JP5504405B2

JP5504405B2 - 血管病予防に効果を有する食品組成物

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Publication number: JP5504405B2
Application number: JP2011288140A
Authority: JP
Inventors: 誠小林; 博子岸
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: JP2012102125A

Description

本発明は、血管病を予防するための食品組成物に関し、詳しくは、魚類などから得られる不飽和脂肪酸の一種であるエイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、以下ＥＰＡと略す）を有効成分とし、血管攣縮に起因する血管病予防用に提供される食品組成物に関する。

本明細書において、以下の用語は次の様に定義される。血管攣縮とは、血管平滑筋の異常収縮、特に細胞質カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度の増加に依存しないＣａ^２＋非依存性の収縮を指す。メンブレンラフト（membrane raft）とは、血管表面に形成されるコレステロールおよびスフィンゴ脂質に富んだ細胞膜上の構造を指す。血管病のシグナル伝達の場として重要であり、コレステロールの除去により消失するという特徴を有す。ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡ（シス型エイコサペンタエン酸）とは、分子中に含まれる二重結合の全てがシス位に配位したＥＰＡを指し、ｔｒａｎｓ−ＥＰＡ（トランス型エイコサペンタエン酸）とは、分子中の少なくとも１個以上の二重結合がトランス位に配位した、ａｌｌ−ｃｉｓ型ではないＥＰＡを指す。

血管攣縮とそれに伴う突発的な血行障害は、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞などを引き起こし、これらの疾患による突然死の死亡者数が毎年６万人を数えるなど、社会的にも重大な問題となっている。特に、くも膜下出血後に高頻度で起こる「脳血管スパズム」は、脳の血管の大部分が攣縮して広範囲にわたり脳が梗塞状態に陥る疾患であり、くも膜下出血の手術が成功したにもかかわらず患者さんの命が救えないといった、深刻な事態を引き起こしている。

血管の収縮にはＣａ^２＋に依存した「正常収縮」と、Ｃａ^２＋に依存しない「異常収縮（攣縮）」が知られており、正常収縮についてはその機構を含めかなりの部分が明らかになってきている。このため、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞などの疾患に対しては、まず機構の明らかな正常収縮の阻害、特にＣａ^２＋チャネルの阻害による治療法や治療薬が提示されている（特許文献１）。

しかしながら、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞などの疾患に対しより重要な関連を持つ血管攣縮については、ほとんど詳細が明らかになっていない。現時点における前記疾患の治療法は、疾患への関連性が少ない正常収縮を抑制することにより血管の収縮を抑制するという、いわば見かけ上の治療法であり、本質的な治療法、すなわち血管攣縮の原因究明と対策が切望されている。

本発明者らは、上記問題を解決すべく研究を重ね、血管攣縮にはスフィンゴ脂質の一種であるスフィンゴシルフォスフォリルコリン(sphingosylphosphorylcholine、以下ＳＰＣと略す)が重要な役割を持つこと、ＳＰＣはＲｈｏｋｉｎａｓｅの活性化を介してＣａ^２＋非依存的に血管平滑筋を収縮させること、更にはＳＰＣによりＦｙｎという別のタンパク質が活性化され、これが血管平滑筋細胞膜壁上のメンブレンラフトと呼ばれる構造に結合することがＲｈｏｋｉｎａｓｅの活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにした。これらの事実は、ＳＰＣの刺激による一連のＲｈｏｋｉｎａｓｅ活性化過程をどこかで阻害することができれば、血管の正常な収縮を阻害することなく血管攣縮を治療できる可能性を示唆した（図１、非特許文献１−４）。

上記予測に基づき、本発明者らは研究を進め、ＳＰＣによる血管攣縮を特異的に阻害する効果のある物質として、魚類などに含まれる高度不飽和脂肪酸の一種であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を見出した。

ＥＰＡは海産植物プランクトンや青魚に多く含まれる高度不飽和脂肪酸の一種であり、これまでに血小板凝固の抑制、血栓の溶解などの効果が報告されている（特許文献２）。これに加えて本発明者らは、ＥＰＡが平滑筋異常収縮を阻害し、かつ平滑筋の正常収縮には全く影響しないという事実を明らかにした（特許文献３）。すなわち、本発明者らにより、脳血管スパズムの様な循環器系疾患に対する新規な治療法が確立された。

