JP5535487B2 - 可変的に架橋された組織 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、埋め込みの前にヒトまたは動物の組織を固定する方法に関する。
発明の背景
グルタルアルデヒドで保存または「固定」された生体人工心臓弁は、石灰化を頻繁に起こし、それにより狭窄および逆流による不備が生じる。加えて、埋め込まれた装置からのグルタルアルデヒドの遅延放出は、細胞毒性である。グルタルアルデヒドとは関わりなく組織を架橋または固定する数種の方法が提示されており、それらは、アジ化アシル、光酸化、エポキシ、ゲニピン、および、カルボジイミドを含む。後半のものは、１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３３，３３９号で説明されている。しかしながら、固定中に組織の収縮が起こることが認められており、組織の収縮を完全に防ぐ架橋形成方法はまだ完成していない（Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．２００１；１０（１）：１１１〜１２４）。これは、適合化が固定の後に起こると予想される心膜または組織の場合は大して重要でない場合があるが、精密に外部とかみ合うこと、すなわち接合が非常に重要となるブタ大動脈基部のリーフレットにとっては恐らく問題になると思われ、過剰な収縮は心臓弁膜尖の不十分な接合をもたらす可能性があり、それにより弁が機能しなくなる可能性がある。従って、最小限の組織の収縮しか生じない改善された固定技術への必要性がなお存在しており、このような技術の模索が続けられている。

組織の収縮の問題に加えて、それぞれの人工器管デバイスは、それぞれ異なる程度の架橋形成を必要とすることも見出されている。一般的に、架橋形成は、人工器管のタンパク質構造内の抗原性部分をブロックまたはマスキングして、外来の物体に対する体の免疫反応を減少させるか、またはなくするという利点を提供する。また架橋形成は、人工器管の表面を生化学的な分解に対して耐性を持たせることによって人工器管デバイスの耐久性も高めることができる。最終的に、架橋を形成することは、人工器管に特定の用途にとってしばしば望まれるある種の剛性を付与することができる。

その一方で、人工器管デバイスとして用いられるあまり高度に架橋されていない組織は、構造的な剛性はより低いと予想され、従ってより柔軟性が高くなる。加えて、このような組織は免疫反応を引き起こし、長期にわたり生分解する可能性が比較的高いと予想される。架橋形成がわずかであるか、または、架橋形成されていない組織は、未加工の組織の特性に類似した特性を示すことが予想される。比較的もろく、柔軟で、および生物分解を受けやすいと予想される。加えて、抗原性の部位をブロックする工程（一般的には架橋を形成する手順の間にブロックされる）が用いられない限り、架橋されていない組織も、未加工の組織で誘発される免疫応答に類似した免疫応答を惹起する可能性もあると予想される。

完全に架橋された組織は多くの利点を有するが、最低限架橋された組織および部分的に架橋された組織が優れたインプラントを形成すると予想される用途がある。部分的に架橋された組織は、架橋された組織の柔軟性が主要な重要性を有するような用途において有用であると予想される。従って、最低限架橋された組織は、最大限の柔軟性が望ましいと予想されるような用途；例えば、皮下における再建術などにおいて有用であると予想される。

従って、架橋の程度が、最低限の架橋から、続いて部分的な架橋、続いて完全な架橋に至る範囲で様々にすることができるバイオインプラントの調整方法が必要である。同様に、部分的に、および、最低限架橋された組織によって免疫反応が惹起されないような方法も必要である。これらの、および関連の必要性は、本発明の実施態様によって満たされる。

発明の概要
前述の、およびその他の必要性は、滅菌済みの架橋された生体組織の製造方法を提供する本発明の実施態様によって満たされる。本方法は、未加工の生体組織を処理して初発の生体組織を生産することから始まる。初発の生体組織は、最低限架橋された（ＭＸ）生体組織の調整用、部分的に架橋された（ＰＸ）生体組織の調整用、または、完全に架橋された（ＥＸ）生体組織の調整用として特徴付けられる。初発の生体組織が、部分的または完全に架橋された生体組織の調整用である場合、最初の処理は、適切な架橋剤の存在下で、望ましい程度の架橋形成を得るのに適した条件下で、組織との架橋を形成することを含む。初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織の調整用である場合、最初の処理は、組織と架橋を形成することを含まない。続いて初発の生体組織は、１またはそれより多くの、初発の生体組織を滅菌するための追加工程で処理される。初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織、または、部分的に架橋された生体組織の調整用である場合、初発の生体組織は、ブロッキング溶液および滅菌溶液と接触させる。初発の生体組織が、完全に架橋された生体組織の調整用である場合、初発の生体組織は、少なくとも滅菌溶液と接触させる。ブロッキング溶液は、少なくともブロッキング剤、および、滅菌剤を含み；および、滅菌溶液は、少なくとも滅菌剤を含む。

前述の、およびその他の必要性はさらに、滅菌済みの可変的に架橋された生体組織の製造方法を提供する本発明の実施態様によって満たされる。本方法は、第一に、未加工の生体組織を架橋形成用溶液と接触させること、ブロッキング溶液と接触させること、または、第一に架橋形成用溶液と接触させること、続いてブロッキング溶液と接触させることによって、生体組織の架橋形成の程度を制御することを含む。生体組織における架橋の程度は、条件、例えば接触時間および／または温度、ならびに、適切な溶液、例えば、完全に、部分的に、または最低限架橋された生体組織を生産するために初発の生体組織を調整する工程の間に未加工の生体組織を晒す架橋形成用溶液、ブロッキング溶液もしくはその両方を選択することによって制御される。次に本方法は、生体組織を滅菌溶液と接触させることを含む。架橋形成用溶液は、架橋剤、カップリング剤、および、カップリング促進剤を含む。ブロッキング溶液は、ブロッキング剤、および、滅菌剤を含む。滅菌溶液は、滅菌剤を含む。

水溶性カルボジイミドでの処理に基づく改善された固定方法が、グルタルアルデヒドで固定された組織と同様に有効に架橋された組織が得られるが、固定の結果として最小の収縮しか示さず、さらに哺乳動物に埋め込んだ後にの石灰化に対して驚くほど改善された耐性を示すことが見出された。

より具体的な形態において、本発明は、生きた哺乳動物に埋め込むのに適切な状態になるように動物組織を固定する方法を提供し、本方法は、前記動物組織を、カップリング促進剤、および、少なくとも２つの反応性を有するアミン部分を含む架橋剤と併用して、反応性を有するカルボキシル部分と反応性を有するアミノ部分との間のアミド結合の形成を促進する有効量のカップリング剤で処理することを含み、ここで前記ジアミン架橋剤は、少なくとも約８０ミリモル濃度の量で存在し、および、前記処理は、前記架橋剤と前記動物組織の分子に含まれる反応性を有する部分との間のアミド化による結合の形成が起こるようにして行われ、それによって前記組織は、固定中の表面積減少を最低限にしながら、プロテアーゼ消化に対して耐性になり、さらにそれによって固定された組織は、石灰化に対して高い耐性を有する。

その他の具体的な形態において、本発明は、生きた哺乳動物に埋め込むのに適切な状態になるように未加工の動物組織を固定する方法を提供し、本方法は、ドナー動物から切り出された未加工の組織を変性させないでを洗浄すること、前記洗浄した動物組織を、反応性を有するカルボキシル部分と反応性を有するアミノ部分との間のアミド結合の形成を促進するカップリング促進剤と併用して、少なくとも２つの反応性を有するアミン部分を含む有効量の架橋剤で、および、カップリング剤で処理することを含み、ここで前記ジアミン架橋剤は、少なくとも約８０ミリモル濃度の量で存在し、および、前記処理は、前記架橋剤と前記動物組織の分子に含まれる反応性を有する部分との間のアミド化による結合の形成が起こるようにして行われ、それによって前記組織は、固定中の表面積減少を最低限にしながら、プロテアーゼ消化に対して耐性になり、さらにそれによって固定された組織は、石灰化に対して高い耐性を有する。

さらなる具体的な形態において、本発明は、少なくとも部分的に、前記組織のタンパク質様の分子間および該組織内に架橋を含む動物組織で形成された人工器管を提供し、ここで架橋は、前記組織上の反応性を有する部分間のアミド結合、および、前記組織上の反応性を有する部分間の追加のアミド結合で構成され、および、ジアミン架橋剤は、少なくとも４個の炭素原子の炭素鎖長を有し、前記架橋の形成は、前記組織を、アミド結合の形成を促進する有効量の水溶性カップリング剤、カップリング促進剤、および、約８０〜約１３０ミリモル濃度の前記ジアミン架橋剤を含む水溶液に晒すことによって達成される。

参考文献の援用
本明細書に記載された全ての出版物および特許出願は、それぞれ個々の出版物または特許出願が参照により開示に含まれるように特定して個々に示されているのと同程度に、参照により本発明に含める。

図面の簡単な説明
本発明の新規の特徴を、添付の請求項で詳細に述べる。本発明の特徴および利点をよりよく理解することは、以下の例証となる本発明の原理が利用されている実施態様について述べられる詳細な説明、および、以下に示す添付の図面を参照することによって達成されると予想される：
図１は、固定中に発生する表面積減少の量を測定するために行われた印付けであるドットを示す、ブタ大動脈のリーフレットの図である。

図２は、ブタリーフレットの熱変性における、固定の持続時間の作用を示すグラフである。
図３は、壁組織およびリーフレットのタンパク質分解酵素による消化に対する耐性を固定時間に対して示したグラフである。

図４は、壁組織およびリーフレットのコラゲナーゼ消化に対する耐性を固定時間に対して示したグラフである。
図５は、本発明に係る方法の実施態様を模式的に示すフローチャートである。

