食欲を高めるという驚くべき認識に基づいている。

本発明の第1の態様によれば、Insl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片、またはInsl5抗体は、治療法に使用される。

本発明の第2の態様によれば、Insl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片は、IBS、便秘または下痢の治療用医薬の製造に使用される。

本発明の第3の態様によれば、Insl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片は、食欲減退を特徴とする疾患の治療用医薬の製造に使用される。

本発明の第4の態様によれば、Insl5抗体は、食欲増進を特徴とする疾患の治療用医薬の製造に使用される。

本発明の第5の態様によれば、ある組成物は、グレリン、またはhGHSR1aに対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片、あるいはInsl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片を含む。

本発明の第6の態様によれば、ある組成物は、グレリン抗体およびInsl5抗体を含む。

本発明の第7の態様によれば、あるワクチンは、Insl5、または免疫原性のその誘導体もしくは断片を含む。

本発明の第8の態様によれば、あるワクチンは、第5の態様による組成物を含む。

本発明の第9の態様によれば、Insl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片、またはInsl5抗体は、食物摂取を変化させ、したがって対象の体重を変化させるために、美容上使用される。

本発明は、以下の図を参照しながら説明される。

大腸の腸内分泌細胞におけるInsl5の発現を示す図である。絶食および摂食に応答したInsl5濃度を示す図である。 Insl5濃度の日周期リズムを示す図である。総合的実験動物モニタリングシステムにおける、野生型4匹およびGPR100欠損4匹のマウスのエネルギー消費および呼吸交換率を例示する図である。図4に示したデータの累積頻度分析を示す図である。図4に概要を示した実験の高脂肪食事および高炭水化物食事の累積摂取量を例示する図である。図4に概要を示した実験の再摂食期間中における、GPR100欠損マウスのより短い(野生型マウスと比較して)食事間隔を例示する図である。図4に概要を示した実験の再摂食期間中における、GPR100欠損マウスのより少ない(野生型マウスと比較して)食事重量、およびより短い食事期間を例示する図である。 Insl5が、野生型マウスにおいて食物摂取量の増加を用量依存的に誘発する(上側パネル)が、GPR100欠損マウスにおいては摂食挙動に何ら作用しない(下側パネル)ことを例示する図である。野生型およびGPR100欠損マウスの大腸におけるペレットの分布を例示する図である。

本発明は、Insl5が、食欲増進性であり、したがって対象中に存在するInsl5の量により、その対象の食欲の制御が可能になるという認識に基づいている。これは、食欲が変化している疾患の治療に有用である。更に、Insl5が、消化(GI)管内の栄養素の推進力を高め、摂食開始時のInsl5の低下が、GI反射に関与していることが判明した。大腸運動に対するこうした作用を前提にすれば、Insl5は、下痢、優勢な過敏性腸症候群および機能性下痢などの大腸運動の変化を伴う疾患/障害の治療に有用である。

食欲の変化を特徴とする疾患は、一般に摂食障害と称する。本明細書で使用する場合、用語「摂食障害」には、肥満などの食欲増進、ならびに拒食症、過食症、悪液質および消耗症候群などの食欲減退の双方を特徴とする疾患が含まれる。Insl5は、大腸運動に対する作用を更に有することが判明したので、これは、大腸運動の変化に関連する病状の治療に有用である。このような疾患の例には、便秘、過敏性腸症候群(IBS)、下痢および下痢-IBSが挙げられる。

疑念を回避するために、Insl5、またはGPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持するその誘導体もしくは断片、またはInsl5抗体は、治療法に使用することができる。好ましくは、この治療法は、食欲の変化または大腸運動の変化を特徴とする疾患の治療である。

実施例に提示したデータは、Insl5が、GPR100を介して作用し、食塩水注入対照動物より、マウスにおける食物摂取量の有意な増加を誘発することを示している。したがって、Insl5濃度の制御によって、食物摂取量が制御されよう。

本明細書で使用する場合、用語「Insl5」とは、インスリン様ペプチド5を指す。このペプチドは、切断によるプロセシングを受けると、ジスルフィド結合で連結された「A」鎖および「B」鎖を含むアミノ酸残基45個の成熟ペプチドを生じる、アミノ酸135個の前駆体(Swiss Prot受入番号Q9Y5Q6)として当技術分野では知られている。この前駆体および成熟ペプチドの配列は、Liuら、J. Biol. Chem.、280巻、1号、292〜300頁、1月7日、2005年の図1のパネルAおよびBに開示されている。この前駆体または成熟ペプチドは、本発明に従って使用することができる。好ましくは、成熟ペプチドが使用される。

Insl5の誘導体も、本発明の範囲に入る。当業者であれば、Insl5の機能を変化させずに、Insl5のアミノ酸残基を変化または欠失させることができることを認識されよう。したがって、Insl5の生物機能を保持するInsl5の誘導体は、本発明の範囲に入る。本明細書で使用する場合、Insl5の生物機能は、食欲を増進させる能力である。更なる生物機能は、GPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能である。この受容体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第A-2005/124361号に開示されているように、当技術分野では公知である。Insl5の誘導体は、GPR100に結合すれば本発明の範囲に入る。より好ましくは、この誘導体は、ナノモル領域のKd、より好ましくは100nM以上のKd、例えば、50nM以上、好ましくは20nM以上、更により好ましくは10nM以上、例えば2.5nM以上のKdでGPR100に結合する。疑念を回避するために、「より大きい」Kdとは、より小さいKd値で表現される、より強い結合を指す。