しかるに、血管攣縮に起因する種々の疾患に対しては、治療と並んでその予防も極めて重要である。脳血管攣縮や冠血管攣縮はいずれも重篤な疾患につながるものであり、症状が現れてから適切な対策を講じるのは勿論のこと、これらの疾患につながるリスクを軽減し、日々の生活の中で疾患発生を予め防ぐことが重要である。しかしながら、これまでのところ、血管攣縮の予防に効果のある物質を主成分とする機能性食品については、報告が無い。

また、血管攣縮に効果のあるＥＰＡの使用に関しては、高濃度の脂肪酸を血液に注射することの危険性もあり、「経口投与」が主たる投与形態になると考えられるが、下記実施例でも述べる通り、ＥＰＡの腸管における吸収効率は健康状態、年齢によって大きく左右される。特に疾患等で体力が著しく低下している患者さんなどにおいては、ＥＰＡを投与しても腸管において十分に吸収されず、期待される効果が現れないといった問題が考えられ、血管攣縮に起因する疾患を予防し、かつ、健康状態にかかわらず効率的に有効成分の摂取が可能な食品組成物の開発が待たれていた。

特開２００４−４３３７４号公報カルシウムチャンネル阻害剤特開平９−１７６００５号公報オメガ−３系のポリ不飽和脂肪酸を併用するＬ−カルニチンまたはアルカノイルＬ−カルニチン含有医薬組成物特開２００１−２６１５５６号公報平滑筋異常収縮の抑制剤

月刊バイオインダストリー２００３年１１月号「エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）による血管攣縮の予防効果」 Nakao F, Kobayashi S.et al. (2002) Circ.Res. 91：953-960 Shirao S, Kobayashi S.et al. (2002) Circ.Res. 91：112-119 Somlyo A.V. (2002) Circ.Res. 91：83-84（Editorials）

本発明は、上記の現状に鑑み、血管攣縮に起因する種々の疾患の予防に関連して、血管攣縮の原因物質であるＳＰＣにより活性化される反応経路を特異的に阻害する物質を有効成分とし、血管攣縮に起因する種々の疾患の予防用食品組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、血管平滑筋の攣縮について研究を進め、ＥＰＡがＳＰＣ−Ｒｈｏｋｉｎａｓｅ系のシグナル伝達作用を阻害することを見いだし、更に今回、この作用が、メンブレンラフトへのＦｙｎタンパク質の移動を阻害することによって起こる事を新たに見いだし、本発明を完成した。また本発明者が発見したＥＰＡの効果は、疾患を起こした部位に作用してそれを治療するといったものではなく、血管攣縮を起こす可能性があるメンブレンラフトに作用し血管の攣縮を抑えるという、いわば予防的で穏やかな作用であり、本発明を食品組成物に応用することで血管病の予防に効果のある食品を製造することが可能となることを示した。

また本発明は、有効成分であるＥＰＡを経口投与する際の問題と考えられる「腸管における吸収効率」を解決するため、胆汁の分泌を促進し、かつ食品組成物として危険性の無い動植物由来の補助成分も含むものであり、疾患などで胃腸の働きが弱った患者さんにおいても効率的にＥＰＡを体内に摂取でき、血管攣縮に起因する疾患を予防可能な食品組成物を提供するものである。

すなわち、本発明の第１の態様は、ＥＰＡを有効成分とする血管病の予防用食品組成物を提供する。

本発明の第２の態様は、ＥＰＡを有効成分とする血管攣縮の予防用食品組成物を提供する。

本発明の第３の態様は、ＥＰＡが実質的にａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡ、及びこれらの薬理学上許容可能な塩またはエステル或いは誘導体のうち少なくとも１つから選ばれる化合物よりなる第１の態様または第２の態様に記載の食品組成物を提供する。

本発明の第４の態様は、魚介類より、摂氏１００度以下の温度で抽出されたＥＰＡを有効成分とする、第１の態様から第３の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第５の態様は、魚介類より、摂氏１００度以下の温度で抽出され、抽出の全工程において生体内での立体構造を保持した状態で抽出されるａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡを有効成分とする、第１の態様から第４の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第６の態様は、スフィンゴシルフォスフォリルコリンによって誘導される血管攣縮の予防用である、第２の態様に記載の食品組成物を提供する。

