JP5528126B2

JP5528126B2 - Ｔｒｐａ１の活性抑制剤および活性抑制方法ならびに皮膚外用剤

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Publication number: JP5528126B2
Application number: JP2010002980A
Authority: JP
Inventors: 郁尚藤田; 真也原; 学管野; 健一栗山; 義雄辻野
Original assignee: Mandom Corp
Current assignee: Mandom Corp
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2030-01-08
Also published as: JP2011140471A

Description

本発明は、ＴＲＰＡ１の活性抑制剤および活性抑制方法ならびに皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる皮膚外用剤などに有用であるＴＲＰＡ１の活性抑制剤およびＴＲＰＡ１の活性抑制方法ならびに皮膚外用剤に関する。

パラベン類やアルカリ剤が配合された化粧料などの外用剤をヒトの皮膚に用いた場合、使用者によっては、皮膚に不快な刺激を感じることがある。前記パラベン類やアルカリ剤による不快な刺激は、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）の１つであるＴＲＰＡ１の活性化と関連していることが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、前記ＴＲＰＡ１は、細胞内のアルカリ化により活性化され、活性化されたＴＲＰＡ１を介して痛覚が引き起こされることが、本発明者らによって見出されている（例えば、非特許文献１参照）。

一方、近年、使用者の安全意識の高まりから、このような不快な刺激を与えないか、または不快な刺激が少ない外用剤が好まれる傾向にある。そのため、前記外用剤による皮膚に対する不快な刺激を抑制する物質や方法の開発が求められている。

特開２００８−７９５２８号公報特開２００９−８２０５３号公報特開２００９−２２５７３３号公報

藤田郁尚ら、「細胞内アルカリ化は、マウスのＴＲＰＡ１の活性化を介した痛覚を引き起こす（ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｌｋａｌｉｚａｔｉｏｎｃａｕｓｅｓｐａｉｎｓｅｎｓａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴＲＰＡ１ｉｎｍｉｃｅ）」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００８年１１月１３日、第１１８巻、第１２号、ｐ．４０４９−４０５７、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、［平成２１年１０月７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃｉ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｖｉｅｗ／３５９５７＞

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するＴＲＰＡ１の活性抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するＴＲＰＡ１の活性抑制方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、皮膚に対する刺激性が低い皮膚外用剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有することを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（２）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（３）前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種である前記（２）に記載のＴＲＰＡ１の活性抑制剤、
（４）ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制方法であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制方法、ならびに
（５）アンモニアを含有する皮膚外用剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とする皮膚外用剤
に関する。

本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという優れた効果を奏する。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという優れた効果を奏する。さらに、本発明の皮膚外用剤は、皮膚に対する刺激性が低いという優れた効果を奏する。

試験例１において、実施例１〜４の各活性抑制剤中における炭酸アンモニウムの濃度、比較例１〜４の各試料中におけるアンモニアの濃度または比較例５〜８の各試料中における塩化アンモニウムの濃度と、細胞内ｐＨとの関係を示すグラフである。試験例２において、炭酸水素ナトリウムの濃度とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比_{活性抑制剤または精製水}／Δ蛍光強度比_AITCとの関係を示すグラフである。

１．ＴＲＰＡ１の活性抑制剤
本発明は、１つの側面では、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有することを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤（以下、「活性抑制剤１」という）に関する。

本発明者らは、炭酸イオンに解離する物質を単独で細胞に接触させたときの細胞内ｐＨが、アンモニアを単独で細胞に接触させたときの細胞内ｐＨと比べて低くなるが、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質と、アンモニアとを混合し、得られた混合物を細胞と接触させたときには、アンモニアを単独で細胞と接触させたときと比べて、細胞内カルシウムイオン濃度が著しく低くなることから、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。

前記活性抑制剤１によれば、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有しているので、前記活性抑制剤１をＴＲＰＡ１と接触させることにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができる。

また、前記活性抑制剤１は、皮膚に対する不快な刺激との関連性があるＴＲＰＡ１の活性を有効に抑制するため、例えば、皮膚外用剤などに配合するための助剤として好適である。前記活性抑制剤１は、例えば、皮膚外用剤などに配合されることによって当該皮膚外用剤などによるヒトの皮膚に対する不快な刺激を抑制することが期待される。

前記活性抑制剤１における炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの濃度は、ＴＲＰＡ１の活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、前記活性抑制剤の保存安定性の観点から、５質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。

