JP5497653B2 - 成分の制御送達のための生体材料 - Google Patents

Description

本発明は、水性相と、ポリマーのネットワークと、該ネットワークに含まれる第２のポリマーと、第２のポリマーを分解するための少なくとも１種の酵素とを含む生体材料に関する。

本発明はまた、該生体材料を調製する方法にも関する。
本発明は、特に活性物質を放出するための生体材料の使用、および生体材料を含む活性物質の制御された放出を行うための用具に関する。

本発明の生体材料は特に化粧品および医薬品の分野で使用することができる。

その特定の性質ゆえに、ゲルは多くの分野、特に食品、化粧品、または医薬品分野で使用されている。ゲルは少なくとも２つの構成成分で構成され、一方は極めて高度に優勢で、液体溶媒に相当し、他方は、固体として記載することができる構成成分である。２つの構成成分は媒体全体にわたって連続している。「固」相は、溶媒に相当する「液」相を捕捉するネットワークを構成し、それが流れるのを防ぐ。媒体は、全体として変形し易く、軟らかい弾性の固体のように挙動する。

ゲルは、ネットワークを形成する結合の種類によって分類することができる。これによって、２つの主なゲル化の機構を区別することができ、結果的に「物理」ゲルまたは「化学」ゲルとなる。

液体状態の溶液または分散液から出発して、連続した固体のネットワークが形成される結果、ゲルが形成される。この形態変換を溶液／ゲルの転移と呼ぶ。
物理ゲルは低いエネルギーの結合（ファン・デル・ワールス、水素結合、極性結合など）によって互いに結合される分子で構成される超分子集合体である。この集合体の安定性は、一定の範囲の物理化学的条件（ｐＨ、分子濃度、温度、溶媒の質、イオン強度など）に正確に関連付けられる。この範囲の外側では、混合物は液体である。従って、物理ゲルについてはゾル／ゲルの転移は可逆的である。従って、媒体のパラメータの変更は、構造の破壊を引き起こし、ゲル／ゾルの転移を誘導することができる。「物理」ゲルを得るための組成は従来技術から周知である。バイオゲルは、天然由来の高分子またはポリマーであるタンパク質または多糖類から本質的に得られる。

「化学」として記載されるゲルも従来技術において既知である。化学ゲルは超分子集合体に相当し、その分子は高エネルギーの結合（共有結合）によって会合する。従って、この集合体の安定性は非常に高い。これらの化学ゲルは改善された安定性を示し、ゲル／溶液の転移を行う唯一の手段は、ネットワークの共有結合を破壊することにある。この理由で、化学ゲルのゾル／ゲル転移は不可逆的であると言われる。

化学ゲルのファミリーの１つは酵素によって触媒されるゲルに相当する。このゲル化方式は主な生物学的過程で特に認められる。血液凝固、治癒、皮膚形成および細胞外マトリクス集合は、可溶性タンパク質のゲル状態への変化が必須である生物学的過程である。生体内では、限られた数の酵素、たとえば、リシルオキシダーゼとトランスグルタミナーゼがこれらの反応を触媒する。インビトロでは、最も使用されるのはトランスグルタミナーゼであり、それは、タンパク質のリジン残基とグルタミン残基の側鎖間で共有結合の架橋を作る。

従って、ＴＧアーゼは生物学的なゲル化ネットワークの形成に関与するタンパク質の重合を触媒する。このタンパク質族は遍在し、原核細胞および真核細胞の双方に見出される。ＴＧアーゼによって、食品産業において、特にすり身を製造するためにまたは多数の肉の派生物（ハム、再水和した食品など）を固めるために多数のタンパク質からゲルを得ることが可能になる。重合可能なタンパク質の例として、ゼラチン、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロブリン、乳清タンパク質、特にカゼインおよびラクトグロブリン、大豆タンパク質、小麦タンパク質、特にグルテニン、卵白および卵黄、および特に卵白アルブミンが挙げられる。

最も広く使用されるタンパク質ゲルの１つは、ゼラチンゲルである。ゼラチンは構造タンパク質であるコラーゲンから得られる。コラーゲンは、三重螺旋に組織化される分子である。これらの三重螺旋は会合して原線維を形成することができ、それが会合して繊維を形成することができる。コラーゲンの三重螺旋は体温では不安定である。ゼラチンはコラーゲンを変性させることによって得られる。コラーゲンを含有する組織が酸またはアルカリの処理を受け、その結果、コラーゲンの三重螺旋の変性が生じる。その際、繊維を作る可能性が完全に失われる。酸処理によってＡ型のゼラチンを生じ、アルカリ処理によってＢ型のゼラチンを生じる。従って、ゼラチン溶液は単離されたコラーゲン鎖で構成される。ゼラチンには多数の用途があるので、物理ゲルが存在しない条件下（高温、極端なｐＨ、特定のイオン強度）でゼラチンゲルを作ることが必要なこともある。ゲルに必要なネットワークを形成するために、次いで共有結合によって、特にＴＧアーゼの作用によってゼラチン鎖を架橋する。こうして得られたゲルは化学ゲルである。

従って、種々の化学ゲルの機械的特性をさらに制御することによって、それらのゲルの可能性を拡大するために必要な基盤が形成される。
生物界の分析によって、極めて動的な系の存在が明らかになっている。生体組織では、細胞は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）と呼ばれ、タンパク質に富み、肉眼で見えるレベルでゲルに例えることができる構造と相互作用している。この構造は主として、上皮細胞の下で結合組織の周りに位置する。細胞は、たとえば、ＥＣＭに剛性を付与するコラーゲンや、細胞の接着機構に関与するフィブロネクチンのような種々の細胞外マトリクス成分を合成する。並行して、細胞は、細胞外マトリクスの分解を生じるプロテアーゼも産生する。従って、細胞は、細胞外マトリクスの構築と分解に同時に関与する。従って、細胞外マトリクスの構造は、不可逆的で静的な構造ではなく、細胞によって合成されたタンパク質の、構築と分解の活動間のバランスの結果生じる動的な平衡に相当する。

同様に、血液凝固機構によって形成される血餅も動的な系を構成する。従って、酵素反応のカスケードを介して不溶性のネットワークに組織化されるようになる可溶性のタンパク質から血餅が形成される。その後、この血餅は別の酵素反応の間に排除される。

これらの動的平衡では、タンパク質のネットワークは不溶性になり、ゲルを形成するように会合する。これは溶液／ゲルの転移に例えられる。また、タンパク質のネットワークはプロテアーゼの作用によって破壊される。この型の転移は、ゲル／溶液の転移に例えられる。従って、凝固におけるような連続的な転移を目の当たりにすることがあり、その際、先ず、血餅が形成され、次いで分解される。

これらの生物学的過程における溶液／ゲルの転移は、最も一般的には上述のトランスグルタミナーゼ族に関連する。反対の転移、すなわち、ゲル／溶液は、タンパク質分解型酵素の拮抗作用に関連する。

最も広く研究されている族の１つは、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のも
のである。それらは、ほとんどの細胞外マトリクスタンパク質を分解する亜鉛依存性のエンドペプチダーゼ族を形成する。しかしながら、多数の異なったプロテアーゼが存在する。プロテアーゼ族の例として、トリプシンまたはマトリプターゼのようなセリンプロテアーゼ、カテプシンＢ，ＬおよびカテプシンＤ，Ｇのようなシステインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ並びにＡＤＡＭ族が挙げられる。

この種の反応を調整する多数の酵素、たとえば、トランスグルタミナーゼ、または代替的にメタロプロテアーゼは、生化学者および酵素学者によって性状分析されている。
溶液／ゲルの転移およびゲル／溶液の転移のための能力を有するゲルは、特許文献１に記載されている。これらのゲルは、水性相と、ポリマーと、ポリマーを分解することが可能である酵素と、該ポリマーを形成するためのモノマーを重合することが可能である酵素とを含む。特許文献１では、「モノマー」は生体高分子またはポリマーとすることができる。さらに、この文献では、用語「ポリマー」は、「ポリマーのネットワーク」に適用される。

従来技術のゲルは、プログラムされたゲル化および再可溶化の動態を示す。さらに、従来技術のゲルは、制御された物理学的特性、たとえば、粘弾性を示す。その上、従来技術のゲルを形成する固体ネットワークと水性相の物理学的特性は不可分に且つ同時に変更される。これらの欠点が、その物理学的特性によってこれらのゲルの適用の分野を限定する。たとえば、従来技術によれば、水性相を改変することなく固体ネットワークを改変することは不可能であり、ゲルの固体ネットワークを改変することなく水性相を改変するのは不可能である。

