JP5547640B2 - 前立腺癌の治療・予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、生体内で抗腫瘍作用を示す（癌治療用）医薬品に関する。より詳しくは、ウイルスエンベロープ、特に不活性化センダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ，以下ＨＶＪと表記することもある）エンベロープ（以下ＨＶＪ−Ｅと表記することもある）を有効成分とする、前立腺癌治療の治療・予防剤に関する。また、本発明は不活性化センダイウイルスエンベロープのみを有効成分とする、メラノーマの治療・予防剤に関する。

遺伝子機能解析や遺伝子治療のために、培養細胞や生体組織に遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法、非ウイルス法が開発されてきた（非特許文献１および非特許文献２）。一般に、細胞へ遺伝子を導入するためには、ウイルス法が効果的である。しかし、ウイルスベクターを用いる方法は、親ウイルス由来の遺伝子の導入とその発現の可能性、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変の可能性があり、安全性の面で問題がある。一方、リポソーム等を用いる非ウイルス法の多くは、細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より低いが、培養細胞や生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比べて劣る傾向にある。

「センダイウイルス」は、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスである。このウイルス粒子は、その表面にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有するエンベロープをもち、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。またセンダイウイルスは、約１５，５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡをゲノムとして有し、ＲＮＡポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。このウイルスを不活性化することで、複製欠損となる、センダイウイルスエンベロープベクターが得られる。
センダイウイルスはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され、細胞膜融合活性（以下、融合活性とする）の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきた。しかし、センダイウイルスは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に生産されるとＣＴＬを誘導することが知られており（非特許文献３）、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたセンダイウイルスとを融合することで、融合粒子（センダイウイルス−リポソーム）を作製する方法が考案され、これにより細胞や生体への非侵襲の遺伝子導入が可能となった（特許文献１、非特許文献４および非特許文献５）。

本発明者らは、これまでに効果的な遺伝子送達能力を持つ（高効率）ウイルスおよび、細胞傷害性および免疫原性がより少ない（低毒性）非ウイルスベクターを組み合わせることにより、新規ハイブリッド遺伝子導入ベクターを開発し、日本血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ；センダイウイルス）由来の融合形成性エンベロープを持つ融合形成性ウイルスリポソームを構築した（金田、１９９８；金田ら、１９９９）。この送達システムでは、ＤＮＡ充填リポソームを、ＵＶ不活性化センダイウイルスと融合させ、融合形成性ウイルス−リポソームであるセンダイウイルス−リポソーム（直径４００〜５００ｎｍ）を形成させる。融合媒介送達の利点は、トランスフェクトされたＤＮＡが、受容体細胞におけるエンドソーム分解およびリソソーム分解から保護されることにある。例えば、センダイウイルス−リポソーム中に取り込まれたＤＮＡは、哺乳動物細胞に安全に送達することができる（特許文献２）。また、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび薬物も、インビトロおよび生体内で細胞中に効率的に導入されうる。さらに、本発明者らは、ウイルスエンベロープを使用する、安全、安定かつ広範囲の生体内組織に遺伝子導入可能な、高遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターとして、センダイウイルスエンベロープを凍結融解処理または界面活性剤と混合することによって、外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターを発明した（特許文献３）。また、センダイウイルスエンベロープを用いて脳または中枢神経にも物質を効率よく導入することが可能である（特許文献４）。さらにまた、センダイウイルスエンベロープに抗癌剤などの化学療法剤を封入して、それを細胞内または生体内に移入する方法も見出し、免疫アジュバント効果を発揮することも見出した（特許文献４、特許文献５、特許文献６）。

ところで、癌の治療方法については、すでに種々のものが開発されている。一般的な癌、特に固形癌の治療としては、有効な薬剤を癌組織に移入して癌細胞を殺傷する方法が挙げられる。また、低分子化合物からなる化学療法剤を投与する化学療法または投薬療法だけでなく、放射線療法、免疫療法、内分泌療法など、種々の療法が開発されている。しかしながら、未だに、完全寛解可能な疾患であるとは断言できない状況にある。固形癌の中でも、特に前立腺癌は、前立腺の細胞が正常の細胞増殖機能を失い、無秩序に自己増殖することにより発生する。近年、本邦における前立腺癌患者の発生、死亡率は増加の一途を辿っている。
前立腺に限局した癌の場合は根治的前立腺摘除術が適応となるが、近年は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）マーカーによるスクリーニングにより、外科的切除可能と判断される早期癌の患者が増加してきている。しかしながら外科的切除後の再発頻度は、一般に２０〜５７％とされ、依然高い再発率が問題となっている。
一般に再発症例および前立腺外に進展が認められる前立腺癌に対しては、局所放射線照射や内分泌療法等が救済療法として選択されるが、根治を得る可能性は概して低い。そこで術前に内分泌療法を施行するネオアジュバント療法も完全切除の可能性を高くする目的で行われているが、不満足な結果となっている。特に、内分泌療法ではしばしばホルモン抵抗性を獲得した前立腺癌細胞が出現し、治療成績を低くしてしまう。そのため、術前内分泌療法に代わる、より有効な前立腺癌の治療法や、ホルモン抵抗性の前立腺癌を効率的に治療する方法の開発が期待されている状況である。

米国特許第５，６３１，２３７号 国際公開第２００１／０５７２０４号パンフレット 特開２００２−０６５２７８号公報 国際公開第２００５／０９５６１３号パンフレット 国際公開第２００４／０３９４０６号パンフレット 国際公開第２００５／０９４８７８号パンフレット

Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，９２６−９３２，１９９３年 Ｌｅｄｌｅｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第６巻、１１２９−１１４４、１９９５年 Ｃｏｌｅ Ｇ．Ａ．ら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８，４３０１−４３０９，１９９７年 Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１４２１−１１４２５，１９９６年 金田ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，５，２９８−３０３，１９９９年

本発明の課題は、前立腺癌の新規な治療・予防剤、および治療・予防法を提供することである。より具体的には、前立腺癌、特に内分泌療法によりホルモン抵抗性となった前立腺癌の治療・予防剤および治療・予防法を提供することである。また、本発明の別の課題は、メラノーマの新規な治療・予防剤を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、ウイルスエンベロープ、特にセンダイウイルスエンベロープそのものが、腫瘍細胞（前立腺癌細胞）のアポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を有することを見出し、ウイルスエンベロープ、特にセンダイウイルスエンベロープそのものが前立腺癌治療・予防剤として利用可能であることを明らかにした。また、本発明者らは、センダイウイルスエンベロープ自体が、メラノーマの治療・予防剤として利用可能であることを見出した。すなわち、本発明は、
［１］ウイルスエンベロープを有効成分として含有する、前立腺癌治療・予防剤；
［２］ウイルスが、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、およびフィロウイルス科からなる群から選択されるいずれか１つの科に属するウイルスである、上記［１］記載の治療・予防剤；
［３］ウイルスが、パラミクソウイルス科に属するウイルスである、上記［２］記載の治療・予防剤；
［４］ウイルスが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよびインフルエンザウイルスからなる群より選択される、上記［１］記載の治療・予防剤；
［５］ウイルスが、センダイウイルスである、上記［４］記載の治療・予防剤；
［６］ＮＫ細胞もしくはアシアロＧＭ１陽性細胞の活性化または腫瘍細胞からのインターフェロンαもしくはβの産生誘導をもたらすことを特徴とする、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の治療・予防剤；
［７］前立腺癌のアンドロゲン感受性が一部または完全に低減されている、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の治療・予防剤。
［８］前立腺癌がホルモン抵抗性である、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の治療・予防剤；
［９］前立腺癌に直接投与されることを特徴とする、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の治療・予防剤；
［１０］前立腺癌に直接注射されることを特徴とする、上記［９］記載の治療・予防剤；
［１１］他の癌治療方法と併用されることを特徴とする、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の治療・予防剤；
［１２］他の癌治療方法が、投薬、内分泌療法、放射線療法、化学療法および免疫療法からなる群より選択される、上記［１１］記載の治療・予防剤；
［１３］内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者に投与されることを特徴とする、上記［１２］記載の治療・予防剤；
［１４］内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者が、アンドロゲン感受性が一部または完全に低減された前立腺癌を有する、上記［１３］記載の治療・予防剤；
［１５］ 内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者が、ホルモン抵抗性前立腺癌を有する、上記［１３］記載の治療・予防剤；
［１６］前立腺癌患者または前立腺癌に罹患するリスクを有する者にウイルスエンベロープを有効量投与することを特徴とする、前立腺癌の治療・予防方法；
［１７］前立腺癌の治療・予防において使用するためのウイルスエンベロープ；
［１８］前立腺癌の治療・予防剤を製造するためのウイルスエンベロープの使用；
［１９］ウイルスエンベロープを有効成分として含有する、前立腺癌細胞のアポトーシス誘導剤；
［２０］ウイルスがセンダイウイルスである、上記［１９］記載のアポトーシス誘導剤；
［２１］前立腺癌患者または前立腺癌に罹患するリスクを有する者にウイルスエンベロープを有効量投与することを特徴とする、前立腺癌細胞のアポトーシス誘導方法；
［２２］前立腺癌細胞のアポトーシス誘導において使用するためのウイルスエンベロープ；
［２３］前立腺癌細胞のアポトーシス誘導剤を製造するためのウイルスエンベロープの使用；
［２４］有効成分としてセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）のみを含有する、メラノーマ治療・予防剤；
［２５］１回あたりの投与量が１０〜１００００ＨＡＵであることを特徴とする、上記［２４］のメラノーマ治療・予防剤；
［２６］１回あたりの投与量が４０〜４００ＨＡＵであることを特徴とする、上記［２４］のメラノーマ治療・予防剤；
［２７］投与回数が１〜１０回であることを特徴とする、上記［２４］のメラノーマ治療・予防剤；
［２８］投与回数が３〜６回であることを特徴とする、上記［２４］のメラノーマ治療・予防剤；
［２９］メラノーマ患者またはメラノーマに罹患するリスクを有する者に、メラノーマの治療・予防のための唯一の有効成分としてセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）を有効量投与することを特徴とする、メラノーマの治療・予防方法；
［３０］メラノーマの治療・予防において使用するためのセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）を唯一の有効成分として含む医薬組成物；
［３１］メラノーマの治療・予防剤を製造するためのセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）を唯一の有効成分として含む医薬組成物の使用
などを提供する。