成熟Insl5は、ナノモル領域の高い親和性でGPR100からレラキシン-3を置換する。したがって、Insl5の好ましい誘導体も、高い親和性でレラキシン-3を置換する。好ましくは、該誘導体のKiは、0.01〜100nMの間、好ましくは0.5〜10nMの間、例えば1.5nMである。前駆体Insl5タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1に示されている。成熟ペプチドのA鎖およびB鎖は、それぞれ配列番号2および配列番号3に示されている。本発明の範囲に入る相同体は、配列番号1または配列番号2および3に対して、70%を超える配列同一性を通常有することになろう。より好ましくは、相同体は、80%を超える配列同一性、例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%および99%の配列同一性を有することになろう。

本明細書に提示した配列に関する配列同一性は、該配列の1種または複数と別の配列との単純な「視認」比較(即ち、厳密比較)によって、その別の配列が、該配列(複数可)と例えば少なくとも70%の配列同一性を有するか否かを確かめるために、決定することができる。

相対的配列同一性は、例えばデフォルトパラメーターを用いる同一性決定用の適切な任意のアルゴリズムを使用して、2種以上の配列間の同一率(%)を計算できる市販のコンピュータプログラムによっても決定することができる。

このようなコンピュータプログラムの典型例は、CLUSTALである。2種の配列間の同一性および類似性を決定する他のコンピュータプログラム法には、それだけに限らないが、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら、1984年、Nucleic Acids Research 12巻、387頁)およびFASTA(Atschulら、1990年、J Molec Biol 403〜410頁)が挙げられる。

相同率(%)は、連続的配列に亘って計算し得るものである、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を、他方の配列中の対応アミノ酸と1回に1つの残基ずつ直接比較する。これを「ギャップなし」整列と呼ぶ。通常、このようなギャップなし整列は、比較的短い数の残基に亘ってしか行われない。

これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、他では同一の一対の配列において、1つの挿入または欠失のために、その後のアミノ酸残基が整列から外され、その結果、全体的整列を行うと、相同率(%)が恐らくは大幅に低下することをそれでは考慮することができない。したがって、大抵の配列比較法は、総合的な相同性スコアに過度のペナルティを課さずに、あり得る挿入および欠失を考慮した最適な整列を生むように設計されている。これは、局所的な相同性を最大限にしようとするために、配列の整列において「ギャップ」を挿入することにより実現される。

しかし、こうしたより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸に対して、できる限りギャップの少ない(比較される2種の配列間の関連性の向上を反映した)配列の整列が、ギャップの多い整列より高いスコアを得るように、整列中に発生する各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てている。ギャップの存在に対して相対的に高いコストを課し、ギャップ中の各後続残基に対してはより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が、通常使用されている。これが、最も一般に使用されているギャップスコアシステムである。高いギャップペナルティのために、当然ながら、ギャップのより少ない最適化された整列が生まれよう。大抵の整列プログラムでは、ギャップペナルティの変更を許容している。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティは、ギャップに対して-12で、各延長に対して-4である。

したがって、最大相同率(%)の計算には、ギャップペナルティを考慮に入れた最適整列の作成が先ず必要になる。このような整列の実行に適したコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ(米国ウィスコンシン大学; Devereuxら、1984年、Nucleic Acids Research 12巻、387頁)である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、それだけに限らないが、BLASTパッケージ(Ausubelら、1999年、同書、18章)、FASTA(Atschulら、1990年、J. Mol. Biol.、403〜410頁)およびGENEWORKS比較ツール一式が挙げられる。BLASTおよびFASTAは共に、オフラインおよびオンラインの検索に利用できる(Ausubelら、1999年、同書、7-58〜7-60頁)。

最終的な相同率(%)は同一性によって評価できるが、配列過程自体は、通常、全か無かの一対比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づく各一対比較にスコアを割り当てる、尺度付き類似性スコア行列が一般に使用される。汎用されるこのような行列の一例は、BLOSUM52行列、即ちBLASTプログラム一式に対するデフォルト行列である。GCG Wisconsinプログラムは、一般に、公表デフォルト値、または供給される場合には特注記号比較表のいずれかを使用する。GCGパッケージのためには公表デフォルト値、または他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62などのデフォルト行列を使用することが好ましい。

有利には、パラメーターをデフォルト値に設定した、BLASTアルゴリズムが使用される。BLASTアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれるhttp://www.ncbi.nih.govBLAST/blast help.htmlに詳細に記載されている。検索パラメーターも、規定されたデフォルトパラメーターに有利に設定することができる。

有利には、BLASTで評価した際の「実質的同一性」は、少なくとも約7、好ましくは少なくとも約9、最も好ましくは10以上のEXPECT値で整合する配列に同等である。BLAST検索におけるEXPECTの閾値は、普通10である。