本発明においては、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンは、単独で用いられていてもよく、併用されていてもよい。炭酸イオンと炭酸水素イオンとが併用されている場合、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの濃度は、炭酸イオンと炭酸水素イオンとを合わせた濃度である。

前記活性抑制剤１において、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンは、例えば、水などの溶媒中で解離した状態で存在していてもよい。この場合、前記活性抑制剤１のｐＨは、前記溶媒中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点から、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、１３以下が好ましく、１１以下がより好ましい。

また、本発明の目的が妨げられない範囲内であれば、前記活性抑制剤１は、例えば、界面活性剤、アルコール、香料、キレート化剤などの他の成分を含有していてもよい。

前記ＴＲＰＡ１の活性としては、例えば、イオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内への陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）などが挙げられる。前記活性は、ＴＲＰＡ１アゴニストがＴＲＰＡ１に結合して当該ＴＲＰＡ１が活性化することによって発現する。

前記陽イオンとしては、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。

また、前記ＴＲＰＡ１アゴニストとしては、例えば、アンモニア、アリルイソチオシアナート、ブラジキニン、シンナムアルデヒド、アリシン、アクロレイン、メントールなどが挙げられる。

前記活性は、例えば、ＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内への陽イオンの流入を指標として用い、活性抑制剤とＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の陽イオン量に対するＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の陽イオン量の割合を算出し、活性抑制剤による陽イオン量の減少率を測定したり、あるいはＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞内における電流の増加量などを指標として用い、活性抑制剤とＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の電流に対するＴＲＰＡ１アゴニストとＴＲＰＡ１とを接触させたときの当該ＴＲＰＡ１を含む細胞内の電流の割合を算出し、活性抑制剤による電流の減少率を測定することによって調べることができる。

また、前記活性抑制剤１によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、例えば、ＴＲＰＡ１を発現する細胞（以下、「ＴＲＰＡ１発現細胞」という）を用い、前記活性抑制剤１の存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内ｐＨと当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内ｐＨとの差異を比較すること、前記活性抑制剤１の存在下にＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度との差異を比較したり、あるいは前記活性抑制剤１の存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内における電流と当該活性抑制剤１の非存在下でＴＲＰＡ１アゴニストと接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内における電流との間の差異を比較することによって評価することができる。

前記細胞内ｐＨは、例えば、ｐＨ蛍光指示薬をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内ｐＨに応じたｐＨ蛍光指示薬の蛍光強度を調べる方法などによって測定することができる。前記ｐＨ蛍光指示薬としては、例えば、ｐＨに応じて蛍光特性が変化する試薬であればよく、例えば、ＢＣＥＣＦ−ＡＭなどが挙げられる。

前記カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などによって測定することができる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、カルシウムイオンと結合し蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化するのであれば特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ２、ＦＵＲＡ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。

また、前記電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。

本発明は、別の側面では、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤（以下、「活性抑制剤２」という）に関する。

前記活性抑制剤２をＴＲＰＡ１と接触させたとき、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質から解離された炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンは、ＴＲＰＡ１と接触する。そのため、前記活性抑制剤２によれば、ＴＲＰＡ１の活性を効果的に抑制することができる。したがって、前記活性抑制剤２は、前記活性抑制剤１と同様に、例えば、皮膚外用剤などに配合するための助剤として好適である。また、前記活性抑制剤２は、例えば、皮膚外用剤などに配合されることによって当該皮膚外用剤などによるヒトの皮膚に対する不快な刺激を抑制することが期待される。

前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１と接触させる際に、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離していればよい。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質としては、例えば、炭酸塩、炭酸水素塩などが挙げられる。前記炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。また、前記炭酸水素塩としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムなどが挙げられる。これらのなかでは、水などの溶媒中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点および前記活性抑制剤２の保存安定性の観点から、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましい。

前記炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムは、例えば、本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制剤を皮膚外用剤などに配合する場合には、皮膚への負荷を効果的に抑制する点で好適である。

前記活性抑制剤２における前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質の濃度は、ＴＲＰＡ１の活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００５質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上となり、前記活性抑制剤２の保存安定性の観点から、好ましくは１０質量％以下が、より好ましく２質量％以下となるように配合されることが望ましい。

前記活性抑制剤２において、前記炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離する物質は、水などの溶媒中に溶解した状態で存在していればよい。溶媒が水である場合、前記活性抑制剤２のｐＨは、前記水中で炭酸イオンおよび炭酸水素イオンに解離した状態で存在させる観点から、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、１３以下が好ましく、１１以下がより好ましい。