本発明の第７の態様は、スフィンゴシルフォスフォリルコリンによって活性化されたＦｙｎタンパク質が、血管壁上メンブレンラフトに移動することによって生じる血管攣縮の予防用である、第２の態様から第５の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第８の態様は、ＥＰＡを有効成分とし、吸収補助成分として、セイヨウタンポポ粉末、アーティチョーク粉末、クルクミン９０％粉末、カキ肉エキス、マリアアザミ抽出物、ウルソデオキシコール酸及びウコン抽出物のうち少なくとも１種類を含む、第１の態様から第７の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第９の態様は、吸収補助成分として、セイヨウタンポポ粉末と、アーティチョーク粉末と、クルクミン９０％粉末と、カキ肉エキスと、マリアアザミ抽出物とを含む第８の態様に記載の食品組成物を提供する。

本発明の第１０の態様は、ＥＰＡを有効成分とし、ＥＰＡの酸化防止用補助成分として、アスコルビン酸、トコフェロール、これらの塩またはエステル、ビタミンＥ、大豆発酵エキスのうち少なくとも１種類を含む、第１の態様から第９の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第１１の態様は、ＥＰＡを有効成分とし、消化吸収促進と、高コレステロール血症改善用補助成分として、卵黄レシチンを含む、第１の態様から第１０の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を提供する。

本発明の第１２の態様は、第１１の態様に記載の食品組成物において、更に調整、安定化用補助成分として蜜蝋及び／またはグリセリン脂肪酸エステルを含む、食品組成物を提供する。

本発明の第１３の態様は、第１の態様から第１２の態様のうちいずれかに記載の食品組成物を含む、血管病予防用の機能性食品を提供する。

本発明の第１４の態様は、主成分であるＥＰＡを７０〜７５重量％、セイヨウタンポポ粉末、マリアアザミ抽出物、カキ肉エキス、ウルソデオキシコール酸、ウコン抽出物から選ばれる少なくとも１種類の吸収補助成分を５〜１５％、アスコルビン酸、トコフェロール、これらの塩またはエステル、ビタミンＥ、大豆発酵エキスから選ばれる少なくとも１種類の酸化防止用補助成分を２〜１５重量％、卵黄レシチンを０．５〜２重量％、調整安定化用補助成分を１０〜１２重量％含んでなり、全体で１００重量％となる組成を含む、血管攣縮に起因する血管病の予防用機能性食品を提供する。

本発明の第１５の態様は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分とし、血管攣縮に起因する血管病の予防用機能性食品であって、主成分として７３．６重量％のＥＰＡ（２８％溶液）を含み、ＥＰＡの腸管における吸収効率を高めるための補助成分として、２重量％のセイヨウタンポポ粉末と、２重量％のアーティチョーク粉末と、２重量％のクルクミン９０％粉末と、２重量％のカキ肉エキスと、２重量％のマリアアザミ抽出物とを含み、ＥＰＡの酸化を防止するための補助成分として、２重量％のビタミンＥと、１重量％のビタミンＣと、１重量％の大豆発酵エキスとを含み、摂取時における消化吸収促進と、高コレステロール血症改善のための補助成分として、１重量％の卵黄レシチンを含み、調整、安定化用の補助成分として、１１．４重量％の蜜蝋とグリセリン脂肪酸エステルを含む、第１３の態様に記載の機能性食品を提供する。

中でも、本発明は〔１〕エイコサペンタエン酸（以下「ＥＰＡ」という）を有効成分とし、吸収補助成分として、セイヨウタンポポ粉末、アーティチョーク粉末、クルクミン粉末、カキ肉エキス、及びマリアアザミ抽出物を含むことを特徴とする、血管攣縮の予防用組成物や、〔２〕アスコルビン酸、トコフェロール、またはこれらの塩、ビタミンＥ、大豆発酵エキスから選ばれる少なくとも１種類のＥＰＡの酸化防止用補助成分を含むことを特徴とする、上記〔１〕に記載の組成物や、〔３〕消化吸収促進と、高コレステロール血症改善用補助成分として、卵黄レシチンを含むことを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の組成物や、〔４〕更に調整、安定化用補助成分として蜜蝋及び／またはグリセリン脂肪酸エステルを含むことを特徴とする、上記〔３〕に記載の組成物からなる。