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)は、blastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxの各プログラムで採用される発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムの意義は、少数の機能強化を加えると共に、KarlinおよびAltschulの統計的方法を用いた発見にある(Karlin and Altschul、1990年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87巻、2264〜68頁; Karlin and Altschul、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90巻、5873〜7頁; http://www.ncbi.nih.govBLAST/blast help.htmlを参照されたい)。BLASTプログラムは、配列類似性検索のため、例えば、問合せ配列に対する相同体を特定するために合うように作成されている。配列データベースの類似性検索における基本的問題に関する考察については、Altschulら(1994年) Nature Genetics 6巻、119〜129頁を参照されたい。

http://www.ncbi.nlm.nih.govで入手できる5種のBLASTプログラムは、以下のタスクを行う: blastpは、アミノ酸問合せ配列をタンパク質配列データベースと比較する; blastnは、ヌクレオチド問合せ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する; blastxは、ヌクレオチド問合せ配列の6フレーム概念翻訳産物(両ストランド)をタンパク質配列データベースと比較する; tblastnは、タンパク質問合せ配列を、全6個のリーディングフレームにおいて動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベース(両ストランド)と比較する; tblastxは、ヌクレオチド問合せ配列の6フレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳と比較する。

BLASTは、以下の検索パラメーターを使用する。

HISTOGRAM - 各検索に対するスコアのヒストグラムを表示する。デフォルトはイエスである。(BLASTマニュアルのパラメーターHを参照されたい)。

DESCRIPTIONS - 報告された整合配列の短い記述数を指定した数に制限する。デフォルト限界は100記述である。(マニュアルページのパラメーターVを参照されたい)。

EXPECT - データベースに対する整合を報告するための統計的有意性の閾値。デフォルト値は10であり、したがって10個の整合は、KarlinおよびAltschul(1990年)の確率論的モデルに従えば単なる偶然で見つかると期待される。整合に因る統計的有意性がEXPECT閾値より大きければ、その整合が報告されることはなかろう。EXPECT閾値が低いほど、厳密度が高まり、報告される偶然の整合が減少する。少数値は許容される。(BLASTマニュアルのパラメーターEを参照されたい)。

CUTOFF - 高スコアセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォルト値は、EXPECT値から計算される(上記を参照)。HSPは、それらHSPに因る統計的有意性が、CUTOFF値に等しいスコアを有する孤立HSPに因ると思われる場合と少なくとも同等に高い場合にだけ、データベース配列のために報告される。CUTOFF値が高いほど、厳密度が高まり、報告される偶然の整合が減少する。(BLASTマニュアルのパラメーターSを参照されたい)。通常、有意性閾値は、EXPECTを用いるとより直感的に取り扱うことができる。

ALIGNMENTS - 高スコアセグメント対(HSP)を報告する先のデータベース配列を指定数に制限する。デフォルト限界は50である。これより多数のデータベース配列が、報告するための統計的有意性の閾値をたまたま満足した場合(上記のEXPECTおよびCUTOFFを参照されたい)、最大の統計的有意性に因る整合だけが報告される。(BLASTマニュアルのパラメーターBを参照されたい)。

MATRIX - BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXのために代替スコア行列を指定する。デフォルト行列はBLOSUM62である(Henikoff & Henikoff、1992年)。妥当な代替選択肢には、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが挙げられる。BLASTNには、代替スコア行列が利用できない。BLASTNにおいてMATRIX指示を指定すると、エラーへの対応が必要になる。

STRAND - TBLASTN検索をデータベース配列の上部もしくは下部ストランドだけに制限する、またはBLASTN、BLASTXもしくはTBLASTXの検索を、問合せ配列の上部もしくは下部ストランド上のリーディングフレームだけに制限する。

FILTER - Wootton & Federhen (1993年) Computers and Chemistry 17巻、149〜163頁のSEGプログラムで決定した場合の組成複雑度が低い問合せ配列のセグメント、または、Claverie & States (1993年) Computers and Chemistry 17巻、191〜201頁のXNUプログラム、もしくはBLASTNについては、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラム(http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい)で決定した場合の短周期内部リピートからなるセグメントを脱マスクする。フィルタリングによって、統計的に有意であるが、生物学的な興味のない報告(例えば、普通の酸性、塩基性またはプロリンの多い領域に対するヒット)をブラスト出力から消去し、問合せ配列の生物学的な興味のより深い領域を、データベース配列に対する特定の整合に利用できるように残すことができる。

フィルタープログラムが見つけた低複雑度配列は、ヌクレオチド配列では文字「N」(例えば、「NNNNNNNNNNNNN」)およびタンパク質配列では文字「X」(例えば、「XXXXXXXXX」)を用いて置換される。

フィルタリングは、問合せ配列(またはその翻訳産物)だけに適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングは、BLASTNにはDUST、他のプログラムにはSEGである。

SWISS-PROT中の配列に適用した場合、SEG、XNUまたは両方にマスクされることは、全く無駄なほどありふれているため、フィルタリングが、常に有効であると期待すべきではない。更に、幾つかの例では、配列の全体がマスクされており、フィルタリングしていない問合せ配列に対して報告された任意の整合の統計的有意性は、怪しむべきであることを示している。

