JP5548979B2 - Hyaluronidase inhibitor - Google Patents
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Description
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野において、また、糖鎖工学技術上における反応制御ツールなどとして有用なヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。 The present invention relates to a hyaluronidase inhibitor that is useful in the fields of pharmaceuticals, cosmetics, foods, etc., and as a reaction control tool and the like in glycotechnology.
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素であり、加水分解酵素である動物由来の酵素と、脱離酵素である微生物由来の酵素に大別され、動物由来の酵素は、その作用部位（基質特異性）により、さらにエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）や、エンド−β−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）などに分類される。哺乳動物のヒアルロニダーゼは、生体内においてヒアルロン酸を分解することで、加齢を含む種々の生命現象、感染、がんの転移、早産・流産などに関与していることが知られている。従って、その阻害剤は、がんや早産・流産などに対する医薬品の有効成分として期待される他、化粧品成分や食品素材などとしても期待される。また、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、糖鎖加水分解活性に加えて糖転移活性を有することが知られており、糖鎖工学技術上においてアクセプターの糖鎖を伸張するために利用することができる。従って、その糖転移活性を阻害する物質は、糖鎖伸張反応の停止や伸張させる糖鎖長の制御を目的とした利用性なども期待される。 Hyaluronidase is an enzyme that degrades hyaluronic acid. It is roughly divided into an enzyme derived from an animal that is a hydrolase and an enzyme derived from a microorganism that is a desorption enzyme. The enzyme derived from an animal has its action site (substrate specificity). ), It is further classified into endo-β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.35), endo-β-glucuronidase (EC 3.2.1.36), and the like. Mammalian hyaluronidase is known to be involved in various life phenomena including aging, infection, cancer metastasis, premature birth and miscarriage by degrading hyaluronic acid in vivo. Therefore, the inhibitor is expected as an active ingredient of pharmaceuticals for cancer, premature labor, miscarriage and the like, and also expected as a cosmetic ingredient and a food material. In addition, endo-β-N-acetylhexosaminidase is known to have glycosyltransferase activity in addition to glycosylation activity, and in order to extend the acceptor's sugar chain in glycoengineering technology. Can be used. Therefore, substances that inhibit the transglycosylation activity are expected to be used for the purpose of stopping the sugar chain elongation reaction or controlling the length of the sugar chain to be elongated.
ヒアルロニダーゼ阻害剤の探索はこれまでにも数多くなされており、種々の化学構造を有するヒアルロニダーゼ阻害剤が提案されている。多糖やオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤についての報告もいくつか存在し、例えば、特許文献１には、コンドロイチン硫酸などが早産や流産を防止するためのヒアルロニダーゼ阻害剤として有用であることが記載されている。また、特許文献２には、所定の生物学的活性を有する硫酸化多糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤が記載されている。特許文献３には、化学合成や、コンドロイチン硫酸などを出発原料として調製することができる硫酸基を持たない２〜８個の構成単糖からなるオリゴ糖誘導体が抗炎症・抗アレルギー作用を有するヒアルロニダーゼ阻害剤として有用であることが記載されている。 Many searches for hyaluronidase inhibitors have been made so far, and hyaluronidase inhibitors having various chemical structures have been proposed. There are also some reports on hyaluronidase inhibitors containing polysaccharides and oligosaccharides as active ingredients. For example, Patent Document 1 discloses that chondroitin sulfate is useful as a hyaluronidase inhibitor for preventing premature birth or miscarriage. Have been described. Patent Document 2 describes a hyaluronidase inhibitor containing a sulfated polysaccharide having a predetermined biological activity as an active ingredient. Patent Document 3 discloses that hyaluronidase having an anti-inflammatory / anti-allergic action is an oligosaccharide derivative composed of 2 to 8 constituent monosaccharides having no sulfate group, which can be prepared using chemical synthesis or chondroitin sulfate as a starting material. It is described as being useful as an inhibitor.
