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JP5487638B2 - 微小粒子分取のための装置及びマイクロチップ - Google Patents
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Description

本発明は、微小粒子分取のための装置及びマイクロチップに関する。より詳しくは、マイクロチップに形成された流路を通流する微小粒子の特性をチップ内において検出した後、微小粒子を含む液滴をチップ外に吐出し、検出された微小粒子の特性に基づき液滴の移動方向を制御して分取を行う微小粒子分取装置等に関する。
従来、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などの微小粒子の特性を判別するため、微小粒子の分散液を流路内に導入し、流路内へ導入された微小粒子の特性を光学的に測定する装置が用いられている。
特に生体関連微小粒子については、フローサイトメトリー（フローサイトメータ）と呼ばれる装置が広く用いられている（非特許文献１参照）。フローサイトメトリーには、微小粒子の特性測定のみを目的としたものや、さらに測定結果に基づいて所望の特性を備えた微小粒子のみを分取できるように構成されたものがある。後者のうち、特に細胞を分取対象とした装置を「セルソータ」と呼んでいる。現在、市販されているセルソータでは、毎秒数千〜数万個という高速で細胞の特性を測定し、分取することが可能である。
従来のフローサイトメトリーでは、以下のようにして、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子の大きさや構造等の特性を測定している。まず、フローセルにおいて測定対象とする微小粒子を含むサンプル溶液をシース液の層流の中心に流し、フローセル内に微小粒子を一列に配列させる。次に、光学検出部において、フローセル内に配列されて通流する微小粒子に測定光を照射し、微小粒子から生じる散乱光や蛍光を検出して微小粒子の特性を測定する。続いて、微小粒子の分取を行う場合には、サンプル液を、微小粒子を含む液滴としてフローセル外の空間に吐出し、液滴の移動方向を制御して、所望の特性を備えた微小粒子を分取する。
特許文献１（第７図）には、従来のセルソータとして、蛍光標識試薬などで染色された細胞をフローセル内で一列に配列するための流体系と、細胞にレーザー光を照射して散乱光や蛍光を検出するための光学系と、フローセル外の空間に吐出された液滴の移動方向を制御するための分取系と、からなる装置が開示されている。
これら従来のフローサイトメトリー（セルソータ）では、流路系を構成するフローセル部品が高価な石英製であることや、このフローセルとは別体のオリフィス部品から構成されており、使用者が簡単に使い捨て可能とされていないため、測定の都度にフローセル部品やオリフィス部品を十分に洗浄しても、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションが生じるおそれがあった。また、分取系を構成する空間が開放空間又は気密性の低い空間とされているため、測定の際に液滴形成の際に発生する微小液滴（エアロゾル）等の汚染物質がサンプルに混入する、あるいは、エアロゾルによる装置使用者への感染や暴露などのバイオハザードの恐れがあった。このようなサンプル間のクロスコンタミネーションやサンプルの汚染、使用者へのバイオハザード、高価なフローセルとオリフィス部品の利用は、特に、セルソータによって分取した幹細胞等を再生医療に用いるような場合には大きな障害となっている。
サンプル間のクロスコンタミネーションやサンプルの汚染、使用者へのバイオハザード、高価なフローセルとオリフィス部品の利用を解決するための技術として、近年、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うための領域や流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（micro-total-analysis system）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称されている。
微小粒子分取技術へのμ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された流路や領域内で微小粒子の特性を光学的、電気的あるいは磁気的に分析する微小粒子分析技術がある。例えば、特許文献２には、基板上に、微粒子含有溶液導入流路と、当該流路の少なくとも一方の側部に配置されたシース流形成流路と、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、該微粒子計測部位の下流に設置された微粒子を分別回収するための２以上の微粒子分別流路と、を有する微粒子分別マイクロチップが開示されている。このマイクロチップは微粒子計測部位から微粒子分別流路への流路口付近に電極を有しており、このマイクロチップを備える微小粒子分取装置によれば、電極電界との相互作用によって微粒子の移動方向を制御し、微小粒子の分取を行うことが可能である。
μ−ＴＡＳを応用したフローサイトメトリー（セルソータ）では、ディスポーザブルユース（使い捨て）が可能なマイクロチップにより流路系を構成することができるため、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションが生じない。また、分取系をチップ上に配設された気密流路内に構成することができるため、測定の際にエアロゾル等の汚染物質がサンプルに混入することがない。しかし、一方で、チップ上に配設された流路内に微小粒子を含む液体を高圧で送液する必要があり、微小粒子の移動方向の制御を微小粒子が液体中を通流している状態で行う必要がある。そのため、微小粒子の通流速度や分取速度を高めることが困難で、従来のフローサイトメトリー（セルソータ）のように毎秒数千〜数万個という高速で細胞の特性を測定し、分取することが難しかった。
特開２００７−４６９４７号公報 特開２００３−１０７０９９号公報
「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」、中内啓光、秀潤社、第2版、2006年8月31日発行