NCBI-gi - 受入名および/または場所名の他に、NCBI gi識別子を出力中に表示させる。

最も好ましくは、配列比較は、http://www.ncbi.nlm.nih.govBLASTに提供されている単純なBLAST検索アルゴリズムを用いて行われる。幾つかの実施形態では、配列同一性を決定する際、ギャップペナルティが全く使用されない。

当業者であれば、Insl5の化学的安定化が可能であることを認識されよう。したがって、化学安定化Insl5は用語「誘導体」の範囲に入る。好ましい安定化Insl5は、peg化Insl5である。

成熟Insl5の生物機能を保持するInsl5断片は、本発明の範囲に入る。その断片は、成熟Insl5の機能、即ち、食欲を増進し、GPR100 Gタンパク質共役受容体に結合する能力を保持する任意の長さでもよい。好ましくは、該断片は、少なくともアミノ酸20残基の長さ、より好ましくは少なくとも25残基、例えば30、35もしくは40残基、またはそれより多数である。

本明細書で使用する場合、用語「Insl5」はその誘導体および断片を包含し、任意の種のInsl5を指す。好ましくは、Insl5は哺乳動物性、より好ましくは人間のものである。

本明細書における考察はInsl5ペプチドに集中しているが、Insl5ペプチド、その誘導体または断片をコードする、DNAまたはRNAなどのポリヌクレオチドの使用が、本発明の範囲に入ることに留意されたい。

Insl5を含む多くの生成物および組成物が、本明細書に開示されている。本発明の目的は、こうした生成物および組成物を患者に投与することであるので、それらを少なくとも1種の医薬用賦形剤または希釈剤と組み合わせて製剤化することが好ましい。

Insl5は食欲増進性であることが判明した。「食欲増進性」という用語は、ある化合物の食欲を増す能力を定義することとして、当技術分野では周知である。したがって、Insl5は、食欲を増し、それゆえ食物摂取量を増すことにより、食欲減退を特徴とする疾患の治療に使用することができる。食欲減退を特徴とする疾患の例は、拒食症、過食症、ならびに悪液質、特に腫瘍および腫瘍治療関連の悪液質である。こうした疾患の1種または複数を患う対象にInsl5を投与すれば、対象の食欲が増し、それゆえ対象の食物摂取量が増して、疾患が治療されよう。

Insl5(またはその誘導体)は、大腸運動の変化に伴う障害に罹っている患者にも投与することができる。このような障害には、便秘、下痢および過敏性腸症候群が挙げられる。そうした障害の1種または複数に罹っている患者にInsl5を投与すれば、GI管における栄養素の推進力が高まり、妨害された栄養素もしくは不要な細菌が感染した栄養素、または他の汚染物の除去が助長されよう。

本発明の代替的な態様では、Insl5抗体は、食欲増進を特徴とする疾患の治療に使用することができる。Insl5自体は、食欲を増進する。したがって、Insl5に対する抗体は、Insl5の循環量を低下させ、それゆえ食欲を減退させることになろう。したがって、食欲増進を特徴とする疾患を患う対象にInsl5抗体を投与すれば、食欲が減退し、対象による食物摂取量が低下することになろう。食欲増進を特徴とする好ましい疾患は、肥満である。肥満は、代謝症候群の一特徴であり、それゆえ2型糖尿病および異常脂質血症などの代謝症候群の他の因子も、Insl5抗体を用いて治療することができる。

食欲増進を特徴とする疾患を治療するために、その疾患を患う人にInsl5抗体を投与することができる。本明細書で使用する場合、用語「Insl5抗体」とは、Insl5に好ましくは特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。

本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、抗原に結合する免疫グロブリン系分子を指す。用語「抗体」は、免疫グロブリンの全5クラス(IgG、IgE、IgA、IgMおよびIgD)を包含する。抗体断片ならびにFabおよびscFV断片などの変形体は、本発明の範囲に入る。当業者であれば、抗体断片を受動免疫に使用することを意図した場合、Fc領域が存在することが好ましいことを認識されよう。Insl5またはその誘導体もしくは断片に結合するモノクローナル抗体は、本発明の範囲に入り、モノクローナル抗体を創製するためのInsl5の使用も、本発明の範囲に入る。ヒト化抗体は、好ましい実施形態である。

特異抗原に対する抗体を対象に投与することは、当技術分野で「受動免疫」として知られている。好ましくは、抗体は、少なくとも1種の医薬として許容される賦形剤と共に投与される。

食欲増進を特徴とする疾患を患う人にInsl5抗体を投与する代わりとして、対象にInsl5を含むワクチンを投与することができる。このワクチンは、Insl5に対する「能動免疫」を生じることになろう。好ましくは、Insl5の1種または複数の断片または誘導体が、ワクチンとして使用される。この実施形態では、該断片または誘導体は、Insl5の生物機能を保持する必要がない。しかし、ワクチンに使用される断片または誘導体は、免疫原性応答の誘発能を保持しなければならない、即ち、「免疫原性」断片または誘導体でなければならない。好ましくは、断片または誘導体が起こす免疫原性応答は、成熟Insl5ペプチドが起こす応答に類似している。このような断片または誘導体に結合する抗体は、成熟Insl5ペプチドにも結合しよう(その断片または誘導体に対応する領域において)。好ましくは、断片または誘導体に対する免疫原性応答で生育される抗体は、成熟Insl5ペプチドに特異的に結合しよう。本明細書で使用する場合、「特異的結合」への言及とは、特異的な抗原またはエピトープに選択的に結合し、他の(関連性のない)抗原またはエピトープには結合しない抗体を指す。好ましくは、Insl5の断片または誘導体と抗体との結合親和性は、マイクロモル領域、例えば50μM以下、より好ましくは10μM以下にある。