なお、前記活性抑制剤２には、本発明の目的がを妨げられない範囲内であれば、例えば、界面活性剤、アルコール、香料、キレート化剤などの他の成分が配合されていてもよい。

前記活性抑制剤２によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、前記活性抑制剤１によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果と同様の手法によって評価することができる。

２．ＴＲＰＡ１の活性抑制方法
本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制方法であり、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることを特徴とする。

本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法によれば、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを用いるので、例えば、ヒトの皮膚をに存在する感覚神経に含まれるＴＲＰＡ１、口腔などの粘膜下に存在する感覚神経に含まれるＴＲＰＡ１などの活性を効果的に抑制することができる。

本発明においては、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの供給源として、前述したＴＲＰＡ１の活性抑制剤を用いて、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることができる。

炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンとＴＲＰＡ１との接触は、ＴＲＰＡ１を含む部位、例えば、ヒトの皮膚を構成する細胞にＴＲＰＡ１の活性抑制剤を供給することによって行なうことができる。

前記ＴＲＰＡ１と接触させる炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの量は、ＴＲＰＡ１の活性の抑制効果を十分に発揮させ、かつ皮膚への負荷を抑制することができる範囲で適宜設定することができる。

なお、ＴＲＰＡ１を含む部位、例えば、ヒトの皮膚における細胞にＴＲＰＡ１の活性抑制剤を供給する場合、当該ＴＲＰＡ１の活性抑制剤の供給時に加えて、ヒトの皮膚への前記ＴＲＰＡ１の活性抑制剤に含まれる炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンの浸透を促進する助剤をさらにヒトの皮膚における細胞に供給してもよい。

本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、前記活性抑制剤１または活性抑制剤２によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果と同様の手法によって評価することができる。

本発明のＴＲＰＡ１の活性抑制方法は、例えば、皮膚と接触したときに不快な刺激を与える皮膚外用剤を使用する時に行なうことにより、皮膚における細胞に含まれるＴＲＰＡ１の活性を抑制するので、皮膚などで引き起こされる不快な刺激を低減することができる。

３．皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、アンモニアを含有する皮膚外用剤であり、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とする。

本発明の皮膚外用剤は、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されているので、当該皮膚外用剤に含まれるアンモニアによるＴＲＰＡ１の活性化が抑制され、皮膚に引き起こされる不快な刺激を低減することができる。

なお、本明細書において、「皮膚外用剤」とは、皮膚に直接適用されるものをいう。前記皮膚外用剤としては、例えば、皮膚脱色剤（ボディーブリーチング剤）などが挙げられる。

本発明の皮膚外用剤におけるアンモニアの含有量は、アンモニアによる効果を十分に発現させる観点から、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましく、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、２０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい。

本発明の皮膚外用剤において、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１と接触させる際に、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離していればよい。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質としては、前記活性抑制剤に用いられる物質と同様の物質が挙げられる。前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質のなかでは、アンモニアによる皮膚への負荷を効果的に抑制する観点から、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましい。

アンモニアに対する前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質の量は、アンモニア１００質量部に対して、アンモニアによる皮膚への負荷を抑制する効果を十分に得る観点から、１質量部以上が好ましく、１０質量部以上がより好ましく、皮膚外用剤の安定性の観点から、１０００質量部以下が好ましく、２００質量部以下がより好ましい。

本発明の皮膚外用剤には、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート化剤、油、アルコール、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、水などの他の成分が配合されていてもよい。

以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１〜４）
炭酸アンモニウムの濃度が１ｍＭ（実施例１）、５ｍＭ（実施例２）、１０ｍＭ（実施例３）または５０ｍＭ（実施例４）となるように、炭酸アンモニウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた水溶液のｐＨを、それぞれ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いて７．４に調整して、活性抑制剤を得た。

（比較例１〜４）
アンモニアの濃度が１ｍＭ（比較例１）、５ｍＭ（比較例２）、１０ｍＭ（比較例３）または５０ｍＭ（比較例４）であるアンモニア水溶液（ｐＨ７．４）を調製し、試料を得た。

（比較例５〜８）
塩化アンモニウムの濃度が１ｍＭ（比較例５）、５ｍＭ（比較例６）、１０ｍＭ（比較例７）または５０ｍＭ（比較例８）となるように、塩化アンモニウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた水溶液のｐＨを７．４に調整して、試料を得た。