図６は、本発明の方法の実施態様を模式的に示すフローチャートである。
発明の詳細な記述
本発明が関連する基本的な固定方法は、米国特許第５，７３３，３３９号で説明されており、その開示はこの参照により開示に含まれる。驚くべきことに、ジアミン架橋剤の量をかなり多く増加させれば、基本的なカルボジイミド架橋の形成方法を用いて劇的な作用を達成できることが見出された。

また、可変的に架橋された生体人工組織が、ここに記載された本発明の実施態様に従って調整することができることも見出されている。
本明細書で用いられる用語「生体人工組織（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）」は、ヒトまたは動物から全部または一部誘導されたあらゆる臓器または組織、または、その他の有機組織から生産されたあらゆる臓器または組織、および、それ自身または人工器管の一部のいずれかとしてヒトまたは動物に埋め込むためのものであるあらゆる臓器または組織などを意味するものである。従って、この用語は一般的に、心臓、心臓弁およびその他の心臓の構成部分、心膜、血管移植片、尿路および膀胱の構成部分、腱、靱帯、腸、ならびに一般的には軟部組織、例えば皮膚、コラーゲンなどの生体人工組織を含む。人工組織は、これらに限定されないが、ヒト、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌまたはネコの組織などの天然の組織から作製されるものが極めて多いと予想されるが、当分野において通常の技術を有する者にとって周知であるその他の天然材料も使用可能である。

本明細書において説明されている一段階での固定方法は、組織上または組織内の活性な部分がほとんど残らないようにして、組織の反応性を有するカルボキシル部分を、組織上の反応性を有するアミン部分または架橋剤のいずれかに結合させることによって生体人工組織を安定化することからなる。

本明細書で用いられる用語「架橋を形成すること」は、組織の分子内および分子間の様々な長さの連結の形成によって生じる生体人工組織の固定を意味し、このような連結は、（ａ）組織の２つの反応性を有する部分の間におけるアミド結合の形成、従って組織の分子内および分子間に短い共有結合の連結が形成されること、または、（ｂ）前記組織上の反応性を有する部分と、共有結合で結合した架橋剤との間におけるアミド結合の形成のいずれかによって生じる。

本明細書において用いられる用語「架橋剤」は、少なくとも２つの遊離の第一アミン基を好ましくはそれぞれの末端に有するジアミンであって、タンパク質様の動物組織上のカルボキシル基とアミド結合を形成することができるジアミンを意味するものである。好ましくは、これらは４〜１２個の炭素原子を有する直鎖の化合物または分岐した化合物である；しかしながらその代わりに、あまり望ましくはないが、環上に反応性を有するアミン部分が適切に配置されているような炭素環化合物を用いてもよく、例えば２，４，６−トリアミノベンゼンである。より好ましくは、通常通りに処理される未加工の組織に十分な貫入が確実に起こるように、約１９０またはそれ未満の分子量、好ましくは約１５０またはそれ未満の分子量を有するジまたはトリアミノ架橋剤が選択される。最も好ましくは、長さが６〜８個の炭素原子であり、１個の反応性を有するアミンが各末端に配置された直鎖である架橋剤である。このような架橋剤は、その長さに沿って任意の置換があってもよいが、好ましくは、反応性を有するアミン、例えば各末端にアミンを有する直鎖アルカンでのみ置換された炭化水素である。好ましい物質は、１，６−ヘキサンジアミン、および、１，７−ヘプタンジアミンである。

本明細書で用いられる用語「カップリング剤」および「カップリング促進剤」は、それぞれアミド結合の形成を促進し強化する試薬を意味する。これらの結合は、組織上の反応性を有するアミンと反応性を有するカルボキシルとの間に形成されてもよいし（従って、このような近接して位置する２個の反応性基の結合）、または、架橋剤上の反応性を有するアミンと、組織上の、または、組織内の反応性を有するカルボキシルとの間に形成されてもよい。ペプチド合成および関連技術における当業者であれば、このような試薬、例えば水溶性カルボジイミドおよびスクシンイミドについて熟知していると思われる。

好ましい実施態様で用いられるカップリング剤は、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であるが、その他の適切なカップリング剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドも使用可能である。ＥＤＣがカップリング剤として用いられるような実施態様で用いられる好ましいカップリング促進剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）であるが、その他の適切なカップリング促進剤、例えばＨＯＢｔ、ＤＭＡＰおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）も使用可能である。カップリング剤およびカップリング促進剤の濃度は様々であってよい。しかしながら、適切な濃度は当業者によって容易に決定することができる。好ましくは、カップリング剤は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約１００ｍＭまたはそれ未満、最も好ましくは約２０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で用いられる。カップリング促進剤は、好ましくは０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭまたはそれ未満で用いられる。

架橋剤、カップリング剤およびカップリング促進剤、加えてそれらの反応生成物は、好ましくは水溶性である。これらは、固定を最大化し、組織の架橋形成を最適化しながら、固定方法中の人工組織へのダメージの危険、および、埋め込みの後の毒性、炎症、石灰化などの危険を最小化するように選択されると予想される。架橋形成に用いられる全ての溶液は、使用前に、汚染の危険を最小化するために０．４５μｍまたはそれ未満のフィルターを通過させてろ過することが好ましい。

人工器管の架橋形成のための反応条件は、架橋形成、カップリングおよび用いられる強化物質に応じて様々であってよい。一般的に、架橋を形成する方法は、水性緩衝液中で行われ、このような水性緩衝液は、なかでも、石灰化の危険を最小化にしつつ最も有効な架橋反応を提供するような当業者周知のものから選択される。適切な緩衝液の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などが挙げられる。

緩衝液のｐＨおよび濃度も同様に、架橋形成、カップリングおよび用いられる強化物質に応じて様々であってよい。好ましくは、緩衝液濃度およびｐＨは、人工器管への害を最小限にしつつ最も有効な架橋反応が提供されるように選択される。例えば、カップリング剤としてＥＤＣ、および、カップリング促進剤としてスルホ−ＮＨＳを用いる場合、処理溶液のｐＨは、約５．０〜約７．４に維持される。反応温度は、約４０℃〜０℃であり得る；好ましくは、反応は、室温で、例えば約１８〜２５℃で簡単に行われる。

概して、本発明の一段階の架橋形成方法によって固定しようとする未加工の人工組織は、氷冷した０．８５％塩類溶液、または、ある種のその他の適切な溶液中で数回リンスすることが可能になるまで、氷上で維持される。好ましくは、このような洗浄またはリンスは、ドナー哺乳動物から切り出された直後に行われるが、いずれの場合においてもその後４８時間以内である。さらなる貯蔵時間が必要な場合、続いてリンスされた組織が保存されるが、適切な緩衝液中で、低温（例えば約４℃）で２４時間を超えないことが好ましい。このような未加工の組織の特性を変更すると予想されるその他の前処理は不必要であるか、またはまったく望ましくない。

一段階法
得られた固定された生体人工装置の特性において驚くべき改善が、生体人工組織を有効に固定するのに必要な量を超える極めて過量の特定のジアミン架橋剤の使用の結果生じるものであることが見出された。驚くべきことに、’３３９特許で述べられている未処理の（ただし洗浄を除く）未加工の組織を他の方法で処理するための最高量と比較してその約４〜５倍多くのジアミン架橋剤が用いられる場合、得られた生成物のその他の有利な特性にいかなる有害な変化も起こすことなく有意な改善が起こることが見出された。より具体的には、固定中に起こる表面積の減少（以下、表面積減少と言う）が、５０％より多く減少し、さらに生成物の石灰化に対する耐性が劇的に増加する。これらの利点は、熱変性、プロテアーゼ消化に対する耐性、または、コラゲナーゼ消化に対する耐性においていかなる不利な変化も起こすことなく得られる。

ジアミン架橋剤の濃度は、好ましくは約８０〜約１３５ミリモル濃度、より好ましくは約９０〜１３０ミリモル濃度、さらにより好ましくは約９５〜１２５ミリモル濃度、最も好ましくは約１００〜１２５ミリモル濃度である。上記で示したように、好ましいジアミン架橋剤は、１２個以下の炭素原子、例えば４〜８個の炭素原子の炭素鎖長を有し、より好ましくは、そのそれぞれの末端にアミン基を有する直鎖アルカンであり、最も好ましくは、１，６−ヘキサンジアミンである。動物組織の処理は、好ましくは、カップリング剤、カップリング促進剤および架橋を形成するジアミンを含む水溶液を適用することによって行われる。水溶性カップリング剤、好ましくはＥＤＣ、および、カップリング促進剤、好ましくはスルホ−ＮＨＳの濃度は上記で考察された通りであり、すなわち約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＥＤＣ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭのスルホ−ＮＨＳである。

もちろん哺乳動物、主としてヒトに生体人工装置を埋め込む前に、滅菌が施されなければならないことは周知であり、このような滅菌は一般的に、包装工程中になされる。従って、有利なことに固定中に最小の表面積減少しか生じない組織は、その後の滅菌中に収縮しないことがしばしば重要である。もちろんこれは、（後になって弁またはその他の生体人工装置に適合させると予想される原材料とは対照的に）接合が悪影響を受ける可能性があるような交換式の心臓弁または同種のものを処理する場合に特に重要である。生体補綴材料のための特に有効な滅菌法は、米国特許第５，９１１，９５１号、６，５０６，３３９号、および、６，５２１，１７９号（この参照によりそれらの全体が開示に含まれる）で説明されている。生体補綴材料を固定し、続いて２５ｍＭのＥＤＣ水溶液中で４０℃で４８時間滅菌処理した場合でも、その生体補綴材料は最小の表面積減少しか示さず、このような滅菌が３回繰り返されたとしてもこの状態を保つことが示されている。このような滅菌手順の繰り返しを用いることによる試験は、単に予防的なものである；生体人工装置を滅菌しているときに、バッチに付随している標的のインジケーターが手順の最後に何がしかの理由でなお陽性を示す場合には、滅菌手順を繰り返すことが必要な場合があり、ごくまれに滅菌手順を２回繰り返すこともある。従って、このような少々極端な条件で処理した組織の表面積減少を測定することは、慎重であると思われる。また、２０％イソプロパノールおよび８０％水を含む溶液、すなわち２５ｍＭのＥＤＣ、および、１００ｍＭのエタノールアミン（ブロッカー）を含む溶液での４０℃で４８時間の処理下で滅菌を行った場合に、有意な収縮が起こらないと予想されることも見出された。