国際公開第２００６／０５６７００号

従って、特にゲルの形態で、ゲルを構成する２つの相のうち１つだけの物性を、制御された方法で改変することができる新規の生体材料に対する現実の必要性が存在する。
分子、特に活性分子（たとえば、化粧品および医薬品もしくは化粧品または医薬品の分子）を取り込むことが可能であり、ゲル化生体材料を構成する２つの相の１つだけの物性を制御された方法で改変することによって、これらの分子を制御された方法で放出することが可能である新規のゲル化生体材料に対する必要性が存在する。

実際、本発明は、ゲルの粘弾性特性を改変することができ、これらの特性の改変がプログラムされる生体材料を提供することによって従来技術の必要性を満たし、これらの欠点を克服することを可能にする。

本発明の主題は特に、水性相と第１のポリマーネットワークとを含む生体材料において、第１のポリマーネットワークは、第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーおよび／または糖類のポリマーの混合物から構成される生体材料である。ここで、第１のポリマーネットワークと水性相とは第１のゲル（Ａ）を形成し、該生体材料は、
（ｉ）第１のポリマーとは異なる、第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物であって、ゲル（Ａ）の水性相に溶解した状態で、またはゲル（Ｂ）を構成する第２のポリマーネットワークの形態で、ゲル（Ａ）に含まれる第２のポリマーと、
（ｉｉ）第２のポリマーを分解するための第１の酵素と、を含む。

本発明によれば、用語「ネットワーク」は、分子の会合体を意味するように意図される。分子間のこの会合は、強いまたは弱い相互作用（共有結合、水素結合、ファン・デル・ワールスなど）によって提供することができる。共有結合の場合、会合は架橋することであり、ネットワークは「架橋された」と言われる。用語「ポリマー」は高分子、たとえば、タンパク質または糖類のポリマーを意味するように意図される。ポリマーネットワークは、タンパク質ポリマーの会合体または糖類ポリマーの会合体である。ポリマーネットワークはゲルを構成することができる。

本発明によれば、用語「水性相」は、たとえば、水、さらにたとえば、リン酸緩衝液またはトリス緩衝液または当業者に既知の緩衝液として好適な緩衝液によって所望のｐＨに緩衝化された緩衝化水溶液のような水溶液を意味するように意図される。それは、たとえば、生体材料に存在する酵素の活性を可能にする媒体であってもよい。

本発明によれば、第１のポリマーネットワークは第１のタンパク質ポリマーから構成することができる。この第１のタンパク質ポリマーは、たとえば、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロブリン、コラーゲンおよびその誘導体、乳タンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、卵黄および卵白タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ソラマメタンパク質、亜麻タンパク質、絹タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、およびビトロネクチン、またはこれらのポリマーの混合物を含む群から選択することができる。従って、第１のポリマーネットワークは、単一の第１のタンパク質ポリマーまたは第１のタンパク質ポリマーの混合物から構成することができる。

本発明によれば、第１のポリマーネットワークは第１の糖類ポリマーから構成することができる。この第１の糖類ポリマーは、たとえば、カラギーナン、アルギナート、キサンタン、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、硫酸化グリコサミノグリカン、グリコーゲン、セルロースおよびその誘導体、ペクチン、デンプンおよびその誘導体、デキストラン、およびキシラン、またはこれらの混合物を含む群から選択されてもよい。従って、この第１のポリマーネットワークは、単一の第１の糖類ポリマーまたは第１の糖類ポリマーの混合物で構成することができる。

本発明によれば、第１のポリマーネットワークは、たとえば、前述のタンパク質と糖類のポリマーの群から選択される第１のタンパク質および糖類のポリマーの混合物でも構成することができる。

本発明によれば、第１のポリマーネットワークは、たとえば、ゼラチン、フィブリンおよびアルギナートのゲルを含む群から選択することができ、この第１のポリマーネットワークは、第２のポリマーとは異なるポリマーで構成されることが理解される。

本発明によれば、第１のポリマーネットワークまたは第１のポリマーの混合物の量は、たとえば、生体材料の総重量に対して０．１〜２０重量％の間、好ましくは０．５〜１０重量％である。

本発明によれば、第２のポリマーは、第１のポリマーネットワークを構成するポリマーとは異なる。この第２のポリマーは、たとえば、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、コラーゲンおよびその誘導体、乳タンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、卵黄および卵白タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ソラマメタンパク質、亜麻タンパク質、絹タンパク質、フィブロネクチ
ン、ラミニン、エラスチン、およびビトロネクチン、またはこれらのポリマーの混合物を含む群から選択することができる。従って、第２のポリマーは、単一のタンパク質ポリマーまたはタンパク質ポリマーの混合物で構成されてもよい。

本発明によれば、第２のポリマーは、たとえば、カラギーナン、アルギナート、キサンタン、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、硫酸化グリコサミノグリカン、グリコーゲン、セルロースおよびその誘導体、ペクチン、デンプンおよびその誘導体、デキストラン、およびキシラン、またはこれらの混合物を含む群から選択することができる。従って、この第２のポリマーは、単一の糖類ポリマーまたは糖類ポリマーの混合物で構成することができる。

本発明によれば、第２のポリマーはまた、たとえば、前述のタンパク質および糖類のポリマーの群から選択される第２のタンパク質ポリマーと第２の糖類のポリマーの混合物で構成することができる。

本発明によれば、第２のポリマーは、たとえば、ゼラチン、フィブリン、ヒアルロン酸およびアルギナートを含む群から選択することができ、この第２のポリマーは第１ポリマーとは異なることが理解される。

本発明によれば、第２のポリマーまたは第２のポリマーの混合物の量は、生体材料の総重量に対して０．０１〜２０重量％の間、好ましくは０．１〜１０重量％とすることができる。

本発明によれば、第１の酵素は、たとえば、メタロプロテイナーゼ族、セリンプロテアーゼ族、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ族、ＡＤＡＭ族、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ、キサンタナーゼ、キトサナーゼおよびヒアルロニダーゼを含むグリコシダーゼ類、並びにヒドロキシアセチルリアーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼおよびアルギン酸リアーゼを含むリアーゼ類を含む群から選択することができる。

本発明によれば、生体材料における第１の酵素の濃度は、２×１０^−７〜５０Ｕ／ｍＬの間、好ましくは２×１０^−６〜２０Ｕ／ｍＬとすることができる。
本発明によれば、生体材料はまた、第１の酵素とは異なる、第１のポリマーネットワークを分解することが可能である第２の酵素を含んでもよく、第２の酵素の作用の下で第１のポリマーネットワークはゲル（Ａ）／溶液の転移を行うことが可能である。

本発明によれば、第１の酵素とは異なる第２の酵素は、たとえば、メタロプロテイナーゼ族、セリンプロテアーゼ族、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ族、ＡＤＡＭ族、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ、キサンタナーゼ、キトサナーゼおよびヒアルロニダーゼを含むグリコシダーゼ類、並びにヒドロキシアセチルリアーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼおよびアルギン酸リアーゼを含むリアーゼ類を含む群から選択することができる。

本発明によれば、生体材料における第２の酵素の濃度は、２×１０^−７〜５０Ｕ／ｍＬの間、好ましくは２×１０^−６〜２０Ｕ／ｍＬとすることができる。
本発明によれば、生体材料はまた、第１の酵素および第２の酵素とは異なる、第１のポリマー間または第１のポリマーの混合物の間に結合を生成することが可能である第３の酵素を含んでもよく、第３の酵素は溶液／ゲル（Ａ）の転移を触媒することが可能である。

本発明によれば、第３の酵素は、リシルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ジス
ルフィドイソメラーゼタンパク質、スルフヒドリルチオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、アルギン酸エピメラーゼ、グルクロン酸イソメラーゼ、セロビオースエピメラーゼ、およびガラクトース−６−スルフリラーゼを含むエピメラーゼを含む群から選択することができる。

本発明によれば、生体材料における第３の酵素の濃度は、０．０１〜５０Ｕ／ｍＬの間、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬの間とすることができる。
本発明によれば、生体材料は、第１の酵素、第２の酵素、および第３の酵素とは異なる、第２のポリマー間または第２のポリマーの混合物の間に結合を生成することが可能である第４の酵素を含んでもよく、第４の酵素は溶液／ゲル（Ｂ）の転移を触媒することが可能である。

本発明によれば、第４の酵素は、たとえば、リシルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、スルフヒドリルチオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、アルギン酸エピメラーゼ、グルクロン酸イソメラーゼ、セロビオースエピメラーゼ、およびガラクトース−６−スルフリラーゼを含むエピメラーゼを含む群から選択することができる。