上述の通り、従来のフローサイトメトリー（セルソータ）では、流路系を構成するフローセルが使い捨て可能な構成とされていないため、サンプル間のクロスコンタミネーションが生じるおそれがあった。また、分取系を構成する空間が開放空間又は気密性の低い空間とされているため、エアロゾル等によってサンプルが汚染されるがあった。また、μ−ＴＡＳを応用したフローサイトメトリー（セルソータ）においても、微小粒子の通流速度や分取速度を高めることが困難なため、解析のハイスループット化が難しいという問題があった。
そこで、本発明は、サンプル間のクロスコンタミネーションやサンプルの汚染、使用者へのバイオハザード、高価なフローセルとオリフィス部品の利用を排除して、高速な解析、安全で高速で安価な分取、を行うことができる微小粒子分取装置を提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本発明は、微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に液滴として排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、オリフィスよりも送液方向上流において流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する２以上の容器と、を備え、前記マイクロチップは、オリフィス部位の流路幅及び流路深さが、光学検出手段による微小粒子の光学特性検出が行われる部位の流路幅及び流路深さよりも小さく形成されると共に、前記光学特性検出が行われる部位と前記オリフィス部位との間は、前記流路の前記送液方向に対する垂直断面の面積が流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されており、前記オリフィスから吐出された前記液滴は前記容器の何れか一つへ回収される微小粒子分取装置を提供する。
この微小粒子分取装置では、前記流路の前記光学特性検出が行われる部位と前記オリフィス部位との間に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた昇圧部が形成されていることが好適である。
また、前記昇圧部において前記液体の層流幅が等方的に縮小されることが好ましい。
さらに、前記流路の前記光学特性検出部が行われる部位より送液方向上流に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた絞込部が形成されていることが好適となる。
この微小粒子分取装置は、光学検出手段による微小粒子の光学特性検出が行われる部位よりも送液方向上流において、流路を通流する液体Ｔの層流中に、微小粒子を含む他の液体Ｓの層流を導入する微小管を備えることができる。
また、この微小管を、電圧を印加可能な金属により形成することにより、微小管を荷電手段として構成することができる。
この微小粒子分取装置では、マイクロチップの少なくともオリフィス部分と、オリフィスからチップ外に吐出された液滴が移動する空間と、が光学検出手段からの光に対して光透過性を有するカートリッジ内空に構成されていることが好適となる。
さらに、このカートリッジは、内空が密閉可能に構成されていることが好適である。
本発明は、また、微小粒子の分取のために用いられるマイクロチップであって、微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設され、流路の所定部位が、通流する微小粒子の光学特性を検出するための光学検出手段からの光が照射される光照射部として構成され、オリフィス部位の流路幅及び流路深さが、光照射部の流路幅及び流路深さよりも小さく形成されると共に、前記光照射部と前記オリフィス部位との間は、前記流路の送液方向に対する垂直断面の面積が流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されているマイクロチップを提供する。
このマイクロチップでは、前記流路の前記光照射部と前記オリフィス部位との間に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた昇圧部が形成されていることが好適である。
また、前記昇圧部において前記液体の層流幅が等方的に縮小されることが好ましい。
さらに、前記流路の前記光照射部より送液方向上流に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた絞込部が形成されていることが好適となる。
このマイクロチップは、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出させるための振動素子を備えることができる。
このマイクロチップでは、前記光照射部よりも送液方向上流に、流路を通流する液体Ｔの層流中に、微小粒子を含む他の液体Ｓの層流を導入する微小管が配設され、該微小管が、電圧を印加可能な金属により形成されていることが好適である。
本発明は、さらに、上記のマイクロチップの少なくともオリフィス部分と、オリフィスからチップ外に吐出された液滴が移動する空間と、が内空に構成され、光学検出手段からの光を光照射部に透過させる光透過性を有するカートリッジを提供する。
このカートリッジは、内空が密閉可能に構成されていることが好適である。
本発明により、サンプル間のクロスコンタミネーションやサンプルの汚染、使用者へのバイオハザード、高価なフローセルとオリフィス部品の利用を排除して、高速な解析、安全で高速で安価な分取、を行うことができる微小粒子分取装置が提供される。
本発明に係る微小粒子分取装置Ａの概略構成を示す図である。 微小粒子分取装置Ａの概略構成を模式的に示す図である。 マイクロチップ１と振動素子２の概略構成を示す図である。 微小管１６配設部位及び絞込部１７近傍の流路１１の構造と、通流するサンプル液層流及びシース液層流の様子を説明する断面模式図である。 昇圧部１３及びオリフィス１２近傍の流路１１の構造と、通流するサンプル液層流及びシース液層流の様子を説明する断面図模式図である。 オリフィス１２から液滴化されて吐出されるサンプル液及びシース液を模式的に示す図である。 流路１１の幅及び深さを説明する断面模式図である。（Ａ）は微小管１６の開口位置、（Ｂ）は光照射部３３、（Ｃ）はオリフィス１２部位における流路１１の断面を示す。 流路１１の幅及び深さについて他の好適な実施形態を説明する図である。 微小粒子分取装置Ａによる微小粒子の分取を模式的に示す図である。 本発明に係るカートリッジの第一実施形態を説明する図である。 本発明に係るカートリッジの第二実施形態を説明する図である。 本発明に係るカートリッジの第三実施形態を説明する図である。 本発明に係るカートリッジの第四実施形態を説明する図である。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。