可変的に架橋された組織
前述の、およびその他の必要性は、滅菌済みの架橋された生体組織の製造方法を提供する本発明の実施態様によって満たされる。本方法は、未加工の生体組織を処理して初発の生体組織を生産することから始まる。初発の生体組織は、最低限架橋された（ＭＸ）生体組織の調整用、部分的に架橋された（ＰＸ）生体組織の調整用、または、完全に架橋された（ＦＸ）生体組織の調整用として特徴付けられる。初発の生体組織が、部分的または完全に架橋された生体組織の調整用である場合、最初の処理は、適切な架橋剤の存在下で、望ましい程度の架橋形成を得るのに適した条件下で、組織と架橋を形成することを含む。初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織の調整用である場合、最初の処理は、組織と架橋を形成することを含まない。続いて初発の生体組織は、１またはそれより多くの、初発の生体組織を滅菌するための追加工程で処理される。初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織、または、部分的に架橋された生体組織の調整用である場合、初発の生体組織は、ブロッキング溶液および滅菌溶液と接触させる。ブロッキング溶液は、少なくともブロッキング剤、および、滅菌剤を含み；および、滅菌溶液は、少なくとも滅菌剤を含む。初発の生体組織が、完全に架橋された生体組織の調整用である場合、初発の生体組織は、少なくとも滅菌溶液と接触させる。

本発明の可変的に架橋を形成する方法は、処理手順および滅菌手順を含む方法として想定することができる。この処理手順とは、最低限に、部分的または完全に架橋された生体組織を調整するために初発の生体組織を生産する手順である。滅菌手順とは、最終産物として最低限に、部分的または完全に架橋された生体組織を生産するために初発の生体組織を滅菌する手順である。

本発明に関して、用語「処理」、「〜を処理すること」、「〜を処理するために」および関連する動詞の同根語は、未加工の生体組織に適用される場合、初発の生体組織を生産するために未加工の組織を調整するために用いられる１種またはそれより多くの手段を意味する。このようにして処理された初発の生体組織は、最低限架橋された、部分的に架橋された、または、完全に架橋された生体組織の調整用の初発の生体組織と分類される。

いくつかの実施態様において、処理は、未加工の生体組織をクリーニングすることを含み、例えば未加工の生体組織を塩類溶液または緩衝溶液でリンスすること、および／または、過量の脂肪を削ぎ落として除去することによるクリーニングを含む。いくつかの実施態様において、処理は、生体組織を適切なサイズおよび形状の断片に切断すること、および／または、断片の重さを量ることを含む。従って、全ての未加工の生体組織は、最低限に、部分的に、または完全に架橋されているかどうかにかかわらず、それらが滅菌される前に何らかの方法で処理される。

本発明によれば、未加工の生体組織を処理することは、生体組織の架橋形成の程度を制御するのに適した条件下で行われる。架橋形成の制御は、最低限架橋された、部分的に架橋された、または、完全に架橋された生体組織を調整するために初発の生体組織を調整するのに適した条件に生体組織を晒すことを伴う。架橋形成の制御は、生体組織をどの程度架橋させるかを決定すること、および、必要に応じて、生体組織を適切な架橋形成用溶液と接触させることを含む。従って、「架橋形成の制御」は、適切な初発の生体組織を得るための試薬、試薬濃度、反応時間および温度のような条件を調節することを意味する。従って、「架橋形成を制御すること」は、架橋形成を防ぐこと、架橋形成を最小化すること、架橋形成を最大化すること、または、最低限の架橋形成と最大限の架橋形成との間の範囲の程度で架橋形成を制御することを包含する。

その他の具体的な実施態様において、初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織の生産用である。いくつかのこのようなケースにおいて、架橋形成の制御は、生体組織を滅菌の前に架橋形成用溶液に接触させないことを必要とする。初発の生体組織が、最低限架橋された生体組織の生産用であるようなその他の実施態様において、初発の生体組織は、得られた架橋形成の程度がごくわずかになるような条件下で（例えば、短い期間、低温、低濃度の架橋剤、カップリング剤および／またはカップリング促進剤）架橋形成用溶液と接触させてもよい。

いくつかの具体的な実施態様において、生体組織の架橋形成の制御によって、部分的に架橋された、または、完全に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織が生産される。初発の生体組織が、部分的または完全に架橋された生体組織の生産用であるような実施態様において、架橋形成の制御は、生体組織において架橋を形成させるための条件を選択すること、および、未加工の生体組織をこのような条件に晒して、部分的または完全に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織を生産することを意味する。選択される条件としては：架橋剤の濃度、カップリング剤の濃度、カップリング促進剤の濃度、温度または反応、および、反応時間が挙げられる。

「初発の生体組織」は、上記で定義された方法のいくつかで処理されているが、少なくとも１つの滅菌工程で処理されていない組織のことである。初発の生体組織は、最低限架橋された生体組織の調整用の初発の生体組織、部分的に架橋された生体組織の調整用の初発の生体組織、および、完全に架橋された生体組織の調整用の初発の生体組織を含む。

滅菌工程は、実施例でより詳細に説明されるが、生体組織を、１種またはそれより多くの滅菌剤を含む溶液と接触させることを含む。このような溶液の１つは、本明細書において「ブロッキング溶液」と称するものであり、これは滅菌剤とブロッキング剤との両方を含む。このような溶液のうちその他は、「滅菌溶液」と称され、これは滅菌剤を含む（ただしブロッキング剤を含んでいなくてもよい）。いくつかの実施態様において、滅菌溶液はブロッキング剤を含まない。

架橋された生体組織中の架橋の程度は、最低限に、部分的または完全に架橋された、として特徴付けることができる。架橋の程度は、架橋の程度と相関する生体組織の特徴を測定する数種の方法によって測定することができる。このような方法の一つにおいて、生体組織が収縮し始める温度が測定される。一般的に、架橋の形成が多ければ多いほど収縮温度もより大きくなるが、これは、より高度に架橋された組織は、熱変性に耐性を有するため、比較的低温での収縮に耐性を有すると予想され、比較的高温での変性に対してのみ影響を受けるためである。実施例５で、熱収縮の方法をより詳細に説明する。

その他のこのような架橋形成を測定する方法において、コラゲナーゼまたはプロナーゼのようなタンパク質分解酵素による消化に耐性を示す生体組織の能力が測定される。一般的に、組織が架橋される程度が大きければ大きい程、その組織のプロテアーゼ消化に対する耐性は、より低い程度に架橋された組織が示すと予想される耐性よりも大きい程度で示されると予想される。実施例５で、この方法をより詳細に説明する。

最低限架橋された（ＭＸ）という用語は、コラーゲン分子の隣接するカルボキシルおよびアミン部分との間の長さがわずかゼロである結合以外に、生体組織中の分子間の架橋が実質的に形成されていない生体組織を意味する。最低限の架橋形成は、当業界既知の様々な方法によって測定し、検証することができる。いくつかの実施態様において、最低限架橋された組織は、それに相当する未加工の生体組織の約±２℃の範囲内の収縮温度を有する。例えば、最低限架橋されたブタ大動脈のリーフレットは、約６８℃の収縮温度を有する。

加えて、最低限の架橋形成は、実施例５で詳細に説明されるプロナーゼ消化による方法によって測定し検証することができる。最低限架橋された生体組織のプロテアーゼ消化に対する耐性は、部分的に架橋された（ＰＸ）、または、完全に架橋された（ＦＸ）組織が示す程度よりも小さい程度を示す。従って、最低限架橋された組織のプロナーゼ消化後に残存する組織のパーセントは、未加工の生体組織のパーセントに類似している。一般的に、未加工の組織はプロテアーゼ消化に対して耐性を有さず、同様に最低限架橋された組織もそのような耐性を有さない。いくつかの実施態様において、最低限架橋された生体組織の１ｍｇ／ｍｌで２４時間のプロナーゼでの処理によって、残存する組織の％が、約０〜約３０％の残存する組織の割合になる。具体的な実施態様において、残存する組織の量は、約２６％である。

完全な架橋形成は、当業界既知の様々な方法によって測定し、検証することができる。例えば、いくつかの実施態様において、完全に架橋された組織は、未加工の、または、最低限架橋された組織の収縮温度よりも少なくとも約１０℃高い収縮温度を有する。例えば、完全に架橋されたブタ大動脈のリーフレットは、約８０℃の収縮温度を有し、これは、それに相当する最低限架橋された組織の収縮温度よりも約１２℃高い。

完全な架橋形成は、実施例５で詳細に説明されるプロナーゼ消化による方法によって測定し検証することができる。完全に架橋された生体組織は、プロナーゼ消化に対して、部分的に架橋された（ＰＸ）または最低限架橋された（ＭＸ）組織が有すると予想される耐性よりも大きい程度で耐性を有すると予想される。従って、完全に架橋された組織のプロナーゼ消化後に残存する組織のパーセントは、未加工の生体組織のパーセントよりもかなり大きい。一般的に、完全に架橋された組織は、プロテアーゼ消化に対して極めて高い耐性を有する。いくつかの実施態様において、完全に架橋された組織の１ｍｇ／ｍｌで２４時間のプロナーゼでの処理によって、残存する組織の％が、少なくとも約８０％の残存する組織の割合になる。具体的な実施態様において、残存する組織の量は、約８８％である。