本発明によれば、生体材料における第４の酵素の濃度は、０．０１〜５０Ｕ／ｍＬの間、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬの間とすることができる。
本発明によれば、第１、第２、第３および第４の酵素は、独立して活性があってもよく、または活性化される酵素であってもよい。

本発明によれば、生体材料の水性相は活性物質も含んでよい。この活性物質は、たとえば、ゲル（Ａ）の水性相に溶解した状態で存在してもよく、ゲル（Ｂ）に存在してもよく、その両方であってもよい。

本発明によれば、用語「活性物質」は、生物（微生物または多細胞生物、たとえば、皮膚、骨、臓器など）の表面で、または生物内において生物学的な活性または生化学的な活性を有する物質または組成物を意味するように意図される。この活性物質は、たとえば、ヒトまたは動物の疾病に関して治療特性または予防特性を有してもよい。それは、医学診断を確立する目的で、または有機的な機能を回復する、正す、もしくは修正する目的でヒトまたは動物に投与することができるいかなる生成物であってもよい。それらは、静菌物質および殺菌物質もしくは静菌物質または殺菌物質、抗生物質、殺菌剤、着色料などであってもよい。

本発明によれば、活性物質は、静菌剤、殺菌剤、血管拡張剤、エオシン、デキストランブルー、メチレンブルー、アズールブルーを含む染料、タンパク質、ヒアルロン酸およびアルギナートを含む糖類、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、抗ニキビ剤、抗アレルギー剤、抗不安薬、抗喘息剤、抗癌剤、脂質低下薬、ホルモン性避妊薬、抗うつ剤、糖尿病治療薬、鎮痛薬、強壮薬、血圧降下剤、抗真菌剤、抗生剤、催眠剤、ホルモン治療剤、偏頭痛治療薬、過剰体重を治療するために使用される薬剤、パーキンソン病治療薬、神経弛緩薬、非ステロイド性抗炎症剤、排卵誘発剤、粘液溶解薬、鎮咳剤、勃起誘発剤、および抗潰瘍剤を含む群から選択することができる。

本発明によれば、それは、活性物質のみであってもよいし、または活性物質の混合物であってもよい。
本発明によれば、活性物質の量は、たとえば、その活性のような因子および使用者によって所望される用量に左右されてもよい。これは、既知の製品で知られた既知の用量を含むので、所望の用量は当業者によって容易に決定することができる。

本発明によれば、本発明の生体材料は、従って、少なくとも１つの活性物質の制御された放出に使用することができる。
本発明は、上述のような生体材料を調製する方法に関し、この方法は、次の工程、すなわち、
ａ）水性相において、第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物から構成される第１のポリマーネットワークを形成する工程（第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物が第１のポリマーネットワークを形成する）と、
ｂ）第１のポリマーまたは第１のポリマーの混合物とは異なる、第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物を添加する工程と、を含み、
添加する工程は、第１のポリマーネットワークの形成の前に実行される。

本発明によれば、本発明の方法は、たとえば、第１のポリマーのネットワークの水性相に含まれる第２のポリマーまたは第２のポリマーの混合物と共に実施することができる。
本発明によれば、本発明の方法は、たとえば、第１のポリマーのネットワークに含まれる第２のポリマーのネットワークを形成する第２のポリマーまたは第２のポリマーの混合物と共に実施することができる。

本発明によれば、種々のポリマーまたはポリマーネットワークの形成または分解は、工程（ｂ）において第１〜第４の酵素を添加することによって誘導することができる。これらの種々の酵素の濃度によって、たとえば、本発明の生体材料の粘弾性特性を制御することができる。

本発明によれば、本発明の方法は、たとえば、１０〜４５℃の間の温度にて実施することができる。
第１のポリマーと第２のポリマーは上記で定義されたとおりである。第１のポリマーおよび第２のポリマー、または第１のポリマーもしくは第２のポリマーの濃度も、上述のとおりである。

本発明によれば、この方法はまた、工程（ｂ）において、第２のポリマーまたは第２のポリマーネットワークを分解することが可能である第１の酵素の添加を含んでもよい。第１の酵素は上記で定義されている。その量は上記で定義されている。

本発明によれば、この方法はまた、工程（ｂ）において、第１のポリマーネットワークの結合を分解することが可能である第２の酵素の添加を含んでもよい。第２の酵素は上記で定義されている。その量は上記で定義されている。

本発明によれば、この方法はまた、工程（ｂ）において、第１のポリマー間に結合を生成することが可能である第３の酵素の添加を含んでもよい。第３の酵素は上記で定義されている。その量は上記で定義されている。

本発明によれば、この方法はまた、工程（ｂ）において、第２のポリマー間に結合を生成することが可能である第４の酵素の添加を含んでもよい。第４の酵素は上記で定義されている。その量は上記で定義されている。

本発明によれば、この方法はまた、工程（ｂ）において、少なくとも１つの活性物質を添加することを含んでもよい。活性物質は上記で定義されている。
本発明によれば、この方法はまた、生体材料を凍結乾燥する工程（ｃ）を含んでもよい。本発明によれば、それは脱水工程であってもよい。これらの工程によって、本発明の材料を長期間にわたって保存し、その後、使用するためにそれを再水和することが可能になる。

本発明はまた、本発明の生体材料を含む活性物質の制御された放出を行うための用具にも関する。
本発明によれば、放出用具は、たとえば、コンタクトレンズ、電極、センサを含む医療用具、介護用具、包帯、含浸圧定布、帯具、外科用包帯、眼科用包帯、歯科用包帯、縫合製品、治療用具、整形外科物品、外科用インプラント、貼付剤、経皮ゲル、能動パッチ、軟組織用の内人工器官およびインプラント、組織工学のための用具、再構築材料、細胞培養用の用具、培養培地、および培養支持体を含む群から選択されてもよい。

本発明の生体材料は、たとえば、前述の用具において使用される材料、特に皮膚、粘膜、臓器、骨、細胞などに接触している材料を部分的にまたは全体的に置き換えてもよい。
化粧品の分野では、従って、本発明に係る生体材料によって、物質、たとえば、使用者の満足度を高める物質、または化粧品活性剤、たとえば、ヒアルロン酸またはレチノールを放出することができるビューティマスクまたはパッチのような新しい化粧品を調製することが可能になってもよい。

医薬品または化粧品の分野では、本発明に係る生体材料によって、さらに、有効成分を捕捉し、且つ所与の動態で溶液状態に戻すことにより該有効成分を放出することが可能であるゲルを、たとえば、所与の時間の後、有効成分を放出するゲルまたはゼラチンカプセルを得ることを可能にすることもできる。