１．微小粒子分取装置
２．マイクロチップ
（１）流路
（２）微小管と絞込部
（３）光照射部
（４）昇圧部とオリフィス
３．振動素子
４．マイクロチップの各部位における流路幅及び深さ
５．微小流分取装置の動作
６．カートリッジ
１．微小粒子分取装置
図１は、本発明に係る微小粒子分取装置の概略構成を示す図である。図中、符号Ａで示す微小粒子分取装置は、マイクロチップ１を構成要素とするカートリッジ７と、マイクロチップ１の所定部位に光を照射する光学検出手段３を備える装置本体と、から大略構成されている。マイクロチップ１は、一部がカートリッジ外に露出し、残りの部分がカートリッジ７内に収容された状態となっている。カートリッジ７の内部には、一対の対電極４，４が配設されている。また、カートリッジ７のマイクロチップ１の反対側には、３つの容器（符号５１，５２，５３）が、各容器の内部がカートリッジ内空と連通するように、接続されている。マイクロチップ１及び対電極４，４、容器５１〜５３を構成要素とするカートリッジ７は、微小粒子分取装置Ａ本体に着脱可能に取り付けられている。微小粒子分取装置Ａ本体には、カートリッジ７の取り付け時において、マイクロチップ１の一部に当接する位置に振動素子（不図示）が配設されている。
微小粒子分取装置Ａの構成について、図２を参照しながらさらに詳しく説明する。図２は、微小粒子分取装置Ａの概略構成を模式的に示す図である。図には、上述したマイクロチップ１と光学検出手段３、対電極４，４、容器５１〜５３が示されている。図中、符号２は、微小粒子分取装置Ａ本体へのカートリッジ７の取り付け時において、マイクロチップ１の一部に当接するように配設された振動素子を示している。また、符号６，６は、接地されたグランド接地対電極を示す。なお、ここでは、カートリッジ７の図示を省略した。
マイクロチップ１には、分取対象とする微小粒子を含む液体（サンプル液）が通流される流路１１が形成されている。光学検出手段３は、流路１１の所定部位に光（測定光）を照射し、流路１１を通流する微小粒子から発生する光（測定対象光）を検出する。以下、流路１１において光検出手段３からの測定光が照射される部位を「光照射部」というものとする。
マイクロチップ１は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳなど）により形成できる。マイクロチップの材質は、光学検出手段３から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
マイクロチップ１への流路１1の成形は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、機械加工によって行うことができる。マイクロチップ１は、流路１１等を成形した基板を、同じ材質又は異なる材質の基板で封止することで形成することができる。
光学検出手段３は、従来のフローサイトメトリーと同様に構成することができる。具体的には、レーザー光源と、微小粒子に対しレーザー光を集光・照射するための集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、レーザー光の照射によって微小粒子から発生する測定対象光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成される。なお、図２では、照射系と検出系を別体に構成した場合を示しているが、照射系と検出系は同一の光学経路により構成してもよい（図１参照）。
光学検出手段３の検出系により検出される測定対象光は、測定光の照射によって微小粒子から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。これらの測定対象光は電気信号に変換され、微小粒子の光学特性はこの電気信号に基づいて検出される。
光照射部を通過したサンプル液は、流路１１の一端に設けられたオリフィスからチップ外の空間に排出される。この際、振動素子２によってマイクロチップ１を振動させることで、サンプル液を液滴化してチップ外の空間に吐出することができる。図２中、符号Ｄは、チップ外の空間に吐出された液滴を示している。
液滴Ｄには、分取対象とする微小粒子が含まれ得る。対電極４，４は、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って配設されており、移動する液滴を挟んで対向するように配置されている。吐出された液滴には不図示の荷電手段によって電荷が付与され、対電極４，４は液滴に付与された電荷との電気的な反発力（又は吸引力）によって液滴の移動方向を制御し、液滴を容器５１〜５３のいずれかに誘導する。なお、液滴を回収する容器５２と５３は、図示したような、通常利用されるプラスチック製の試験管容器などでもよいし、プラスチック基板上に９６個のウェルなどが設けられている分注プレート容器などでもよい。
微小粒子分取装置Ａは、このように、光学検出手段３による微小粒子の特性検出までをマイクロチップ１において行い、その後、微小粒子の移動方向の制御をチップ外の空間において行うことを特徴としている。微小粒子分取装置Ａでは、光学検出手段３により検出された微小粒子の光学特性に基づいて、その微小粒子が含まれる液滴の移動方向を対電極４，４により制御することで、所望の特性を備えた微小粒子を容器５１〜５３のいずれかに回収し、分取することができる。
なお、微小粒子分取装置Ａにおいて、光学検出手段３は、例えば、電気的又は磁気的な検出手段に置換されてもよい。微小粒子の特性を電気的又は磁気的に検出する場合には、流路１１に両側に微小電極を対向させて配設し、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、あるいは、磁化、磁界変化、磁場変化等を測定する。この場合、微小粒子の分取は、微小粒子の電気的又は磁気的な特性に基づいて行われる。
以下、微小粒子分取装置Ａの各構成の詳細とその機能について順に説明する。まず、図３〜図８を参照して、マイクロチップ１と振動素子２について説明する。
２．マイクロチップ
（１）流路