Insl5を組み入れるワクチンの調製は、当業者にとって単純なものとなろう。ワクチン組成物は、感染に対する有効な免疫を得るために、必要または所望な場合、医薬として許容される適切な担体またはアジュバント、例えばミョウバンを用いて製剤化することができる。適切なアジュバントには、それだけに限らないが、アルミニウム塩、スクワレン混合物、アクイリン混合物、サポニン誘導体、免疫賦活性複合体(ISCON)、非イオン性ブロックコポリマーの界面活性剤、およびβ-グルカンが挙げられる。

食欲の変化を特徴とする多くの疾患が、病状であることは周知である。しかし、当業者であれば、対象の体重制御は美容に応用されることも認識されよう。したがって、本発明の一実施形態では、Insl5またはInsl5抗体は、対象の体重に増減を起こす美容法に使用される。本明細書で使用する場合、用語「美容の」とは、当技術分野における普通の意味、即ち、さしたる医療上の恩恵なしに、人の外観の変化、好ましくは改善だけに関する意味を与えられることである。

本発明は、Insl5が食欲増進ホルモンであるという驚くべき認識に基づいている。他の唯一の食欲増進ホルモンとして、グレリンが知られている。本発明の一態様によれば、ある組成物は、グレリンまたはその誘導体もしくは断片と、Insl5またはその誘導体もしくは断片とを含む。

任意の種から得られるグレリンを使用することができる。ヒトのグレリンが好ましく、これは、ヒト成長ホルモン分泌促進剤の受容体1A(hGHSR1a)における効力あるアゴニストである、アミノ酸28個の成熟ペプチドとして当技術分野において周知である。n-オクタノイル酸によるグレリンの3位残基のアシル化が、グレリンの活性にとって必須である。ヒトのグレリンの配列は、当技術分野において公知であり、Swiss Prot受入番号Q9UBU3を有する(アミノ酸残基117個の前駆体で、そのうち残基28個の成熟ペプチドは、24〜51位の残基である)。前駆体または成熟グレリンペプチドは、正しい本発明に従って使用することができる。好ましくは、成熟ペプチドが使用される。hGHSR1aに対してアゴニスト作用能を維持するグレリンの誘導体および断片は、本発明の範囲に入る。グレリンの最初の4または5残基を包含する短鎖ペプチドは、hGHSR1aを機能的に活性化する能力を保持する。具体的には、Gly-Ser-Ser(n-オクタノイル)-Pheセグメントは、アゴニストの効力および機能に必要な「活性コア」である(Bednarekら、J. Med. Chem.、43巻(23号)、4370〜4376頁、2000年)。Insl5について上記に示したように、本明細書におけるグレリンの考察はこのペプチドに集中しているが、グレリンまたはその断片もしくは誘導体をコードする、RNAまたはDNAなどのポリヌクレオチドの使用は、本発明の範囲に入る。

理論に拘ることは欲していないが、グレリンおよびInsl5の組合せは、これらのホルモン2種を別々に投与するより有利である。

Insl5またはその免疫原性断片もしくは誘導体と、グレリンまたはその免疫原性断片もしくは誘導体とを含むワクチンは、本発明の範囲に入る。

グレリン抗体およびInsl5抗体を含む組成物は、本発明の範囲に入る。本明細書で使用する場合、グレリン抗体は、グレリンに好ましくは特異的に結合する免疫グロブリン分子(上記で定義したような)である。

やはり理論に拘ることは欲していないが、Insl5抗体およびグレリン抗体の組合せは、食物摂取量の減少に相乗作用を有すると考えられる。この組合せは、食欲減退ホルモンの投与などの代替手法より優れていると考えられる。特に、空腹、満腹および吐き気が、連続した感覚であることが認められた。したがって、食欲減退化合物の治療ウィンドウは、普通狭い。満腹の誘発は、もう少し高い濃度で誘発される吐き気と分離するのが困難である。この一般的制約は、2種の食欲増進ホルモンであるグレリンおよびInsl5の同時阻害には当てはまらない。更に一層効力を高めるために、グレリン抗体およびInsl5抗体の少用量の食欲減退物質(吐き気を誘発しない)との組合せが可能である。

本発明を、以下の非限定的な実施例に関して説明する。

実施例で使用する略号
wtまたは+/+ - 129/SvEv株の野生型マウス
GPR100-/-、-/-またはGPR100欠損 - 129/SvEvをバックグランドとし、GPR100がホモ接合型欠失の動物
RER - 呼吸交換率
EE - エネルギー消費
HFD - 高脂肪食
HCD - 高炭水化物食

