JP5548838B2

JP5548838B2 - バンコマイシン湿体の精製方法

Info

Publication number: JP5548838B2
Application number: JP2011545284A
Authority: JP
Inventors: チョ・ジンスク; ヨン・ジョンウォン; チョイ・ウンソ; キム・ジョンミン; チョイ・ホジョン; キム・スンハグ; キム・ソンキュ; キム・ジェジョン
Original assignee: Samyang Biopharmaceuticals Corp
Current assignee: Samyang Biopharmaceuticals Corp
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: JP2012515159A; EP2376646B1; US20110275786A1; KR101101663B1; WO2010082726A3; US8609368B2; KR20100083356A; EP2376646A2; CN102272320A; WO2010082726A2; CN102272320B; EP2376646A4

Description

本発明は、逆浸透圧を用いたバンコマイシン湿体の精製方法に関するものである。より具体的には、本発明は、バンコマイシン製造工程中の乾燥過程で発生する、低い温度安定性による純度低下を効果的に防止することができるバンコマイシン湿体の精製方法に関するものである。

下記式Ｉで表されるバンコマイシンは、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のうちの微生物、即ち、アミコルラトップシス・オリエンタルリース（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）種（ＡＴＣＣ１９７９５）菌株によって生産され、−Ｏ−バンコサミニル−Ｏ−グリコシルとヘプタペプチドとが化学的に結合して製造される、約１４４９の分子量を持つグリコペプチド系抗生物質であり、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンで終わるムコペプチド前駆体に結合して細胞壁合成を阻害するメカニズムにより抗菌性を示す。主に、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などのグラム陽性菌、及び、ペニシリンやセファロスポリン系抗生物質の耐性グラム陽性菌に対して優れた薬理効果を示す。

また、バンコマイシンは、手術後の患者、老齢患者、および免疫が弱い患者にとっては致死性であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の治療に効果が高いことが知られている。このようなバンコマイシン塩、特に、バンコマイシン塩酸塩は経口剤（液剤あるいはカプセル）、又は注射剤に常用されている。

バンコマイシンを分離及び精製するための、従来から知られている代表的技術は、次の通りである：

米国特許第７，０１８，８１４号及び韓国特許第５５４４８１号には、（ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液をｐＨ１−３の条件下で強酸性陽イオン交換樹脂に通過させ、ｐＨが９−１１で濃度が０.０５−０.２Ｎとなる水酸化アンモニウム水溶液に溶出させる段階；（ｂ）得られる溶出液をｐＨ３−５に調整した後、弱塩基性陰イオン交換樹脂及びアルミナに連続して通過させ、水で洗浄し、色素を除く段階；（ｃ）得られる溶出液を疎水性吸着樹脂に通過させ、Ｃ_１−４アルコール水溶液に溶出させる段階；及び（ｄ）前記溶出液に塩酸を加えてｐＨを２−５に調整し、Ｃ_１−４アルコール、アセトニトリル、アセトンまたはメチルイソブチルケトンを含む水溶性有機溶媒を加え、バンコマイシン塩酸塩を結晶化する段階を経ることによりバンコマイシン塩酸塩を精製する方法が開示されている。

前記特許によれば、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を分離精製する過程において、結晶化方法により結晶体を得て濾過した後、濾過された沈殿物（結晶体）を真空乾燥（実施例においては４０℃以下の温度で真空乾燥）することによりバンコマイシン塩酸塩を得ることができる。

米国特許第５,８５３,７２０号には、最初に微生物醗酵液をシリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィー（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）過程及び塩−水−エタノール溶液からエタノールを使用して沈殿させる過程を組み合わせるバンコマイシンの精製工程が開示されている。前記特許によれば、培養−精密濾過−イオン樹脂による吸着後、シリカゲルカラムで主分画物（ｍａｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ：純度平均９３％）及び副分画物（ｓｉｄｅｆｒａｃｔｉｏｎ: 純度９０％以下）を得る。前記主分画物の場合、濃縮−濾過−濃縮及び脱色が行われ、高温噴霧乾燥（流入空気温度：１１５〜１３０℃、排出空気温度：８５±５℃）−真空乾燥（４５〜５０℃）を通じて乾燥された固形製品を得る。一方、副分画物の場合、酸性化後の逆浸透圧工程による脱塩及び濃縮−エタノール及び塩化ナトリウムを加えてエタノールを使用して沈殿（結晶化）−冷却及び濾過工程を経て、次にシリカゲルカラムに再び送られて主分画物に対する処理工程を行う。前記特許の場合、少なくとも７〜１１段階の多段階を経るうえに、シリカゲルカラムによるバンコマイシン（塩）の純度については言及されているものの、その後の工程（特に、逆浸透圧及び真空乾燥）における純度変化については記載されていない。後述のように、前記特許は純度９３％以上のバンコマイシンを得ることができるが、後続の乾燥工程（特に、高温噴霧乾燥及び４５〜５０℃での真空乾燥）過程において純度が低下することから、実質的にＥＵ医薬品基準である純度９３％以上に適合した製品を製造し難くなる。