図３は、マイクロチップ１と振動素子２の概略構成を示す図である。マイクロチップ１には、サンプル液が導入されるサンプルインレット１５と、シース液が導入されるシース液インレット１４が形成されている。シース液インレット１４に導入されたシース液は、Ｙ軸正方向及び負方向の２方向に分岐して流路１１を送液され、略９０度に２回折り曲げられた後に合流し、下流に送液される
（２）微小管と絞込部
流路１１のシース液が合流する部位には、サンプルインレット１５から導入されたサンプル液をシース液層流中に導入するための微小管１６が配設されている。サンプル液の層流は、微小管１６内を通流して、シース液インレット１４から導入されて流路１１を通流するシース液層流中に導入される。これにより、サンプル液層流を、周囲がシース液層流によって取り囲まれた状態で、流路１１下流に送液することができる。
微小管１６は、電圧を印加可能な金属で形成されており、流路１１を通流するシース液及びサンプル液に対し、正又は負の電荷を付与する荷電手段として構成されている。サンプル液及びシース液は、流路１１の一端に設けられたオリフィス１２において液滴化され、チップ外の空間に吐出される。このとき、微小管１６に電圧を印加することで、吐出される液滴に正又は負の電荷を付与することができる。
図３中、符号１７は、流路１１に設けられた絞込部を示す。絞込部１７は、送液方向に対する垂直断面の面積が、流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されている。
図４は、微小管１６の配設部位と絞込部１７の近傍の流路１１の構造と、通流するサンプル液層流及びシース液層流の様子を説明する断面模式図である。（Ａ）は水平断面図（ＸＹ断面図）、（Ｂ）は垂直断面図（ＺＸ断面図）を示す。図中、符号Ｓはサンプル液層流、符号Ｔはシース液層流を示し、符号Ｐはサンプル液に含まれる分取対象微小粒子を示している。
サンプル液層流Ｓは、微小管１６によって流路１１を通流するシース液層流Ｔ中に導入され、図に示すように、シース液層流Ｔで取り囲まれた状態（３次元層流）となって送液されている。
絞込部１７の流路側壁は送液方向に従って図中Ｙ軸方向に狭窄するように形成されており、絞込部１７はその上面視において次第に細くなる錘形とされている。この形状によって、絞込部１７は、シース液とサンプル液の層流幅を図中Ｙ軸方向に絞り込んで送液する。また、絞込部１７は、その流路底面が上流から下流に向かって深さ方向（Ｚ軸正方向）に高くなる傾斜面となるように形成されており、同方向にも層流幅の絞り込みを行う。
このように、サンプル液層流Ｓがシース液層流Ｔによって取り囲まれた３次元層流を形成し、この３次元層流の層流幅を絞り込んで送液することにより、絞り込まれたサンプル液層流Ｓ中に微小粒子Ｐをひとつずつ配列させて送流することができる。そして、流路１１内における微小粒子Ｐの送流位置を位置決めして、光学検出手段３からの測定光を精度良く微小粒子Ｐに照射することが可能となる。
特に、絞込部１７によれば、マイクロチップ１の水平方向（図４（Ａ）Ｙ軸方向）のみならず、垂直方向（同（Ｂ）Ｚ軸方向）にもサンプル液層流Ｓの層流幅を絞り込むことができるため、流路１１の深さ方向における測定光の焦点位置を微小粒子Ｐの送流位置と精緻に一致させることできる。このため、微小粒子Ｐに精度良く測定光を照射して高い測定感度を得ることが可能となる。
ここで、流路１１を十分に細い流路として形成し、この流路１１を通流するシース液層流Ｔ中に、径の小さい微小管１６を用いてサンプル液層流Ｓを導入すれば、予め層流幅が絞り込まれた３次元層流を形成することも可能と考えられる。しかしながら、この場合には、微小管１６の径を小さくすることによって、微小管１６に微小粒子Ｐが詰まる可能性がある。
マイクロチップ１では、絞込部１７を設けたことにより、サンプル液中に含まれる微小粒子Ｐの径に対して十分に大きい径の微小管１６を用いて３次元層流の形成を行った後に、層流幅の絞り込みを行うことができる。従って、上記のような微小管１６の詰まりの問題が生じない。
図４では、微小管１６を、その中心が流路１１の中心と同軸上に位置するように配設した場合を示した。この場合、サンプル液層流Ｓは、流路１１を通流するシース液層流Ｔの中心に導入されることになる。シース液層流Ｔ中におけるサンプル液層流Ｓの位置は、流路１１内における微小管１６の開口位置を調節することによって任意に設定することができる。また、層流幅の絞込みのためには、絞込部１７は、送液方向に対する垂直断面の面積が、流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されていればよく、図４に示した形状に限られず、例えば流路底面及び上面の両方を傾斜面として形成し絞り込みを行うこともできる。
微小管１６の内径は、分取対象とする微小粒子Ｐの径に応じて適宜設定することができる。例えば、サンプル液として血液を用い、血球細胞の分析を行う場合には、好適な微小管１６の内径は１０〜５００μｍ程度である。また、微小管１６の開口位置における流路１１の幅及び深さは、微小粒子Ｐの径を反映した微小管１６の外径に応じて適宜設定すればよい。例えば、微小管１６の内径が１０〜５００μｍ程度である場合、微小管１６の開口位置における流路１１の幅及び深さはそれぞれ１００〜２０００μｍ程度が好適である。なお、微小管の断面形状は、円形以外にも、楕円形や四角形、三角形など任意の形状とすることができる。
絞込部１７における絞り込み前のサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、流路１１の幅及び深さと微小管１６の径に依存して変化し得るが、絞込部１７の送液方向に対する垂直断面の面積を適宜調整することによって任意の層流幅にまで絞り込むことができる。例えば、図４（Ｂ）において、絞込部１７の流路長をＬ、流路底面の傾斜角度をθ３とした場合、絞込部１７における３次元層流の絞り込み幅はＬ・ｔａｎθ３となる。従って、流路長L及び傾斜角度θ３を適宜調整することによって任意の絞り込み幅を設定することが可能である。さらに、図４（A）中、絞込部１７流路側壁のＹ軸方向における狭窄角度をそれぞれθ１、θ２とし、これらと上記θ３を「θ３＝２×θ１、θ１＝θ２」となるように形成することで、サンプル液層流Sとシース液層流Tを等方的に縮小して、微小管１６により形成された３次元層流を乱すことなく層流幅を絞り込むことができる。
（３）光照射部
図３中、符号３３は、光学検出手段３からの測定光が照射される光照射部を示す。光照射部３３では、光学検出手段３からの測定光の照射によって微小粒子から発生する測定対象光の検出が行われる。