(実施例1)
Insl5は、摂食条件に応答して大腸の腸内分泌細胞から分泌されるホルモンである
GPR100欠損動物に認められる微妙な代謝表現型を探るために、GPR100およびその内因性リガンドInsl5の発現パターンを調べた。

GPR100について公表された発現データは、CNSを除く末梢組織における広範な分布を示唆している。他の大抵の組織発現データは、公表資料間で一致していない。例えば、ノーザンおよびドットブロットのデータは、腎臓、肝臓、骨格筋および心臓で発現が最高であるが、大腸または小腸では全く発現しないことを示唆しているのに対し、定量rtPCRでは、大腸で発現が最高であり、腎臓では殆ど発現せず、心臓または骨格筋では全く発現しないことが明らかになった。rtPCRで測定したマウス組織における発現データ(示していない)は、胸腺、胃、小腸および肺で発現が最高であることを明らかにした。

該リガンドについての発現データは、より決定的である。公表された全てのEST配列は、マウスの腸または胸腺のいずれかに由来する。小腸における規格化したEST発現は、胸腺での大まかに2倍高い。こうした示唆的データに基づいて、市販の抗体(Phoenix Pharmaceuticals GmbH、ドイツ)を用いて免疫組織化学検査を行った。INSL5は、腸内分泌細胞を示唆する、大腸腺窩の一部の散在性上皮細胞中に検出された。全細胞ではないが、一部の細胞におけるInsl5のPYYおよびクロモグラニン(示していない)との共局在化は、この考えを裏付けた(図1)。

図1 - 免疫組織化学検査により、大腸の腸内分泌細胞におけるInsl5の発現が示される。連続的切片を、それぞれPYYまたはInsl5について染色している。同じ細胞における共局在化は、矢印で示されている。注目すべきことに、Insl5陽性ではないPYY陽性細胞が数個存在する。他の切片では逆のことが当てはまり、Insl5陽性細胞はPYYを染色しない。

組織は、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いて潅流固定し、脱水し、パラフィンで包埋し、標準法を用いて切片化した。市販のポリクローナルウサギ抗体(Phoenix Pharmaceuticals GmbH、ドイツ)を使用し、ビオチニル化二次抗体およびABCキット(Vectastain)で検出する。

INSL5は、腸内分泌細胞により分泌されるので、その血漿濃度が、動物の飼料摂取状態と関係するか否かを調べた。通常の固形飼料食を取っている野生型動物を終夜絶食させ、血液試料を飼料再摂取の前、および後の数時点で採取した。Insl5濃度は、RIA(Phoenix Pharmaceuticals GmbH、ドイツ)を用いて測定した。終夜絶食した後では、Insl5濃度が高く、15分後には有意に低下した。飼料再摂取の開始から1時間後、INSL5濃度は、ピークに達し、その後の時点では再び低かった。第2のピークは、次の夜の間に認められた。GPR100欠損マウスについても同様なパターンが認められるが、各ピークは遅れている(図2)。グレリンは、GPR100の欠失により実質的に変化しない。

Insl5分泌の観察パターンは、日周期活動パターンおよび飼料摂取挙動の重ね合わせとも思われる。そこで、予め絶食させずに自由に飼料を摂取したマウスにおけるInsl5濃度を調べた。Insl5の最低濃度は、その夜の間に認められる(図3)。野生型動物は、日中の方が高濃度であり、午後にピークを有する。こうしたピークは、GPR100欠損動物では後の時点に時期がシフトしている。マウスは、主要飼料摂取期が夜時間中にある夜行性動物であるので、このInsl5分泌パターンは、このホルモンの食欲増進機能と一致している。この考えと関連して、自由に飼料を摂取した動物の濃度(約0.1〜2pg/0.1ml)と比較して、絶食動物の飼料再摂取中における一般に遥かに高いInsl5濃度(大部分の時点で5〜10pg/0.1ml)がある。興味深いことには、最高濃度が、飼料再摂取期の夜の間に認められる(図2)。

図2 - 絶食および飼料再摂取に応答するInsl5濃度。動物を終夜絶食させる。飼料再摂取は、0時点で開始し、実験の間中継続する。試料は、飼料再摂取の前、飼料再摂取から15分、30分、1時間、2、4、6、8、10時間の後に抜き取る。GPR100-/-のマウスについては、幾つかの試料採取時刻が省かれている。必要な試料容量のために、動物は試料採取時に屠殺する。性別、遺伝子型別および時点別に、動物2匹を使用する。内挿線は、ラグランジュの三次関数である。

絶食している雄性および雌性の野生型動物のInsl5濃度は、5pg/0.1ml位で始まる。飼料再摂取から15分後、急激に低下する。その濃度は、30分で再び増加し、1時間位で大まかに開始値に達する。2時間では、その濃度が低くなり、残りの観察期間の間、更に減少する。

図3 - Insl5濃度の日周期リズム。Insl5の底は、真夜中の間、即ち動物の主要飼料摂取期の直後に出現する。GPR100-/-のマウスでは、ピークが遅れ、夜時間中に再調整される。グレリンについても、類似の時期シフトが雌性KOマウスで認められる。雄性KOマウスでは、ピークが認められない。Insl5濃度は、図2に比較して一般に低い(Insl5については縦座標が異なることに注意されたい)。動物は試料採取時に屠殺する。性別、遺伝子型別および時点別に、動物2匹を使用する。内挿線は、ラグランジュの三次関数である。