しかしながら、前述した従来技術は、真空乾燥過程において真空乾燥期間１日〜２日間最低３.２％から最高５.６％まで純度が低くなるなど、バンコマイシンの安定性が低下する問題がある。また、温度を下げて２５℃で真空乾燥過程を同じ期間に実施する場合、純度変化は１％未満を示したが、不純物であるエタノールを０.５％以上、水分を４〜１０％まで含有することが確認された。

このように、バンコマイシンは温度に敏感な医薬品であるから、真空乾燥温度を４０〜５０℃に設定する場合、純度に対する安定性を確保することができない。一方、真空乾燥温度を４０℃以下に下げる場合には、エタノール含有量及び水分含量の基準に適合しないため、従来の精製工程の最終段階としての、乾燥製品の形態で生産する際に採択される真空乾燥方法は、安定した高純度バンコマイシンを効率的に生産しかねる。さらに、前記特許には主に分離精製過程に重点を置いており、乾燥過程における安定性低下及びこれによる純度低下の問題に対しては別に言及されていない。

一方、ＥＵ医薬品基準に適合する、安定した高純度バンコマイシンのためのＥＵ医薬品基準（ＥＵ薬典６.０）は純度９３％以上、水分含量最大５％に規格化されているが、エタノール含有量はＩＣＨＨａｒｍｏｎｉｓｅｄｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ:ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｆｏｒＲｅｓｉｄｕａｌＳｏｌｅｎｔｓ）を参照して０.５％未満に規格化されている。

このように、従来のバンコマイシン精製工程中の乾燥過程において、低い温度安定性による純度低下を防止し、各種医薬品関連基準を満たす精製工程の開発が必要となっている。

本発明者らは、前述の従来技術の問題点を解決するために研究を続けた結果、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシン（より具体的には、バンコマイシン塩酸塩のようなバンコマイシン塩）を精製する過程の中で得られる湿体を、逆浸透圧方式による濃縮及び凍結乾燥することにより、乾燥過程においても安定性が確保されて高純度バンコマイシンを製造することができる方法を開発するようになった。

従って、本発明の目的は、バンコマイシンの精製工程中の乾燥過程において、安定性低下による純度低下を効果的に防止することができるバンコマイシン湿体の精製方法を提供することである。

その他の目的は、ＥＵ医薬品基準などで要求される各種規格を満たすことができるバンコマイシン湿体の精製方法を提供することである。

本発明によれば、
ａ）バンコマイシンを含有する微生物醗酵液から得られる湿体を約１〜４０ｇ／Ｌの濃度に水溶性溶媒に溶解させ、逆浸透圧濾過させる段階；及び
ｂ）前記濾過されたバンコマイシンを凍結乾燥する段階；
を含むバンコマイシン湿体の精製方法が提供される。

本発明によるバンコマイシン湿体の精製方法は、従来のバンコマイシン精製工程中の乾燥過程で発生する安定性低下を改善することによって、高純度バンコマイシンを製造することができる長所を持つ。従って、今後、商用化の可能性が高いと判断される。

図１ａ〜１ｃは、実施例１によってバンコマイシンを含む湿体の精製工程中の純度変化を観察するために、それぞれ湿体、逆浸透圧濾過後の濃縮物及び凍結乾燥物に対するＨＰＬＣ分析を行った結果を示した図面である。図２は、実施例１〜４によってバンコマイシンを含む湿体の精製工程におけるバンコマイシンの純度変化を示す図面である。図３は、比較例１によってバンコマイシンを含む湿体の精製工程におけるバンコマイシンの純度変化を示す図面である。図４は、比較例３によってバンコマイシンを含む湿体の精製工程におけるバンコマイシンの純度変化を示した図面である。