本発明によって、前立腺癌の新たな治療・予防剤が提供される。本発明によって提供される前立腺癌治療・予防剤は、その活性成分としてウイルスエンベロープ、特にセンダイウイルスエンベロープを含有する。本発明の治療・予防剤は、特にホルモン抵抗性の前立腺癌に対して優れた治療効果を発揮する。
前立腺癌の治療においては、現在ＰＳＡスクリーニング法、外科的切除法、内分泌療法、放射線治療法などが存在するが、その根治は依然大きな課題である。本発明は、生体内実験を用いてセンダイウイルスエンベロープが前立腺癌への直接投与で癌を著しく退縮させることを示した。
また、本発明によって、メラノーマの新たな治療・予防剤が提供される。該治療・予防剤は、低用量でメラノーマ退縮効果を示す。

センダイウイルスエンベロープの前立腺癌細胞（ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞ＬＮＣａｐ、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３およびＤＵ１４５）もしくはヒト正常前立腺上皮細胞（ＰＮＴ２）に対する殺能力を示すデータである。（Ａ）はセンダイウイルスエンベロープのウイルス数（ｘ軸）に対する前立腺癌細胞もしくはヒト正常前立腺上皮細胞のコントロールに対する生存率（ｙ軸）を示し、（Ｂ）はその代表的形態を示す（倍率×４０）。矢印はセンダイウイルスエンベロープにより融合した細胞を示す。 センダイウイルスエンベロープの、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞（ＰＣ３，ＤＵ１４５）、ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞（ＬＮＣａｐ細胞）もしくはヒト正常前立腺上皮細胞（ＰＮＴ２）への接着能力を示すデータである。ホルモン抵抗性前立腺癌細胞、ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞もしくはヒト正常前立腺上皮細胞にＰＫＨ２６でラベルされたセンダイウイルスエンベロープを投与し、細胞融合が起こるか検討した（共焦点顕微鏡倍率×２００）。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。 センダイウイルスエンベロープの、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞（ＰＣ３）に対するアポトーシス誘導能を示すデータである。前立腺癌細胞のセンダイウイルスエンベロープ（ＭＯＩ １０^４）処置後、もしくは未処置（ｃｏｎｔｒｏｌ）のＴＵＮＥＬ染色を示す（共焦点倍率×２００）。ＤＡＰＩ染色は細胞核を示す。 センダイウイルスエンベロープのホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３に対するアポトーシス誘導能を示すデータである。（Ａ）はアネキシンＶ陽性のホルモン抵抗性前立腺癌細胞を、センダイウイルスエンベロープ処置群、非処置（コントロール）群の間で比較したものである。（Ｂ）はセンダイウイルスエンベロープ処置し、１２、２４時間後の腫瘍細胞におけるＣａｓｐａｓｅのタンパク質発現を示したものである。 センダイウイルスエンベロープのホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３に対するＩ型インターフェロン誘導能を示すデータである。図５（Ａ）は、センダイウイルスエンベロープのウイルス数（ｘ軸）に対する、ＰＣ３が培地中に産生するＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α、β）の発現量（ｙ軸）の推移を示すグラフである。グラフは３回の試行の結果を統計処理したデータを表示している。図５（Ｂ）は、ＲＩＧ−Ｉの発現に対する、センダイウイルスエンベロープおよび抗ＩＮＦ受容体抗体の作用を示すウェスタンブロット解析像である。内部コントロールとしてβアクチンを用いた。 センダイウイルスエンベロープのホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３に対するアポトーシス誘導のメカニズムを示すデータである。（Ａ）はセンダイウイルスエンベロープ処置されたホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３のｐＳＴＡＴ１、カスパーゼタンパク質発現を、ＪＡＫ阻害剤前処置群、非処置群の間で比較したものである。内部コントロールとしてβアクチンを用いた。（Ｂ）はセンダイウイルスエンベロープ処置されたホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３のｐＳＴＡＴ１、カスパーゼ３およびカスパーゼ８タンパク質発現を、ＪＡＫ阻害剤前処置および抗ＩＦＮ受容体抗体前処置の有無で比較したウェスタンブロット解析像である。内部コントロールとしてβアクチンを用いた。（Ｃ）はセンダイウイルスエンベロープ処置されたアネキシンＶ陽性のホルモン抵抗性前立腺癌細胞を、ＪＡＫ阻害剤前処置群、非処置群の間で比較したものである。 センダイウイルスエンベロープのｉｎ ｖｉｖｏにおけるホルモン抵抗性前立腺癌細胞退縮作用を示すデータである。（Ａ）はＳＣＩＤマウスに移植したホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対し、センダイウイルスエンベロープの直接投与がホルモン抵抗性前立腺癌細胞の退縮を促進することを示す。■：センダイウイルスエンベロープ（５，０００ＨＡＵ）投与群（ｎ＝３）；●：ＰＢＳ投与群（ｎ＝３）。（Ｂ）はホルモン抵抗性前立腺癌細胞移植後４１日目のＰＢＳ投与群もしくはセンダイウイルスエンベロープ投与群ＳＣＩＤマウスの代表的写真である。これらにより、ＳＣＩＤマウスに移植したホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対し、センダイウイルスエンベロープが腫瘍抑制効果を持つことを明らかになった。（Ｃ）は、抗アシアロＧＭ−１抗体によりＮＫ細胞を欠損させたＳＣＩＤマウスに移植したホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対し、センダイウイルスエンベロープの直接投与がホルモン抵抗性前立腺癌細胞の退縮を促進することを示す。■：センダイウイルスエンベロープ（５，０００ＨＡＵ）投与群（ｎ＝３）；●：ＰＢＳ投与群（ｎ＝３）；▲：センダイウイルスエンベロープ（５，０００ＨＡＵ）＋抗アシアロＧＭ−１抗体投与群（ｎ＝４）。統計データはｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍで表される。グループ間の比較はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔによって行った。危険率Ｐ＜０．０１を有効とした。 ホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対する、センダイウイルスエンベロープのインターフェロンを介したアポトーシスのメカニズムを示した図である。 （Ａ）は、ヒトＰＣ３細胞株マウス移植モデルにおけるＧＥＮ０１０１を４日に１回、計３回投与した場合における腫瘍増殖抑制効果を示したものである。（Ｂ）は、ヒトＰＣ３細胞株マウス移植モデルにおけるＧＥＮ０１０１投与開始後の体重変化率の推移を示したものである。 （Ａ）は、ヒトＰＣ３細胞株マウス移植モデルにおけるＧＥＮ０１０１を７日に１回、計２回投与した場合における腫瘍増殖抑制効果を示したものである。（Ｂ）は、ヒトＰＣ３細胞株マウス移植モデルにおけるＧＥＮ０１０１投与開始後の体重変化率の推移を示したものである。 ＨＶＪ−Ｅ腫瘍内投与後の各群における腫瘍体積の変化を示したものである。◆^Ａ：Ａ群（３回投与対照群）、◆^Ｂ：Ｂ群（３回投与４０ＨＡＵ群）、◆^Ｃ：Ｃ群（３回投与４００ＨＡＵ群）、■^Ｄ：Ｄ群（６回投与対照群）、■^Ｅ：Ｅ群（６回投与４０ＨＡＵ群）、■^Ｆ：Ｆ群（６回投与４００ＨＡＵ群）、６〜９匹の平均値±標準偏差、＊＊：ｐ＜０．０１、腫瘍細胞移植後２０日におけるＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。 ＨＶＪ−Ｅ腫瘍内投与後の各群における生存曲線を示したものである。Ａ：３回投与した群間での生存曲線。Ｂ：６回投与した群間での生存曲線。◆^Ａ：Ａ群（３回投与対照群）、◆^Ｂ：Ｂ群（３回投与４０ＨＡＵ群）、◆^Ｃ：Ｃ群（３回投与４００ＨＡＵ群）、■^Ｄ：Ｄ群（６回投与対照群）、■^Ｅ：Ｅ群（６回投与４０ＨＡＵ群）、■^Ｆ：Ｆ群（６回投与４００ＨＡＵ群） ｄａｙ１５からｄａｙ３６までの各群の体重変化率を示したものである。◆^Ａ：Ａ群（３回投与対照群）、◆^Ｂ：Ｂ群（３回投与４０ＨＡＵ群）、◆^Ｃ：Ｃ群（３回投与４００ＨＡＵ群）、■^Ｄ：Ｄ群（６回投与対照群）、■^Ｅ：Ｅ群（６回投与４０ＨＡＵ群）、■^Ｆ：Ｆ群（６回投与４００ＨＡＵ群）、ｄａｙ４の体重を基準とした変化率（％）の平均値±標準偏差で示した。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ウイルスエンベロープを有効成分として含有する前立腺癌治療・予防剤を提供する。