既に説明したように、光照射部３３では、絞込部１７によってサンプル液層流及びシース液層流の層流幅が絞り込まれているため、流路１１内におけるサンプル液層流Ｓの送流位置に測定光の焦点位置を精緻に一致させ、微小粒子に精度良く測定光を照射することが可能である。
光照射部３３におけるサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、絞込部１７の送液方向に対する垂直断面の面積を適宜調整することによって任意の層流幅とすることができるが、流路１１の幅及び深さでそれぞれ２０〜２０００μｍ程度が好適である。
（４）昇圧部とオリフィス
図３中、符号１２は、光照射部３３を通過したシース液及びサンプル液をチップ外の空間に排出するオリフィスを示す。シース液及びサンプル液は、次に説明する振動素子２の作用によってオリフィス１２で液滴化され、チップ外に吐出される。
符号１３は、オリフィス１２よりも上流であって、光照射部３３よりも下流の流路１１に設けられた昇圧部を示す。昇圧部１３は、送液方向に対する垂直断面の面積が、流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されている。すなわち、絞込部１７と同様に、流路側壁が送液方向に従って図中Ｙ軸方向に狭窄するように形成されており、流路底面が上流から下流に向かって深さ方向（Ｚ軸正方向）に高くなる傾斜面となるように形成されている。
図５は、昇圧部１３とオリフィス１２の近傍の流路１１の構造と、通流するサンプル液層流及びシース液層流の様子を説明する断面図模式図である。（Ａ）は水平断面図（ＸＹ断面図）、（Ｂ）は垂直断面図（ＺＸ断面図）を示す。図中、符号Ｓはサンプル液層流、符号Ｔはシース液層流を示し、符号Ｐはサンプル液に含まれる分取対象微小粒子を示している。
サンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔは、昇圧部１３において図中Ｙ軸方向及びＺ軸方向に層流幅を絞り込まれて送液されている。この層流幅の絞り込みによって、昇圧部１３は、サンプル液及びシース液の流路１１内における送液圧を高め、これらを高圧でオリフィス１２から排出するために機能する。この昇圧部１３の機能により、オリフィス１２で液滴化される際に、より高い周波数で液滴を形成することが可能となり、高速の分取が可能となる。図３及び図５中、吐出された液滴の移動方向を符号Ｆで示す。
オリフィス１２部位のサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、昇圧部１３の送液方向に対する垂直断面の面積を適宜調整することによって任意の層流幅にまで絞り込むことができる。例えば、図５（Ｂ）において、昇圧部１３の流路長をｌ、流路底面の傾斜角度をθ３とした場合、昇圧部１３における３次元層流の絞り込み幅はＬ・ｔａｎθ３となる。従って、流路長ｌ及び傾斜角度θ３を適宜調整することによって任意の絞り込み幅を設定することが可能である。オリフィス１２部位におけるサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、オリフィス１２部位の幅及び深さでそれぞれ２０〜５００μｍ程度が好適である。
なお、サンプル液層流Ｓとシース液層流Ｔの層流幅の絞り込みは、昇圧部１３の流路底面及び上面の両方を傾斜面として行うこともでき、昇圧部１３の形状は図に示す形状に限定されない点は、絞込部１７に同じである。また、図５（A）中、昇圧部１３流路側壁のＹ軸方向における狭窄角度θ１、θ２及びＺ軸方向における狭窄角度θ３を、「θ３＝２×θ１、θ１＝θ２」となるように形成することで、微小管１６により形成された３次元層流を等方的に縮小し、乱すことなく層流幅を絞り込むことができる点も、絞込部１７で説明した通りである。
３．振動素子
図３中、符号２は、微小粒子分取装置Ａ本体へのカートリッジ７の取り付け時（図１参照）において、マイクロチップ１の一部に当接する振動素子を示している。ここでは、振動素子２を微小粒子分取装置Ａ本体側に配設した場合として説明するが、振動素子２はマイクロチップ１の内部構成としてチップと一体に設けられるものであってもよい。
振動素子２は、マイクロチップ１を所定周波数で振動させることにより、オリフィス１２においてサンプル液及びシース液を液滴化してチップ外の空間に吐出させる。このような振動素子を用いたサンプル液及びシース液の液滴化は、従来のフローセルを用いたフローサイトメトリーと同様にして行うことができる。振動素子２は、例えば、インクジェットプリンタにも採用されるピエゾ振動素子等によって構成される。
図６は、オリフィス１２から液滴化されて吐出されるサンプル液及びシース液を模式的に示す図である。微小粒子Ｐを含むサンプル液層流Ｓは、シース液層流Ｔとともに、オリフィス１２において液滴化され、液滴Ｄとなって図中矢印Ｆ方向に吐出される。
振動素子２は、所定の周波数でマイクロチップ１を振動させることにより、図に示すように、吐出される各液滴Ｄに微小粒子Ｐがひとつずつ含まれるようにサンプル液及びシース液を液滴化する。この際、振動素子２の周波数は、光照射部３３において光学検出手段３により検出される微小粒子Ｐの送流速度（流速）及び送液圧力、マイクロチップ１の共振周波数等に基づいて設定される。また、振動素子２の周波数は、オリフィス１２部位における流路１１の幅と深さ（すなわち、垂直断面の面積）によっても設定される。
４．マイクロチップの各部位における流路幅及び深さ
図７は、流路１１の各部位における幅及び深さを説明する断面模式図である。図は、流路１１のＹＺ断面を示し、（Ａ）は微小管１６の開口位置、（Ｂ）は光照射部３３、（Ｃ）はオリフィス１２部位における流路１１の断面を示す。
図７（Ａ）に示すように、微小管１６の開口位置では、サンプル液層流Ｓとシース液層流Ｔは、サンプル液層流Ｓの周囲をシース液層流Ｔが取り囲んだ３次元層流として送液されている。既に説明したように、微小管１６の開口位置における流路１１の幅及び深さは、微小粒子Ｐの径を反映した微小管１６の外径に応じて適宜設定され、例えば、１００〜２０００μｍ程度とされる。
微小管１６により形成された３次元層流は、絞込部１７によって層流幅を絞り込まれた状態で光照射部３３に送液されてくる（図７（Ｂ）参照）。絞込部１７によって層流幅を絞り込むことにより、光照射部３３には、サンプル液層流Ｓ中に微小粒子Ｐがひとつずつ配列されて送流されてくる。