本発明は下記の説明により全て達成できる。下記の説明は本発明の好ましい具体例を示すものと理解されるべきであり、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書において、「バンコマイシンを含有する微生物醗酵液」の微生物とは、バンコマイシンを生成して培養物中にバンコマイシンを蓄積できる微生物であればよく、特定の種に限定されるものではない。これに対する具体例は、米国特許第３,０６７,０９９号及び第５,２３５,０３７号、韓国特許第５５４４８１号などに記載されており、これらの文献は本発明の参考文献に含まれる。例えば、前述のように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液は、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、特にアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（ＡＴＴ１９７９５）、またはＮｏｃａｒｄｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、特にＮｏｃａｒｄｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓＮＲＲＬ２４５２を培養（または振盪培養）することにより得ることができる。

本発明による方法はバンコマイシンを含有する微生物醗酵液から得られる湿体を対象として行われる。

本発明において、「湿体」とはバンコマイシンを含有する微生物醗酵液からバンコマイシンを得る過程において水分を含有する状態で存在する状態を示し、ここで水分含量は、例えば、約１０〜９０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約３０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲である。一般的には、精製過程の中、または、その後に結晶化（特に、エタノール結晶化）を行い、得られる結晶体を濾過させて乾燥していない状態であり、結晶体が水溶性有機溶媒と混合溶液である結晶化溶液から分離された状態を示す。また、前記湿体のバンコマイシン純度は好ましくは約９３％以上、より好ましくは約９５％以上であり、固形分含量は好ましくは約１０〜９０％、より好ましくは約５０％〜７０％の範囲である。

このように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液から湿体を得るには、クロマトグラフィー、結晶化などの従来の分離精製工程（一般的には、結晶化による分離工程）が使用されている。具体的には、韓国特許公開第１９９８−３９７３７号に開示されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階を経て分離精製し、これを濃縮し、エタノール結晶化する過程で湿体を得ることができる。より具体的には、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階を経て分離精製し、約１５０〜２００ｇ／Ｌの濃度に濃縮した後、伝導率約１５〜２５ｍｓ／ｃｍ及びｐＨ約２〜４の条件下で約１.５〜２の体積比でエタノールを投入し、エタノール結晶化することにより湿体を得ることができる。

以外にも、韓国特許第５５４４８１号に開示されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を強酸性陽イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂、アルミナ及び疎水性吸着樹脂を順番に通過させて分離精製することにより湿体を得ることができる。前述したこれら先行文献は本発明の記載を構成しているものであり、本発明の参考文献に含まれる。

逆浸透圧工程
本発明によれば、前記湿体を最初に約１〜４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１５〜３０ｇ／Ｌの濃度で水溶性溶媒に溶解する。ここで、前記水溶性溶媒の具体例としては、水、Ｃ_１−４の脂肪族アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどから選択される）、またはこれらの混合物が挙げられる。好ましくは水、より好ましくは精製水である。水溶性溶媒内の湿体濃度が過度に高い場合、湿体に含まれているエタノールなどの有機溶媒によって溶解に長時間を要するだけでなく、特にエタノール含有量が水分含量よりも高い場合には完全に溶解されないため、逆浸透圧工程前に濾過工程を有する際に濾過が容易ではなく、溶解されないバンコマイシンによって回収率が低下する問題が発生することができる。一方、湿体濃度が過度に低い場合、エタノール含有量に係らず水によく溶解されるものの、例えば、濾過及び逆浸透圧工程に要する時間が増加するため、工程の効率性が低下する問題が発生することができる。従って、水溶性溶媒内の湿体濃度を前述の範囲に調節することが好ましい。

前述のように、水溶性溶媒に適正濃度で湿体を溶解させた後、逆浸透圧工程（濾過工程）により塩または有機溶媒などの不純物を除き、バンコマイシンを濃縮する。本発明の好ましい態様によれば、前記逆浸透圧工程前に濾過工程を有し、ここで、好ましくは約０.１〜０.６μｍの除菌フィルター、特に、一般的には約０.４５μｍの除菌フィルターを利用して濾過する。このように、逆浸透圧工程前に濾過工程を有する理由は、溶解されない不純物を除くことにより逆浸透圧をより容易に行い、また無菌バンコマイシンを得るためである。