また、本発明は〔５〕上記〔１〕から〔４〕のうちいずれか１に記載の組成物を含む、血管攣縮予防用の機能性食品や、〔６〕エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分とし、主成分として７３．６重量％のＥＰＡ（２８％溶液）含み、ＥＰＡの腸管における吸収効率を高めるための補助成分として、２重量％のセイヨウタンポポ粉末と、２重量％のアーティチョーク粉末と、２重量％のクルクミン９０％粉末と、２重量％のカキ肉エキスと、２重量％のマリアアザミ抽出物とを含み、ＥＰＡの酸化を防止するための補助成分として、２重量％のビタミンＥと、１重量％のビタミンＣと、１重量％の大豆発酵エキスとを含み、摂取時における消化吸収促進と、高コレステロール血症改善のための補助成分として、１重量％の卵黄レシチンを含み、調整、安定化用の補助成分として、１１．４重量％の蜜蝋とグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記〔５〕に記載の機能性食品からなる。

本発明の食品組成物を利用することによって、血管攣縮に起因する種々の疾患に予防効果のある機能性食品を製造することが可能となる。また本発明は、有効成分であるＥＰＡの腸管における吸収効率を高めるための補助成分を含んでおり、これによって消化機能が弱った人や高齢者でも効果的に血管病を予防できる食品を製造することが可能となる。

本発明者らによって明らかにされた、Ｃａ^２＋非依存性血管攣縮に係るＳＰＣ−Ｆｙｎ−Ｒｈｏｋｉｎａｓｅカスケードの模式図を示す。（Ａ）ＥＰＡの分子式を示す。（Ｂ）ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡの立体構造の模式図を示す。（Ｃ）ｔｒａｎｓ−ＥＰＡの立体構造の模式図を示す。ＳＰＣによって誘導される血管攣縮に対するＥＰＡの効果を、その立体構造に着目して比較した。縦軸は血管収縮の度合を示し、横軸は時間を表す。グラフ下部のバーはそれぞれの刺激（カリウム、ＳＰＣ）を与えた時間を表す。ＳＰＣ刺激によって引き起こされた血管攣縮に対し、ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡはｔｒａｎｓ−ＥＰＡに比べて高い抑制効果（時間の早さ及び抑制の度合い）を示した。ＳＰＣ刺激によって誘導される血管攣縮からの回復を、ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡとｔｒａｎｓ−ＥＰＡとで比較した。縦軸はＳＰＣ刺激による収縮からの回復（弛緩）の割合を表す。ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡは、ｔｒａｎｓ−ＥＰＡに比べて、弛緩の割合が有意に高かった（ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０５）。ヒト冠状動脈平滑筋細胞において、ＳＰＣによる刺激はＦｙｎタンパク質のメンブレンラフトへの移動を誘導する（上段左側の矢印）。一方、ＥＰＡによる前処理を行った平滑筋細胞においては、ＳＰＣ刺激によるＦｙｎタンパク質の移動が見られず（下段左側）、ＥＰＡがＦｙｎタンパク質のメンブレンラフトへの移動を阻害することが示された。ＥＰＡ含有食品摂取後の血中ＥＰＡ濃度の変化を、本発明の補助成分無し（Ａ）、補助成分有り（Ｂ）のそれぞれについて調べた。調査対象はＡさん（５０代）、Ｂさん（４０代）、Ｃさん（３０代）の３名で、表２のスケジュールに沿って血液を採取し、ＥＰＡ濃度を計測した。補助成分無しでは、３名ともＥＰＡ濃度の大きな上昇は見られなかったのに対し（Ａ）、補助成分有りでは３名ともＥＰＡ濃度の上昇が見られた。図中縦軸はＥＰＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。ＥＰＡ含有食品摂取後の血中アラキドン酸濃度の変化を、本発明の補助成分無し（Ａ）、補助成分有り（Ｂ）のそれぞれで比較した。ＥＰＡ含有食品を摂取した場合においても、血中のアラキドン酸濃度は大きな変化が見られなかった。図中縦軸はアラキドン酸濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。図６、図７の結果を、ＥＰＡ含有食品摂取時（０ｈ）の濃度を１００とした相対値で表した。各成分の血中濃度のうち、「補助成分有りのＥＰＡ濃度」が最も大きな上昇率を示した。図中縦軸は脂肪酸濃度の相対値（０ｈ＝１００）を表し、ＡＲＡ（Ｓｏｌｉｄｂａｒ）はアラキドン酸を表す。