本明細書で使用される場合、「ウイルスエンベロープ」とは、ウイルスの最も外側に位置する膜状の構造物を意味する。ウイルスにおいては、エンベロープは、通常、ウイルスゲノム及びカプシドタンパク質を覆っている。ウイルスエンベロープは、通常、その内腔に種々の物質を担持することが可能であり、且つ細胞膜へ融合し、その内腔に含まれる物質を細胞内へ移入する活性を有する。そのため、ウイルスエンベロープの内腔に、所望の物質［遺伝子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質（またはペプチド）、化合物（抗癌剤、抗菌剤、免疫促進剤など）］を封入し、これを個体へ投与することにより、種々の組織や細胞の内部へ、所望の物質を送達することが可能である。すなわち、ウイルスエンベロープは種々の物質のベクターとして使用可能である。本発明において使用されるウイルスエンベロープは、その内腔に、生体内や細胞内への導入が意図される物資を封入していても、封入していなくてもよい。後述の実施例に示すように、ウイルスエンベロープ自体に前立腺癌細胞を殺傷する効果があるので、好ましい一実施態様において、ウイルスエンベロープ内には生体内や細胞内への導入が意図される物質が実質的に封入されていない。

本発明のウイルスエンベロープの調製に用いられるウイルスとしては、エンベロープを有しているウイルスであれば、ＤＮＡウイルスであってもＲＮＡウイルスであってもよい。また本発明のウイルスは野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。

そのようなウイルスとしては、ＤＮＡウイルスに属するポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、およびバキュロウイルス科、並びにＲＮＡウイルスに属するレトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、およびフィロウイルス科等に属するウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては上記のウイルスのなかでも、パラミクソウイルス科に属するウイルスが好ましく用いられる。

好ましいウイルスの具体例としては、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられ、最も好ましくは、センダイウイルスが用いられる。

本発明で用いられるセンダイウイルスは、例えばＶＲ−１０５、ＶＲ−９０７等をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ．住所：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８ ＵＳＡ，ＴＥＬ［１］−７０３−３６５−２７００）より購入することができる。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＡＴＣＣＡｄｖａｎｃｅｄＣａｔａｌｏｇＳｅａｒｃｈ／ＰｒｏｄｕｃｔＤｅｔａｉｌｓ／ｔａｂｉｄ／４５２／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ？ＡＴＣＣＮｕｍ＝ＶＲ−１０５＆Ｔｅｍｐｌａｔｅ＝ａｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ

ウイルスエンベロープについてより詳しくは、例えば、特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ０３／０１４３３８号公報等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。または、本明細書中の下記実施例に記載された方法に従って、センダイウイルスを増殖させ、回収したウイルスからエンベロープを単離及び精製することによってもセンダイウイルスエンベロープを調製することもできる。

本発明に用いられるウイルスエンベロープとして、不活化ウイルスを用いてもよい。不活化ウイルスは、ウイルスゲノムを不活化処理することにより得ることができる。不活化処理としては、例えばＵＶ処理やアルキル化処理を挙げることができる。このウイルスゲノムの不活化処理により、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが、ウイルスエンベロープ内で変性または断片化する。具体的には、下記実施例中に記載された方法に従って、センダイウイルスエンベロープを不活化させることもできる。

また、本発明に用いられるウイルスエンベロープは、単離且つ精製されたものであってもよい。「単離且つ精製」とは、目的物以外の成分（ウイルスゲノム、カプシドタンパク質等）を除去する操作がなされていることを意味する。

本明細書中において「前立腺癌」とは、前立腺に発生し前立腺に限局する癌、前立腺に発生し前立腺外にも浸潤した癌、及び前立腺に発生した癌に由来する転移・再発性の癌を包含する。
前立腺癌は、発生当初はアンドロゲン依存的に増殖するため、アンドロゲン分泌組織（睾丸、副腎等）の摘出や、アンドロゲンの拮抗阻害薬の投与等により、体内におけるアンドロゲンの分泌量や、アンドロゲンの作用を抑制する内分泌療法（ホルモン療法）が有効である場合が多い。「アンドロゲン」の例としては、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステロン、アンドロステンジオンなどが挙げられる。また、本明細書中において、「内分泌療法（ホルモン療法）」とは、アンドロゲンの分泌や働きを抑えることによって、前立腺癌細胞の増殖を抑制する治療法をいう。内分泌療法（ホルモン療法）の具体的手段としては、精巣摘除術（去勢術）および薬物療法が挙げられ、薬物療法としては、ＬＨ−ＲＨアゴニスト、抗男性ホルモン剤（抗アンドロゲン剤）、または女性ホルモン剤（エストロゲン剤）等の投与が挙げられる。しかし、この療法を継続すると前立腺癌細胞のアンドロゲンに対する感受性が低下し、やがてアンドロゲン非依存的に増殖し得るようになることが知られている。その結果、前立腺癌に対する内分泌療法（ホルモン療法）の有効性が減弱する。本発明の治療・予防剤は、このようなアンドロゲンへの感受性が一部または完全に低減された前立腺癌に特に有効である。「アンドロゲンへの感受性」とは、アンドロゲンの刺激により前立腺癌細胞の増殖が促進される程度を意味する。「アンドロゲンへの感受性の完全な低減」とは、アンドロゲンの刺激により前立腺癌の増殖が全く促進されないことを意味する。「アンドロゲンへの感受性の一部低減」とは、アンドロゲンの刺激により前立腺癌の増殖は促進されるものの、その程度が、前立腺癌の発生当初よりも小さいことを意味する。また、本発明の治療・予防剤は、特にホルモン抵抗性の前立腺癌に有効である。「ホルモン抵抗性」とは、アンドロゲンへの感受性が低減したため、内分泌療法（又はホルモン療法）が一部又は完全に無効となった前立腺癌の状態をいい、アンドロゲン抵抗性の前立腺癌をも包含する。「内分泌療法が一部無効」とは、内分泌療法により前立腺癌増殖が部分的に抑制されるが、完全にはその増殖が停止しないことをいう。「内分泌療法が完全に無効」とは、内分泌療法により前立腺癌増殖が全く抑制されないことをいう。

ウイルスエンベロープが、アンドロゲンへの感受性が一部または完全に低減された前立腺癌や、ホルモン抵抗性の前立腺癌に特に有効である理由は不明であるが、このような特性を有する前立腺癌細胞にウイルスエンベロープが特異的に融合し得ることが、一つの理由であると考えられる。

本明細書中、「治療」とは、対象とする癌に対して、その癌の進行を遅らせるか、またはその癌組織を縮小もしくは消失させることをいう。すなわち、癌細胞を完全にまたは一部を殺傷することのほか、癌細胞の増殖を完全にまたは部分的に抑制または遅らせることも包含する。また、「予防」とは、前立腺癌に罹患するリスクを有する患者に投与することにより前立腺癌の発生を予め抑制すること、および前立腺癌治療後の患者に投与することにより癌の再発・転移を防止することをも包含しうる。

本発明に用いられるウイルスエンベロープが前立腺癌を予防又は治療するメカニズムの全容は不明であるが、ウイルスエンベロープの以下のような作用が相まって、前立腺癌に対する優れた治療・予防効果を発揮すると考えられる。

（アポトーシス誘導）
ウイルスエンベロープは、前立腺癌細胞に直接作用し、アポトーシスを誘導することができる。従って本発明の治療・予防剤は、前立腺癌細胞のアポトーシス誘導剤として有用である。アポトーシスとは、細胞の形態学的変化およびＤＮＡのヌクレオソーム単位での断片化という生化学的変化の２つによって定義された、遺伝的に制御された細胞死を指す。

（インターフェロンα又はβ産生の誘導）
ウイルスエンベロープは、前立腺癌細胞にサイトカインであるインターフェロンα及び／又はβの産生を誘導する。インターフェロンαやβは、強力な抗腫瘍効果を有しており、ＮＫ細胞を活性化し、また腫瘍細胞に対して直接作用し、増殖を抑制することが知られている。

（ＮＫ細胞の活性化）
後述の実施例に示すように、抗アシアロＧＭ１抗体処理によりＮＫ細胞を欠損したマウスにおいては、前立腺癌に対するウイルスエンベロープの治療効果が減少している。従って、ウイルスエンベロープの抗腫瘍効果の少なくとも一部は、ウイルスエンベロープがＮＫ細胞（アシアロＧＭ１陽性細胞）を直接的又は間接的に活性化することにより達成されたものと考えられる。