逆浸透圧工程、即ち、逆浸透圧濾過（ｒｅｖｅｒｓｅｏｓｍｏｓｉｓｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、例えば、水及びＣ_１−４脂肪族アルコールの混合物から塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムのような塩（ｓａｌｔ）または脂肪族アルコールなどの有機溶媒を除く目的として行われる。前記逆浸透圧工程に使用可能な濾過膜（ｍｅｍｂｒａｎｅｆｉｌｔｅｒ）は、一般的には、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）、ポリサルフォン（ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ウレタン（ｕｒｅｔｈａｎｅ）などの材質からなり、前記濾過膜の分画分子量（ｃｕｔ−ｏｆｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ）は、好ましくは約１００〜５００、より好ましくは約２００〜４００の範囲である。前記濾過膜の分画分子量が過度に少ない場合には、分離工程時間が長くなる一方、工程圧力が増加し、分離され難くなる問題が発生できる。一方、分画分子量が過度に大きい場合には、工程内のバンコマイシンまたはバンコマイシン塩の回収率が低くなり得る。従って、前述の分画分子量範囲の濾過膜を用いるのが好ましい。これら代表例として、Ｎａｎｏｍａｘ^ＴＭ５０ＲＯＳｐｉｒａｌｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）ＴＦＣ−ＳＲ１００−Ｔ（ＫＯＣＫｍｅｍｂｒａｎｅｓｙｓｔｅｍ）などが挙げられる。

逆浸透圧濾過膜及びその装置に関する好ましい条件を下記表１に示す。ただし、本発明は下記条件に限定されるものではない。

なお、逆浸透圧濾過膜及びその装置の適用可能な有機溶媒及び塩の例を下記表２に示す。

*：水に対する濃度％

本発明の好ましい態様によれば、逆浸透圧濾過工程を通じてバンコマイシンが約５０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは約１２０〜１８０ｇ／Ｌの濃度となるように濃縮する。濃縮結果、濃度が過度に高い場合には、容易に沈殿されて製品の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）が増加し、純度が低下する短所がある。一方、濃度が過度に低い場合には、凍結乾燥対象である試料の体積が増加することにより、凍結乾燥時に試料の凍結に長時間を要するとともに、回収率が低くて効率が低下する問題が発生する可能性がある。従って、前述の濃縮濃度を持つように逆浸透圧濾過過程を調節するのが好ましい。同時に、エタノール含有量を０.５％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは約０.１〜０.３％（ｗ／ｖ）水準で調節するのが好ましい。その理由は、エタノール含有量が過度に低い場合、エタノール除去率を高めるための逆浸透圧工程が長くなり効率が低下する一方、エタノール含有量が過度に高い場合には、凍結乾燥時に水分含量を減少させる時間が長くなり工程効率が低下する恐れがあるからである。

本発明によれば、前述の逆浸透圧濾過工程の結果、濃縮されたバンコバイシンの純度は前記湿体の純度（好ましくは約９５％以上）と殆ど差異がないだけではなく、濾過過程での損失されるバンコマイシンも約１％未満である。

凍結乾燥工程
前記の逆浸透圧工程を通じて濃縮されたバンコマイシンは後続段階として凍結乾燥される。「凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎまたはｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎｇ）」とは、通常、物質を凍結させ、水蒸気（ｗａｔｅｒｖａｐｏｒ）の分圧を下げることにより、固体の状態にある水を気体に昇華させる乾燥方式と知られている。分圧を下げることにより、氷状態の水が熱エネルギーを供給することで液体に変化せず水蒸気に直接昇華する。本発明によれば、好ましくは凍結乾燥過程における濃縮されたバンコマイシンの純度をほぼ等しく維持しながら（好ましくは純度変化約１％未満）約９３％以上、より好ましくは約９５％以上、エタノール含有量を約０.５％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは約０.３％（ｗ／ｖ）未満に、また水分含量を約５％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは約４％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは約３％未満に下げる。

本発明において、前記凍結乾燥工程の好ましい具体例によれば、濃縮されたバンコマイシンを、好ましくは約−４〜−１９６℃、より好ましくは約−４０〜−１５０℃、特に好ましくは約−７０℃で約３〜４８時間、好ましくは約１２〜３６時間凍結後、凍結乾燥器を稼働させ、凍結乾燥器の温度を好ましくは約−６０℃から約４０℃まで、より好ましくは約−４０℃から約２０℃まで、好ましくは約１２〜４８時間、より好ましくは約２４〜３６時間にわたって徐々に上昇させる。

次に、好ましくは約６〜２４時間、より好ましくは約１２〜１８時間維持させる。

これに関して、従来技術における乾燥段階、特に噴霧乾燥及び／又は真空乾燥の代わりに凍結乾燥を採用することにより、高純度バンコマイシンの該純度を安定的に維持することができるだけではなく、エタノール及び水分含量においても各種規格の要求水準を満たすことができる。