本発明のそのほかの特徴および利点は、添付の図面を参照して以下に続く説明を読む中でさらに明らかになるであろう。

本発明に係る生体材料におけるエオシン放出の変化を、時間を追って示す図。矢印は、コラゲナーゼを含むゲルについての再可溶化時間を示す。 本発明に係る生体材料における時間の関数としてのデキストランブルーの放出比率を示す図。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における分での時間の関数としての物理ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸（１％）の分解の影響を示す図。１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（黒色の記号）、５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（暗灰色の記号）、１０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（明灰色の記号）、およびゼラチンのみ（白色の記号）。 分での時間の関数としての物理ゲルの三重螺旋の形成に対するヒアルロン酸（１％）の分解の影響を示す図。１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（白色の記号）、酵素なし（黒色の記号）およびゼラチンのみ（灰色の記号）。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における分での時間の関数としての化学ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸（％）の分解の影響を示す図。１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（黒色の記号）、５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（暗灰色の記号）、１０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（明灰色の記号）、およびゼラチンのみ（白色の記号）。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における時間の関数としての、コラゲナーゼ（１．１２×１０^−４Ｕ／ｍＬ）を含有する物理ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸の効果を示す図。１％ヒアルロン酸（黒色の記号）およびゼラチンのみ（白色の記号）。 ヒアルロン酸（１％）の存在下での時間の関数としての物理ゲルの粘弾性特性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）における変化を示す図。該ゲルは、種々の濃度のコラゲナーゼ：０．９５×１０^−４Ｕ・ｍＬ^−１（黒色の記号）、１．１２×１０^−４Ｕ・ｍＬ^−１（灰色の記号）、１．２９×１０^−４Ｕ・ｍＬ^−１（白色の記号）を含有する。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における時間の関数としての、コラゲナーゼ（２．３２×１０^−４Ｕ／ｍＬ）とトランスグルタミナーゼ（１．５Ｕ／ｍＬ）を含有する化学ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸の効果を示す図。１％ヒアルロン酸（黒色の記号）およびゼラチンのみ（白色の記号）。 ヒアルロン酸（１％）の存在下での時間の関数としての化学ゲルの粘弾性特性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）における変化を示す図。該ゲルは、トランスグルタミナーゼ（１．５Ｕ・ｍＬ^−１）と種々の濃度のコラゲナーゼ：２．０６×１０^−４Ｕ／ｍＬ（黒色の記号）、２．３２×１０^−４Ｕ・ｍＬ^−１（灰色の記号）、２．５８×１０^−４Ｕ・ｍＬ^−１（白色の記号）を含有する。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における時間の関数としての、コラゲナーゼ（１．１２×１０^−４Ｕ／ｍＬ）を含有する物理ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸（１％）の分解の影響を示す図。１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（黒色の記号）、５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（暗灰色の記号）、１０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（明灰色の記号）、およびゼラチンのみ（白色の記号）。 所与の周波数（６．３ラジアン・ｓ^−１）における時間の関数としての、トランスグルタミナーゼ（１．５Ｕ／ｍＬ）とコラゲナーゼ（２．３２×１０^−４Ｕ／ｍＬ）を含有する化学ゲルの粘弾性（Ｇ’：四角形、Ｇ”：三角形）に対するヒアルロン酸（１％）の分解の影響を示す図。１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（黒色の記号）、５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（暗灰色の記号）、１０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（明灰色の記号）、およびゼラチンのみ（白色の記号）。 １Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼと共に得た種々のゼラチン（７％）ゲルからの４０℃での時間の関数としてのアズールブルーの放出を示す図。ヒアルロン酸なし（黒色の棒）、１％のヒアルロン酸あり（灰色の棒）、１％のヒアルロン酸と１５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼあり（白色の棒）。

［実施例１：本発明に係る生体材料を調製する方法］
この実施例ではＡ１型のゼラチンを使用した。該ゼラチンはシグマ社（ＳＩＧＭＡ：登録商標）（Ｇ２５００）から販売されており、ブタの皮膚に由来する。抽出する手順は酸処理であり、ｐＨは８に等しい。最終的に、３００のブルーム強度を有する。

この実施例で使用したヒアルロン酸は細菌ストレプトコッカス・エクイ属によって産生される。フルカ社（Ｆｌｕｋａ）（登録商標）（４８１７８）によって入手した。該ヒアルロン酸は、約１００万ダルトンの多糖類である。グルクロン酸カルボキシルのｐＫａは２．４である。

この実施例で使用したアルギナートは、藻類マクロシスティス・ピリフェラから抽出する。該アルギナートは、シグマ社から販売されている（Ａ２１５８）。
この実施例で使用したフィブリノゲンは、ウシ由来のフィブリノゲンＩＶ型であり、シグマ社から販売されている（Ｆ４７５３）。純度は６８％である。

使用したトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）は、アクチバＷＭ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ：登録商標）という名称のもとで味の素社によって製造された。それは、細菌ストレプトヴェルティシリウム属によって分泌される。分子量は４３，０００であり、４０℃にて１００Ｕ／ｇ^−１の活性を有する。

この実施例で使用したコラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクムから単離されたＩＡ型の亜鉛メタロプロテアーゼである（シグマ社、Ｃ−９８９１）。その分子量は１１６，０００である。酵素の最大活性は、ＣａＣｌ_２とＮａＣｌの存在下で得られる。これらの要素はゼラチンを阻害することが示された（結果は示さない）。本出願の実施例ではコラゲナーゼ活性の試験にはそれらを使用しなかった。

サーモリシンは、バチルス・セルモプテオリティカス・ロッコ（シグマ社による供給、Ｐ−１５１２）から単離されたＸ型のプロテアーゼである。それは亜鉛メタロプロテアーゼであり、その分子量は３４，６００である。

トリプシンは、ウシの膵臓から単離されたセリンプロテアーゼである。それは、シグマ社、Ｔ−１４２６によって販売されている。ＭＷは２３，８００である。作成者によって包装される前に、トリプシンと共に存在するキモトリプシン活性を下げるため、２−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で酵素を処理した。

アルギン酸リアーゼは、フラボバクテリウム属から抽出する。それは、３８７３０Ｕ／ｇの活性を有する。該アルギン酸リアーゼは、シグマ社（Ａ１６０３）によって販売されている。

使用したトロンビンは、ウシの血漿から抽出する。それは、３４．８Ｕ／ｍｇの活性を有する。該トロンビンは、シグマ社（Ｔ４６４８）によって販売されている。
［Ａ：第１のポリマーネットワークと、第２のポリマーと、第１の酵素とを含む生体材料を調製する方法］
ａ）この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素とを含む生体材料を製造する。

生体材料の調製のために、７％濃度のゼラチンと、１％のヒアルロン酸（重量対体積の比）と、種々の濃度のヒアルロニダーゼ（１、５、１０Ｕ／ｍＬ）とによって試料を調製した。ゼラチン粉末をｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液と共にインキュベートして４℃にて１５分間保管した。次いで、溶液の表面にヒアルロン酸を載せた。次いで、長くとも１５分間、４０℃にて撹拌することによって調製物を可溶化した。最終濃度よりも少なくとも５倍高い開始濃度で同一緩衝液にて予め調製したヒアルロニダーゼの溶液を、ゼラチンとヒアルロン酸の調製物に混合する。

物理ゲルを得るために、１分当たり０．５℃の温度降下で４０℃から２７℃までの温度勾配を溶液に適用した。
ｂ）この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、アルギナートである第２のポリマーと、アルギン酸リアーゼである第１の酵素とを含む生体材料を製造する。

生体材料は、０．５％のゼラチンと、１％のアルギナートと、０．２Ｕ／ｍＬのアルギン酸リアーゼとから構成される。このゲルを得るために、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液の溶液をゼラチン粉末に加える。前もってアルギナートの溶液を調製し（同じ緩衝液で）、ゼラチンに加える。混合物を４０℃にて３０分間インキュベートする。次いでアルギン酸リアーゼの溶液を反応媒体に加え、２７℃にて混合物をインキュベートする。

ｃ）この実施例では、アルギナートゲルである第１のポリマーネットワークと、ゼラチンである第２のポリマーと、コラゲナーゼまたはトリプシンまたはサーモリシンのいずれ
かである第１の酵素とを含む生体材料を製造する。

生体材料は、１％のアルギナートと、１％のゼラチンと、プロテアーゼとから構成される。新しく調製した、カルシウム−ＥＤＴＡ（１０ｍＬ中、２８２ｍｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏおよび７９８ｍｇのＮａ_４ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ）の溶液で加熱することなく、アルギン酸ナトリウム（０．１ｇ）を溶解する。５％のゼラチン溶液を水で調製し、使用前に少なくとも４時間、混合物を４℃で保管する。最終濃度１％のアルギナートと１％のゼラチンを得るように溶液を混合し、混合物を４０℃にて３０分間インキュベートする。Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンの３Ｍ溶液を即座に調製し、その３１２μＬをプロテアーゼと同時に前の混合物に加える。コラゲナーゼの最終濃度は１．１２×１０^−５Ｕ／ｍＬである。サーモリシンの最終濃度は３．２５×１０^−４Ｕ／ｍＬである。トリプシンの最終濃度は２．４６×１０^−４Ｕ／ｍＬである。混合物を４０℃でインキュベートし、そのとき、ゼラチンは溶液の形態である。混合物を２５℃または１０℃の温度でインキュベートすれば、ゼラチンはゲルの形態である。

［Ｂ：第１のポリマーネットワークと、第２のポリマーと、第１の酵素と、第２の酵素とを含む生体材料を調製する方法］
この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素と、コラゲナーゼまたはトリプシンまたはサーモリシンのいずれかである第２の酵素とを含む生体材料を製造する。

Ａ−ａ）で調製した生体材料と同じ実験プロトコルによって生体材料を調製し、プロテアーゼ（コラゲナーゼまたはトリプシンまたはサーモリシンのいずれか）をゼラチン溶液に添加する。ゼラチン溶液における分布を最適化するため、酵素試料の体積は最終体積の少なくとも２０％に相当する。ゼラチンに添加する前に、第１の酵素と第２の酵素を含有する単一の溶液を、水槽にて、４０℃で電磁撹拌によって調製する。コラゲナーゼの最終濃度は１．１２×１０^−４Ｕ／ｍＬである。サーモリシンの最終濃度は３．２５×１０^−３Ｕ／ｍＬである。トリプシンの最終濃度は２．４６×１０^−３Ｕ／ｍＬである。