（細胞傷害性Ｔ細胞の活性化）
ウイルスエンベロープは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させる。従って、ウイルスエンベロープは直接的な細胞傷害効果のみならず、抗腫瘍免疫を介して抗腫瘍効果を発揮し得る。

本発明の治療・予防剤は、任意の経路で投与することができる。しかし、上記のように、ウイルスエンベロープは前立腺癌細胞に対して直接作用し、そのアポトーシスを誘導し得るので、ウイルスエンベロープができるだけ効率的に前立腺癌細胞に接触し得るように投与することにより、より高い治療効果を引き出すことができる。このような観点から、本発明の治療・予防剤は、前立腺癌組織および／またはその周辺へ皮下投与または直接投与が望ましい。ここで、「直接投与」とは、投与した薬剤が癌組織に送達されればよく、注射、塗布、噴霧、または薬剤送達システムと併用してターゲットすることなどにより、可能である。すなわち、直接投与により、治療対象とする癌組織に局所的に薬剤が作用しうる。ウイルスエンベロープの治療・予防効果を最大限に引き出すため、本発明の治療・予防剤は、好ましくは前立腺癌組織内へ直接注射される。

本発明の前立腺癌治療・予防剤の一態様は、実質的に何も人為的に封入されていないウイルスエンベロープを、有効成分として含有する。場合によっては、他の１種以上の癌治療・予防に有効な成分とともに、１つの製剤として製剤化することも可能であるが、かかる有効成分はエンベロープ中には人為的に封入されてはいない。

本発明中の癌治療・予防剤は、その剤形は問わないが、注射剤、軟膏、スプレー剤などの医薬組成物が挙げられる。好ましくは注射剤である。さらにまた、現在、種々の癌組織に優先的または特異的に物質（薬剤など）を送達するターゲティング手法が開発されており、また将来開発されると予想される。本発明の治療・予防剤はこれらのターゲティング手法とともに用いて、癌組織にターゲティングされるように処方することもできる。
当業者であれば、それぞれの投与方法に応じた医薬組成物に製剤化できる。
製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合して製剤化される。
賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、デンプン類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野において通常に使用される着色料が挙げられる。

また、本発明の癌治療・予防剤の投与量は、治療・予防上有効な量で投与できる。具体的な投与量は、一般的な医者や治療現場の担当者が、その患者の状態に応じて決定することができる。対象患者の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、成人当たりセンダイウイルスエンベロープとして通常は、１００〜４０，０００ＨＡＵ、好ましくは５００〜２０，０００ＨＡＵ、さらに好ましくは１，０００〜１０，０００ＨＡＵ、特に好ましくは５，０００ＨＡＵ以下の量を投与する。

投与回数もまた、一般的な医者や治療現場の担当者が、その患者の状態に応じて決定することができる。一般的には、複数回投与が好ましいが、これに限定はされない。
たとえば、注射剤を癌組織に直接注射により３日おきに３回直接投与する、などの投与方法が考えられる。

本発明の癌治療・予防剤は、治療・予防上有効な量で単独で使用することが可能である。あるいはまた、本発明の前立腺癌治療剤で治療を行った後、または連続的投与の間において、外科的治療により癌を一部または完全に取り除くことができる。さらにまた、本発明の前立腺癌治療剤は、他の薬剤、たとえば化学療法剤、と併用して投与することもできる。この場合、本発明の前立腺癌治療薬と他の薬剤とを、同時、または任意の順序で投与してもよい。

さらにまた、本発明の前立腺癌治療・予防剤は、他のあらゆる癌治療方法と併用することも可能である。他の癌治療方法としては、限定はされないが、たとえば、外科的摘出手術、内分泌療法、放射線療法、化学療法、免疫療法などが挙げられる。これら他の治療方法の前後、または時期を同じくして、本発明の治療・予防剤を投与することができる。すなわち、本発明の治療・予防剤は、ｉ）他の治療方法を適用された前立腺癌患者、ｉｉ）他の治療方法により治療継続中の前立腺癌患者、又はｉｉｉ）他の治療方法の適用が予定されている前立腺癌患者に投与することができる。ここで、「内分泌療法」とは、上記の記載の通りである。また、「放射線療法」とは、放射線が持つ電離作用を腫瘍を制御する目的で照射することをいう。本明細書で使用される場合、「化学療法」とは、抗癌剤を用いて癌治療を行うことをいう。本明細書で使用される場合、「免疫療法」とは、患者体内での免疫機能を向上させることで癌を治療するまたはその進行を遅らせる治療方法を指す。一般的にはワクチン療法や養子免疫療法、サイトカイン療法、ＢＲＭ療法などが挙げられる。上述のように、本発明のウイルスエンベロープは、アンドロゲンへの感受性が一部または完全に低減された前立腺癌や、ホルモン抵抗性の前立腺癌に特に有効である。従って、本発明の治療・予防剤を内分泌療法と併用することで、ホルモン非抵抗性の前立腺癌細胞とホルモン抵抗性の前立腺癌細胞の双方を除去することができる。好ましい一態様において、内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者に、本発明の治療・予防剤が投与される。内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者は、内分泌療法の結果としてアンドロゲン感受性が一部又は完全に低減された前立腺癌や、ホルモン抵抗性の前立腺癌を有している場合があり、このような場合に本発明の治療・予防剤は特に有利である。

本発明の前立腺癌治療剤は、癌組織の体積の増大を抑制する。すなわち、本発明の前立腺癌治療剤は、何の治療も施さない前立腺癌組織に比べて、その体積の増大を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上低減させうる。後述の実施例に示すように、３日ごとに３回直接癌組織に注射により投与することで、最終投与から３０日以上にわたって、投与後の癌組織の体積増加を９０％以上、もしくは９５％以上抑制することができる。センダイウイルスエンベロープによるこのような劇的な効果は本発明によりはじめて見出されたものである。本発明の前立腺癌治療剤は、実質的にセンダイウイルスエンベロープからなる有効成分を有することを特徴とするものである。したがって、従来の化学療法剤による副作用（吐き気、脱毛など）は有さない。
本発明の不活性化ウイルスエンベロープの抗腫瘍効果のメカニズムとしては、限定はしないが以下のとおり推測される。センダイウイルスエンベロープの細胞膜上のレセプターはｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅの一種であり、中でもＧＤ１ａが主要な受容体である。このｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅは正常の前立腺上皮にはほとんどなく、ホルモン抵抗性の前立腺癌で強発現している。したがってセンダイウイルスエンベロープをホルモン抵抗性の前立腺癌細胞と接触させると効率よく細胞融合を起こして細胞増殖を阻害する。一方、ウイルス由来２本鎖ＲＮＡが細胞内のウイルスゲノムレセプターであるＲＩＧ−Ｉに結合し、そのシグナル伝達によりインターフェロン−α、βを分泌させ、癌細胞は自分の分泌したインターフェロンによりｃａｓｐａｓｅ３、８を活性化してアポトーシスを起こす。しかし正常前立腺細胞はセンダイウイルスエンベロープによるインターフェロン分泌もなく影響を受けない。さらにセンダイウイルスエンベロープはＲＩＧ−Ｉの発現の増強も促し、この癌細胞特異的なアポトーシス誘導効果を増強する。マウスでの腫瘍モデルでは、この効果に加えて、本発明者が腎癌のマウスモデルで見たように腫瘍を攻撃できるＮＫ細胞も活性化されることが分かり、抗腫瘍効果がさらに高まる。またヒト前立腺癌のマウスモデルでは検証はできないが、すでに我々が大腸癌の治療実験で報告しているように腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞も活性化されることが予想され、直接的な腫瘍殺傷効果に加えて腫瘍に対する宿主免疫の活性化により、局所の癌病巣へのセンダイウイルスエンベロープの投与により治療抵抗性である癌でも原発巣ばかりでなく遠隔転移も抑制し、さらには再発をも防止できることが期待される。

さらに、本発明のセンダイウイルスエンベロープは単独でメラノーマに対しても腫瘍退縮効果を示す。従って、本発明は有効成分としてセンダイウイルスエンベロープのみを含有する、メラノーマ治療・予防剤を提供する。なお、メラノーマにおける「治療」または「予防」とは、前記の前立腺癌における「治療」または「予防」と同義である。

有効成分としてセンダイウイルスエンベロープのみを含有するとは、他の１種以上の抗腫瘍効果を持つ成分がエンベロープ中に封入されていない、あるいは治療・予防剤中に含有されないことをいう。また、本明細書中において「メラノーマ」とは、皮膚、眼窩内組織、口腔粘膜上皮などに発生し該発生箇所に限局する癌、皮膚、眼窩内組織、口腔粘膜上皮などに発生し該発生箇所以外にも浸潤した癌、及び皮膚、眼窩内組織、口腔粘膜上皮などに発生した癌に由来する転移・再発性の癌をも包含する。