以下、本発明に対する理解のために好ましい実施例を示す。ただし、下記の実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されることであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本実施例における純度は下記仕様を持つ装置を用いて測定した。
ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＯＤＳ（Ｃ１８）、４.６Ｘ２５０、５ｍｍ

分析条件
１.ｐＨ３.２ＴＥＡｂｕｆｆｅｒ：水１９９６ｍＬにＴＥＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）４ｍＬを加えてｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄでｐＨ３.２を合わせる。
２.移動相
− 移動相Ａ：ｐＨ３.２ＴＥＡｂｕｆｆｅｒ９２０ｍＬ、ＡＣＮ（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）７０ｍＬ、ＴＨＦ（Ｔｅｔｒａｐｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）１０ｍＬの混合溶液
− 移動相Ｂ：ｐＨ３.２ＴＥＡｂｕｆｆｅｒ７００ｍＬ、ＡＣＮ２９０ｍＬ、ＴＨＦ１０ｍＬの混合溶液
３.勾配（Ｇｒａｄｉｅｎｔ）は下記表３に示す。

４.流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
５.吸光度：２８０ｎｍ
６.注入量：２０ｍＬ

製造例１
バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からの湿体（１）取得
韓国特許公開第１９９８−３９７３７号に記載されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階の分離精製を行い１８０ｇ／Ｌの濃度に濃縮した後、塩化アンモニウムを加えて２１ｍｓ／ｃｍの伝導率に調整し、次に塩酸を加えてｐＨ２.８に調節した。前記条件下で、１.８の体積比でエタノールを投入してエタノール結晶化することにより湿体を得た。前記湿体は純度９６.６％、固形分含量５４％、エタノール及び水分含量４５％を示した。

製造例２
バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からの湿体（２）取得
韓国特許公開第１９９８−３９７３７号に記載されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階の分離精製を行い１７６ｇ／Ｌの濃度に濃縮した後、塩化アンモニウムを加えて２３ｍｓ／ｃｍの伝導率に調整し、次に塩酸を加えてｐＨ２.５に調節した。前記条件下で、１.８の体積比でエタノールを投入してエタノール結晶化することにより湿体を得た。前記湿体は純度９６.２％、固形分含量５５％、エタノール及び水分含量４０％を示した。

製造例３
バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からの湿体（３）取得
韓国特許公開第１９９８−３９７３７号に記載されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階の分離精製を行い１９０ｇ／Ｌの濃度に濃縮した後、塩化アンモニウムを加えて２０ｍｓ／ｃｍの伝導率に調整し、次に塩酸を加えてｐＨ２.２に調節した。前記条件下で、１.８の体積比でエタノールを投入してエタノール結晶化することにより湿体を得た。前記湿体は純度９５.８％、固形分含量５１％、エタノール及び水分含量５０％を示した。

製造例４
バンコマイシンを含有する微生物醗酵液からの湿体（４）取得
韓国特許公開第１９９８−３９７３７号に記載されているように、バンコマイシンを含有する微生物醗酵液を多段階の分離精製を行い１７５ｇ／Ｌの濃度に濃縮した後、塩化アンモニウムを加えて２２ｍｓ／ｃｍの伝導率に調整し、次に塩酸を加えてｐＨ２.５に調節した。前記条件下で、１.８の体積比でエタノールを投入してエタノール結晶化することにより湿体を得た。前記湿体は純度９６.２％、固形分含量４２％、エタノール及び水分含量５５％を示した。

実施例１
逆浸透圧の濾過
製造例１によって取得された湿体１９０ｇを２Ｌの精製水に溶解させた後、０.４５μｍの除菌フィルター装置（製造社: Ｗｈａｔｍａｎ、材質: ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ、商品名: ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｆｉｌｔｅｒｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、精製水を加えて溶液の最終体積が４Ｌになるように調整した。その後、逆浸透圧装置（製造社: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名: Ｈｅｌｉｃｏｎｒｅｖｅｒｓｅｏｓｍｏｓｉｓｓｙｓｔｅｍ、メンブレン: ＮａｎｏｍａｘＴＭ５０ｍｅｍｂｒａｎｅ）の試料投入部に前記溶液を投入し、圧力を８ｂａｒに維持しながら濃縮を始めた。逆浸透圧による濾過を通じて余液が約３Ｌになるまで濃縮した後、２Ｌの精製水を加えた。同じ圧力を加えて余液が２Ｌになるまで濃縮し、また２Ｌの精製水を加えて最終体積が約０.５Ｌになるまで濃縮した。その後、圧力を解除して１０分間、濃縮液を回収した。