［Ｃ：第１のポリマーネットワークと、第２のポリマーと、第１の酵素と、第３の酵素とを含む、本発明に係る生体材料を調製する方法］
ａ）この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素と、トランスグルタミナーゼである第３の酵素とを含む生体材料を製造する。

生体材料を調製するために、７％の濃度のゼラチンと、１％のヒアルロン酸（重量対体積の比）と、１．５Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼと、種々の濃度のヒアルロニダーゼ（１、５、１０Ｕ／ｍＬ）とによって試料を調製した。ゼラチン粉末をｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液と共にインキュベートして、４℃にて１５分間保管した。次いで、溶液の表面にヒアルロン酸を載せる。次いで、長くとも１５分間、４０℃にて撹拌することによって調製物を可溶化した。最終濃度よりも少なくとも５倍高い開始濃度で同一緩衝液にて予め調製したヒアルロニダーゼとトランスグルタミナーゼの溶液を、ゼラチンとヒアルロン酸の調製物に混合する。

ｂ）この実施例では、フィブリンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素と、トロンビンである第３の酵素とを含む生体材料を製造する。

生体材料は、４．８ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと、０．２４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸と、０．２Ｕ／ｍＬのトロンビンと、１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼと、２×１０^−２
モル／ＬのＣａＣｌ_２と１５×１０^−２モル／ＬのＮａＣｌを含有する。成分はすべて、事前に３７℃に加熱したｐＨ７．４の５０ミリモル／Ｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液に溶解する。フィブリノゲンは前もってＣａＣｌ_２と、ＮａＣｌと、ヒアルロン酸と混合する。次いで、トロンビンとヒアルロニダーゼの溶液を反応媒体に加え、混合物を３７℃でインキュベートする。

［Ｄ：第１のポリマーネットワークと、第２のポリマーと、第１の酵素と、第２の酵素と、第３の酵素とを含む生体材料を製造する方法］
この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素と、コラゲナーゼまたはトリプシンまたはサーモリシンのいずれかである第２の酵素と、トランスグルタミナーゼである第３の酵素とを含む生体材料を製造する。

この生体材料はＣ−ａ）のように調製するが、ここでは、プロテアーゼ（コラゲナーゼまたはトリプシンまたはサーモリシンのいずれか）をトランスグルタミナーゼとヒアルロニダーゼの酵素混合物に添加する。コラゲナーゼの最終濃度は２．３２×１０^−４Ｕ／ｍＬである。サーモリシンの最終濃度は６．５×１０^−３Ｕ／ｍＬである。トリプシンの最終濃度は４．３５×１０^−３Ｕ／ｍＬである。

［実施例２：ゲルによるエオシンの放出］
この実施例は、コラゲナーゼである第２の酵素とトランスグルタミナーゼである第３の酵素の存在または非存在下で行い、第１のポリマーネットワークはゼラチンゲルである。

生体材料を調製するために、５％濃度のゼラチンと、１Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼと、０．１ｍｇ／ｍＬのエオシン（シグマ社）と、任意で、３．５×１０^−５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼによって試料を調製した。エオシンを含有する、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液と共にゼラチン粉末をインキュベートして４℃にて１５分間保管した。次いで、長くとも１５分間、４０℃にて撹拌することによってそれを可溶化した。最終濃度よりも少なくとも５倍高い開始濃度で同一緩衝液にて予め調製したトランスグルタミナーゼと、任意でコラゲナーゼの溶液をゼラチン調製物に混合する。

この実施例の目的は、第２のポリマーを含まないゲルが低分子量の物質を制御して放出できないことを示すことである。
コラゲナーゼを含有するゲルは３０分で形成され、約２０時間で再び液体になった（可溶化時間）。

第２のゲルも形成した。この第２のゲルは、５％のゼラチンと１Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼで構成された。５１７ｎｍにて分光光度法によって時間を追ってエオシンの放出を監視した。シグナルの上昇はエオシンの放出に直接相関する。ゲルにおけるコラゲナーゼの存在下または非存在下で、ゲルによるエオシンの放出は連続的である（図１）。

［実施例３：ゲルによるデキストランブルーの放出］
この実施例で使用した生体材料は、エオシンを最終濃度５ｍｇ／ｍＬのデキストランブルー（ＭＷ ２，０００，０００）に置き換えた以外、実施例２で使用したものと同一である。

６２０ｎｍにて、分光光度法によってデキストランブルーの放出を監視した。シグナルの上昇はデキストランブルーの放出に直接相関する。
ゲルがゲルの形態である限り、デキストランブルーの放出は見られなかった（図２）。ゲルの可溶化の間、すなわち、ゲル化の２４時間後、着色剤の放出が見られた。

ゲルに存在する分子の放出は、ゲルの粘弾性特性に左右される。この場合、活性物質の放出はゲルの再可溶化時間にのみ関連付けられる。従って、ゲル相の間での活性物質の放出は制御されない。

［実施例４：生体材料の弾性および粘性を検討する方法］
ゲルのレオロジーのパラメータを検討することによって、ゲルの弾性および粘性の検討を行った。

レオロジーの定義は、１９２９年、米国レオロジー学会によって確立された。レオロジーは、材料の流れと変形に関するすべての研究を含む。その原理は、試料に応力（伸長、圧縮、剪断など）を加え、その結果、試料の変形を生じることにある。応力と変形の関係は、試料固有の特性および外部条件に左右される。レオロジー研究に使用される１つの変形は、剪断運動である。剪断の特に単純な例は、２つの平面の間での試料の動きに関わるものであり、一方が不動であり、他方はそれ自体に対して平行に動くことができる。

剪断の影響下で、試料の平坦な層は、異なった速度で互いに平行に流れる。可動の面に接する層は同じ速度でそれと共に動くが、不動の面に接する層は動かない。これがすべりなし境界（ｎｏｎ ｇｌｉｓｓｅｍｅｎｔ ａ ｌａ ｐａｒｏｉ）仮説と呼ばれるものである。そこから、層の動きの速度勾配が確立されるようになり、２つの数量が剪断を特徴付ける：
・境界層間の速度の変動に相当する剪断速度。それは、時間の逆数（ｓ^−１）として表される。
・種々の層間の接線の摩擦力に比例する剪断強度τ。その単位は、パスカル（Ｐａ）である。

振動性の分析または動的な分析は、所与のパルシング、ωとともに振動する剪断運動を強要することにある。この場合、応力（τ）と変形（γ）は、同一のパルシングであるが、特定の位相シフトと共に時間を追って正弦曲線で変化する。幾つかの数量が特徴的である：
変形と応力の間の位相シフトδ
比Ｇ^＊＝（τ_０）／（γ_０）、式中、τ_０およびγ_０はそれぞれ、応力および最大振幅の変形を表す。

この比は剛性率と呼ばれる。それは、弾性成分（貯蔵弾性率）と粘性成分（損失弾性率）から構成される複素数である。弾性率は、パスカル（Ｐａ）の単位を持つ応力の大きさを有する。
Ｇ^＊ _（ω）＝Ｇ’_（ω）＋Ｇ”_（ω）
位相シフトδは、以下によって２つの成分に結び付けられる：
Ｇ’＝Ｇ^＊ｃｏｓδ
Ｇ”＝Ｇ^＊ｓｉｎδ
その結果
ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’となる。

純粋に粘性の系については、応力と変形の間の位相シフトは９０°に等しいので、Ｇ’の値＝０であり、Ｇ”は粘性弾性率として決定される。これに対して、弾性の固体については、０に等しいのはＧ”である。貯蔵弾性率もまた弾性率と呼ばれる。δが０〜４５°の間であれば、材料は粘性挙動よりもさらに弾性の挙動を有するが、δが４５〜９０°の間であれば、その反対が真実であることは明らかである。

ゲル化過程は、ゲル化点によって特徴付けられ、ゲル化点は、ゲルの形成に必要な、創出された結合の画分に相当する。ゲル時間はそれ自体、ゲル化点に達するために必要な時間によって決定される。

レオロジーでは、ゲル時間は、応力と振動変形の間の位相シフト角度δが４５°の値に達するのに必要な時間であるとみなすことができるので、Ｇ”／Ｇ’比については１に等しいとみなすことができる。この場合：
・Ｇ”＞Ｇ’且つｔａｎδ＞１の場合、試料は液体であるとみなすことができる。
・Ｇ’＞Ｇ”且つｔａｎδ＜１の場合、試料はゲル化される。
・Ｇ’＝Ｇ”且つｔａｎδ＝１の場合、試料はゲル化点にある。