本発明のメラノーマ治療・予防剤は、その剤形は問わないが、注射剤、軟膏、スプレー剤などの医薬組成物が挙げられる。好ましくは注射剤である。さらにまた、現在、種々の癌組織に優先的または特異的に物質（薬剤など）を送達するターゲティング手法が開発されており、また将来開発されると予想される。本発明のメラノーマ治療剤はこれらのターゲティング手法とともに用いて、メラノーマ組織にターゲティングされるように処方することもできる。当業者であれば、それぞれの投与方法に応じた医薬組成物に製剤化でき、製剤上の必要に応じて、薬学的に許容される担体などは、前記の前立腺癌治療・予防剤に用いられるものを適宜使用することができる。

また、本発明のメラノーマ治療・予防剤の投与量は、治療・予防上有効な量で投与できる。具体的な投与量は、一般的な医者や治療現場の担当者が、その患者の状態に応じて決定することができる。対象患者の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、成人当たりセンダイウイルスエンベロープとして通常は、一回あたりの投与量が１０〜１，００００ＨＡＵ、好ましくは４０〜４００ＨＡＵの量を投与する。

投与回数もまた、一般的な医者や治療現場の担当者が、その患者の状態に応じて決定することができる。一般的には、複数回投与が好ましいが、これに限定はされない。
たとえば、注射剤を癌組織に直接注射により通常１〜１０、好ましくは３〜６回直接投与する、などの投与方法が考えられる。また、投与の間隔についても、患者の状態に応じて決定することができるが、例えば、２または３日おきに投与することができる。
以下の実施例おいて、本発明を詳細に述べるが、本発明はそれらになんら限定されるものではない。

実施例１ 界面活性剤を用いる不活性化センダイウイルスエンベロープの調製
（１：センダイウイルスの増殖）
センダイウイルスは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
本実施例において、センダイウイルスの増殖を以下のようにおこなった。センダイウイルスの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したセンダイウイルス（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ ＮａＣｌを混合し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置き、これをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。

（２：センダイウイルスの精製）
センダイウイルスは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。

（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ，３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ，９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。
本実施例において、具体的には、以下の方法によってセンダイウイルスを精製した。
センダイウイルス含有漿尿液（センダイウイルス含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−１ｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５，１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００×ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣ１、５．４ｍＭ ＫＣ１；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００×ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき、沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存した。
このウイルス液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。本明細書においてＨＡＵ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）とは赤血球を凝集させる活性の単位であり、ＨＶＪ−Ｅの１ＨＡＵとはニワトリの赤血球と混合した場合に凝集を起こす最小単位のことをいう。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。
さらにショ糖密度勾配を用いたセンダイウイルスの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロ一ルと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。

（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるセンダイウイルスの精製も本発明に適用可能である。
手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜ｌＭ ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。
具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、センダイウイルスをカラムによって精製した。
漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％ ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、センダイウイルスを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２％マンニトール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のセンダイウイルス回収率であり優れた結果がえられた。
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ）でセンダイウイルスを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりセンダイウイルスの画分を濃縮した。

（３：センダイウイルスの不活性化）
センダイウイルスの不活性化を、以下に記載するように、紫外線照射によって行った。

（３．１：紫外線照射法）
センダイウイルス懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ^２を照射した。不活性化されたウイルスは、複製能力は持たないが、ウイルスへの融合能力は保持されている。

実施例２ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンダイウイルスエンベロープの抗腫瘍効果
ＰＣ３細胞、ＤＵ１４５細胞およびＬＮＣａｐ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＤＵ１４５細胞は１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ存在下でＲＰＭＩ１６４０メディウム（Ｎａｋａｒａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）中で培養した。ＰＣ３細胞は１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ存在下でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｆ１２ メディウム中で培養した。細胞培養は全て３７℃、５％ＣＯ_２の加湿条件下で行った。
ホルモン抵抗性前立腺癌細胞であるＰＣ３細胞およびＤＵ１４５細胞、ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞株であるＬＮＣａｐ細胞、もしくはヒト正常前立腺上皮細胞（ＰＮＴ２）をそれぞれ９６穴プレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、２４時間後にセンダイウイルスエンベロープと反応させた［ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）：１０〜１０^４］。更に２４時間培養し、細胞の生存率をＣｅｌｌｔｉｔｅｒ ９６^（Ｒ） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、ＭＴＳアッセイにより調べた。生存率は、各々のセンダイウイルスエンベロープ未処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する割合で表され、グラフを図１（Ａ）に示す。ホルモン抵抗性前立腺癌細胞においてはいずれの細胞でも、センダイウイルスエンベロープの濃度依存的に生細胞が減少し、ＭＯＩ １０^４のセンダイウイルスエンベロープで処理した細胞では、コントロールに比べてＰＣ３細胞では４６％、ＤＵ１４５細胞では３５％にまで減少した。一方、センダイウイルスエンベロープは同濃度の幅ではホルモン非抵抗性前立腺癌細胞および正常前立腺上皮細胞の生存率に影響を与えなかった。それぞれの細胞株のコントロールおよびＭＯＩ １０^４のセンダイウイルスエンベロープ処理の顕微鏡画像を図１（Ｂ）に示す（倍率×４０）。
ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞および正常前立腺上皮細胞ではセンダイウイルスエンベロープによる細胞死は認められず、センダイウイルスエンベロープはホルモン抵抗性（前立腺）癌細胞選択的に細胞死を誘導した。これにより、センダイウイルスエンベロープのホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対する選択的抗腫瘍効果が明らかにされた。

実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンダイウイルスエンベロープの細胞接着、細胞膜融合効果
ホルモン抵抗性前立腺癌細胞ＰＣ３細胞およびＤＵ１４５細胞、ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞ＬＮＣａｐならびにヒト正常前立腺上皮細胞（ＰＮＴ２）を、それぞれ６穴プレートに入れたポリエチレンイミン・コートされたカバーガラス上に２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。翌日、ＰＫＨ２６でラベルされたセンダイウイルスエンベロープ（ＭＯＩ １０^４）と３７℃で６０分間反応させた後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ処置で固定した（１５分、４℃）。ＤＡＰＩで細胞核を対比染色した後、細胞を共焦点顕微鏡で観察した（倍率×２００）。
これらにより、センダイウイルスエンベロープはホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対して接着能力、そして膜融合能力を持つことが明らかになった（図２）。

実施例４ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＵＮＥＬアッセイ
ＰＣ３細胞を、６穴プレートに入れたポリエチレンイミン・コートされたカバーガラス上に１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。翌日、センダイウイルスエンベロープと反応させ（ＭＯＩ １０^４）、更に２４時間培養した後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、４％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ処置で固定した（１５分、４℃）。Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＴＡＫＡＲＡ ｂｉｏ．）を用いて、説明書の手順に従い、アポトーシス細胞をｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）染色により検出した。共焦点顕微鏡観察（倍率×２００）の結果を図３に示す。これらにより、センダイウイルスエンベロープ投与群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の増加が明らかになった。

実施例５ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンダイウイルスエンベロープの細胞死誘導効果
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、センダイウイルスエンベロープ処置後のアポトーシス細胞の割合の違いを調べた。ＰＣ３細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６穴プレートに播種し、２４時間後、細胞をセンダイウイルスエンベロープと反応させた（ＭＯＩ １０^４）。更に２４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄してアネキシンＶ（５μｌ）とプロピディウムイオダイド（ＰＩ）（２μｌ）を含む染色溶液に再懸濁し、暗所で１５分間、室温で処置した。アネキシンＶとプロピディウムイオダイドは、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。細胞はＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果を図４（Ａ）に示す。ＭＯＩ １０^４のセンダイウイルスエンベロープで処置した細胞群では、センダイウイルスエンベロープ未処置のコントロール群に比べて２倍以上のアネキシンＶ陽性細胞の増加が認められた。次に、ＰＣ３細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６穴プレートに播種し、２４時間後、センダイウイルスエンベロープと反応させた（ＭＯＩ １０^４）。更に１２もしくは２４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで融解した。これに等量のサンプルバッファーを加えた後、細胞融解液を１０分間煮沸した。各サンプルについて１０μｇ分のタンパク質を４−２０％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌにかけ、電気泳動により解析した。泳動後サンプルをフッ化ポリビニリデンメンブレンに移し、メンブレンを５％スキムミルクでブロッキングし、１次抗体０．１％、５％スキムミルクの反応液と共に４℃、オーバーナイトで処置した。その後メンブレンを洗い、ＨＲＰ−ラベルされた抗ｃａｓｐａｓｅ３抗体（ＰＣ−０２０：ＴＲＥＶＩＧＥＮ，ＭＤ，ＵＳＡ）、抗ｃａｓｐａｓｅ８抗体（Ｈ−１３４：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗ｃａｓｐａｓｅ９抗体（Ｈ−８３：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）と、室温で約１時間反応させた。化学発光による検出はＥＣＬ ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に記載のプロトコールをもとに行った。その結果を図４（Ｂ）に示す。ＭＯＩ １０^４のセンダイウイルスエンベロープで処置した細胞では、コントロールに比べてｃａｓｐａｓｅ３と８の発現上昇が認められた。なお陽性対照群として、放射線照射（ＲＴ５０Ｇｙ）のサンプルを用いた。これらにより、センダイウイルスエンベロープはホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対してアポトーシス誘導能を持つことが明らかになった。