前記回収された濃縮液を分析した結果、バンコマイシンの純度は９６.４％、バンコマイシンの濃度は１１８ｇ／Ｌ、そしてエタノール含有量は０.３８％（ｗ／ｖ）であった。

凍結条件
前記濃度１１８ｇ／Ｌのバンコマイシン濃縮液を、鉄材容器に高さ１ｃｍ以下になるように注いだ後、−７０℃から１日間、完全に凍結させた。その後、棚の温度を−４０℃に調節した凍結乾燥器（製造社: Ｌａｂｃｏｎｃｏ、製品名: Ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｓｙｓｔｅｍ）に凍結された濃縮液を盛った鉄材容器を入れて４２時間、凍結乾燥させた。前記凍結乾燥されたバンコマイシンを分析した。

２４時間の凍結乾燥の後、バンコマイシンの純度は９６.４％であり、純度変化はなかった。また、エタノール含有量及び水分含量は、それぞれ０.２５％（ｗ／ｖ）及び３.４％（ｗ／ｖ）であった。

本実施例において、湿体からバンコマイシンを精製する工程中の純度変化を観察するために、ＨＰＬＣ分析を行った結果を図１ａ〜１ｃに示した。前記図面から分かるように、湿体（図１ａ）、逆浸透圧の濾過を経った濃縮物（図１ｂ）、及び凍結乾燥物（図１ｃ）は、バンコマイシンに相当するピーク面積において実質的な相違点はなかった。これは、一連の精製過程の中でバンコマイシンの純度の低下が抑制されたことを意味する。

実施例２
逆浸透圧の濾過
製造例１によって取得された湿体２５０ｇを２Ｌの精製水に溶解させた後、０.４５μｍの除菌フィルター装置（製造社: Ｗｈａｔｍａｎ、材質: ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ、商品名: ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｆｉｌｔｅｒｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、精製水を加えて溶液の最終嵩が５Ｌになるように調整した。その後、逆浸透圧装置（製造社: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名: Ｈｅｌｉｃｏｎｒｅｖｅｒｓｅｏｓｍｏｓｉｓｓｙｓｔｅｍ、メンブレン: ＮａｎｏｍａｘＴＭ５０ｍｅｍｂｒａｎｅ）の試料投入部に前記溶液を投入し、圧力を８ｂａｒに維持しながら濃縮を始めた。逆浸透圧による濾過を通じて余液が約３Ｌになるまで濃縮した後、３Ｌの精製水を加えた。同じ圧力を加えて余液が３Ｌになるまで濃縮し、また３Ｌの精製水を加えて最終体積が約０.５Ｌになるまで濃縮した。その後、圧力を解除して１０分間、濃縮液を回収した。

前記回収された濃縮液を分析した結果、バンコマイシンの純度は９６.４％、バンコマイシンの濃度は１４２ｇ／Ｌ、そしてエタノール含有量は０.２４％（ｗ／ｖ）であった。

凍結条件
前記濃度１４２ｇ／Ｌの濃縮液を鉄材容器に高さ１cm 以下になるように注いだ後、−７０℃から１日間、完全に凍結させた。その後、棚温度を−４０℃に調節した凍結乾燥器（製造社: Ｌａｂｃｏｎｃｏ、製品名: Ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｓｙｓｔｅｍ）に凍結された濃縮液を盛った鉄材容器を入れて４２時間、凍結乾燥させた。前記凍結乾燥されたバンコマイシンを分析した。

２４時間の凍結乾燥の後に、バンコマイシンの純度は９６.４％であり、純度変化はなかった。また、エタノール含有量は０.１１％（ｗ／ｖ）、水分含量は２.７％（ｗ／ｖ）であった。