ゲル化点のこの定義は、ゲルの線形範囲内で緩和時間は無限なので、粘弾性のパラメータは測定条件に無関係であるという事実を考慮に入れる。
ゲル化点を考慮する別の方法は、レオメータによる振動変形の検証である。

以下の実施例では、使用したレオメータは、サーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）（登録商標）のレオストレス（ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ）１５０である。レオメータの方式は、変形を加える（応力の印加が可能である）コーン／プレート方式である。トルク（応力）を加え、正しい変形が得られるまで得られる変形を記録することによる反復方法を用いて実際の変形を検証した。

実験には２つのコーンを使用した。それらは双方共チタン製であり、２°の角度を有する。これに対して、２つのコーンはその直径という点で異なり、一方が３５ｍｍ、他方が６０ｍｍである。

試料を載せる支持体の温度調節を可能にするクライオスタットＦ６（サーモエレクトロン）にレオメータを接続した。蒸発を防ぐために多湿のチャンバーを作る方式を使用する。さらに、試料と大気の間の変換を最大限防ぐため、支持体の導管にシリコーン油（５０ｍＰａ・ｓ）を加えた。

コンピュータとレオウィン（Ｒｈｅｏｗｉｎ）（登録商標）ソフトウエアによってレオメータを制御した。
［実施例５：ポリマーネットワークに対する第２のポリマーの分解の効果の検討］
この実施例の目的は、本発明の生体材料における第１の酵素による第２のポリマーの分解の効果を明らかにすることである。

この実施例では、実施例１Ａ−ａ）に記載された方法に従ってゲルの調製を実施した。
この実施例で使用した化合物は、実施例１Ａ−ａ）で付与されたものと同一である。
生体材料の弾性についての種々の測定を、実施例４で付与されたレオメータによって実施した。

実施例では、実施例４で付与された方法に従って、生体材料の弾性または弾性率を測定した。
実施例では、実施例４で付与された方法によって生体材料の粘性を測定した。

この実施例では、調べた生体材料は、
・第１のポリマーとしてのゼラチン、従って第１のポリマーネットワークとしてのゼラチンゲル（ゲル（Ａ））と、
・第２のポリマーとしてのヒアルロン酸と、
・第１の酵素としてのヒアルロニダーゼと、を含む。

この実施例では、７％のゼラチンと１％のヒアルロン酸との溶液に種々の濃度のヒアルロニダーゼを添加した。次いで、４０℃から２７℃までの温度勾配をゲル化に適用した。ヒアルロニダーゼの濃度は１、５、１０Ｕ／ｍＬである。この濃度範囲によってゲル化に対するヒアルロン酸の分解の、推定される効果を評価し、これらの効果を数値化することも可能になる。

ヒアルロニダーゼを含有するゲルすべてについて、９００分後、ゼラチン物理ゲルのみのそれと同等の値を有するＧ’に向かって弾性が集中すると思われる。同時に、ヒアルロニダーゼの濃度の関数として粘性（Ｇ”）は低下することが特徴である（図３）。

従って、この結果は、ヒアルロン酸の分解がゲル化した媒体で生じうることを示す。
ヒアルロン酸の分解から生成されたオリゴマーの効果は、物理ゲルのゲル化では認められなかった（結果は示さない）。

第２のポリマーの分解がポリマーネットワークに作用しないことを示すために、偏光分析法によって生体材料を観察した。
１％のヒアルロン酸と、７％のゼラチンと、１Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼとを含有する溶液を実施例１に記載された方法に従ってゲル化させた。偏光分析法によって三重螺旋の形成を、時間を追って監視し、酵素の非存在下における同じ溶液のそれと比較した。

使用した偏光計は、ジュラボ（Ｊｕｌａｂｏ）Ｆ２５クライオスタットを備えたジャスコ（Ｊａｓｃｏ）１１００（登録商標）であり、温度はコンピュータ管理される。該偏光計は、０．００１°の精度で角度を測定する。ガラスのセルが０．１ｄｍの光学パスおよび１ｍＬの体積を有する。クライオスタットに接続した水循環式のジャケットによって、キュベットを温度調節することができる。従って、このように調節された温度を、偏光計に接続したプローブによってキュベット中で直接測定した。検討の測定はすべて４３６ｎｍで実施した。

コンピュータを偏光計に接続し、ソフトウエアが時間の関数としてキュベットにおける角度と温度を記録する。ジャスコのソフトウエアは、「スペクトラマネージャー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｎａｇｅｒ）」（登録商標）であるが、クライオスタットは、「ジュラボイージーテンプ（Ｊｕｌａｂｏ Ｅａｓｙ Ｔｅｍｐ）」ソフトウエア（登録商標）を用いて管理する。

図４の曲線によって示されるように、ゼラチンの三重螺旋形成の動態はどのような種類のゲルでも同一である。９００分後、三重螺旋の含量は２５．５〜２７％の間で変化する。

従って、ヒアルロニダーゼの活性およびその分解生成物も、物理ネットワークにいかなる効果も有しない。従って、タンパク質ネットワークの形成は、可溶性相のリモデリングとは無関係に生じる。

［実施例６：第３の酵素によって形成された第１のポリマーネットワークに対する第２のポリマーの分解の効果の検討］
この実施例では、ゼラチンゲルである第１のポリマーネットワークと、ヒアルロン酸である第２のポリマーと、ヒアルロニダーゼである第１の酵素と、トランスグルタミナーゼである第３の酵素とを含む生体材料を製造する。プロトコルは実施例１Ｃ−ａ）に記載されている。

７％のゼラチンと１％のＨＡ（ヒアルロン酸）との溶液に種々の濃度のヒアルロニダーゼを添加した。４０℃の温度にて１．５Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼを添加することによって化学ゲルのゲル化を得る。

物理ゲルに関しては、使用したヒアルロニダーゼの濃度は、１、５、１０Ｕ／ｍＬである。
ＨＡの分解は、最短時間にわたってのみＧ’の値に対して効果を有する。これは、溶液が速くゲル化すればするほどＧ’が速く上昇するという事実に関連付けられる。しかしながら、９００分後、または１５０分から出発したとしても、種々の試料のＧ’はＨＡを含有していないゲルのそれと同等である。多糖類の分解がどのような状態であれ、共有結合で架橋したゼラチンのネットワークにそれは影響を有しない。

これに対して、ヒアルロン酸の脱重合は、ゲルの粘性に多大な影響を有する。これは、酵素の量がどのようなものであれ、ゼラチンの値に低下する前にＧ”が最大に達するためである（図５）。この実施例は、ゲル（ゲルＡ）を形成する第３の酵素（トランスグルタミナーゼ）によって誘導されたポリマーネットワーク（ゼラチン）の水性相に含まれる第２のポリマー（ＨＡ）の分解は、弾性（Ｇ’）に影響をしないが、水性相の粘性（Ｇ”）にのみ影響することを示す。

［実施例７：本発明に係る生体材料のゲル（Ａ）に対する第２のポリマーと第２の酵素の効果の検討］
実施例の目的は、ゲル（Ａ）に対する第２のポリマーと第２の酵素の効果を明らかにすることである。

この実施例では、調べた生体材料は、
・第１のポリマーとしてのゼラチン、従って第１のポリマーネットワークとしてのゼラチンゲル（ゲル（Ａ））と、
・第２のポリマーとしてのヒアルロン酸と、
・第２の酵素としてのコラゲナーゼと、を含む。

生体材料の調製のために、７％濃度のゼラチンと、１％のヒアルロン酸（重量対体積の比）と、種々の最終濃度のコラゲナーゼ：０．９５×１０^−４、１．１２×１０^−４、１．２９×１０^−４Ｕ／ｍＬとによって試料を調製した。ゼラチン粉末を、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液と共にインキュベートして、４℃にて１５分間保管した。次いで、溶液の表面にヒアルロン酸を載せる。次いで、長くとも１５分間、４０℃にて撹拌することによってそれを可溶化した。最終濃度よりも少なくとも５倍高い開始濃度で同一緩衝液にて予め調製したコラゲナーゼの溶液をゼラチンとヒアルロン酸の調製物に混合する。