こうしたデータは、飼料摂取の動機付けが、少なくとも部分的にInsl5によって媒介されることを示唆している。

(実施例2)
GPR100欠損動物における食事の量および頻度ならびに主要栄養素嗜好性の変化
代謝および飼料摂取挙動に対するGPR100の喪失を更に探るために、生存期間が相応する雄性マウスのwt 4匹およびGPR100欠損型4匹に、総合実験動物モニタリングシステム(CLAMS; Columbus Instruments Ltd.)を用いて、絶食および飼料再摂取の手順を施した。CLAMSは、チャンバーを8個、チャンバー1個につき、2食の消費量を独立にモニターする2個のフードホッパー、赤外線ビーム遮断に基づく活動モニター、水摂取量モニタリング、および間接熱量計を装備している。マウスは、高脂肪食(HFD; 35kcal%の炭水化物、45kcal%の脂肪)およびほぼ等カロリーの高炭水化物食(HCD; 70kcal%の炭水化物、10kcal%の脂肪)の選択権を与えられた。1昼目に馴らした後、動物を終夜絶食させ、2昼目から48時間後の実験終了まで食物の選択に戻した(図4)。

図4 - CLAMSにおけるEEおよびRER。生存期間が相応する雄性マウスのwt 4匹およびGPR100欠損型4匹に、総合実験動物モニタリングシステム(CLAMS; Columbus Instruments Ltd.)を用いて、絶食および飼料再摂取の手順を施した。

絶食期間中、エネルギーを節約するために、エネルギー消費(EE)は低下しつつあり、呼吸交換率(RER、消費酸素当たりに生成する二酸化炭素)は0.7に近づき、燃料として脂肪に依存していることを示す。1日目の朝に食物が再び利用できるようになった後、RERが劇的に増加する。RERの1は、動物が炭水化物だけを燃焼させていることを示す。RERの自然リズムは、炭水化物および脂肪の貯蔵が再び満たされた3日目の間にようやく取り戻されている。残りの実験中に認められるEEとRERとの緩い相関関係は、より低いEEおよびRERを特徴とする絶食期間と、飼料摂取期間(より高いEEおよびRER)との間の正常な変化を反映している。したがって、2昼目および2夜目は、飼料再摂取期間と見なされ、3昼目は移行期間であり、3夜目は、自由に飼料を摂取する動物にとって正常な状態を表す。

3夜目中のRERは、GPR100欠損動物においてwtにおけるより高くなる傾向がある。その期間中のRER分布が広範囲なため、このデータは、累積度数プロットで再分析する(図5)。

図5 - 図4で概説した実験の3夜目からのwtおよびGPR100 -/-マウスのRERに関する累積度数分析。

異なるRERの原因を調べるために、食物消費量を分析した。累積合計食物消費量は、実験全体に対して異なっておらず(データは示していない)、飼料再摂取期間中(2昼目〜2夜目)の2食に関しても差はない。飼料再摂取期間後の3昼目および3夜目に、有意な差が現れる。GPR100 -/-動物は、wtに比較して高炭水化物食を好む。したがって、wt動物は、HFDをより多量に消費する(図6)。

図6 - 図4で概説した実験の高脂肪食(HFD)および高炭水化物食(HCD)の累積摂取量。データは、平均値+95%信頼区間として提示されている。

EEまたは活動パターンの変化はないので、食物嗜好性の差が、ほぼ間違いなく、GPR100 -/-マウスの高いRERの唯一の説明となる。消化管ホルモンが、他の挙動特性の他に食物嗜好性に影響することは、珍しいことではない。普通、幾つかの必須栄養素は、特定のホルモンの分泌を誘発する上で、他のものより有効である。反対に、グレリンは、脂肪摂取に対する嗜好性を誘発することが示された。これは、GPR100欠損動物における炭水化物に対して観察された嗜好性と一致している。逆に、これは、Insl5が、グレリン同様に脂肪消費量を高めることを示唆している。

累積摂取量は別として、個々の食事パターンは興味深いものであった。食事間隔には、有意差がなかった。飼料再摂取期間中、特に2夜目および3昼目に、GPR100 -/-マウスには食事間隔が短縮する傾向がある(p=0.151; 図7)。対照的に、GPR100 -/-マウスでは、食事重量が有意に減少する(p=0.002)。同様に、個々の食事の継続時間も有意に短縮する(p=0.0001; 図8)。こうした知見は、GPR100媒介Insl5シグナルが、飼料を摂取する動機付けに寄与し、図6に既に示したように、Insl5が、高脂肪食に対する嗜好性を誘発することを示唆している。