以下に本発明を詳細に説明する。本発明の第１の態様は、ＥＰＡを主成分とし、血管病の予防に効果のある食品組成物である。ＥＰＡそれ自体は公知の物質であり、血栓溶解などに効果を持つことがこれまでに知られているが、血管病の予防に効果のある物質としてのＥＰＡはこれまでに知られておらず、本発明により初めて明らかとなった。

本発明の第２から第５の態様においては、ＥＰＡを有効成分とし、血管攣縮に起因する血管病の予防用食品組成物が提示される。本発明におけるＥＰＡは、好ましくはａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡであって、更に好ましくは、魚介類より抽出されるａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡであって、抽出の全工程において立体構造を保持した状態で抽出されるａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡである（図２）。前記立体構造を保持するためには、例えば、抽出工程において摂氏１００度以上の加熱を受けないことが望ましいが、実施例で述べるとおり、重要なのはＥＰＡの立体構造であって、抽出温度そのものは本発明を何ら限定するものではない。これは、これまでに知られている健康食品の組成物としてのＥＰＡが、その抽出の過程で高温条件にさらされる事が多く、その結果としてＥＰＡ分子の５つの二重結合のうち少なくとも１個、あるいは２個又は３個以上がトランス位に置き換わったｔｒａｎｓ−ＥＰＡに変化していることを考慮に入れたものであり、実施例で示す様に、実質的にａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡはｔｒａｎｓ−ＥＰＡに比べて血管攣縮に対する効果を持つことが本発明者によって初めて明らかになった事を考慮したものである。

本発明の第６、第７の態様においては、ＥＰＡを有効成分とし、下記要因が引き起こす血管攣縮に起因する血管病の予防用食品組成物が提示される。本態様における血管病は、詳しくは、スフィンゴシルフォスフォリルコリン（ＳＰＣ）によって誘導されるＣａ^２＋非依存性の血管異常収縮に起因するものであって、更に詳しくは、前記血管病に対するＥＰＡの作用がＳＰＣによって活性化されたＦｙｎタンパク質の血管壁上メンブレンラフトへの移動を阻害するものであることを特徴とする。本発明者らによって、Ｆｙｎタンパク質がＳＰＣの刺激によって活性化されメンブレンラフトに移動し、活性化されたＦｙｎタンパク質がＲｈｏｋｉｎａｓｅを活性化することで血管攣縮を引き起こすことが明らかとなった（図１）。メンブレンラフトは血管壁にコレステロールが沈着することで形成される構造であり、ＥＰＡはこの構造にＦｙｎタンパク質が移動するのを阻害する効果を持つことから、本発明は血管攣縮が起こった後の治療だけではなく、血管攣縮に至る過程を阻害する、いわば「予防的」な効果を持つことが初めて明らかとなった。上記態様において、第２から第５の態様に記載のＥＰＡを含む食品組成物もまた、本発明に含まれるものである。

本発明の第８、第９の態様においては、ＥＰＡを有効成分とし、「腸管での吸収効率を高める補助成分」を含む、血管攣縮に起因する血管病の予防用食品組成物が提示される。特に高齢者や疾患の患者さんにおいては、消化器系の機能が低下しており、有効成分が十分に吸収されず期待した効果が現れないという問題がある。この点を考慮し、また健康な状態においても十分な吸収を保証するために、腸管におけるＥＰＡの吸収効率を高めるための補助成分が示される。ここでいう補助成分とは、好ましくはセイヨウタンポポ粉末、アーティチョーク粉末、クルクミン９０％粉末、カキ肉エキス、マリアアザミ抽出物のうち少なくとも１種類であり、より好ましくは上記全てを組み合わせたものである。これら補助成分は全て天然の動植物由来の成分であって、胆汁分泌を促進するものであり、食品としての安全性も確立されたものである。本発明の実施においては、これらを適宜組み合わせて使用すれば良く、その配合割合等は本発明を限定するものではない。また同様に、経口投与される薬剤の吸収効率を高める目的で臨床的に使用されているウルソデオキシコール酸、または本発明が食品組成物であることに鑑み、消費者に添加物として抵抗を感じさせない目的で、ウルソデオシキコール酸を含む「ウコン抽出物」も、本態様の補助成分として有効である。