実施例６ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンダイウイルスエンベロープのＩＦＮα、β発現誘導効果
ＰＣ３細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種し、２４時間後に細胞をセンダイウイルスエンベロープと反応させ（ＭＯＩ １０^２〜１０^４）、更に２４時間培養した。培養上清を回収し、ｔｙｐｅＩインターフェロン（ＩＮＦ−αとＩＮＦ−β）の発現を、市販で入手できる試薬を用い（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）、ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果を図５（Ａ）に示す。センダイウイルスエンベロープのｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙにＩＦＮα、βの発現の上昇が認められた。次に、ＲＮＡヘリカーゼであるＲｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）の発現に対する、センダイウイルスエンベロープおよび抗ＩＮＦ受容体抗体の影響を調べた。ＰＣ３細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種し、２４時間後に細胞を抗ＩＦＮ受容体抗体（２０μｇ／ｍｌ）による前処置の有無に分け、３時間の前処置を行った後、更にセンダイウイルスエンベロープと２４時間反応させた（ＭＯＩ １０^４）。その結果を図５（Ｂ）に示す。これより、センダイウイルスエンベロープ処置はＲＩＧ−Ｉ発現を増加させる一方、この作用は抗ＩＦＮ受容体抗体処置により低減されることが明らかになった。

実施例７ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンダイウイルスエンベロープによる細胞死誘導におけるＪＡＫの重要性
ＰＣ３細胞を約１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６穴プレートに播種し、２４時間後、細胞をＪＡＫ阻害剤（１μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＵＳＡ）による前処置１時間の有無に分け、センダイウイルスエンベロープと反応させた（ＭＯＩ １０^４）。更に２４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで融解した。これに等量のサンプルバッファーを加えた後、細胞融解液を１０分間煮沸した。このサンプルを実施例と同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット法を用いてｐＳＴＡＴ１（Ｓｅｒ７２７：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｃａｓｐａｓｅ３、８、βアクチン（ＩＭＧ−５１４２Ａ：ＩＭＡＧＥＮＥＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）についてタンパク質の発現を解析した。その結果を図６（Ａ）に示す。ＭＯＩ １０^４のセンダイウイルスエンベロープで処置した細胞群では、センダイウイルスエンベロープ未処置のコントロール群に比べてＳＴＡＴ１のリン酸化とｃａｓｐａｓｅ３、８の活性化が認められた。
また、ＩＦＮ受容体からのシグナルの影響を調べるため、以下の実験を行った。ＰＣ３細胞を約１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６穴プレートに播種し、２４時間後、細胞をセンダイウイルスエンベロープ単独（ＭＯＩ １０^４）、センダイウイルスエンベロープとＪＡＫ阻害剤（１μＭ）、センダイウイルスエンベロープと抗ＩＦＮ受容体抗体（２０μｇ／ｍｌ）の３グループに分け、まずＪＡＫ阻害剤および抗ＩＦＮ受容体抗体による前処置を３時間行った後、更にセンダイウイルスエンベロープと２４時間反応させた（ＭＯＩ １０^４）。この後ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで融解した。これに等量のサンプルバッファーを加えた後、細胞融解液を１０分間煮沸した。このサンプルを実施例と同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット法を用いてｐＳＴＡＴ１（Ｓｅｒ７２７：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｃａｓｐａｓｅ３、８、βアクチン（ＩＭＧ−５１４２Ａ：ＩＭＡＧＥＮＥＸ，ＣＡ，ＵＳＡ）について蛋白発現を解析した。その結果を図６（Ｂ）に示す。センダイウイルスエンベロープ投与前にＪＡＫ阻害剤を処置するとＳＴＡＴ１のリン酸化が消失し、ｃａｓｐａｓｅ３，８の発現も減少した。センダイウイルスエンベロープ投与前に抗ＩＦＮ受容体抗体を処置するとＳＴＡＴ１のリン酸化が減少し、ｃａｓｐａｓｅ３、８の発現も減少した。
次に、ＰＣ３細胞を約１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６穴プレートに播種し、２４時間後、細胞をＪＡＫ阻害剤（１μＭ）による前処置１時間の有無に分け、センダイウイルスエンベロープと反応させた（ＭＯＩ １０^４）。更に２４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄してアネキシンＶ（５μｌ）とプロピディウムイオダイド（ＰＩ）（２μｌ）を含む染色溶液に再懸濁し、暗所で１５分間、室温で処置し、フローサイトメーターを使って解析した。その結果を図６（Ｃ）に示す。センダイウイルスエンベロープ投与で上昇が認められたアネキシンＶ陽性細胞は、ＪＡＫ阻害剤による前処置によって減少した。これらにより、センダイウイルスエンベロープはＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化してカスパーゼを活性化し、アポトーシスを誘導することが明らかになった。

実施例８ マイクロアレーによるセンダイウイルスエンベロープの遺伝子発現誘導の解析 ＰＣ３細胞を１０ｃｍ ｄｉｓｈにつき１×１０^６個の密度で播種し、２４時間後にセンダイウイルスエンベロープと反応させた（ＭＯＩ １０^４）。更に１２時間培養を続け、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、キット付属のプロトコールに従いＲＮＡ抽出を行った。マイクロアレー解析はＢＩＯ ＭＡＴＲＩＸ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＣ．（Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。その結果、発現上昇が認められた上位２０遺伝子を表１に示す。表中、下線表示された遺伝子は、ＩＦＮ誘導性遺伝子であることを示す。

実施例９ in vivoでの癌細胞増殖
使用した動物については、５〜６週齢雄Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｊ−ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．（Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。ＰＣ３ ｃｅｌｌｓ（５×１０^６ｃｅｌｌｓ）をＰＢＳ１００μｌに再懸濁し、５〜６週齢雄Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｊ−ＳＣＩＤマウスの背中に、皮内注射により投与した。癌が直径約４−６ｍｍに成長したら、手術後１０、１３、１６日目にセンダイウイルスエンベロープ（５，０００ＨＡＵ ｉｎ ａ ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ １００mｌ）もしくはＰＢＳ１００μｌを腫瘍内注射した。癌体積はノギスを用いて盲目検査により測り、以下の公式により計算した：ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ^３）＝ｌｅｎｇｔｈ×（ｗｉｄｔｈ）^２／２。その結果を図７（Ａ）に示す。センダイウイルスエンベロープ群では、著しく腫瘍増殖が阻害されたが、コントロールのＰＢＳ群ではその効果は認められなかった。腫瘍移植後４１日目のセンダイウイルスエンベロープ治療群とＰＢＳ治療群の写真を図７（Ｂ）に示す。これらにより、ＳＣＩＤマウスに移植したホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対し、センダイウイルスエンベロープが腫瘍抑制効果を持つことを明らかになった。
また、抗アシアロＧＭ−１抗体を投与することにより作成するＮＫ細胞欠損モデルにおいて、センダイウイルスエンベロープの効果を調べた。ＰＣ３細胞を同系のＳＣＩＤマウスの背部皮内に注射し、センダイウイルスエンベロープまたはセンダイウイルスエンベロープおよびアシアロＧＭ１抗体４０μｌを３日おきに３回腫瘍内注射した（ｄａｙ１０、１３、１６）。この結果を図７（Ｃ）に示す。センダイウイルスエンベロープと抗アシアロＧＭ１抗体治療群では腫瘍抑制効果の減少が観察された。
以上より推測される、ホルモン非抵抗性前立腺癌細胞に対する、センダイウイルスエンベロープのアポトーシス誘導メカニズムの概略を図８に示す。なお、センダイウイルスエンベロープの受容体となるガングリオシドＧＤ１ａ（Ｒｏｃｈｅｌｅａｕ Ｊ．Ｖ．らＢｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０， １３９−５５， ２０００年、Ｗｙｂｅｎｇａ Ｌ．ＥらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ９５１３−８， １９９６年）は、ＰＣ３細胞、ＤＵ１４５細胞には高く発現される一方、ＬＮＣａｐ細胞には発現されていないことが既に知られている（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ Ｍ．ＨらＩｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１１６， ３６８−７７． ２００５年）。