部分的に架橋された（ＰＸ）という用語は、ＭＸとＦＸとの中間の程度に架橋された生体組織を意味する。いくつかの実施態様において、部分的な架橋形成は、１種またはそれより多くの架橋された生体組織の特徴を測定し、それらを、それに相当する完全に架橋された生体組織、および、最低限架橋された生体組織における特徴と比較することによって確立することができる。架橋された組織の特徴としては、上述のような、および、実施例５で記載された通りの収縮温度およびプロテアーゼ消化に対する耐性が挙げられる。いくつかの実施態様において、部分的に架橋された組織は、少なくとも１つの架橋された組織の特徴が、それに相当する最低限架橋された組織の特徴（例えば、プロテアーゼ消化後に残存する組織の％、または、収縮温度）よりも大きく、且つそれに相当する完全に架橋された組織の特徴よりも小さい架橋された組織である。

部分的な架橋形成は、当業界既知の様々な方法によって測定し、検証することができる。例えばいくつかの実施態様において、部分的に架橋された組織は、未加工の、または、最低限架橋された組織の収縮温度よりも少なくとも約４℃高いが、完全に架橋された組織の収縮温度よりも少なくとも約６℃低い収縮温度を有する。例えば、部分的に架橋されたブタ大動脈のリーフレットは、約７３℃の収縮温度を有するが、これは、それに相当する最低限架橋された組織の収縮温度よりも約５℃高く、且つそれに相当する完全に架橋された組織の収縮温度よりも約７℃低い。

部分的な架橋形成は、実施例５で詳細に説明されるプロナーゼ消化による方法によって測定し検証することができる。部分的に架橋された生体組織は、プロナーゼ消化に対して、最低限架橋された（ＭＸ）が有する耐性よりも大きい程度で耐性を有するが、完全に架橋された（ＦＸ）組織が有する耐性よりも小さい程度である。従って、部分的に架橋された組織のプロナーゼ消化後に残存する組織のパーセントは、未加工の生体組織のパーセントよりもいくらか大きいが、完全に架橋された組織の場合のパーセントほど大きくはない。いくつかの実施態様において、部分的に架橋された組織の１ｍｇ／ｍｌで２４時間のプロナーゼでの処理によって、残存する組織の％が、５０％より大きくなるが、８０％未満の残存する組織の割合になる。具体的な実施態様において、残存する組織の量は、約７２％である。

いくつかの実施態様において、本発明の方法は、３つの別々の工程として想定することができる。ＭＸ工程は、未加工の組織を提供すること、未加工の組織をブロッキング溶液に接触させること、続いてその組織を最終的な滅菌溶液と接触させることを含み、このようにして最終的な滅菌済みの最低限架橋された組織を得ることができる。いくつかの具体的な実施態様において、ＭＸ工程はまた、実質的に架橋形成が起こらないように、未加工の組織を架橋形成用溶液に極めて短い期間で接触させること、および／または、極めて低濃度の架橋試薬と接触させることも含む。ＰＸ工程は、架橋剤を含む緩衝溶液中で、未加工の組織を、低濃度のカップリング剤、および、低濃度のカップリング促進剤と接触させ、その後この組織を、ブロッキング溶液、続いて最終的な滅菌溶液と接触させることを伴い、このようにしてＰＸ組織を得ることができる。ＦＸ工程は、未加工の組織を、架橋剤の存在下でより高濃度のカップリング剤、より高濃度のカップリング促進剤を含む緩衝液と接触させることを伴い、このようにして架橋された組織を生産することができる。このようにして架橋された組織を最終的な滅菌溶液と接触させ、ＦＸ組織を生産することができる。いくつかの実施態様において、このようにして架橋された組織は、架橋を形成する工程と最終的な滅菌工程との間に、ブロッキング溶液と接触させてもよい。

前述の、およびその他の必要性は、滅菌済みの可変的に架橋された生体組織の製造方法を提供する本発明の実施態様によってさらに満たされる。本方法は、未加工の生体組織および架橋された生体組織からなる群より選択される初発の生体組織を、任意に第一の滅菌剤、および、ブロッキング剤を含む第一の滅菌溶液と接触させ、中間の生体組織を生産すること；および、中間の生体組織を、第二の滅菌剤を含む第二の滅菌溶液と接触させ、滅菌済みの可変的に架橋された生体組織を生産することを含む。

前述の、およびその他の必要性は、初発の生体組織を可変的に架橋形成する方法を提供する本発明の実施態様によって満たされ、それにより、最低限に、部分的または完全に、のいずれかの予め決められた程度に架橋して、滅菌済みの架橋された生体組織を生産することができる。本方法は、加工しようとする初発の生体組織を選択すること、および、初発の生体組織に付与される架橋形成の程度を選択することを含む。この組織を処理して、初発の生体組織を調整することができる。このような処理は任意に、未加工の生体組織を架橋形成用溶液と接触させることを含んでいてもよく、それにより、完全に、または、部分的に架橋された生体組織を作製するのに使用するための初発の生体組織を調整することができる。続いて初発の生体組織を、少なくとも１つの滅菌溶液と接触させる。最低限または部分的に架橋された生体組織を作製するための初発の生体組織のケースにおいて、初発の生体組織は、最初にブロッキング溶液に接触させ、続いて滅菌溶液に接触させる；完全に架橋された組織を作製するための初発の生体組織のケースにおいて、初発の生体組織は、少なくとも滅菌溶液と接触させる。ブロッキング溶液は、滅菌剤、ブロッキング剤、および、任意に浸透促進剤を含む。このような滅菌溶液は、滅菌剤、緩衝液、および、任意に浸透促進剤を含む。

本方法は、本発明に係る方法の流れ図を示す図５を参照しながらさらに想定することができる。本方法は、２つの下位の方法：処理／架橋形成を制御すること（Ｓ１０２、Ｓ１０４、および、Ｓ１０６）、および、滅菌（Ｓ１０８、Ｓ１１０、および、Ｓ１１２）を組み合わせることによって想定することができる。より具体的には、処理工程Ｓ１０２において、屠殺場のような適切な供給源からの未加工の組織を入手し、脂肪を削ぎ落とし、切断し、氷冷した塩類溶液でリンスする。次に、Ｓ１０４において、初発の生体組織が、最低限架橋された（ＭＸ）生体組織の調整用なのか、部分的に架橋された（ＰＸ）生体組織の調整用なのか、または、完全に架橋された（ＦＸ）生体組織の調整用なのかを決定することによって架橋の形成を制御する。初発の生体組織をＰＸまたはＦＸ組織の調整用にする場合、組織（ｐＰＸまたはｐＦＸと識別され、ここで「ｐ」は、それが処理中であることを示す）は架橋を形成する工程Ｓ１０６で処理されるが、ここでこの組織は、架橋形成用溶液と接触し、この架橋形成用溶液は、架橋剤（例えば、アルカンジアミン、例えば１，６−ヘキサンジアミン、または、１，７−ヘプタンジアミン）、カップリング剤（例えば、カルボジイミド、例えばＥＤＣ）、カップリング促進剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ））、および、任意に浸透促進剤（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_８アルカノール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、または、オクタノール）を含む。架橋の形成は、長さがゼロではない架橋形成を特定の程度で有する初発の生体組織が生産されるように、架橋剤の濃度、カップリング剤の濃度、カップリング促進剤の濃度、浸透促進剤の濃度、ｐＨ、温度および／または反応時間を変化させることによって制御される。最低限架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織のケースにおいて、架橋の形成は、架橋の形成をスキップすること（図５で図示されている実施態様に関して示されているように）、または、生体組織中で起こる架橋の形成をなくすか、または実質的になくするような程度に、架橋剤の濃度、カップリング剤の濃度、カップリング促進剤の濃度、浸透促進剤の濃度、温度および／または反応時間を減少させることによって実質的に制御される。

架橋形成用溶液中の架橋剤の量は、望ましい架橋形成量に応じて、少なくとも約１ミリモル濃度（ｍＭ）、特に少なくとも約５ｍＭであってもよいし、例えば約１〜５００ｍＭの範囲、例えば約５ｍＭ〜約１３０ｍＭの範囲であってもよい。

一般的に、架橋形成用溶液に適切な緩衝液を添加することが有利であるとみなされる。最終的な溶液のｐＨは、約５．０〜７．４の範囲、特に約６．５であると予想され、目標のｐＨが達成されるように必要に応じて酸または塩基のいずれかを添加することによってその範囲に調節することができる。

カップリング剤の量は、少なくとも約０．１ｍＭ、特に少なくとも約１．０ｍＭであってもよく、例えば約０．１〜１００ｍＭ、特に約１〜約５０ｍＭであってもよい。適切なカップリング剤はカルボジイミドを含み、このようなカルボジイミドの一例はＥＤＣである。