本発明の第１０の態様においては、ＥＰＡを有効成分とし、「ＥＰＡの酸化を防止する補助成分」を含む、血管攣縮に起因する血管病の予防用食品組成物が提示される。本発明においては、上述の通り立体構造が保持されたＥＰＡ、好ましくはａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡを有効成分としており、その酸化を防止することは本発明の効果を有効に得るために重要である。前記補助成分は、ビタミンＥ、ビタミンＣ、大豆発酵エキスのうち少なくとも１つであり、好ましくはこれら全てである。これら補助成分は抗酸化成分として効果を持つものであるが、ビタミン類はそれ自身でも栄養的に重要な要素であり、本発明の実施形態が健康食品であることを考えれば、これらの補助成分を含むことは食品として好ましいものである。

本発明の第１１、１２の態様においては、ＥＰＡを有効成分とし、「その他の補助成分」を含む、血管攣縮に起因する血管病の予防用食品組成物が提示される。本態様におけるその他の補助成分は、摂取時における消化吸収促進と、高コレステロール血症改善のための卵黄レシチンと、調整、安定化用の蜜蝋とグリセリン脂肪酸エステルである。本発明を利用した機能性食品は、必ずしも健康状態が良好な人のみが利用するものでは無く、これらの場合にも有効に消化吸収される補助成分と調整用成分は、本発明の効果を引き出すために重要である。

本発明の第１３から第１５の態様においては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分とし、更に吸収補助成分、酸化防止成分、消化吸収と高コレステロール血症改善用補助成分及び調整安定化用補助成分を含有する食品組成物を含む、血管攣縮に起因する血管病の予防用機能性食品が提供される。食品の態様は特に本発明を限定するものではないが、魚類から抽出されたＥＰＡがいわゆる「魚臭さ」を持つことから、例えば外側を消化性材料で覆われたカプセル状食品、タブレットなどが提示される。

以下に本発明の実施例を述べる。
（標本の調製）
ブタ冠状動脈（左前下行枝）を主幹分岐部から１ｃｍ遠位で約３ｃｍ切り取り、あらかじめ混合ガス（９５％Ｏ_２，５％ＣＯ_２）を通気し氷冷したＫｒｅｂｓ液（１２３ｍＭＮａＣｌ，４．７ｍＭＫＣｌ，１５．５ｍＭＮａＨＣＯ_３，１．２ｍＭＭｇＣｌ_２，１．２５ｍＭＣａＣｌ_２，１１．５ｍＭＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ）に浸した。以下サンプル調製は上記Ｋｒｅｂｓ液を１５分おきに交換しながら行った。血管の周りの脂肪を取り除いた後、外膜を取り除き、綿棒で内皮を除去し、剃刀を用いて平滑筋条片１ｍｍ×４ｍｍを作製した。

（平滑筋条片へのＦｕｒａ−２（Ｃａ^２＋指示薬）の負荷）
まず試験管に混合液を負荷したＫｒｅｂｓ液２ｍｌを入れ、１００μｌのｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）を加えて十分にピペッティングを行った。次にその１ｍｌを１．５ｍｌチューブに移した。暗室で５０μｇのＦｕｒａ−２ＡＭ（ＤＯＪＩＮＤＯ）に４０μｌのＤＭＳＯを加えた後、５０−６０回ピペッティングをし、そのうちの１０μｌを上記１．５ｍｌチューブに加え、すぐに十分にピペッティングをした。その後、遮光してある超音波破砕装置で氷冷しながら５分間破砕を行い、激しく撹拌する操作を６回繰り返した。暗室で１．５ｍｌチューブから元の試験管にＦｕｒａ−２ＡＭを溶かした液を戻し、上記標本を入れ、３７℃に保ち、Ｆｕｒａ−２を４時間負荷した。４時間後、標本を取り出し、Ｋｒｅｂｓ液に浸し４５分間おき、細胞に付着したＦｕｒａ−２ＡＭを除いた後、平滑筋条片を測定装置に取り付けた。

（装置）
Ｆｕｒａ−２を負荷した平滑筋条片は、容積５ｍｌのマグヌス管中で３７℃に保たれた。平滑筋条片を吊したワイヤーをトランスデューサー（ＦＤピックアップ：日本光電社製）につなぎ、増幅器（歪圧力用アンプ：日本光電社製）を通して記録計（卓上型ペンレコーダーＵ−２２８：Pantos社製）で張力を検出した。細胞内Ｃａ^２＋濃度測定には、蛍光測定装置（ＣＡＭ２３０：JASCO社製）を用いて、平滑筋条片を３４０ｎｍと３８０ｎｍの光で交互に励起し、その蛍光強度の比（Ｆ３４０／３８０）を検出することによって測定した。