（試験例１）
（１）ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の調製
１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地に、ＨＥＫ２９３細胞を最終濃度が４×１０⁷細胞／ｍＬとなるように懸濁し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液に、ｐＨ蛍光指示薬〔シグマアルドリッチ社製、商品名：ＢＣＥＣＦ−ＡＭ〕を最終濃度が１μＭとなるように添加し、混合物を得た。その後、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、ＨＥＫ２９３細胞にｐＨ蛍光指示薬を導入した。得られた細胞を標準緩衝液（組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４に調整）で洗浄し、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞を得た。

（２）細胞内ｐＨの測定
前記ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞を、最終濃度が３×１０⁷細胞／ｍＬとなるように前記標準緩衝液に懸濁し、細胞浮遊液を得た。前記細胞浮遊液を還流槽付の蛍光測定用装置の還流槽に入れ、３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料を前記細胞浮遊液に添加し、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞と実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料とを接触させた。その後、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに基づく励起波長４４０ｎｍにおける蛍光強度と、前記ＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに基づく励起波長４９５ｎｍにおける蛍光強度とを測定した。

なお、前記還流槽付の蛍光測定用装置として、ＣＣＤカメラを取り付けた倒立顕微鏡〔オリンパス（株）製、商品名：ＢＸ−７１〕に還流槽を設け、かつシリンジから還流槽を通って試薬を還流するようにした装置を用いた。

前記蛍光強度の測定は、実施例１〜４の活性抑制剤または比較例１〜８の試料と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞中のＢＣＥＣＦ−ＡＭに由来する励起波長４４０ｎｍにおける蛍光および励起波長４９５ｎｍにおける蛍光を前記ＣＣＤカメラで取り込み、取り込まれた蛍光を、画像処理解析ソフト〔スキャナリティックスインコーポレーティド（ＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓＩｎｃ．）製、商品名：ＩＰＬａｂＶｅｒ．５．０〕で解析することにより行なった。

また、細胞内ｐＨは、予め標準ｐＨ溶液を用いて作成した検量線と前記蛍光強度とを用いて算出した。なお、前記標準ｐＨ溶液として、緩衝液（組成：１００ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、２０μＭナイジェリシンナトリウム、ｐＨ６．０、７．０、８．０または８．５に調整）を用いた。

試験例１において、実施例１〜４の各活性抑制剤中における炭酸アンモニウムの濃度、比較例１〜４の各試料中におけるアンモニアの濃度または比較例５〜８の各試料中における塩化アンモニウムの濃度と、細胞内ｐＨとの関係を調べた結果を図１に示す。図１中、白三角は実施例１〜４の活性抑制剤（炭酸アンモニウム）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨ、黒丸は比較例１〜４の試料（アンモニア）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨ、白丸は比較例５〜８の試料（塩化アンモニウム）と接触させたときのＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨをそれぞれ示す。

図１に示された結果から、実施例１〜４それぞれの活性抑制剤（炭酸アンモニウム）と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞の細胞内ｐＨは、比較例１〜４の試料（アンモニウム）と接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞および塩化アンモニウムと接触させたＢＣＥＣＦ−ＡＭ導入細胞それぞれの細胞内ｐＨと比べて低くなる傾向にあることがわかる。

（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド）を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。

また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０⁵細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

（実施例５〜７）
炭酸水素ナトリウムの濃度が１０ｍＭ（実施例５）、５ｍＭ（実施例６）または１０ｍＭ（実施例７）となるように、当該炭酸水素ナトリウムを２５℃で精製水に溶解させた。その後、得られた溶液のｐＨを、それぞれ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いて７．４に調整して、活性抑制剤を得た。

（試験例２）
前記試験例１の結果から、炭酸アンモニウムは、アンモニアおよび塩化アンモニウムと比べて細胞内ｐＨを上昇させる度合いが小さいため、細胞内のアルカリ化によって活性化されるＴＲＰＡ１の活性への影響が低いと考えられる。そこで、炭酸アンモニウムと同様に炭酸イオンに解離する炭酸水素ナトリウムを用い、ＴＲＰＡ１の活性への影響を調べた。

（１）ＴＲＰＡ１発現細胞へのＦＵＲＡ２−ＡＭの導入
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中で、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入した。

（２）ＴＲＰＡ１の活性の測定
前記（１）においてＦＵＲＡ２−ＡＭを導入したＴＲＰＡ１発現細胞をのせたカバーグラスを蛍光測定用装置の還流槽に入れた。その後、前記還流槽中のＴＲＰＡ１発現細胞を緩衝液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。