光照射部３３におけるサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、絞込部１７の送液方向に対する垂直断面の面積を適宜調整することによって任意に設定できる。光照射部３３における流路１１の幅（Ｗ）及び深さ（Ｈ）は、光検出手段３による光学的検出角度（光学系の開口数）を十分大きくするため、それぞれ２０〜２０００μｍ程度とすることで、光学的検出角度δ及び開口数を十分に大きくとることが可能となる。
さらに、光照射部３３における流路１１の形状は、深さ（Ｈ）に対して幅（Ｗ）を大きくし、光検出手段３による測定光の照射方向に対して長方形形状とすることが好ましい。光照射部３３における流路１１をこのような幅広な形状とすることで、光学系の開口数をより大きくとることが可能となる。
光照射部３３を通過したサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔは、昇圧部１３によって、図７（Ｃ）に示すように再度層流幅を絞り込まれてオリフィス１２に送液される。昇圧部１３よって層流幅を絞り込むことにより、オリフィス１２からのサンプル液及びシース液の排出圧を高めることができる。
オリフィス１２部位におけるサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅は、昇圧部１３の送液方向に対する垂直断面の面積を適宜調整することによって任意に設定できる。オリフィス１２において、高速で高周波の液滴を形成するためには、オリフィス１２部位におけるサンプル液層流Ｓ及びシース液層流Ｔの層流幅を小さくして、サンプル液及びシース液の排出圧を十分に高めることが好ましい。このため、オリフィス１２の開口における流路１１の幅（ｗ）及び深さ（ｈ）は、光照射部３３における幅（Ｗ）及び深さ（Ｈ）よりも小さくする。あるいは、オリフィス１２の開口における流路１１の断面面積を、光照射部３３における断面面積よりも小さくする。したがって、オリフィス１２の開口における流路１１の幅（ｗ）及び深さ（ｈ）は、それぞれ２０〜５００μｍ程度とすることが好適となる。
ここでは、微小管１６により形成された３次元層流の層流幅を、まず絞込部１７によって光照射部３３における微小粒子の光学検出に適した幅とし、次いで昇圧部１３によって高周波の液滴形成が可能な幅とする場合を説明した。流路１１における層流幅の絞り込みは、絞込部１７及び昇圧部１３の２段階で行う必要はなく、例えば図８に示すように、流路１１の微小管１６の開口位置からオリフィス１２までの間で、連続して徐々に流路幅及び深さ、あるいは流路断面面積が小さくなるようにして行うこともできる。
この他、流路１１の形状は、微小管１６の開口位置、光照射部３３及びオリフィス１２部位における流路幅及び深さが上記の好適な数値範囲とされる限りにおいて、、あるいは流路断面面積が上記の大小関係を満たす限りにおいて、様々な形状に形成され得るものとする。
また、オリフィス１２の開口の形状は、正方形や長方形、円形などの任意の形状とすることが可能である。さらに、図８に示すように、開口部の端面部分を逆テーパ形状に形成することもできる。オリフィス１２の開口端面部分を、このようなラッパ形状とすることで、形成される液滴の水切れをよくすることができる。
５．微小粒子分取装置の動作
続いて、微小粒子分取装置Ａの動作について図９を参照しながら説明する。
流路１１の光照射部を通過したサンプル液及びシース液は、オリフィス１２からチップ外の空間に排出される。光照射部では、光学検出手段によって、微小粒子の光学特性の検出と同時に、微小粒子の送流速度（流速）及び微小粒子の間隔等の検出が行われている。検出された微小粒子の光学特性、流速及び間隔等は、電気的信号に変換され装置の全体制御部（不図示）に出力される。全体制御部は、この信号に基づいて振動素子２の振動数を制御し、オリフィス１２において形成される液滴Ｄ中に微小粒子Ｐがひとつずつ含まれるようにマイクロチップ１を振動させる。
さらに、全体制御部は、微小管１６に印加される電圧を、振動素子２の振動周波数に同調させて制御することにより、流路１１を通流するシース液及びサンプル液に付与される電荷の正負を切り換え、オリフィス１２において形成される液滴Ｄに正又は負の電荷を付与する。光学検出手段によって検出された微小粒子の光学特性は、電気信号に変換されて全体制御部に出力されており、全体制御部は、この信号に基づいて微小管１６に印加される電圧を制御し、各液滴に含まれる微小粒子の光学特性に応じて液滴に付与する電荷を決定する。具体的には、全体制御部は、例えば、所望の特性を有する分取対象微小粒子を含む液滴を正に、分取対象微小粒子を含まない液滴を負に帯電させる。
この際、液滴Ｄの荷電状態を安定化させるため、微小粒子分取装置Ａでは、オリフィス１２近傍に、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、グランド接地対電極６，６を配置している。グランド接地電極６，６は、移動する液滴を挟んで対向するように配置されており、微小粒子の移動方向を制御するための対電極４１，４２とオリフィス１２との間に配設される。
オリフィス１２から荷電されて吐出される液滴Ｄは、対電極４１，４２との間に作用する電気的力によって移動方向を制御される。この際、移動方向の制御を正確に行うためには、安定した電荷が液滴に付与されていることが必要である。対電極４１，４２には、非常に高い電圧が印加されるため、対電極４１，４２の高電位が、オリフィス１２において微小管１６から液滴Ｄに付与される電荷に影響を与えると、液滴Ｄの荷電状態が不安定になるおそれがある。そこで、微小粒子分取装置Ａでは、オリフィス１２と対電極４１，４２との間に接地されたグランド接地電極６，６を配することで、このような対電極４１，４２の高電位による影響を排除している。
オリフィス１２から吐出される液滴Ｄの移動方向の制御は、例えば、以下のように行われる。すなわち、所望の特性を有する分取対象微小粒子が含まれる液滴を正に、分取対象微小粒子を含まない液滴を負に帯電させる先の例では、対電極４１を正に、対電極４２を負に帯電させることにより、分取対象微小粒子のみを容器５３に分取することができる。具体的には、正電荷が付与された分取対象微小粒子を含む液滴は、対電極４１との電気的反発力及び対電極４２との電気的吸引力によって、移動方向を矢印ｆ３方向に制御され容器５３に誘導される。一方、負電荷が付与された分取対象微小粒子を含まない液滴は、動方向を矢印ｆ２方向に制御され容器５２に誘導される。