実施例１０ ヒトＰＣ−３細胞株マウス移植モデルにおけるＧＥＮ０１０１の腫瘍増殖抑制効果
また、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３）を宿主として調製したセンダイウイルスエンベロープ凍結乾燥製剤（ＧＥＮ０１０１）を用いた実験を行った。方法は、基本的には鶏卵を用いた方法と同じであり、宿主として、鶏卵の変わりにヒト細胞（ＨＥＫ２９３）を用いた。精製後、常法に従って凍結乾燥製剤化したものを用いた。これに対しては、センダイウイルスエンベロープの単位としてノイラミニダーゼ活性（ｍＮＡＵ）を用いた（ＨＡＵ、ｍＮＡＵの変換についてはおおよそＨＡＵ／ｍＮＡＵ＝５〜３）。
ホルモン抵抗性のヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ３）をＳＣＩＤマウスに皮内移植した担癌動物モデルに対し、ＧＥＮ０１０１（１，０００ｍＮＡＵ）を４日に１回の間隔で計３回腫瘍内投与した場合（試験ア）と、７日に１回の間隔で計２回腫瘍内投与した場合（試験イ）の両条件における腫瘍増殖抑制効果を検討した。実験開始日（Ｄａｙ０）に、対数増殖期のヒトＰＣ３細胞をトリプシン処理し、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン株式会社）で洗浄したのち、ＲＰＭＩ１６４０とマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）の２：１混合液に分散し、移植用の細胞懸濁液を調製した。ネンブタール（大日本住友製薬株式会社）麻酔下の６週齢のＣ．Ｂ−１７／ｌｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｊｃｌ雄マウス（日本クレア株式会社）２６匹に対し、右側背部の体毛をバリカンで刈り、個体あたり２．０×１０^６個の細胞を皮内に移植した。腫瘍細胞移植後４日目（ｄａｙ４）に動物２０匹を選別し、各群の腫瘍体積平均値がほぼ均一になるよう層化無作為抽出法により４群に分け、さらに試験ア、イにおける投薬群（ＧＥＮ０１０１）および対照群（溶媒投与群）に無作為に割り付けた（ｎ＝５）。１，０００ｍＮＡＵのＧＥＮ０１０１または溶媒（５％トレハロース溶液）の投与は、試験Ａではｄａｙ４、ｄａｙ８およびｄａｙ１２の計３回、試験Ｂでは細胞移植後ｄａｙ４およびｄａｙ１１の計２回それぞれ行った。各投与日において、麻酔気化器を用い気化したフォーレン（アボットジャパン株式会社）を満たした麻酔箱に、一定時間動物を入れた。麻酔箱から取り出した直後の動物の腫瘍内に、１−ｍＬシリンジ（テルモ株式会社）と３０Ｇ注射針（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて、ＧＥＮ０１０１または溶媒のみを０．１ｍＬ投与した。投薬開始日から実験最終日（Ｄａｙ４８）までの間、腫瘍体積および体重変化率をモニターした。
なお、腫瘍体積および体重変化率は以下の式により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［短径（ｍｍ）］^２×長径（ｍｍ）／２
体重変化率（％）＝１００×［（各測定日の体重／群分け時の体重）−１］
薬効の評価項目はｄａｙ４８における腫瘍体積とし、対照群と投薬群の差を統計学的に検定した。試験ア、イともに先ずＦ検定により等分散性の検定を行い、等分散の場合はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を、不等分散の場合はＷｅｌｃｈのｔ検定をそれぞれ実施した。検定は全て両側検定で行い、有意水準はα＝０．０５またはα＝０．０１とした。
投薬開始日（ｄａｙ４）からｄａｙ４８までの各試験群の腫瘍体積、体重変化率の平均値およびそれらの標準誤差の推移を試験アについては図９、試験イについては図１０に示す。試験アおよび試験イ共に、Ｄａｙ１９以降、対照群では平均腫瘍体積が著明に増大したのに対し、投薬群では明瞭な増加の傾向を示さず観察期間を通じて低値で推移した（図９Ａ、図１０Ａ）。観察終了日（ｄａｙ４８）の時点で、投薬群に目視による腫瘍の識別が容易でない個体もみられた（データ示さず）。Ｄａｙ４８における投薬群の平均腫瘍体積は、試験アでは対照群の８．０％、試験イでは対照群の９．５％であり、いずれの試験においても、対照群と投与群との間の差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５［試験ア］，ｐ＜０．０１［試験イ］）。いずれの試験においても、観察期間を通じて体重増加に対する投薬の影響はほとんど認められなかった（図９Ｂ、図１０Ｂ）。
以上より、１，０００ｍＮＡＵのＧＥＮ０１０１を腫瘍移植後４日目（ｄａｙ４）より４日に１回の間隔で計３回腫瘍内投与した場合、およびｄａｙ４より７日に１回の間隔で計２回腫瘍内投与した場合の両用法において有意な薬効が示された。また、体重増加に対する投薬の影響はほとんど認められないことが明らかになった。

実施例１１ マウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞株マウス移植モデルにおけるＨＶＪ−Ｅの腫瘍増殖抑制効果

（１）被験物質および対照物質
被験物質として、ＨＶＪ−Ｅの凍結乾燥製剤（ジェノミディア（株）、ロット番号：ＣＣ７−１３）を用いた。投与に際しては、注射用水（大塚製薬工場（株）、ロット番号：Ｋ７Ｃ７５）により凍結乾燥製剤を溶解し４００００ＨＡＵ／ｍＬとした後、終濃度４００ＨＡＵ／ｍＬ、または４０００ＨＡＵ／ｍＬになるように５％トレハロース溶液（ジェノミディア（株）、ロット番号：ＧＰ２９）で希釈し、それぞれＤＦＤ−４０、ＤＦＤ−４００とした。被験物質は投与当日に調製し、氷上で保存ののち注射筒に充填し、投与まで常温で１分間静置した。対照物質として、５％トレハロース溶液（ジェノミディア（株）、ロット番号：ＧＰ２９）を用いた。以下、５％トレハロース溶液をＴＳと記載する。

（２）動物
Ｂ１６／ＢＬ６細胞株移植用動物として６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス、７０匹を日本チャールスリバー（株）から購入し、耳パンチ法により個体識別した。また、群分け前は動物入荷日、系統、性別、個体識別番号を、群分け後は試験番号、動物入荷日、系統、性別、試験群、動物番号、個体識別番号を飼育ケージのラベルに記載した。馴化期間は動物入荷日から８日間とし、馴化期間中、全個体の一般状態（外観的異常の有無、摂餌・摂水の状態など）を観察した。ポリカーボネート製のマウス用ケージ（日本クレア（株）、縦１３．６×横２０．８×高さ１１．５ｃｍ）にオートクレーブ滅菌済み床敷き（（株）イワクラ）を入れ、馴化期間および実験期間中のいずれの期間も１ケージにつき１匹のマウスを収容した。飼育室の温度は２３±２℃、湿度は５５±１０％、換気回数は１０〜１５回／時間（オールフレッシュ・エアー方式）、照明時間は７：００〜１９：００とした。ケージを収納するラックについては、土日祝日を除き毎日、消毒液（ピューラックス（６％次亜塩素酸ナトリウム、（株）オーヤラックス）を３００倍希釈した液）を用いて拭き、床も掃除後に消毒液で拭いた。飼料は固形飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業（株））とし、飲水は栗東市営水道水とした。余剰動物は試験から除外し、ジエチルエーテルにより安楽死させた。

（３）腫瘍細胞株の培養および細胞懸濁液の調製
Ｂ１６／ＢＬ６（マウスメラノーマ株、ＩＤ：ＴＫＧ ０５９８、ロット番号：１２−６−０２）を東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターから購入し、再起培養開始後１週間以降１ヶ月以内に使用した。継代用培地は１０％ウシ胎子血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社）とし、５％のＣＯ_２存在下、３７℃で培養した。２日毎に継代する場合、１．５×１０^６個の細胞を１０ｃｍの培養皿に播種した。３日毎に継代する場合は１．０×１０^６個の細胞を１０ｃｍの培養皿に播種した。実験開始日（Ｄａｙ０）の午後に対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ（−）、日水製薬（株））に５．０×１０^６個／ｍＬ（５．０×１０^５個／０．１ｍＬ／マウス）になるように懸濁した。得られた液を移植用の細胞懸濁液とし、３０Ｇの注射針（ベクトン・ディッキンソン社）を装着した１ｍＬの注射筒（テルモ（株））に採取して移植した。調製後の細胞懸濁液は氷上に置き、適時、ピペット操作により攪拌しながら、６０分以内に移植を完了させた。

（４）腫瘍細胞の移植
ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、大日本住友製薬（株））を生理食塩液（大塚製薬工場（株））で希釈し、６ｍｇ／ｍＬの溶液とした。マウスの腹腔内に本溶液をペントバルビタールナトリウム６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、麻酔した。移植部位の体毛をバリカンで刈ったのち、０．１ｍＬの細胞懸濁液を右側背部皮内に移植した。

（５）群分け
腫瘍細胞移植後４日（Ｄａｙ４）に腫瘍径を測定した。腫瘍体積が７０ｍｍ^３以上の個体、腫瘍細胞移植時に細胞懸濁液が漏れた個体、腫瘍細胞移植部位の近傍の皮下に黒斑が確認された個体、および腫瘍細胞移植部位に紅斑のある個体を除外し、残り全個体の腫瘍体積の平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。次に、腫瘍体積が平均値±２ＳＤ以内の条件を満たした５４例を決定した。これらの個体を、各群の平均腫瘍体積が均一になるように、腫瘍体積に基づいて層化無作為抽出法により６群に分けた。さらに、カードを用いてそれぞれ無作為に各試験群へ９匹ずつ振り分けた。
腫瘍細胞移植後１１日（Ｄａｙ１１）において、群間に無視できない腫瘍体積の偏りが認められたため、Ｄａｙ１１の投与前に、Ｄａｙ１１の腫瘍体積に基づき、再度群分けを行った。同じ物質を投与した個体各１８例（試験群１および４、試験群２および５、試験群３および６）を平均体積がほぼ均一になるように腫瘍体積別に層化無作為抽出法により各２群に分け、さらにその２群ごとにカードを用いて無作為に３回投与あるいは６回投与群に振り分け６群とした。群分けを表２に示す。