また、アンモニアの濃度が１０ｍＭとなるように、アンモニアと実施例５、実施例６または実施例７の活性抑制剤とを混合した。つぎに、得られた混合物を前記還流槽に入れ、前記活性抑制剤とアンモニアとＴＲＰＡ１発現細胞に含まれるＴＲＰＡ１とを接触させた。なお、還流槽内の溶液のｐＨを７．４となるように調整した。

その後、前記還流槽において、ＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度_340nm」という）およびＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度_380nm」という）を測定した。測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、Δ蛍光強度比_{活性抑制剤}を算出した。前記Δ蛍光強度比_{活性抑制剤}は、（活性抑制剤を用いたときの蛍光強度_340nm／活性抑制剤を用いたときの蛍光強度_380nm−前記緩衝液を用いたときの蛍光強度_340nm／前記緩衝液を用いたときの蛍光強度_380nm）に基づいて算出した。

また、前記活性抑制剤に代えて、ＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記活性抑制剤を用いた場合と同様にして、Δ蛍光強度比_AITCを算出した。前記Δ蛍光強度比_AITCは、（アリルイソチオシアナートを用いたときの蛍光強度_340nm／アリルイソチオシアナートを用いたときの蛍光強度_380nm−前記緩衝液を用いたときの蛍光強度_340nm／前記緩衝液を用いたときの蛍光強度_380nm）に基づいて算出した。算出されたΔ蛍光強度比_{活性抑制剤}とΔ蛍光強度比_AITCとから、Δ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITCを算出した。

なお、対照として、実施例５〜７の活性抑制剤の代わりに精製水（比較例９）を用いたことを除き、実施例５〜７の活性抑制剤を用いた場合と同様にして、Δ蛍光強度比_精製水（精製水を用いたときの蛍光強度_340nm／精製水を用いたときの蛍光強度_380nm）を算出した。算出されたΔ蛍光強度比_精製水とΔ蛍光強度比_AITCとから、Δ蛍光強度比_精製水／Δ蛍光強度比_AITCを算出した。

試験例２において、炭酸水素ナトリウムの濃度とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比_{活性抑制剤または精製水}／Δ蛍光強度比_AITCとの関係を調べた結果を図２に示す。

図２において、「Δ蛍光強度比_{活性抑制剤または精製水}／Δ蛍光強度比_AITC」は、Δ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITCおよびΔ蛍光強度比_精製水／Δ蛍光強度比_AITCの総称を示す。また、図２において、試験番号１は活性抑制剤の代わりに精製水（比較例９）を用いたときのΔ蛍光強度比_精製水／Δ蛍光強度比_AITC、試験番号２は実施例５の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITC、試験番号３は実施例６の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITC、試験番号４は実施例７の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITCを示す。

図２に示された結果から、実施例５〜７の活性抑制剤を用いたときのΔ蛍光強度比_{活性抑制剤}／Δ蛍光強度比_AITCが、精製水（比較例９）を用いたときのΔ蛍光強度比_精製水／Δ蛍光強度比_AITCと比べて著しく小さくなっているため、炭酸水素ナトリウムをＴＲＰＡ１に接触させた場合、アンモニアによるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の増加が抑制されることがわかる。したがって、これらの結果から、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができることがわかる。

以上の結果より、炭酸アンモニウムや炭酸水素ナトリウムなどのように炭酸イオンに解離する物質により、ＴＲＰＡ１アゴニストによるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の増加が抑制されるため、炭酸アンモニウムや炭酸水素ナトリウムなどのように炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質は、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤として当該ＴＲＰＡ１に作用することがわかる。また、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンにより、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することができることがわかる。

（処方例）
以下、本発明に係る皮膚外用剤の処方例を示す。
処方例１ボディーブリーチング剤
アンモニア１質量％
炭酸水素ナトリウム
（炭酸イオンおよび炭酸水素イオン換算量）１質量％
セタノール４質量％
ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油２質量％
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル２質量％
塩化セチルトリメチルアンモニウム１質量％
１，３−ブチレングリコール３質量％
過酸化水素３質量％
グリチルリチン酸ジカリウム０．１質量％
精製水残部

Claims

ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンを含有することを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤。
ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制剤。
前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項２に記載のＴＲＰＡ１の活性抑制剤。
ＴＲＰＡ１の活性を抑制する活性抑制方法（ただし、医療行為を除く）であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンをＴＲＰＡ１と接触させることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性抑制方法。
アンモニアを含有する皮膚外用剤であって、炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が配合されており、前記炭酸イオンおよび／または炭酸水素イオンに解離する物質が、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする皮膚外用剤。