以上のように、コンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖がヒアルロニダーゼ阻害活性を有することは特許文献１や特許文献２などから既に知られているところであるが、その医薬品としての利用を考えた場合、長鎖のコンドロイチン硫酸などはエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの基質となることから、生体内で酵素活性を阻害する側面と酵素の基質として作用する側面を併せ持つので、目的とする薬理効果を十分に発揮させることができないという問題がある。加えて、硫酸化多糖は、その構成糖に対する硫酸基の結合位置や結合数、立体構造などの点において著しい多様性を有していることから、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが困難であるという問題がある。また、従来技術においては、ヒアルロニダーゼに対する阻害活性とは、その糖鎖加水分解活性に対する阻害活性を意味しており、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが有する糖転移活性に対して多糖やオリゴ糖がどのような活性を有するかは、特許文献１〜特許文献３を含め、従来技術からは全く推し量ることができない状況にある。 As described above, it is already known from Patent Document 1 and Patent Document 2 that sulfated polysaccharides such as chondroitin sulfate have a hyaluronidase inhibitory activity. Since chondroitin sulfate is a substrate for endo-β-N-acetylhexosaminidase, it has both a side that inhibits enzyme activity in vivo and a side that acts as a substrate for the enzyme. There is a problem that it cannot be fully demonstrated. In addition, sulfated polysaccharides have significant diversity in terms of the position and number of sulfate groups bonded to their constituent sugars, as well as the three-dimensional structure. There is a problem that it is difficult to secure. In addition, in the prior art, the inhibitory activity against hyaluronidase means the inhibitory activity against the sugar chain hydrolysis activity, and the polysaccharide or the sugar transfer activity possessed by endo-β-N-acetylhexosaminidase The activity of the oligosaccharide, including Patent Documents 1 to 3, cannot be estimated at all from the prior art.
そこで本発明は、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention can ensure uniformity as a chemical substance that is an active ingredient of a pharmaceutical product, and uses an oligosaccharide having an inhibitory activity on sugar chain hydrolysis activity and / or transglycosylation activity as an active ingredient. It aims at providing a hyaluronidase inhibitor.
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであるウシ精巣性ヒアルロニダーゼの基質となるコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ヒアルロン酸のそれぞれを構成するオリゴ糖の中に、当該酵素の糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対する阻害活性を有するものを見出した。 As a result of intensive studies in view of the above points, the present inventors have found that chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate, which is a substrate for bovine testicular hyaluronidase, which is endo-β-N-acetylhexosaminidase, Among the oligosaccharides constituting each of the hyaluronic acids, those having an inhibitory activity on the sugar chain hydrolyzing activity and / or the sugar transfer activity of the enzyme were found.
上記の知見に基づいてなされた本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、請求項１記載の通り、下記の（１）〜（４）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
また、請求項２記載の阻害剤は、請求項１記載の阻害剤において、ヒアルロニダーゼがエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであることを特徴とする。
また、請求項３記載の阻害剤は、請求項２記載の阻害剤において、阻害対象とするヒアルロニダーゼの活性が糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性であることを特徴とする。
また、本発明のエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）の糖転移活性の阻害剤は、請求項４記載の通り、下記の（５）〜（６）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
The hyaluronidase inhibitor of the present invention made based on the above findings is characterized in that, as described in claim 1, at least one selected from the following (1) to (4) is an active ingredient.
(1) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] are linked.
(2) [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] oligosaccharide consisting of 6 saccharides linked to 3 disaccharide units or a salt thereof.
(3) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked.
(4) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 saccharides in which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked .
Also, inhibitors of claim 2, in inhibitor according to claim 1, wherein the hyaluronidase is an end-beta-N-acetyl-hexosaminidase.
The inhibitor according to claim 3 is characterized in that, in the inhibitor according to claim 2, the activity of the hyaluronidase to be inhibited is sugar chain hydrolysis activity and / or transglycosylation activity.
Moreover, the inhibitor of the transglycosylation activity of endo-β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.35) of the present invention is the following (5) to (6) as described in claim 4. At least one selected from the above is used as an active ingredient.
(5) An oligosaccharide or a salt thereof comprising a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
(6) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 sugars to which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
本発明によれば、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to ensure uniformity as a chemical substance which is an active ingredient of a pharmaceutical, and an oligosaccharide having an inhibitory activity on sugar chain hydrolysis activity and / or transglycosylation activity is used as an active ingredient. Hyaluronidase inhibitors can be provided.
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、下記の（１）〜（６）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするものである。
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の阻害対象となるヒアルロニダーゼとしては、例えば、糖鎖加水分解活性および糖転移活性を有するエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが挙げられる。
The hyaluronidase inhibitor of the present invention comprises at least one selected from the following (1) to (6) as an active ingredient.
(1) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] are linked.
(2) [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] oligosaccharide consisting of 6 saccharides linked to 3 disaccharide units or a salt thereof.