（６）被験物質および対照物質の投与
腫瘍細胞移植後４日（Ｄａｙ４）、６日（Ｄａｙ６）、８日（Ｄａｙ８）、１１日（Ｄａｙ１１）、１３日（Ｄａｙ１３）および１５日（Ｄａｙ１５）に被験物質または対照物質を投与した。１１日（Ｄａｙ１１）、１３日（Ｄａｙ１３）および１５日（Ｄａｙ１５）には、Ｄ群、Ｅ群、Ｆ群にのみ投与した。気化器（ＴＫ−５、ニューロサイエンス（株））により２〜３％のイソフルラン（フォーレン、アボットジャパン（株））が維持されている麻酔箱の中に動物を入れ、６分間吸入麻酔した。麻酔箱から取り出した直後に、動物の腫瘍内に０．１ｍＬの被験物質または対照物質を投与した。投与に際しては、腫瘍塊近位の皮下に注射針を刺入し、皮下を通して腫瘍に針先が到達したことを確認したのち、さらに腫瘍の中心部まで針を刺入した。最後まで抵抗を感じながらゆっくりと投与した。ただし、Ｄａｙ１１（４回目）の投与以降において、腫瘍径が１６０ｍｍ^３を超える個体では、腫瘍組織が生存している可能性の高い腫瘍辺縁部に投与した。

（７）腫瘍体積測定
Ｄａｙ４、８、１１、１３、１５、１８、２０、２４、２８、３２および３６に、デジタルノギス（（株）ミツトヨ、ＣＤ−１５）を用いて、腫瘍の短径と長径を測定した。なお、腫瘍径の測定の際、以下の３項目の基準に従った。（１）腫瘍細胞移植部位の黒斑あるいは黒色の結節を測定する。（２）痂皮等が観察された場合、当該部位が黒色でかつ原発巣と接触していれば測定範囲に含む。（３）原発巣が黒色でなくなった場合、腫瘍消失と判断する。各群とも個々の腫瘍体積を次の計算式により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［短径（ｍｍ）］^２×長径（ｍｍ）／２
統計学的解析はＤａｙ２０の腫瘍体積に対して実施した。腫瘍が体重に影響を与えない最長の期間としてＤａｙ２０を設定した。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いた。Ｄａｙ２０の結果について、投与回数別にＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて解析した。すなわち、Ａ群（３回投与対照群）の結果に対するＢ群（３回投与４０ＨＡＵ群）とＣ群（３回投与４００ＨＡＵ群）の結果、並びにＤ群（６回投与対照群）の結果に対するＥ群（６回投与４０ＨＡＵ群）とＦ群（６回投与４００ＨＡＵ群）の結果をそれぞれ検定した。検定結果が有意であった場合、投与回数による差異を、Ａ群とＤ群、Ｂ群とＥ群、Ｃ群とＦ群の組み合わせについて、Ｈｏｌｍの多重比較検定により解析した。また、用量による差異を、Ｂ群とＣ群、Ｅ群とＦ群の組み合わせについて、Ｈｏｌｍの多重比較検定により解析した。ＨＶＪ−Ｅ腫瘍内投与後の腫瘍体積を図１１に示す。Ｂ群、Ｃ群、Ｅ群、Ｆ群のいずれも、対応する投与回数の対照群に比べて低い値で推移し、腫瘍細胞移植後２０日においては、対応する投与回数の対照群に比べて有意に低い腫瘍体積であった。一方、３回投与と６回投与のいずれにおいても、４０ＨＡＵ群と４００ＨＡＵ群の間に差は認められなかった。また、４０ＨＡＵと４００ＨＡＵのいずれの用量においても、３回投与群と６回投与群の間に差は認められなかった。検定結果を表３にまとめて示す。

（８）生存率の算定
各群とも実験終了日までの生存率を次の計算式により算出した。死亡日については、正午以前に死亡した場合は当日の死亡とみなし、それ以降に死亡した場合は翌日の死亡とみなした。統計学的解析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により生存率グラフを作成した後、投与回数別に、Ｌｏｇｒａｎｋ検定を用いて行った。多重補正はＨｏｌｍ法に従った。生存率は、下記の式にしたがって求めた。
生存率（％）＝１００×（各群の生存例数）／（Ｄａｙ１１の各群の例数）
Ｄ群においてのみ、５回目投与後１日以内に２個体が死亡した。死亡原因は特定できなかったが、大きくなった腫瘍内に薬液を投与することによるストレスが、ショックのような何らかの致死性反応を引き起こした可能性がある。死亡した２個体のデータは、解析対象から除外した。ＨＶＪ−Ｅ腫瘍内投与後の生存曲線を図１２に示す。３回投与では、Ｃ群（４００ＨＡＵ群）において、対照群に比べて生存期間の延長は認められなかったが、Ｂ群（４０ＨＡＵ群）では有意な生存期間の延長が認められた。一方、６回投与では、Ｅ群（４０ＨＡＵ群）、Ｆ群（４００ＨＡＵ群）のいずれも対照群に比べて有意な生存期間の延長が認められた。Ｌｏｇｒａｎｋ検定結果を表４に示す。

以上より、生存期間はいずれの群でも長くなっていた。本実施例においては４００ＨＡＵ３回投与群（Ｃ群）では、有意差は認められなかったものの、その他の群では有意差が認められた。

（９）体重
入荷翌日（Ｄａｙ −７）、腫瘍細胞移植当日（Ｄａｙ０）、および腫瘍体積測定日（Ｄａｙ４、８、１１、１５、１８、２０、２４、２８、３２および３６）に、電子天秤（研精工業（株）、ＧＸ−２０００）を用いて測定した。測定結果はプリンター（（株）エー・アンド・デイ、ＡＤ−８１２１）で印字した。各群とも個々のＤａｙ４以降の体重変化率を次の計算式により算出した。
体重変化率（％）＝１００×（各測定日の体重−Ｄａｙ４の体重）／（Ｄａｙ４の体重）
Ｄａｙ４（初回群分け）以降Ｄａｙ１１までの体重変化率は、各群とも、体重が一過的に減少する個体が認められたものの、体重変化率の平均値からは、全体傾向として顕著な体重の増減は認められず、群間での明らかな差も認められなかった。Ｄａｙ１２以降の体重変化率については、Ｄａｙ２０までは全体傾向として顕著な体重の増減は認められず、群間での明らかな差も認められなかった。Ｄａｙ２０以降では、各群とも、実験期間を通じて体重変化率の平均値が増加し、体重増加の傾向がみられた。図１３にＤａｙ１５からＤａｙ３６までの各群の体重変化率を示す。

前立腺癌の治療においては、現在ＰＳＡスクリーニング法、外科的切除法、内分泌療法、放射線治療法などが存在するが、その根治は依然大きな課題である。本発明によって提供される活性成分としてウイルスエンベロープ、特にセンダイウイルスエンベロープを含有する癌治療・予防剤は、ホルモン抵抗性の前立腺癌に対して優れた治療・予防効果を発揮し、特に内分泌療法後の前立腺癌の再燃癌に対して治療上有効である。また、本発明のセンダイウイルスエンベロープのみを含有する癌治療・予防剤はメラノーマに対して低用量での退縮効果を示し、患者への負担の軽減に寄与する新たな治療薬として期待できる。
本出願は、日本で出願された特願２００８−２３７１０２（出願日：平成２０年９月１６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (14)

1. 野生型センダイウイルスエンベロープを有効成分として含有する、前立腺癌治療・予防剤。
2. ＮＫ細胞もしくはアシアロGM1陽性細胞の活性化または腫瘍細胞からのインターフェロンαもしくはβの産生誘導をもたらすことを特徴とする、請求項１に記載の治療・予防剤。
3. 前立腺癌のアンドロゲン感受性が一部または完全に低減されている、請求項１または２に記載の治療・予防剤。
4. 前立腺癌がホルモン抵抗性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療・予防剤。
5. 前立腺癌に直接投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療・予防剤。
6. 前立腺癌に直接注射されることを特徴とする、請求項５記載の治療・予防剤。
7. 他の癌治療方法と併用されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療・予防剤。
8. 他の癌治療方法が、投薬、内分泌療法、放射線療法、化学療法および免疫療法からなる群より選択される、請求項７記載の治療・予防剤。
9. 内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者に投与されることを特徴とする、請求項８記載の治療・予防剤。
10. 内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者が、アンドロゲン感受性が一部または完全に低減された前立腺癌を有する、請求項９記載の治療・予防剤。
11. 内分泌療法の適用履歴を有する前立腺癌患者が、ホルモン抵抗性前立腺癌を有する、請求項９記載の治療・予防剤。
12. 前立腺癌の治療・予防剤を製造するための野生型センダイウイルスエンベロープの使用。
13. 野生型センダイウイルスエンベロープを有効成分として含有する、前立腺癌細胞のアポトーシス誘導剤。
14. 前立腺癌細胞のアポトーシス誘導剤を製造するための野生型センダイウイルスエンベロープの使用。