(実施例3)
Insl5の投与は、wtにおいて飼料摂取を誘発するが、GPR100 -/-マウスでは誘発しない
Insl5は食欲増進ホルモンであるという仮説を直接試験するために、それをwtおよびGPR100 -/-マウスの腹腔内に投与した。Insl5は、wt動物における食物摂取量の増加を用量依存的に誘発する(図9、上側パネル)。GPR100 -/-マウスでは、Insl5は飼料摂取挙動に全く作用しない(図9、下側パネル)。これは、Insl5が食欲増進作用を有することを実証している。その上、この作用はGPR100を通して媒介される。

(実施例4)
大腸運動はGPR100 -/-マウスにおいて変化する
公表および内部の発現データは、Insl5およびGPR100の双方が大腸内で発現することを示唆している。このことから、このリガンド受容体系が、大腸運動の調節に関与していることを示すことができよう。回腸から大腸に入る容量の90%もが、大腸の中を移動する際に吸収される。その残りは、容量が減少していく結果、肛門に近づくにつれ移動が遅くなるペレットに圧縮される。排便の準備ができた成熟ペレットは、直腸内に貯蔵される。排便は、様々な機構により誘発されるが、その機構の1つは胃肛門反射である。多量の食事の消費による胃の膨張が、排便を誘発する。こうした機構におけるGPR100の潜在的な関与を探るために、自由に飼料を摂取していた動物を屠殺し、外植した大腸における肛門までの距離として、ペレットの位置を測定した。wt動物における肛門までの距離に亘る頻度分布は、大腸の遠位部ほど速度が減少することと関連している。その結果、大部分のペレットは、大腸の最後部の9mmに観察された(図10)。GPR100 -/-動物における分布は、より近位の大腸セグメントでは同様であるが、最も遠位の2セグメントにおけるペレット含量は、減少しており、これは、ペレットが、しばらく貯蔵される代わりに放出されることを示している。

こうした知見は、GPR100およびInsl5が、消化管運動の調節に関与していることを単に示すだけではない。消化管ホルモンの放出は、様々な機構によりしばしば誘発される。早期には、神経系に媒介されることが多いが、後期には、栄養素の腸管壁との直接接触により誘発されることが多い。自由に飼料を摂取していたGPR100 -/-動物におけるInsl5分泌に認められた時期シフトは、腸管壁の栄養塊との直接接触によるこの誘発が後期に起こり、その結果、Insl5分泌の遅延抑制が起こることを示している(図3)。類似の時期遅延は、絶食動物に飼料を再摂取させた後に認められる(図2)。更に、自由摂取および再摂取の両実験において、GLP1およびグレリンも時期シフトを受けることがある程度示されている。

治療有用性
以上の知見からの結論は、INSL5が食欲増進性の腸内分泌ホルモンであることである。その分泌は、飼料摂取条件により調節される。具体的には、食物消費がInsl5の分泌を抑制するが、絶食は誘発する。大腸における主要な発現を前提とすれば、絶食動物における高い血漿濃度の早期(15分)抑制は、恐らく神経性または内分泌性のシグナルによる。後期の低濃度は、大腸内栄養素の直接作用に媒介されるとも思われる。

データが示すところによれば、大腸運動は、直腸の遠位部におけるInsl5により阻害されるが、これが早期の排便を起こすとも思われる。排便の遅れとは対照的に、Insl5は、GI管全体に対して運動を促進する。

Insl5抗体も、肥満、および代謝症候群の関連する特徴の治療に有用である。この手法は、グレリン抗体と組み合わせれば遥かに強力になるようである。更に、Insl5自体は、拒食症、過食症、悪液質または下痢-IBSの治療に有用である。

Claims

食欲減退を特徴とする疾患の治療用医薬の製造における、(i)Insl5、または(ii)その誘導体もしくは断片であって、そのアミノ酸配列が(i)のInsl5のアミノ酸配列に対して90％を超える同一性を有し、かつ、GPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持する、誘導体もしくは断片の使用。
前記疾患が、拒食症、悪液質または消耗性疾患である、請求項1に記載の使用。
前記医薬が、(i)グレリン、または(ii)その誘導体もしくは断片であって、Gly-Ser-Ser(n-オクタノイル)-Pheセグメントを含み、かつ、hGHSR1aに対する結合能を保持する、誘導体もしくは断片を含む、請求項1または請求項2に記載の使用。
食欲減退を特徴とする疾患の治療に使用するための、(i)Insl5、または(ii)その誘導体もしくは断片であって、そのアミノ酸配列が(i)のInsl5のアミノ酸配列に対して90％を超える同一性を有し、かつ、GPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持する、誘導体もしくは断片を含む組成物。
前記疾患が、拒食症、悪液質または消耗性疾患である、請求項4に記載の組成物。
請求項3に規定したグレリンを更に含む、請求項5に記載の組成物。
(i)グレリン、または(ii)その誘導体もしくは断片であって、Gly-Ser-Ser(n-オクタノイル)-Pheセグメントを含み、かつ、hGHSR1aに対する結合能を保持する、誘導体もしくは断片、および(iii)Insl5、または(iv)その誘導体もしくは断片であって、そのアミノ酸配列が(iii)のInsl5のアミノ酸配列に対して90％を超える同一性を有し、かつ、GPR100 Gタンパク質共役受容体に対する結合能を保持する、誘導体もしくは断片
を含む食欲増進用組成物。
治療に使用するための請求項7に記載の組成物。