あるいは、例えば、所望の特性を有する分取対象微小粒子が含まれる液滴に電荷を付与せず、分取対象微小粒子を含まない液滴を正又は負に帯電させ、対電極４１，４２を正又は負に帯電させれば、分取対象微小粒子のみを容器５１に分取することができる。その他、液滴Ｄに付与する電荷と、対電極４１，４２による液滴の移動方向の制御は、従来のフローサイトメトリーと同様に様々な組合せにおいて行うことができる。なお、液滴Ｄを回収するための容器は２以上設けられ、３つに限定されることはないものとする。さらに、これらの容器は、回収した液滴を貯留することなく排出する排出路として構成されていてもよく、回収された分取対象でない微小粒子が破棄されるようにしてもよい。
ここでは、液滴Ｄに、その液滴に含まれる微小粒子の特性に基づいて正又は負の電荷を切り換えて付与して分取を行う場合を例に説明した。液滴の分取は、液滴Ｄには全てに正又は負のどちらかに帯電させ、対電極４１，４２に印加する電圧のほうを微小粒子の特性に基づいて切り換えることにより行うこともできる。また、光学検出手段を電気的又は磁気的な検出手段に置換した場合にも、微小粒子の電気的又は磁気的特性に基づき同様にして液滴の移動方向を制御することで、所望の特性を備えた微小粒子を容器５１〜５３のいずれかに回収し、分取することが可能である。
以上のように、微小粒子分取装置Ａによる微小粒子の分取は、光学検出手段３による微小粒子の特性検出までをマイクロチップ１において行い、その後、微小粒子の移動方向の制御をチップ外の空間に吐出された液滴として行うことを特徴としている。
先に説明したように、従来のフローセルを用いたフローサイトメトリーでは、層流形成のための流路系を構成するフローセル部品と、液滴を形成するためのオリフィス部品が、高価で、それぞれの位置を層流が乱れないように微調整（アライメント）する必要があり、使い捨て可能な構成とされていないため、サンプル間のクロスコンタミネーションが生じるおそれがあった。これに対して、微小粒子分取装置Ａでは、層流形成及び微小粒子の特性検出を、フローセル部品とオリフィス部品を一体としたディスポーザブルユースが可能なマイクロチップ１において行うため、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションが生じない。さらに、従来のようなアライメントが不要になり、使用者がより簡便に分取を行うことが可能となる。
また、微小粒子分取装置Ａでは、微小粒子の移動方向の制御をチップ外の空間で行うことで、従来のμ−ＴＡＳを応用したフローサイトメトリーのように、微小粒子の移動方向の制御を通流する液体中で行う必要がなく、より高い分取速度を達成することができる。さらに、微小粒子分取装置Ａでは、流路１１内においてサンプル液及びシース液の送液圧を十分に高め、オリフィス１２から高速で高周波の液滴を吐出することが可能であり、高い分取速度が得られる。
６．カートリッジ
さらに、微小粒子分取装置Ａでは、液滴の移動方向の制御が行われる空間を、密閉可能なカートリッジ７（図１参照）内空に構成することが好適となる。すなわち、図１０に示すように、マイクロチップ１の少なくともオリフィス１２部分と、オリフィス１２からチップ外に吐出された液滴Ｄが移動する空間と、はカートリッジ７内の気密空間に配されることが望ましい。このとき、オリフィス１２での液滴形成が阻害されないように、マイクロチップ１は、振動素子２からの振動によりオリフィス１２部分が所定の振動数で振動できるようにカートリッジ７に取り付けられる。具体的には、マイクロチップ１は、オリフィス１２とは反対端側でカートリッジ７に固定され、オリフィス１２端側はカートリッジ７と接触していないことが望ましい。
カートリッジ７の内空には、液滴の移動方向制御のための対電極４，４及びグランド接地電極６，６が配設されている。液滴を回収するための容器５１〜５３は、カートリッジ７に着脱可能に取り付けられており、取り付け時においてカートリッジ７の内空に気密に接続するようにされている。
このように、液滴が吐出されるオリフィス１２から、液滴が回収される容器５１〜５３までの空間を密閉可能なカートリッジ７内空に構成することで、オリフィスから液滴を形成する際に発生する微小液滴（エアロゾル）等の汚染物質がサンプルに混入することを防止できる。また、同時に、液滴や液滴形成時に発生するエアロゾルをカートリッジ７内に閉じ込めることができ、感染性の細胞などの危険性を伴う微小粒子を分取する場合に、使用者に対する暴露や環境の汚染を防止できる。
カートリッジ７は、マイクロチップ１と同様に、全体をガラスや各種プラスチックにより形成し、光学検出手段からの測定光に対して光透過性を有することが望ましい。あるいは、図に示すように、マイクロチップ１の光照射部に対応する位置に光学窓３４を設けて、この光学窓３４部分のみに測定光に対する透過性を付与してもよい。あるいは、光学窓３４をカートリッジ７の一部をくり抜いて設けた場合には、光学検出手段として開口数が高く、動作距離が小さい対物レンズを用いた場合にも、対物レンズがマイクロチップ１の光照射部面に近接することができる。この場合、開放された光学窓からの汚染を防止するため、マイクロチップ１のオリフィス１２端を細く形成し、図１１に示すように、マイクロチップ１と液滴の移動方向の制御が行われる空間との接続口の開口を小さくすることが望ましい。マイクロチップ１のオリフィス１２端を細く形成することで、図１０に比べて接続口の開口を小さくすることができる。さらに、細く形成したオリフィス１２端を液滴の移動方向の制御が行われる空間内に挿入することで、液滴や液滴形成時に発生するエアロゾルの封止効率を高めることができる。
カートリッジ７内の気密性をさらに高めるためには、光学窓３４は、ガラス等の光透過性の材質によって形成されることが好ましい。この場合、光学窓３４は、例えば、表面に反射防止膜や反射防止ナノ構造を形成したプラスチックや、石英等の高透過材料によって形成し、光学窓の厚さを可能な限り薄く形成して、光学損失ができるだけ小さくなるようにする。
図１２及び図１３、カートリッジ７の他の好適な実施形態を示す図である。図１２に示すように、液滴の移動方向の制御を行う対電極４，４及びグランド接地対電極６，６は、微小粒子分取装置Ａ本体側に設けることもできる。この場合、カートリッジ７に嵌め込み穴を設け、装置本体への取り付け時において、この嵌め込み穴に対電極４，４及びグランド接地対電極６，６が挿入されるようにする。嵌め込み穴に挿入された状態において、対電極４，４及びグランド接地対電極６，６は、マイクロチップ１のオリフィスから吐出される液滴の移動方向に沿って配置される。