（測定方法）
１１８ｍＭ高カリウム溶液による脱分極性の収縮を１５分間起こし、その後Ｋｒｅｂｓ液で１５分間弛緩させる操作をくり返し、高カリウム脱分極による張力の波形が安定したところで、４０ｍＭカリウム溶液を加え、その収縮がプラトーに達したところでBradykinin（ブラジキニン）を１μＭ加えて内皮の有無を確認した。Bradykininによって平滑筋が弛緩しない場合、内皮が除去されていると判断した。その後、Ｋｒｅｂｓ液で１５分弛緩させ、３０μＭＳＰＣで刺激を加えた。更に、ＳＰＣ刺激による張力が最大かつプラトーになったところで、ＥＰＡを最終濃度が６０μＭになるように加えた。またＥＰＡは、生体内の立体構造を保持したａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡと、高温処理等によって分子内の二重結合の１個以上がｔｒａｎｓ位に配位したｔｒａｎｓ−ＥＰＡの両方の効果を同一実験条件下で比較した。

（結果）
血管平滑筋の収縮実験において、ＥＰＡはＳＰＣによる収縮を抑制する一方で、高カリウム脱分極による収縮は抑制しなかった。この実験において細胞内Ｃａ^２＋濃度の変化も同時に測定したが、ＳＰＣによる収縮は細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇を伴わないのに対し、高カリウム脱分極による収縮は細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇を伴い、ＥＰＡが異常収縮（細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇を伴わない）を抑制する一方で正常収縮（細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇を伴う）には影響しない事を明らかにした。

血管攣縮に対するＥＰＡの効果を、その立体構造に注目して調べた。３０μＭＳＰＣ投与処理によって誘導される血管攣縮のシグナルを指標とし、ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡとｔｒａｎｓ−ＥＰＡのそれぞれを処理した時の血管攣縮を比較した（図３、図４）。グラフに示すとおり、ａｌｌ−ｃｉｓ−ＥＰＡはｔｒａｎｓ−ＥＰＡに比べ、血管攣縮抑制の早さ、程度ともに有意に高い効果を示した。

（メンブレンラフトへのＦｙｎの結合に対する、ＥＰＡの阻害的作用）
ヒト冠状動脈平滑筋（ＣＡＳＭＣｓ，Cambrex社製）は、ＳｍＧＭ−２培地で培養した。実験２４時間前に血清を除去し、６０μＭのＥＰＡで１０分間前処理し、３０μＭのＳＰＣにて５分間刺激した後、Ｆｙｎの局在と、メンブレンラフトに局在すると言われるＣａｖｅｏｌｉｎ−１タンパク質の局在の関係を、免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡観察（ＬＳＭ−５１０，Carl Zeiss社製）により検討した。結果を図５に示す。対照のＥＰＡ前処理をしなかった細胞（上段）では、ＳＰＣ刺激によりＦｙｎタンパク質が細胞内から形質膜に結合し（左側、矢印）、またＣａｖｅｏｌｉｎ−１（中央）と共局在して（右側に合成像）、ＳＰＣ刺激によりＦｙｎタンパク質がメンブレンラフトに移動する事が示された。一方、ＥＰＡ前処理をした細胞（下段）においては、ＳＰＣ刺激によるＦｙｎタンパク質の形質膜への移動が見られず（左側）、またＣａｖｅｏｌｉｎ−１タンパク質（中央）との共局在も見られなかったことから（右側に合成像）、ＥＰＡがＦｙｎタンパク質のメンブレンラフトへの移動を抑制する事が示された。

（本発明を利用した機能性食品の組成と吸収効率）
ＥＰＡは油であるため、食事に伴い産生される胆汁により分散され、吸収される。しかし、市販のＥＰＡ含有食品には、「食後に服用すべき」等の説明は無く、また摂取後におけるＥＰＡの血中濃度がどの様になるのか等のデータも明らかでない。そこで本実施例では、絶食時におけるＥＰＡの吸収効果を得る目的で、「本発明の補助成分を含むＥＰＡ含有食品（ＥＰＡ−Ｐ）」と「補助成分を含まないＥＰＡ含有食品（ＥＰＡ−Ｎ）」それぞれの絶食時における吸収効率を調べた。「補助成分を含むＥＰＡ含有食品」の組成は表１の通りであり、ＥＰＡ−ＮのＥＰＡ含有量はＥＰＡ−Ｐと同じである。