カップリング促進剤の量は、望ましい架橋の程度に応じて、少なくとも約０．０１ｍＭ、特に約０．０５〜約１０ｍＭ、例えば約０．０５〜約５ｍＭであり得る。
架橋剤、カップリング剤およびカップリング促進剤の量は、生体組織中で達成される架橋の程度を変化させるために、それぞれ独立して変化させることができる。単に説明のためだけの非限定的な実施例として、完全に架橋された（ｐＦＸ）組織を調整するために初発の生体組織は、少なくとも約５ｍＭ、例えば約１０〜３０ｍＭのカップリング剤（例えば、ＥＤＣのようなカルボジイミド）、および、少なくとも約０．１ｍＭ、例えば約０．５〜３ｍＭのカップリング促進剤（例えば、ＮＨＳ、または、Ｓ−ＮＨＳ）を含む架橋形成用溶液を用いることによって調整してもよい。具体的な実施態様において、完全に架橋された（ＦＸ）組織を調整するための初発の生体組織は、約１５〜約２０ｍＭ、特に約２０ｍＭ、カップリング剤、および、約０．５〜１．５ｍＭ、特に約１ｍＭのカップリング促進剤を用いて調整してもよい。完全に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織を作製するための、典型的な架橋形成用溶液の接触時間は、約１時間〜約９６時間、約２時間〜約７２時間、約４時間〜約４８時間、または、約８時間〜約２４時間である。完全に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織を作製するための典型的な温度は、約１０℃〜約５０℃、約１５℃〜約４５℃、または、約２０℃〜約５０℃である。

その他の単に説明のためだけの非限定的な実施例として、部分的に架橋された（ｐＰＸ）組織を調整するための初発の生体組織は、クリーニングされた未加工の生体組織を、約１〜約５ｍＭ、特に約２．５ｍＭのカップリング剤、および、約０．０５〜約０．４ｍＭ、特に約０．１２５ｍＭのカップリング促進剤を含む架橋形成用溶液と接触させることによって調整することができる。部分的に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織を作製するための典型的な架橋形成用溶液の接触時間は、約１時間〜約９６時間、約２時間〜約７２時間、約４時間〜約４８時間、または、約８時間〜約２４時間である。部分的に架橋された生体組織を調整するための初発の生体組織を作製するための典型的な温度は、約１０℃〜約５０℃、約１５℃〜約４５℃、または、約２０℃〜約５０℃である。

決定工程Ｓ１１０において、組織をブロッキング工程Ｓ１０８で処理するかどうかが決定される。中間の滅菌工程Ｓ１０８において、初発の生体組織（ｐＰＸまたはｐＭＸ）は、ブロッキング剤、滅菌剤、および、任意に浸透促進剤を含むブロッキング溶液と接触させる。ブロッキング剤は、生体組織のタンパク質中の遊離のカルボキシル基と安定な共有結合を形成することによって組織の架橋形成をブロックすることができる一官能価の反応性を有する部分である。本明細書では「ブロッキング溶液」と述べられているが、当業者であれば、組織表面上のいくつかの反応性を有する部位をブロックすることに加えて、「ブロッキング溶液」はまた、生体組織を滅菌するのにも役立つことを理解しているものと予想される。

説明のための非限定的な実施例として、ブロッキング剤は、組織を構成するタンパク質中の遊離のカルボキシル基と反応する第１級モノアミンであってもよい。ブロッキング剤の目的は、最低限または部分的に架橋する予定の組織中で長さがゼロの架橋が形成されることを防ぐことである。このようなモノアミンは、可溶性の第１級モノアミンであってもよいし、１種またはそれより多くの可溶化する官能基（例えばヒドロキシル基）を含んでいてもよい。このような用途に特に適したモノアミンはエタノールアミンであり、これは、トリス緩衝溶液中で製造することが有利である。その他の適切なモノアミンとしては、プロパノールアミンが挙げられる。ブロッキング剤の濃度は様々であってよく、約１０〜約５００ｍＭ、特に約５０〜約２５０ｍＭ、および、約１００ｍＭのモノアミンのブロッキング剤、例えばエタノールアミン、プロパノールアミン、または、ブタノールアミンである。特に適切なブロッキング剤は、約１００ｍＭのエタノールアミンである。

約５〜２５％（体積／体積）、特に約２０％の適切な浸透促進剤、例えばＣ_１〜Ｃ_８アルカノール、例えばイソプロパノールまたはｎ−プロパノールの存在下で、ブロッキング工程Ｓ１０８で用いられるカルボジイミド（例えばＥＤＣ）のような滅菌剤の量は、約１０〜約３０ｍＭの範囲、特に約２０〜２５ｍＭの範囲で様々であってよい。

一般的に、完全に架橋された組織を調製するための初発の生体組織の場合、それらをブロッキング工程Ｓ１０８で処理する必要は必ずしもなく、これは、完全に架橋された組織を調整するための初発の生体組織は一般的に、架橋を形成する工程Ｓ１０６で完全に架橋されるためである。通常、滅菌工程１０８でカップリング剤と反応すると予想される反応性基は一般的に、完全に架橋された生体組織の調整用の初発の生体組織を調整するための処理／架橋形成を制御する工程の間に完全にブロックされるため、図５で説明されているように、ｐＦＸ組織の場合はブロッキング工程Ｓ１０８をスキップしてもよい。しかしながら、その代わりの実施態様において、ｐＦＸ組織は、ブロッキング工程Ｓ１０８で処理されてもよく、このケースにおいて、ブロッキング剤の添加は、ＦＸ組織の加工全体にとって有害であるとはみなされず、さらに滅菌工程を行うことによって、単に最終産物の滅菌状態を強化することができる。ｐＭＸ組織において処理／架橋形成を制御するケースと同様に、ｐＦＸ組織がブロッキング溶液と接触する時間は、ｐＭＸまたはｐＰＸ組織で用いられる時間と比較して短くすることができる。具体的な実施態様において、ｐＦＸ組織がブロッキング溶液と接触する時間は、ｐＭＸまたはｐＰＸ組織で用いられる時間の１０％未満、５％未満、２％未満、または、１％未満である。

続いてｐＭＸ、ｐＰＸまたはｐＦＸ組織は、最終的な滅菌工程Ｓ１１２で処理される。ｐＥＸ組織がブロッキング工程Ｓ１０８で処理されないケースにおいて、ｐＥＸ組織は決定工程Ｓ１１０から直接、最終的な滅菌工程Ｓ１１２に移行する。どのような場合においても、最終的な滅菌工程Ｓ１１２は、ｐＭＸ、ｐＰＸまたはｐＦＸ組織を、滅菌剤（例えば、ＥＤＣのようなカルボジイミド）、緩衝液、および任意に浸透促進剤を含む滅菌溶液と接触させることを含む。約５〜２５％（体積／体積）、特に約２０％（体積／体積）の適切な浸透促進剤、例えばＣ_１〜Ｃ_８アルカノール（例えば、イソプロパノール、または、ｎ−プロパノール）の存在下で用いられる場合、滅菌剤の濃度は、少なくとも約５ｍＭ、例えば約５〜約５０ｍＭであってもよい。

緩衝液は、前述の段落で図５に関して述べられているが、当然のことながら、図５で説明されている方法のその代わりの実施態様のいくつかにおいて、本方法は、緩衝液を用いないで行ってもよい。従って、本発明のいくつかの実施態様において、図５で説明されている方法は、架橋剤、カップリング剤、および、カップリング促進剤を含む架橋形成用溶液；滅菌剤およびブロッキング剤を含むブロッキング溶液；および、滅菌剤を含む滅菌溶液を用いて行うことができる。本発明のその他の実施態様において、図５で説明されている方法は、緩衝液、架橋剤、カップリング剤、および、カップリング促進剤を含む架橋形成用溶液；緩衝液、滅菌剤およびブロッキング剤を含むブロッキング溶液；および、緩衝液および滅菌剤を含む滅菌溶液を用いて行うことができる。本発明のさらにその他の実施態様において、図５で説明されている方法は、緩衝液、架橋剤、カップリング剤、および、カップリング促進剤を含む架橋形成用溶液；緩衝液、浸透促進剤、滅菌剤およびブロッキング剤を含むブロッキング溶液；および、浸透促進剤、緩衝液および滅菌剤を含む滅菌溶液を用いて行うことができる。

従って、本発明を概念的に解釈するその他の方法は、図６で示されるような２部からなる工程としてである。この工程Ｓ２０２の第一の部分において、未加工の生体組織は、架橋されるか、ブロックされるか、または、その両方が行われる。図６のＳ２０２において、生体組織における架橋の程度は、例えば組織が、架橋形成用溶液と接触させるのか、ブロッキング溶液と接触させるのか、または、架橋形成用溶液とブロッキング溶液との両方と接触させるのかどうか、架橋形成中の試薬および／またはブロッキング溶液の濃度、前記接触が起こる温度、および、前記接触が起こる時間のような条件を選択することによって制御される。適切な架橋剤の濃度、カップリング剤、カップリング促進剤、ブロッキング剤および滅菌剤、ならびに適切な温度および反応時間は、上記でより詳細に考察されている。続いて得られた可変的に架橋された生体組織（ｐＭＸ、ｐＰＸまたはｐＦＸ）は、滅菌工程Ｓ２０４で処理される。

滅菌工程２０４は、生体組織（ｐＭＸ、ｐＰＸまたはｐＦＸ）を滅菌溶液と接触させることを含む。滅菌溶液は滅菌剤を含むが、ここで具体的な滅菌剤、それらの濃度、加えて滅菌のための時間および温度は上記でより詳細に考察されている。得られた滅菌済みの架橋された生体組織（ＭＸ、ＰＸまたはＦＸ）は、本発明の滅菌済みの可変的に架橋された生体組織である。

実施例５は、本発明に係る可変的に架橋された組織を調整する手順を説明する。本発明の境界線は添付された請求項に記載されるため、当然ながらこれらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１
この第一の実験は、架橋形成中の表面積減少に対する１，６−ヘキサンジアミン濃度の作用を示すために行われた。