物理ゲルを得るために、１分当たり温度を０．５℃低下させて４０℃から２７℃までの温度勾配を溶液に適用した。
ヒアルロン酸の存在下で、Ｇ’の値は１７０分を超えて経時的に低下するが、３１分（多糖類なしでの４０分に対して）での生体材料のゲルは、１１６．５ＰａのＧ’_ｍａｘと、６４．４ＰａのＧ”_ｍａｘを示し、９００分（Ｇ’＝Ｇ”として概算した）後、全体的な再可溶化を示さない。従って、多糖類によって導入された物理化学的修飾および分子修飾もしくは物理化学的修飾または分子修飾に従ってゲルの動態および粘弾性は大幅に変化する（図６Ａ）。１．２９×１０^−４Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ濃度を用いてゲル（参考として、ゲル／ゾルの転移時間についてはＧ’＝Ｇ”である）の全体的な再可溶化を得ることが可能である（図６Ｂ）。

従って、我々は、第２のポリマー（ＨＡ）を一体化することによって、特許文献１に記載されたように、ゾル／ゲルに次いでゲル／ゾルへの二重転移が可能であることを示している。

［実施例８：本発明に係る生体材料の第３の酵素によって形成されるゲル（Ａ）に対する第２のポリマーと第２の酵素の効果の検討］
この実施例の目的は、第１のポリマーネットワーク（ゼラチンゲル）における第２の酵素（コラゲナーゼ）と第３の酵素（トランスグルタミナーゼ）の作用によって触媒される、ゾル／ゲルに次ぐゲル／ゾルへの二重転移が第２のポリマー（ＨＡ）の存在によって影響されるかどうかを決定することである。

生体材料の調製のために、７％濃度のゼラチンと、１％のヒアルロン酸（重量対体積の比）と、１．５Ｕ／ｍＬのトランスグルタミナーゼと、種々の最終濃度のコラゲナーゼ（２．０６×１０^−４、２．３２×１０^−４、２．５８×１０^−４Ｕ／ｍＬ）とによって試料を調製した。ゼラチン粉末を、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液と共にインキュベートし、４℃にて１５分間保管した。次いで、溶液の表面にヒアルロン酸を載せる。次いで、長くとも１５分間４０℃にて撹拌することによってそれを可溶化した。最終濃度よりも少なくとも５倍高い開始濃度で同一緩衝液にて予め調製したヒアルロニダーゼとトランスグルタミナーゼの溶液を、ゼラチンとヒアルロン酸の調製物に混合する。

ゼラチン／ＨＡ系は３．１分以内にゲル化するが、「ゼラチンのみ」の系は１５分でゲル化する。Ｇ’_ｍａｘの値が２６４Ｐａであり（ＨＡなしでは５０Ｐａ）、Ｇ”_ｍａｘの値が６１．７Ｐａである（ＨＡなしでは４．４Ｐａ）ので、多糖類の存在下で最大粘弾性も大きく上昇する。最終的に、ゲルの全体的な再可溶化時間は、ほかの場合で１５２分であるのに対して３９６分である（図７）。

従って、ヒアルロン酸の固有の粘弾性は、さらに強いゲルを付与するようにゲル化が生じると、系の粘弾性をさらに迅速に高めるように導き、最終的に、コラゲナーゼによるその再可溶化を制限する。

従って、第１のポリマーネットワークにおける第２の酵素と第３の酵素の作用によって触媒される、ゾル／ゲル（Ａ）に次ぐゲル（Ａ）／ゾルの二重転移は、第２のポリマーの存在によって影響される。

［実施例９：第２の酵素の作用と組み合わせた第１の酵素による第２のポリマーの分解の、本発明に係る生体材料のゲル（Ａ）に対する効果の検討］
実施例の目的は、第１のポリマーネットワーク（ゼラチンゲル）における第２の酵素（コラゲナーゼ）の作用によって触媒される、ゾル／ゲルに次ぐゲル／ゾルへの二重転移が、第１の酵素（ヒアルロニダーゼ）による第２のポリマー（ＨＡ）の分解に影響されるかどうかを決定することである。

生体材料は、実施例８のプロトコルに従って調製する。
粘弾性の変化は使用するＨアーゼ（Ｈａｓｅ）の量によって異なる（図８）。ＨアーゼなしのＨＡ入りの生体材料に比べて、レオロジーのパラメータは大幅に低下する。コラゲナーゼとヒアルロニダーゼの間で相乗効果が確立されるようになり、損失弾性率という点と貯蔵弾性率という点の双方でそれを認めることができる。

従って、ポリマーネットワーク（ゼラチンゲル）における第２の酵素（コラゲナーゼ）の作用によって触媒される、ゾル／ゲル（Ａ）に次ぐゲル（Ａ）／ゾルの二重転移が、第１の酵素（ヒアルロニダーゼ）による第２のポリマー（ＨＡ）の分解に影響される。

生体材料を調製する間、実施例１Ｂに記載されたように、コラゲナーゼをサーモリシンまたはトリプシンと置き換える場合、同じ結論を提示することができる。
［実施例１０：第２の酵素の作用と組み合わせた第１の酵素による第２のポリマーの分解の、第３の酵素によって形成されたゲル（Ａ）に対する効果の検討］
実施例の目的は、第３の酵素（トランスグルタミナーゼ）によって形成されたポリマーネットワーク（ゼラチンゲル）における第２の酵素（コラゲナーゼ）の作用によって触媒されるゾル／ゲル−ゲル／ゾルへの二重転移が、第１の酵素（ヒアルロニダーゼ）によって生成される第２のポリマー（ＨＡ）の分解に影響されるかどうかを決定することである。

生体材料は、実施例Ｄのプロトコルに従って調製する。
ＨＡを伴った生体材料の特徴は、使用したヒアルロニダーゼの濃度に左右される（図９）。

従って、２つの加水分解酵素の間で相乗効果が確立されるようになると思われ、該相乗効果は、Ｈアーゼがない生体材料と比べて、結果的に、粘弾性のさらに大きな低下を生じる。

従って、第３の酵素（トランスグルタミナーゼ）によって形成された第１のポリマーネットワーク（ゼラチンゲル）における第２の酵素（コラゲナーゼ）の作用によって触媒されるゾル／ゲル−ゲル／ゾルへの二重転移は、酵素（ヒアルロニダーゼ）によって生成される第２のポリマー（ＨＡ）の分解に影響される。

生体材料を調製する間、実施例１Ｄに記載されたように、コラゲナーゼをサーモリシンまたはトリプシンと置き換える場合、同じ結論を提示することができる。
［実施例１１：本発明に係る生体材料によるアズールブルーの放出］
この実施例では、生体材料からのアズールブルーの放出を検討した。調べた生体材料は、
・第１のポリマーとしてのゼラチン、従って第１のポリマーネットワークとしてのゼラチンゲル（ゲル（Ａ））と、
・第２のポリマーとしてのヒアルロン酸と、
・第１の酵素としてのヒアルロニダーゼと、
・第３の酵素としてのトランスグルタミナーゼと、
・アズールブルーと、を含む。

本実施例では、種々のゲル中で、ゼラチンは７％の濃度であり、トランスグルタミナーゼは１Ｕ／ｍＬである。存在する場合、ヒアルロン酸は１％の濃度であり、ヒアルロニダーゼは１５Ｕ／ｍＬである。

１．２５ｍｇ／ｍＬのアズールブルー（シグマ社）を含有する、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液をゼラチン粉末に加える。次いで、１．５％のヒアルロン酸溶液をゼラチン溶液に加え、混合物を４０℃にて３０分間インキュベートする。同じ緩衝液で調製した酵素溶液（トランスグルタミナーゼのみ、またはトランスグルタミナーゼとヒアルロニダーゼ）を、次いでゼラチン溶液に混合する。混合物を４０℃に置く。

こうして、ゼラチンとトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）とアズールブルーを含有するゲルを得た。ゼラチンとヒアルロン酸（ＨＡ）とトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）とアズールブルーを含有するゲルを得た。最終的にゼラチンとヒアルロン酸（ＨＡ）とトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）とヒアルロニダーゼとアズールブルーを含有するゲルを得た。

種々のゲルが含有される媒体の光学密度（６３０ｎｍにおけるＯＤ）を測定することによって、時間の関数としておよびゲルの関数としてアズールブルーの放出を測定した（図１０）。

アズールブルー放出を、ゲルの成分の関数として測定する（図１０）。
この実験は、本発明に係る生体材料が物質の放出を可能にし、この放出が制御されることを明瞭に実証している。

［実施例１２：本発明に係る生体材料によるヒアルロン酸の放出］
この実施例では、生体材料からのヒアルロン酸の放出を検討した。調べた生体材料は、・第１のポリマーとしてのゼラチン、従って第１のポリマーネットワークとしてのゼラチンゲル（ゲル（Ａ））と、
・第２のポリマーとしてのヒアルロン酸と、
・第１の酵素としてのヒアルロニダーゼと、を含む。