実施例３
逆浸透圧の方法
製造例２によって取得された湿体２９０ｇを２Ｌの精製水に溶解させた後、０.４５μｍの除菌フィルター装置（製造社: Ｗｈａｔｍａｎ、材質: ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ、商品名: ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｆｉｌｔｅｒｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、精製水を加えて溶液の最終嵩が６Ｌになるように調整した。その後、逆浸透圧装置（製造社: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名: Ｈｅｌｉｃｏｎｒｅｖｅｒｓｅｏｓｍｏｓｉｓｓｙｓｔｅｍ、メンブレン: ＮａｎｏｍａｘＴＭ５０ｍｅｍｂｒａｎｅ）の試料投入部に前記溶液を投入し、圧力を８ｂａｒに維持しながら濃縮を始めた。逆浸透圧による濾過を通じて余液が約３Ｌになるまで濃縮した後、３Ｌの精製水を加えた。同じ圧力を加えて余液が３Ｌになるまで濃縮し、また３Ｌの精製水を加えて最終体積が約０.５Ｌになるまで濃縮した。その後、圧力を解除して１０分間、濃縮液を回収した。

前記回収された濃縮液を分析した結果、バンコマイシンの純度は９６.０％、バンコマイシンの濃度は１７６ｇ／Ｌ、そしてエタノール含有量は０.２２％（ｗ／ｖ）であった。

凍結条件
前記濃度１７６ｇ／Ｌのバンコマイシン濃縮液を鉄材容器に高さ１cm以下になるように注いだ後、−７０℃から１日間、完全に凍結させた。その後、棚温度を−４０℃に調節した凍結乾燥器（製造社: Ｌａｂｃｏｎｃｏ、製品名: Ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｓｙｓｔｅｍ）に凍結された濃縮液を盛った鉄材容器を入れて４２時間、凍結乾燥させた。前記凍結乾燥されたバンコマイシンを分析した。

２４時間の凍結乾燥の後に、バンコマイシンの純度は９５.８％であり、純度変化はほとんどなかった。また、エタノール含有量及び水分含量は、それぞれ０.１８％（ｗ／ｖ）及び３.０％（ｗ／ｖ）であった。

実施例４
逆浸透圧の濾過
製造例２によって取得された湿体２７４ｇを２Ｌの精製水に溶解させた後、０.４５μｍの除菌フィルター装置（製造社: Ｗｈａｔｍａｎ、材質: ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｎｉｔｒａｔｅ、商品名: ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｆｉｌｔｅｒｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、精製水を加えて溶液の最終嵩が６Ｌになるように調整した。その後、逆浸透圧装置（製造社: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名: Ｈｅｌｉｃｏｎｒｅｖｅｒｓｅｏｓｍｏｓｉｓｓｙｓｔｅｍ、メンブレン: ＮａｎｏｍａｘＴＭ５０ｍｅｍｂｒａｎｅ）の試料投入部に前記溶液を投入し、圧力を８ｂａｒに維持しながら濃縮を始めた。逆浸透圧による濾過を通じて余液が約３Ｌになるまで濃縮した後、３Ｌの精製水を加えた。同じ圧力を加えて余液が３Ｌになるまで濃縮し、また３Ｌの精製水を加えて最終嵩が約０.５Ｌになるまで濃縮した。その後、圧力を解除して１０分間、濃縮液を回収した。

前記回収された濃縮液を分析した結果、バンコマイシンの純度は９６.０％、バンコマイシンの濃度は１６２ｇ／Ｌ、そしてエタノール含有量は０.０９％（ｗ／ｖ）であった。

凍結条件
前記濃度１６２ｇ／Ｌのバンコマイシン濃縮液を鉄材容器に高さ１cm以下になるように注いだ後、−７０℃から１日間、完全に凍結させた。その後、棚温度を−４０℃に調節した凍結乾燥器（製造社: Ｌａｂｃｏｎｃｏ、製品名: Ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｓｙｓｔｅｍ）に、凍結された濃縮液を盛った鉄材容器を入れて４２時間、凍結乾燥させた。前記凍結乾燥されたバンコマイシンを分析した。

２４時間の凍結乾燥の後に、バンコマイシンの純度は９６.０％であり、純度変化はなかった。また、エタノール含有量及び水分含量は、それぞれ０.０８％（ｗ／ｖ）及び３.１％（ｗ／ｖ）であった。

前記実施例１〜４により、バンコマイシンを含む湿体を精製する過程におけるバンコマイシンの純度を測定した結果を図２に示した。図示のように、実施例１〜４において本発明による工程の場合には、製造過程の中でバンコマイシンの純度が実質的に低下されることなく、一定に維持されることが分かる。