８０個のリーフレットを未加工のブタ大動脈基部から切り出した。各リーフレットの水気を吸い取って過量の緩衝液を除去し、ガラス表面に平らに置いて、逆さまにして流出させた。続いてレチクルを備えた解剖顕微鏡下で、図１で示されるように、心臓弁膜尖に、放射状および円周方向に製造元の推奨に従って組織マーキングダイで印を付けた。中心のドットと４個の外部ドットそれぞれとの距離は、架橋形成前は５ｍｍであった；それゆえに、マーカー間の最大限の距離は、１０ｍｍであった。次にこれらのリーフレットをそれぞれ２０個の心臓弁膜尖からなる４つのグループにランダムに分け、以下の条件下でインキュベートすることによって架橋した：
グループ１：２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、および、１ｍＭのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中の１１．２５ｍＭの１，６−ヘキサンジアミン（ＤＩＡ）水溶液中で、室温で９６時間。

グループ２：グループ１と同様、ただし６２ｍＭのＤＩＡを用いた。
グループ３：グループ１と同様、ただし１１２．５ｍＭのＤＩＡを用いた。
グループ４：リーフレットを、’３３９特許に従って２工程の手順でインキュベートした。第一の工程はグループ１と同様にして４８時間インキュベートし、それに続いて第二の工程のインキュベートを、２０ｍＭのＥＤＣ／１ｍＭのスルホ−ＮＨＳの存在下で７．５ｍＭのスベリン酸を用いて行った。

架橋形成が完了した後、マーカー間の距離を、レチクルを備えた顕微鏡を用いて放射状および円周方向について再度測定し、表面積減少を計算した。顕微鏡の較正は、それぞれの使用の前に行われた。サイズの減少を計算し、その結果を表１に示した。

この実験において、２工程で固定したサンプル、すなわちグループ４は、１２％の表面積減少を示したが、それと比較してグループ３がわずか約３％であった。匹敵する条件を用いた実験において、グルタルアルデヒドで固定されたリーフレットの収縮が５％およびそれより高い割合であることがわかった。この結果から、リーフレットの収縮における有意な減少は高いＤＩＡ濃度で得られることが実証され、この結果は、少なくとも２０年間当業界の標準であったグルタルアルデヒドでの固定より優れている。

実施例２
１１２．５ｍＭより高いＤＩＡ濃度の架橋形成における作用を決定するために、以下の実験を行った。

各条件に関する２１個のリーフレットを、未加工のブタ大動脈基部から切り出した。各条件につき、７個の基部に加えて、それらの３種それぞれの切り出されたリーフレットを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および、１１２．５ｍＭまたは１６０ｍＭいずれかのＤＩＡの水溶液２５０ｍｌ中で、２０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホ−ＮＨＳの存在下で室温で９６時間インキュベートした。インキュベート後、サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄し、続いて、２５ｍＭのＥＤＣと共に、イソプロピルアルコールの非存在下で（０％）、または、５％または２０％いずれかのイソプロピルアルコール存在下で４０℃で４８時間、３回滅菌した。１つの条件において、２０％イソプロパノールを含む溶液で滅菌中に、ブロッカーとして１００ｍＭのエタノールアミンを添加した。

その結果を表２に示し、イソプロピルアルコールの非存在下で１１２．５ｍＭのＤＩＡで固定されたリーフレットを３回連続して滅菌処理しても、すなわち１１２．５ｍＭのＤＩＡに関する表１と比較しても組織の有意な収縮を誘発しないことが実証された。５または２０％いずれかのアルコールの添加で滅菌したところ、多少の収縮が生じた；しかしながら、２０％イソプロピルアルコールの存在下で滅菌が行われる場合（収縮が別の状況で最大になると予想される場合）に１００ｍＭのエタノールアミンを添加すると、このような繰り返しの滅菌による収縮を有意に抑制する。またデータによれば、架橋を形成する工程中にＤＩＡ濃度を１６０ｍＭに高めると、元の状態のままである１４％の組織の収縮が誘発されたことも示された（これは、イソプロピルアルコールの非存在下または存在下での滅菌中に影響を受けない）；これは、標準的な固定処理によって生じる収縮量よりもかなり大きい収縮量である。

実施例３
次の実験を行い、ブタ大動脈弁の架橋形成に対するインキュベート時間の作用を３種の異なる観点から決定した。

４個の弁からなる５グループをそれぞれ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１２．５ｍＭのＤＩＡ、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＥＤＣ、および、１ｍＭのスルホ−ＮＨＳを含む水溶液中で３、６、２４、４８および９６時間インキュベートした。次に、これらの弁を滅菌生理食塩水で洗浄し、あらゆる反応副産物を除去した。これらを、使用するまで１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、および、２０％イソプロピルアルコール中で保存した。架橋を形成する有効性を決定するために、熱変性試験、および、コラゲナーゼおよびプロテアーゼによるタンパク質分解への耐性に関する試験を行った。これらの試験の手順は、Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．１９９６；５（５）：５１８〜２５で説明されている。未加工のブタ大動脈基部をコントロールとして用いた。

ａ．熱変性
リーフレットを大動脈基部から切り出し、それらに上記の参考文献で説明されているような熱安定性試験で処理した（条件１つあたりｎ＝３個）。その結果を図２に示したが、それによれば、心臓弁膜尖組織の架橋形成は適度に迅速に起こり、熱変性に対する最大の安定性が、約２４時間のインキュベートで達成され、その後発生する変化はほとんどないことが示される。

ｂ．プロテアーゼによる消化に対する耐性
リーフレット（条件１つあたり９個）、および、大動脈壁の切り取り試片（条件１つあたり１２個）を、Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．１９９６で説明されている試験に従ってプロテアーゼ消化で５０℃で２４時間処理した。その結果を図３に示すが、それによれば、心臓弁膜尖および大動脈壁両方の最大の消化に対する耐性は、架橋形成の約２４時間後に起こることが示される。

ｃ．コラゲナーゼ消化に対する耐性
リーフレット（条件１つあたり９個）、および、大動脈壁の切り取り試片（条件１つあたり１２個）を、上記の参考文献で説明されている試験に従ってコラゲナーゼ消化で３７℃で７２時間処理した。図４に示した結果から、最大の耐性は、実質的に固定の約２４時間後に得られたこと、および、耐性は、さらに２４時間処理してもほんのわずかしか改善されないことが実証された。

実施例４
実施例３で得られた優れた結果に続いて、ＥＤＣ、および、１１２ｍＭのＤＩＡを用いて架橋された組織と、一般的に実施例３と同じ試験計画を用いて標準的なグルタルアルデヒドで固定された組織とを比較する実験を行った。

１１２ｍＭのＤＩＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＥＤＣ、および、１ｍＭのスルホ−ＮＨＳの水溶液を用いてブタ大動脈基部を架橋した。室温でのインキュベートの９６時間後に、弁を滅菌生理食塩水で徹底的に洗浄して、未反応の試薬およびあらゆる反応副産物を除去した。弁を、実施例２の滅菌方法に従って２０％イソプロパノールを用いて３回滅菌した。標準的なグルタルアルデヒドで固定された、および、固定されていないブタ大動脈基部は、カリフォルニア州サンタアナのメドトロニック・ハート・バルブス（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅｓ）によって提供された。リーフレットおよび大動脈壁の切り取り試片（５ｍｍ×５ｍｍ）を切り出し、一般的に実施例３で説明されている通りの架橋形成試験で処理した。加えて、リーフレットおよび大動脈壁の切り取り試片を幼年のラットの皮下に８週間埋め込んで、石灰化への耐性を評価した。

ａ．熱変性
リーフレットの熱変性の結果を表４Ａに示す。未加工のリーフレット（すなわち固定されていないリーフレット）、および、グルタルアルデヒドで固定されたリーフレットに関する熱変性温度が、それぞれ６５．５℃および８４．９℃であることを見出し、これらはこれまでの試験結果と一致する。ＥＤＣで架橋されたリーフレットに関して決定された熱変性温度は８０．５℃であり、これは、未加工の組織の場合の温度から１５℃を超える有意な増加を示す。グルタルアルデヒドで固定されたリーフレットよりもよりわずかに低いが、これはまったく問題がないように感じられる。以前に述べた動的な差と共に、このようなより低い変性温度から、１１２ｍＭのＤＩＡ存在下でのＥＤＣでの架橋形成は、グルタルアルデヒドで固定した場合の架橋形成とは異なる架橋を誘導することが示される。

ｂ．プロテアーゼ消化に対する耐性
この試験では、通常の試験溶液よりもわずかに高い強度の試験溶液を用いた；わずか１５０ｍｇではなく２４２ｍｇのプロナーゼを、２５０ｍｌの溶液に溶解させた。プロテアーゼ消化に対する耐性の結果を表４Ｂに示す。２４時間のインキュベート後に、未加工の組織は完全に消化された。プロテアーゼ消化に対する耐性に関して、心臓弁膜尖および大動脈壁の両方におけるこのような高いジアミン濃度を用いたカルボジイミド固定と、標準的なグルタルアルデヒドでの架橋形成との間に有意な差はない。これらの結果によれば、この架橋形成方法は、グルタルアルデヒドでの固定と同様に有効であることが示される。

コラゲナーゼ消化に対する耐性の結果を表４Ｃに示す。未加工のリーフレット（主としてコラーゲンで構成される）は完全に消化された；しかしながら、各大動脈壁のかなりの部分がそのままであった。心臓弁膜尖に関して、ＥＤＣで固定された組織と、グルタルアルデヒドで固定された組織との間に有意な差はない；しかしながら、グルタルアルデヒドで固定された壁組織は、コラゲナーゼ消化に対する耐性が、ＥＤＣで固定された組織よりもわずかに少ないようである。総合すれば、これらの結果から、ＥＤＣおよび１１２ｍＭのＤＩＡで架橋された組織のコラゲナーゼに対する耐性は、グルタルアルデヒドで架橋された組織が示すコラゲナーゼに対する耐性と少なくとも同等であることが示される。