また、図１３に示すように、カートッジ７には、マイクロチップ１にサンプル液を供給するためのサンプル液リザーバ８を設けてもよい。サンプル液リザーバ８からのサンプル液は、サンプル液インレット１５からマイクロチップ１に供給される。これにより、サンプル液の供給路についても、ディスポーザブルユースが可能な構成とでき、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションを一層防止できる。
Ａ 微小粒子分取装置
Ｄ 液滴
Ｐ 微小粒子
Ｓ サンプル液層流
Ｔ シース液層流
１ マイクロチップ
１１ 流路
１２ オリフィス
１３ 昇圧部
１４ シース液インレット
１５ サンプル液インレット
１６ 微小管
１７ 絞込部
２ 振動素子
３ 光学検出手段
３３ 光照射部
３４ 光学窓
４、４１、４２ 対電極
５１、５２、５３ 容器
６ グランド接地電極
７ カートリッジ
８ サンプル液リザーバ

Claims (16)

  1. 微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、
    オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、
    吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、
    オリフィスよりも送液方向上流において流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、
    チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、
    対電極間を通過した液滴を回収する二以上の容器と、を備え、
    前記マイクロチップは、オリフィス部位の流路幅及び流路深さが、光学検出手段による微小粒子の光学特性検出が行われる部位の流路幅及び流路深さよりも小さく形成されると共に、
    前記光学特性検出が行われる部位と前記オリフィス部位との間は、
    前記流路の前記送液方向に対する垂直断面の面積が流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されており、
    前記オリフィスから吐出された前記液滴は前記容器の何れか一つへ回収される
    微小粒子分取装置。
  2. 前記流路の前記光学特性検出が行われる部位と前記オリフィス部位との間に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた昇圧部が形成された請求項１に記載の微小粒子分取装置。
  3. 前記昇圧部において前記液体の層流幅が等方的に縮小される請求項２に記載の微小粒子分取装置。
  4. 前記流路の前記光学特性検出部が行われる部位より送液方向上流に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた絞込部が形成された請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小粒子分取装置。
  5. 光学検出手段による微小粒子の光学特性検出が行われる部位よりも送液方向上流において、流路を通流する液体Ｔの層流中に、微小粒子を含む他の液体Ｓの層流を導入する微小管を備える請求項１〜４のいずれか一項に記載の微小粒子分取装置。
  6. 電圧を印加可能な金属により形成した微小管を荷電手段として構成した請求項５に記載の微小粒子分取装置。
  7. マイクロチップの少なくともオリフィス部分と、オリフィスからチップ外に吐出された液滴が移動する空間と、が光学検出手段からの光に対して光透過性を有するカートリッジ内空に構成されている請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小粒子分取装置。
  8. カートリッジ内空が密閉可能に構成されている請求項７に記載の微小粒子分取装置。
  9. 微小粒子の分取のために用いられるマイクロチップであって、
    微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設され、
    流路の所定部位が、通流する微小粒子の光学特性を検出するための光学検出手段からの光が照射される光照射部として構成され、
    オリフィス部位の流路幅及び流路深さが、光照射部の流路幅及び流路深さよりも小さく形成されると共に、
    前記光照射部と前記オリフィス部位との間は、
    前記流路の送液方向に対する垂直断面の面積が流路上流から下流へ次第に小さくなるように形成されている
    マイクロチップ。
  10. 前記流路の前記光照射部と前記オリフィス部位との間に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた昇圧部が形成された請求項９に記載のマイクロチップ。
  11. 前記昇圧部において前記液体の層流幅が等方的に縮小される請求項１０に記載のマイクロチップ。
  12. 前記流路の前記光照射部より送液方向上流に、流路側壁、流路底面及び流路上面の全てが傾斜面とされた絞込部が形成された請求項９〜１１のいずれか一項に記載のマイクロチップ。
  13. オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出させるための振動素子を備える請求項９〜１２のいずれか一項に記載のマイクロチップ。
  14. 前記光照射部よりも送液方向上流に、流路を通流する液体Ｔの層流中に、微小粒子を含む他の液体Ｓの層流を導入する微小管が配設されており、該微小管が、電圧を印加可能な金属により形成されている請求項９〜１３のいずれか一項に記載のマイクロチップ。
  15. 請求項９〜１４のいずれか一項に記載のマイクロチップの少なくともオリフィス部分と、オリフィスからチップ外に吐出された液滴が移動する空間と、が内空に構成され、光学検出手段からの光を光照射部に透過させる光透過性を有するカートリッジ。
  16. 内空が密閉可能に構成されている請求項１５に記載のカートリッジ。
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