生体材料はすべて３％のゼラチンを含有し、２０℃でのインキュベートによって得られた。存在する場合、ヒアルロン酸は１％の濃度であり、ヒアルロニダーゼは１５Ｕ／ｍＬである。

ゲルは、以下の方法によって得られた：ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液をゼラチン粉末に加えた。次いで１．５％のヒアルロン酸溶液をゼラチン溶液に加え、次いで混合物を４０℃にて１５分間インキュベートした。

ヒアルロニダーゼを含有するゲルについては、同じ緩衝液で調製した酵素を含有する溶液を次いでゼラチン溶液に加え、混合物を２０℃に置いた。
ゲルからのヒアルロン酸の放出は、偏光分析法によって評価した。使用した偏光分析法は実施例５のものと同一であった。この物質放出は、寸法の関数として制御され、時間をかけて制御される。

従って、本発明に係る生体材料は、ゼラチンゲルに含まれるヒアルロン酸の制御された放出を可能にする。

単純なゲルの水性相に含有される物質の放出は、水性相の粘性を変更することによって調節される。
従って、本発明の生体材料は、物質の制御された放出を可能にする。

Claims (26)

1. 水性相と第１のポリマーネットワークとを含む生体材料において、第１のポリマーネットワークは、第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物から構成され、第１のポリマーネットワークと水性相とは第１のゲル（Ａ）を形成し、生体材料は、
   前記第１のポリマーとは異なる、第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物であって、ゲル（Ａ）の水性相に溶解した状態で、または第２のゲル（Ｂ）の形態で、ゲル（Ａ）に含まれている、第２のポリマーと、
   第２のポリマーを分解するための第１の酵素と、を含む生体材料。
2. タンパク質のポリマーは、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロブリン、コラーゲンおよびゼラチン、乳タンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、卵黄および卵白タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ソラマメタンパク質、亜麻タンパク質、絹タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、およびビトロネクチンから選択される請求項１に記載の生体材料。
3. 糖類のポリマーは、カラギーナン、アルギナート、キサンタン、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、硫酸化グリコサミノグリカン、グリコーゲン、セルロース、ペクチン、デンプン、デキストラン、およびキシランから選択される請求項１または２に記載の生体材料。
4. 第１の酵素は、メタロプロテイナーゼ族と、セリンプロテアーゼ族と、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ族と、ＡＤＡＭ族と、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ、キサンタナーゼ、キトサナーゼ、およびヒアルロニダーゼを含むグリコシダーゼ類と、ヒドロキシアセチルリアーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、およびアルギン酸リアーゼを含むリアーゼ類とから選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体材料。
5. 第１のポリマーネットワークを分解することが可能であり、かつ、第１の酵素とは異なる、第２の酵素を含み、第１のポリマーネットワークは、第２の酵素の作用の下、ゲル（Ａ）／溶液の転移を行うことが可能である請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体材料。
6. 前記第２の酵素は、メタロプロテイナーゼ族と、セリンプロテアーゼ族と、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ族と、ＡＤＡＭ族と、アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ、キサンタナーゼ、キトサナーゼ、およびヒアルロニダーゼを含むグリコシダーゼ類と、ヒドロキシアセチルリアーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、およびアルギン酸リアーゼを含むリアーゼ類とから選択される請求項５に記載の生体材料。
7. 生体材料は、第１のポリマーまたは第１のポリマーの混合物の間に結合を生成することが可能であり、かつ、第１の酵素および第２の酵素とは異なる、第３の酵素を含み、第３の酵素は溶液／ゲル（Ａ）の転移を触媒することが可能である請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体材料。
8. 第３の酵素は、リシルオキシダーゼと、トランスグルタミナーゼと、トロンビンと、ジスルフィドイソメラーゼタンパク質と、スルフヒドリルチオールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、リポキシゲナーゼと、アルギン酸エピメラーゼ、グルクロン酸イソメラーゼ、セロビオースエピメラーゼ、およびガラクトース−６−スルフリラーゼを含むエピメラーゼとから選択される請求項７に記載の生体材料。
9. 生体材料は、第２のポリマーまたは第２のポリマーの混合物の間に結合を生成することが可能であり、かつ、第１の酵素、第２の酵素、および第３の酵素とは異なる、第４の酵素を含み、第４の酵素は溶液／ゲル（Ｂ）の転移を触媒することが可能である請求項１〜８のいずれか一項に記載の生体材料。
10. 第４の酵素は、リシルオキシダーゼと、トランスグルタミナーゼと、トロンビンと、ジスルフィドイソメラーゼタンパク質と、スルフヒドリルチオールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、リポキシゲナーゼと、アルギン酸エピメラーゼ、グルクロン酸イソメラーゼ、セロビオースエピメラーゼ、およびガラクトース−６−スルフリラーゼを含むエピメラーゼとから選択される請求項９に記載の生体材料。
11. 第１のポリマーネットワークは、ゼラチンゲル、フィブリンゲル、およびアルギナートゲルから選択される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生体材料。
12. 第１のポリマーネットワークまたは第１のポリマーの混合物の量は、生体材料の総重量に対して０．１〜２０重量％の間である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の生体材料。
13. 第２のポリマーまたは第２のポリマーの混合物の量は、生体材料の総重量に対して０．０１〜２０重量％の間である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の生体材料。
14. ゲル（Ａ）の水性相、ゲル（Ｂ）、またはその両方に活性物質が溶解している請求項１〜１３のいずれか一項に記載の生体材料。
15. 活性物質は、静菌剤と、殺菌剤と、染料と、タンパク質と、糖類と、リポソームと、ナノ粒子と、ミセルと、抗ニキビ剤と、抗アレルギー剤と、抗不安薬と、抗喘息剤と、抗癌剤と、脂質低下薬と、ホルモン性避妊薬と、抗うつ剤と、糖尿病治療薬と、鎮痛薬と、強
    壮薬と、血圧降下剤と、抗真菌剤と、抗生剤と、催眠剤と、ホルモン治療剤と、偏頭痛治療薬と、過剰体重を治療するために使用される薬剤と、パーキンソン病治療薬と、神経弛緩薬と、非ステロイド性抗炎症剤と、排卵誘発剤と、粘液溶解薬と、鎮咳剤と、勃起誘発剤と、および抗潰瘍剤とから選択される請求項１４に記載の生体材料。
16. 前記染料は、エオシン、デキストランブルー、メチレンブルー、およびアズールブルーから選択される、請求項１５に記載の生体材料。
17. 前記糖類は、ヒアルロン酸およびアルギナートから選択される、請求項１５に記載の生体材料。
18. 請求項１に記載の生体材料を調製するための方法であって、
    ａ）水性相において、第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物から構成される第１のポリマーネットワークを形成する工程であって、第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第１のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物が第１のポリマーネットワークを形成する前記工程と、
    ｂ）第２のポリマーネットワークを形成することが可能であり、かつ、第１のポリマーまたは第１のポリマーの混合物とは異なる、第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマー、または第２のタンパク質のポリマーもしくは糖類のポリマーの混合物を添加する工程と、を含み、
    前記添加する工程は第１のポリマーネットワークの形成の前に実行される方法。
19. 工程ｂ）において、第２のポリマーまたは第２のポリマーネットワークを分解することが可能である第１の酵素を添加することを含む請求項１８に記載の方法。
20. 工程ｂ）において、第１のポリマーネットワークの結合を分解することが可能である第２の酵素を添加することを含む請求項１８または１９に記載の方法。
21. 工程ｂ）において、第１のポリマーの間に結合を生成することが可能である第３の酵素を添加することを含む請求項２０に記載の方法。
22. 工程ｂ）において、第２のポリマーの間に結合を生成することが可能である第４の酵素を添加することを含む請求項２１に記載の方法。
23. 工程ｂ）において、少なくとも１つの活性物質を添加することを含む請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の生体材料を含む、活性物質の制御された放出を行うための用具。
25. 医療用具と、介護用具と、包帯と、含浸圧定布と、帯具と、外科用包帯と、眼科用包帯と、歯科用包帯と、縫合製品と、治療用具と、整形外科物品と、外科用インプラントと、貼付剤と、経皮ゲルと、能動パッチと、軟組織用の内人工器官およびインプラントと、組織工学のための用具と、再構築材料と、細胞培養用の用具と、培養培地と、培養支持体とから選択される請求項２４に記載の用具。
26. 前記医療用具は、コンタクトレンズ、電極、およびセンサから選択される、請求項２５に記載の用具。