ｃ．幼年のラットに埋め込んでから８週間後の石灰化
滅菌したブタ大動脈基部からリーフレットおよび壁の切り取り試片（１ｃｍ×１ｃｍ）を切り出した。これらのサンプルを滅菌生理食塩水で２分間で３回洗浄し、続いて幼年のラットの皮下にランダムに埋め込んだ。８週間後に、これらのサンプルを取り出し、洗浄し、上述の参考文献で説明されているような定量的なカルシウム解析で処理した。

表４Ｄに示した結果から、１１２ｍＭのＤＩＡの存在下でＥＤＣで架橋された組織、心臓弁膜尖かまたは大動脈壁かどうかにかかわらず、グルタルアルデヒドで固定された組織よりも極めて有意に石灰化に対する耐性を示したことがわかる。

その上、大動脈壁の石灰化は、グルタルアルデヒドで固定された大動脈壁組織の場合の石灰化よりも有意に低いだけでなく、さらに、’３３９特許で説明されているようにして固定されたそれに匹敵する大動脈壁組織よりも低かった。上記で報告した埋め込みから８週間後の壁組織中のカルシウムレベルは、これまでに観察されたちょうど４週間埋め込んだ後のレベルよりもわずかに下回っている。これまで、８週間の埋め込み後のこのような大動脈壁におけるカルシウムレベルは、サンプル１ｇあたり約８０ｍｇのＣａ^＋＋であったが、これは、目下本発明のサンプルで見出される臨床的に有意であるとみなされるレベルの実質的に２倍のレベルである。

前述の実施例で得られた結果から、生体補綴材料の特徴、例えばその熱変性、そのプロテアーゼ消化に対する耐性、および、そのコラゲナーゼ消化に対する耐性を改善するために行われた一段階の固定の結果として起こる表面積の減少を最小化することにおいて、本発明が有効であることが示される。この点において、最近の２〜３０年の間、グルタルアルデヒドでの固定は一般的に容認された標準であるため、同じ組織のグルタルアルデヒドでの固定と公平に比較することが可能である。従って、改善された固定方法を用いて処理された組織の特徴は、これら３つの形態でグルタルアルデヒドで７日間処理された場合の同じ組織の特徴と都合よく比較されることが示される。また実施例３によれば、この方法を用いた固定の作用は、約２４〜４８時間インキュベートした後に実質的に最大化され、さらなる処理は有害ではないが、必ずしも必要ではない場合があるようであることも示される。また、この２４時間での極限の架橋形成の達成は、実質的に１時間または２時間後に完了するその他の架橋形成手順と対比することもでき、それにより、本発明の方法は、長期にわたり未加工の組織に深く貫入することによっているため、異なる架橋形成が極めて高い確率で発生する可能性があることが示される。それゆえに、極めて実質的な特性の改善が、８時間の処理の後に得られることが観察できるが、好ましくは、ＥＤＣ−アミン高濃度での固定は、ほぼ室温で少なくとも２４時間で行われる。おそらく最も劇的な改善は石灰化への耐性において起こるが、多くの点から、この石灰化への耐性は最も重要な生体人工装置の特徴の１つであり、これはなぜなら、石灰化は、人工心臓弁において稼働中に狭窄および逆流を引き起こす欠陥の根本的な原因の１つであることが示されているためである。以前’３３９特許で説明されている方法による固定が、匹敵するグルタルアルデヒドで固定された生体人工組織に比べて石灰化への耐性において多少の改善を示したが、表４Ｄによれば、大動脈壁組織は、グルタルアルデヒドで固定された組織の石灰化への耐性の約２倍の石灰化への耐性を示し、この方式で処理されたリーフレットは、ほぼ２０倍大きい耐性を示すことがわかる。この驚くべき石灰化への耐性は、本発明に従って処理された組織を含む生体人工装置に、極めて有用な耐久性を付与すると予想される。

実施例５：心膜組織の可変的な架橋形成
組織の調整
屠殺場から心膜シートを得て、氷冷した塩類溶液で、リンス溶液の流れが透明になるまで徹底的にリンスした。続いて心膜シートをクリーニングして脂肪を除去した。続いて心膜シートをシートに切断し、これを、さらなる加工のために準備するまで氷冷した塩類溶液上で維持した。

組織の望ましい架橋の程度［完全な架橋（ＦＸ）、部分的な架橋（ＰＸ）、または、最低限の架橋（ＭＸ）］を選択し、続いて以下で詳細に説明されているように選択された架橋形成の程度に適した工程に従った。

ＦＸ−固定
各心膜シートをテンプレート上にホルダーを用いて固定し、氷冷した塩類溶液（Ｓ１溶液）を含む固定容器中に置いた。全てのシートが容器中にあるときは、容器を覆って０〜４℃で維持した。続いて、１１２．５ｍＭの１，６−ヘキサンジアミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＥＤＣ、および、１ｍＭのＳ−ＮＨＳを含む固定溶液を製造した。固定用容器から食塩水を完全に排水し、即座に固定溶液で交換し、確実に全てのシートが固定溶液中に完全に浸されるようにした。組織を、固定溶液の存在下で室温で９６時間でインキュベートした。

固定の最後に、各容器から固定溶液を排水し、シートから完全に除去した。確実に本方法中ずっと全てのシートを湿った状態に維持して、全ての試薬および反応副産物がシートから完全に除去されるまでシートを氷冷した食塩水（Ｓ１）で徹底的にリンスした。固定された組織を、覆われた容器中でＳ１溶液中で４℃で次の工程まで維持した。

ＦＸ−滅菌
必要に応じて、固定されたシートを適切なサイズに切断し、個々に標識された滅菌容器中に置き、塩類溶液（Ｓ１）中に浸し、乾燥を防いだ。固定用容器を次の工程までしっかり覆ったまま維持した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．６５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコール、および、２５ｍＭのＥＤＣを含む滅菌溶液を製造した。

滅菌容器から食塩水を排水し、即座に滅菌溶液で交換し、確実に全てのシートが完全浸されるようにした。容器をしっかり覆って、滅菌溶液の蒸発を防いだ。この容器をローラー装置上に４０±２℃で４８±２時間置いた。滅菌時間が完了した後、インキュベーターから容器を取り出し、室温で保存した。

ＰＸ−固定
各心膜シートをテンプレート上にホルダーを用いて固定し、氷冷した塩類溶液（Ｓ１溶液）を含む固定容器中に置いた。全てのシートが容器中にあるときは、容器を覆って０〜４℃で維持した。続いて、１１２．５ｍＭの１，６−ヘキサンジアミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭのＥＤＣ、および、０．１２５ｍＭのＳ−ＮＨＳを含むＰＸ固定溶液を製造した。

続いて、塩類溶液を各固定用容器から排水し、即座にＰＸ固定溶液で交換し、確実に全てのシートが完全に浸されるようにした。続いてこの容器を覆い、振盪機上に置き、１００ｒｐｍで９６±２時間回転させた。固定時間の最後に、各容器から固定溶液を排水した。確実に本方法中ずっと全てのシートを湿った状態に維持して、全ての試薬および副産物が組織から完全に除去されるまでシートを氷冷した食塩水（Ｓ１）で徹底的にリンスした。シートを、次の工程まで覆われた容器中で４℃で維持した。

ＰＸ−滅菌
トリス／エタノールアミンブロッキング試薬を用いたブロッキング処理
１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのエタノールアミン、２０％イソプロピルアルコール、および、２０ｍＭのＥＤＣを含むブロッキング溶液を製造した。容器から食塩水を排水し、即座にブロッキング溶液で交換し、確実に完全に全てのシートが覆われるようにした。続いてこの容器をインキュベーター中に４０±２℃で４８±２時間置いた。ブロッキング時間の最後に、インキュベーターから容器を取り出し、室温に戻し、その後容器からブロッキング溶液を排水した。確実に本方法中ずっと全てのシートを湿った状態に維持して、全ての試薬および副産物が完全に除去されるまでシートを氷冷した食塩水でリンスした。続いてシートを個々の滅菌容器中に置き、次の工程まで氷冷した食塩水で覆った。

最終的な滅菌−滅菌条件下でのＥＤＣでの処理
２０％イソプロパノール、２０ｍＭのＥＤＣ、および、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む最終的な滅菌溶液を製造した。続いて、滅菌容器から塩類溶液を排水し、即座に最終的な滅菌溶液で交換し、確実に全てのシートが完全に覆われるようにした。続いてこの容器をしっかり覆い、インキュベーター中でローラー装置上に４０±２℃で４８±２時間置いた。反応時間が完了した後、インキュベーターから容器を取り出し、続いて室温で保存した。

ＭＸ−ブロッキング
各シートをテンプレート上にホルダーを用いて固定し、固定用容器中に置き、食塩水（Ｓ１）中に完全に浸した。続いてこの容器を覆い、４℃で維持し、一方で滅菌溶液を製造した。続いて、２０％イソプロパノール、１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのエタノールアミン、および、２０ｍＭのＥＤＣを含むブロッキング溶液を製造した。

続いて固定用容器から食塩水を排水し、即座にブロッキング溶液で交換し、確実に各シートがブロッキング溶液で完全に覆われるようにした。続いてこの容器をしっかり覆って蒸発を防ぎ、インキュベーター中に４０±２℃で４８±時間置いた。インキュベート時間の最後に、インキュベーターから容器を取り出し、室温に戻した。確実に本方法中ずっと全てのシートを湿った状態のままにして、全ての試薬および副産物がシートから除去されるまでシートを食塩水（Ｓ１）で徹底的にリンスした。続いて、シートを個々に標識された滅菌容器中に置き、塩類溶液（Ｓ１）中に完全に浸して、乾燥を防いだ。