本実施例における測定スケジュールを、表２に示した。Ａさん（５０代）、Ｂさん（４０代）、Ｃさん（３０代）の３名を対象に、スケジュールの各段階において約１０ｍｌの血液を採取し、血中のＥＰＡ濃度及びアラキドン酸濃度（対照）を計測した。ＥＰＡ−Ｎ，ＥＰＡ−Ｐ各計測の間には約１週間の間隔をおいた。

表２に示したスケジュールの各段階における脂肪酸の濃度を、図６、図７及び表３に示す（ＥＰＡ含有食品摂取前の血中濃度を１００とした相対値は図７と表４）。３名の血中脂肪酸のうち、アラキドン酸濃度（対照）は補助成分の有無によらず１０％前後の上昇を示した。ＥＰＡでは、補助成分無し（Ｎ）ではＣさん（３０代）で６時間後に３７％の増加を示したのに対し、Ａさん（５０代）、Ｂさん（４０代）ではほとんど上昇が見られなかった。これに対して、補助成分有り（Ｐ）では、３名とも４時間後、６時間後それぞれでＥＰＡ濃度が上昇し、６時間後における上昇率はＡさんで５９％、Ｂさんが１３％、Ｃさんが５３％であった。これらの結果は、（１）絶食後など胃腸の働きが弱った状態では、ＥＰＡ含有食品を摂取しても有効成分が血中に届かない場合があり、若年齢（〜３０代）より高年齢（４０代〜）でその傾向が強い（２）これらの状態においても、本発明における補助成分を追加することによって、ＥＰＡが血中に取り込まれるようになる、という事を示唆しており、これはＥＰＡ含有食品における本発明の有効性を示すものである。

（本発明を利用した機能性食品の組成と吸収効率２）
上記実施例７において、ＥＰＡ−Ｐ、ＥＰＡ−Ｎそれぞれの摂取後における血中のＤＨＡ濃度の変化を、ＥＰＡ濃度の変化と対比した（表５、表６）。血中ＤＨＡ濃度は、摂取後４−６時間でやや増加する傾向が見られたが、増加率はＥＰＡに比べ低い数値を示した。本発明の食品組成物が、血中ＥＰＡ濃度を特異的に増加させる事が示された。

本発明は、いわゆる「健康食品産業」において、血管病を予防しうる新たな食品を製造するための食品組成物を提供するものであり、健康に対する意識が高まり、また疾患を日々の生活の中で予防する事の重要性が認識されつつある今日において、本発明の提供する食品組成物は「健康食品」の組成物として利用可能である。

Claims

エイコサペンタエン酸（以下「ＥＰＡ」という）を有効成分とし、吸収補助成分として、セイヨウタンポポ粉末、アーティチョーク粉末、クルクミン粉末、カキ肉エキス、及びマリアアザミ抽出物を含むことを特徴とする、血管攣縮の予防用組成物。
アスコルビン酸、トコフェロール、またはこれらの塩、ビタミンＥ、大豆発酵エキスから選ばれる少なくとも１種類のＥＰＡの酸化防止用補助成分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
消化吸収促進と、高コレステロール血症改善用補助成分として、卵黄レシチンを含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の組成物。
更に調整、安定化用補助成分として蜜蝋及び／またはグリセリン脂肪酸エステルを含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の組成物を含む、血管攣縮予防用の機能性食品。
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有効成分とし、主成分として７３．６重量％のＥＰＡ（２８％溶液）を含み、ＥＰＡの腸管における吸収効率を高めるための補助成分として、２重量％のセイヨウタンポポ粉末と、２重量％のアーティチョーク粉末と、２重量％のクルクミン９０％粉末と、２重量％のカキ肉エキスと、２重量％のマリアアザミ抽出物とを含み、ＥＰＡの酸化を防止するための補助成分として、２重量％のビタミンＥと、１重量％のビタミンＣと、１重量％の大豆発酵エキスとを含み、摂取時における消化吸収促進と、高コレステロール血症改善のための補助成分として、１重量％の卵黄レシチンを含み、調整、安定化用の補助成分として、１１．４重量％の蜜蝋とグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項５に記載の機能性食品。