比較例１
米国特許番号第７、０１８、８１４号及び韓国特許番号第５５４４８１号の記載により、乾燥されたバンコマイシンを得た。即ち、製造例３によって取得された湿体５０ｇを４０℃で４８時間、真空乾燥した。その結果、図３のように、真空乾燥の１２時間後の純度は９３.０％、１８時間後の純度は９２.８％、２４時間後の純度は９１.９％、３６時間後の純度は９０.６％、４２時間後の純度は９０.３％、そして４８時間後の純度は９０.２％に減少し、２日間の真空乾燥の過程でエタノール含有量及び水分含量はそれぞれ０.０９％及び２.９％であった。このように、２日間の真空乾燥の過程でバンコマイシンの純度は約５％以上減少し、実際にバンコマイシンの精製工程に適用するのに困難であると判断された。

比較例２
真空乾燥温度を２５℃にして５日間、実施したことを除いては、比較例１と同じ方法で乾燥過程を行った。その結果、バンコマイシンの純度は９４.６％、エタノール含有量は０.６％（ｗ／ｖ）、そして水分含量は８％（ｗ／ｖ）であり、ヨーロッパ医薬品基準に適合しないことを確認した。

比較例３
米国特許番号第５、８５３、７２０号に示された方法により、乾燥されたバンコマイシンを得た。即ち、製造例４によって取得された湿体６９.７ｇを２００ｍＬになるように精製水に溶解させ、濃度を１５０ｇ／Ｌに調節して噴霧乾燥器（製造社: ＢＵＣＨＩ、製品名: ＭｉｎｉｓｐｒａｙｄｒｙｅｒＢ−１９１）を用いて乾燥を実施した。噴霧乾燥のために、流入温度を１３０℃、そして排出温度を８５℃に設定し、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で試料を注入した。

前記のように、噴霧乾燥されたバンコマイシンの純度は９４.９％、そして水分含量は８.６％（ｗ／ｖ）であった。前記噴霧乾燥された試料を回収して４０℃から２日間、真空乾燥し、図４のように２４時間の真空乾燥の後に純度は９３.７％、３６時間後の純度は９３.３％、そして４８時間後の純度は９２.８％であった。水分含量の場合には４８時間後に４.６％（ｗ／ｖ）であった。従って、噴霧乾燥及び真空乾燥を実施した結果、純度が３％以上低下された。また、エタノール含有量は０.２％（ｗ／ｖ）で、水分含量においては基準値である５％ｗ／ｖ）に近接して安定した高純度バンコマイシンの製造に限界があると判断される。

本発明の単純な変形又は変更は、本発明の領域に属するものであり、本発明の具体的な保護範囲は添付された特許請求範囲により明確になる。

Claims

ａ）バンコマイシンを含む微生物醗酵液から得た湿体を１〜４０ｇ／Ｌの濃度で水溶性溶媒に溶解させ、前記バンコマイシンの濃度が５０〜２００ｇ／Ｌの範囲になるように逆浸透圧濾過させる段階；及び
ｂ）前記濾過されたバンコマイシンを凍結乾燥する段階；
を含むバンコマイシン湿体の精製方法であって、
前記湿体内の水分含量が３０〜５０％（ｗ／ｖ）であり、湿体内のバンコマイシンの純度が９３％以上であることを特徴とする、バンコマイシン湿体の精製方法。
前記水溶性溶媒が水、Ｃ_１−４の脂肪族アルコール、又はこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１記載のバンコマイシン湿体の精製方法。
前記逆浸透圧濾過に使われるメンブレンの分子量基準（ｃｕｔ−ｏｆｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ）が、１００〜５００Ｄａであることを特徴とする、請求項１または２記載のバンコマイシン湿体の精製方法。
前記段階ａ）によって濾過されたバンコマイシン内のエタノール含有量が０.５％（ｗ／ｖ）未満であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のバンコマイシン湿体の精製方法。
前記段階ｂ）が、
前記濾過されたバンコマイシンを−４〜−１９６℃で３〜４８時間、凍結させる段階；及び
前記凍結されたバンコマイシンを凍結乾燥器内で、−６０℃から４０℃まで１２〜４８時間にわたって凍結乾燥器の温度を徐々に上昇させ、凍結乾燥する段階；
を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のバンコマイシン湿体の精製方法。
前記凍結乾燥されたバンコマイシン内のエタノール含有量が０.３％（ｗ／ｖ）未満であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のバンコマイシン湿体の精製方法。
前記凍結乾燥されたバンコマイシン内の水分含量が５％（ｗ／ｖ）未満であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載のバンコマイシン湿体の精製方法。