ＭＸ−最終的な滅菌
続いて、２０％イソプロパノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．６５％ＮａＣｌ、および、２０ｍＭのＥＤＣを含む最終的な滅菌溶液を製造した。続いて、滅菌容器から塩類溶液を排水し、即座に最終的な滅菌溶液で交換し、確実に全てのシートが滅菌溶液中に完全に浸されるようにした。続いて滅菌容器をしっかり覆って蒸発を防ぎ、ローラー装置上のインキュベーター中に４０±２℃で４８±２時間置いた。インキュベート時間の最後に、インキュベーターから容器を取り出し、室温に戻した。続いてこの容器を室温で保存した。

実施例６：架橋形成の決定
上記で概説した手順を用いて得られた架橋の程度を決定するために、実施例５に記載の方法により得られたＭＸ、ＰＸおよびＦＸ組織を、収縮温度およびプロナーゼ消化試験で処理した。タンパク質変性（熱収縮）の温度は、コラーゲンベースの組織の架橋形成に関して十分容認された測定方法である。Ｓｕｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９７；Ｂｉｌｌｉａｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２００１；米国特許第５，４４７，５３６号を参照。タンパク質分解への耐性も同様に、架橋形成を特徴付けるために十分容認された方法である。Ｓｕｎｇ等，１９９７；Ｂｉｌｌｉａｒ等，２００１；米国特許第５，４４７，５３６号；Ｇｉｒａｒｄｏｔ，Ｊ．Ｍ．等，Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓ．，５（５），５１８〜２５，（１９９６）。

収縮温度を当業界で認められている方法によって決定した。Ｓｕｎｇ等，１９９７；Ｂｉｌｌｉａｒ等，２００１； 米国特許第５，４４７，５３６号。実質的にサンプルは、水浴中で２つのクランプの間に固定した。クランプの１つ（いわゆるピボットクランプ）の運動を測定するように適合させたスケール上で連続的な、および明らかな運動が観察されるまで、水浴を次第に加熱した。このような運動が始まる温度は、収縮温度と指定される。収縮温度が低ければ低いほど、架橋の程度はより少ない。

サンプル（８サンプル、それぞれ約２ｍｍ×２ｃｍ）を、上記の実施例５に従ってＭＸ、ＰＸおよびＦＸ加工で処理したウマの心膜の９種の異なるロットから切断した。各サンプルの一方の端部を熱収縮装置上の固定されたクランプに入れ、他方の端部を、ピボットクランプの運動を示すように設計されたポインターを備えた同装置上のピボットクランプで留めた。先頭に水浴を装着し、水浴を撹拌しながら組織を加熱した。サンプルのクランプと同じレベルにデジタル温度計のプローブを置いた。水温を、５５〜６０℃から開始して、約０．１℃／秒で徐々に昇温した。ピボットクランプからの針が一定で明らかな運動（＞２ｍｍ）を記録したら、温度を記録した。ランとランの間に水を交換し、同じ手順で次のサンプルを測定した。以下の表５に、上記の実施例５９に記載の方法によって生産され、この手順に従って試験されたＭＸ、ＰＸおよびＦＸサンプルの収縮温度を示す。

酵素による消化試験で、プロナーゼ、非特異的なタンパク質分解酵素を用いて、架橋されていないタンパク質を消化した。組織サンプルをリンスし、酵素溶液中で特定の期間インキュベートした。消化の前後に乾燥させた組織サンプルの質量を量り、未消化のタンパク質の比率を得た。消化の程度は、架橋の程度に反比例する。

サンプル（５、それぞれ約１ｃｍ×１ｃｍ）を、上記の実施例５で概説された手順により得たＭＸ、ＰＸおよびＦＸ加工したウマの心膜１０種の異なるロットから切断した。サンプルを０．９％ＮａＣｌ水溶液で３回洗浄した（５分のリンスを２回、および、１５分のリンスを１回）。サンプルを組織培養用のフード内で一晩空気乾燥させた。次の日、化学天秤でサンプルの重さを量り、重さ（Ｗ_{ｉｎｉｔｉａｌ}）を記録した。

水性ＨＥＰＥＳ緩衝液を酵素による消化試験の日に新しく製造した。この緩衝液を組織サンプルに添加する直前に、プロテアーゼおよびＣａＣｌ_２をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび０．６ｍｇ／ｍｌでこの緩衝液に添加した。各サンプルに酵素溶液（３ｍｌ）を添加した。サンプルを振盪しながら５０℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、酵素からサンプルを除去し、毛羽のないティッシュ上で３回水気を吸収させて乾燥させ、組織培養用フード中で一晩乾燥させた。最終的なサンプル質量（Ｗ_{ｆｉｎａｌ}）を測定し、以下の式を用いて、消化された組織重量の未消化の組織重量に対する簡単な比率を計算した：１００％×（Ｗ_{ｆｉｎａｌ}／Ｗ_{ｉｎｉｔｉａｌ}）、式中Ｗ_{ｆｉｎａｌ}は、消化された組織の乾燥重量であり、Ｗ_{ｉｎｉｔｉａｌ}は、未消化の組織の乾燥重量である。以下の表５に、上記の実施例５に記載の方法によって作製されたＭＸ、ＰＸおよびＦＸ組織の結果を示す。

以下の表５でわかるように、本発明の方法は、最低限の架橋から、続いて部分的な架橋、続いて完全な架橋に至る範囲で、架橋形成の範囲を提供する。

目下本発明を実施するために発明者等にとって既知の最良の形態を構成する好ましい特定の実施態様に関して本発明を説明したが、当然ながら当業界において通常の技術を有するものにとっては明白であると予想される様々な変化および改変を、添付の請求項で定義される本発明の範囲から逸脱することなく施すことができる。例えば、水溶液を用いた処理を行うことが好ましいが、その代わりに、その他の生体適合性溶媒、または、溶媒の組み合わせを当業界において一般的に既知の通りに用いてもよい。

後述される請求項において、本発明の具体的な特徴を特記する。
好ましい本発明の実施態様を本明細書において示し説明したが、このような実施態様は、単に一例として提供されるていることは、当業者にとって明白であると思われる。当業者であれば、ここで本発明から逸脱することなく多数の改変法、変化および置換を想像できるものと予想される。当然ながら、本明細書において説明されている本発明の実施態様に対する様々な代替法が、本発明の実施において使用可能である。本発明の範囲は、以下の請求項で定義され、これらの請求項およびそれらの等価体の範囲内の方法および構造はそれらに包含されることとする。

固定中に発生する表面積減少の量を測定するために行われた印付けであるドットを示す、ブタ大動脈のリーフレットの図である。 ブタリーフレットの熱変性における、固定の持続時間の作用を示すグラフである。 壁組織およびリーフレットのタンパク質分解酵素による消化に対する耐性を固定時間に対して示したグラフである。 壁組織およびリーフレットのコラゲナーゼ消化に対する耐性を固定時間に対して示したグラフである。 本発明に係る方法の実施態様を模式的に示すフローチャートである。 本発明の方法の実施態様を模式的に示すフローチャートである。

Claims (15)

1. 未加工の組織から、滅菌済みの部分架橋した生体組織を製造する方法であって：
   ａ）未加工生体組織と、ジアミン架橋剤、０．１〜５ｍＭのカルボジイミドカップリング剤および０．０５〜０．４ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）であるカップリング促進剤を含む架橋形成用溶液とを接触させて、部分架橋組織を生成し、
   ｂ）該部分架橋組織と、モノアミン、浸透促進剤および滅菌剤を含むブロッキング溶液とを接触させ、そして
   ｃ）次いで、得られた組織と、滅菌剤を含み、ブロッキング剤を含まない最終的な滅菌溶液とを接触させ、滅菌済みで且つ部分架橋した生体組織を生成させ、得られた部分架橋生体組織は、５０℃、２４時間１ｍｇ／ｍｌプロナーゼで処理したとき、５０％より大きいが、８０％未満の残存する組織をもたらす、上記生体組織の製造方法。
2. 前記カップリング剤が１〜２．５ｍＭの濃度のカルボジイミドカップリング剤であり、滅菌剤がカルボジイミド滅菌剤であり、滅菌済みで且つ部分架橋した生体組織を生成させ、当該組織の収縮温度は、未加工生体組織の収縮温度より少なくとも４℃高く、完全架橋組織の収縮温度よりも少なくとも６℃低い、請求項１に記載の方法。
3. 前記架橋剤がアルカンジアミンであり、前記カップリング剤がカルボジイミドであり、前記カップリング促進剤が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）である、請求項１に記載の方法。
4. 前記架橋剤がアルカンジアミンであり、前記カップリング剤が１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）である、請求項２に記載の方法。
5. 架橋剤溶液中で２．５ｍＭのＥＤＣ濃度を使用する請求項４に記載の方法。
6. ブロッキング溶液が５０〜２５０ｍＭのモノアミンおよび浸透促進剤として２５％のＣ１−Ｃ８アルカノールを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記最終的な滅菌溶液が、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、アルカノールおよび緩衝液としてＮ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 浸透促進剤が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｔ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｎ−ブタノールおよびｓ−ブタノールから選択される低級アルカノールである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記ブロッキング溶液中のモノアミンブロッキング剤が５０〜２５０ｍＭの濃度である、請求項１〜５、７または８のいずれかに記載の方法。
10. モノアミンがエタノールアミンである、請求項９に記載の方法。
11. ブロッキング溶液が、緩衝液をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記緩衝液がトリス−（ヒドロキシメチル）アミノエタンである、請求項１１に記載の方法。
13. ブロッキング溶液が、滅菌剤としてＥＤＣを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 工程ｂ）の終わりに、前記組織をリンスし、総ての試薬および副産物を除去する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 請求項１に記載の方法により製造された滅菌済みの部分架橋した生体組織。

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