(3) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked.
(4) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 saccharides in which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked.
(5) An oligosaccharide or a salt thereof comprising a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
(6) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 sugars to which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
Examples of the hyaluronidase to be inhibited by the hyaluronidase inhibitor of the present invention include endo-β-N-acetylhexosaminidase having sugar chain hydrolysis activity and transglycosylation activity.
上記の（１）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン４−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
上記の（２）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン４−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
上記の（４）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン６−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
上記の（５）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧｌｃＮＡｃの１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
上記の（６）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧｌｃＮＡｃの１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
上記の（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩やカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。 Examples of the oligosaccharide salt defined in the above (1) to (6) include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, and the like.
（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖は、それぞれコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、例えば、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼを用いたこれらの多糖の酵素分解と、各種のクロマトグラフィーを用いた精製を行うことによって調製することができる（必要であればＢｉｏｃｅｍｉｓｔｒｙ，３３（１９９４），６５０３−６５０７などを参照のこと）。出発原料として使用することができる多糖の由来は特段限定されるものではなく、コンドロイチン４−硫酸およびコンドロイチン６−硫酸は、例えば、ウシ、クジラ、サメ、サケなどの動物（魚類を含む）の皮、骨、軟骨などに多く含まれていることは周知の通りである。ヒアルロン酸の由来は動物であっても微生物であってもよく（動物由来のヒアルロン酸としては例えばニワトリのトサカに含まれているものなどがよく知られている）、市販されているものを使用することができる。また、（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖は、化学合成によっても調製することができる（必要であればＣｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，１３（２００７），５２９−５４０やＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３（２００４），５２２１−５２２４などを参照のこと）。 The oligosaccharides defined in (1) to (6) are known substances as constituent oligosaccharides of chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate, and hyaluronic acid, respectively. For example, these oligosaccharides using bovine testicular hyaluronidase are used. It can be prepared by enzymatic degradation of polysaccharides and purification using various chromatographies (see Biochemistry, 33 (1994), 6503-6507, etc. if necessary). The origin of the polysaccharide that can be used as a starting material is not particularly limited, and chondroitin 4-sulfate and chondroitin 6-sulfate are derived from, for example, skins of animals (including fish) such as cattle, whales, sharks, and salmon. As is well known, it is abundant in bone, cartilage and the like. Hyaluronic acid may be derived from animals or microorganisms (hyaluronic acids derived from animals are well known, for example, those contained in chicken crest), and commercially available ones are used. can do. The oligosaccharides defined in (1) to (6) can also be prepared by chemical synthesis (Chem. Eur. J., 13 (2007), 529-540 and Angew. Chem if necessary). Int. Ed., 43 (2004), 5221-5224, etc.).
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤をがんや早産・流産などに対する医薬品の有効成分として利用する場合、（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖またはその塩を、自体公知の方法で各種の製剤形態（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤など）に製剤化し、経口的または非経口的に投与すればよい。その投与量は、患者の年齢や体重、症状の程度、健康状態などの条件によって適宜設定されるべきものである。また、例えばアンチエイジングのための化粧品成分などとして利用する場合、自体公知の基材や配合成分などとともにクリーム剤やローション剤などに製剤化して投与することができる。また、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、食品素材として利用することも可能であり、種々の形態の食品（サプリメントを含む）にヒアルロニダーゼ阻害作用を発揮するに足る有効量を添加して食してもよい。 When the hyaluronidase inhibitor of the present invention is used as an active ingredient of a medicine for cancer, premature labor, miscarriage, etc., various preparations of oligosaccharides or salts thereof defined in (1) to (6) by various methods known per se. It may be formulated into a form (tablet, granule, capsule, injection, etc.) and administered orally or parenterally. The dosage should be appropriately set according to conditions such as the age and weight of the patient, the degree of symptoms, and the health condition. For example, when it is used as a cosmetic ingredient for anti-aging, it can be formulated into a cream or lotion together with known bases and ingredients. Moreover, the hyaluronidase inhibitor of the present invention can be used as a food material, and may be eaten by adding an effective amount sufficient to exert a hyaluronidase inhibitory action to various forms of food (including supplements). .
さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、生化学分野における研究試薬などとしても利用することができ、とりわけエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが有する糖転移活性に対して阻害活性を有する本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、アクセプターに対する糖鎖伸張反応の停止剤や伸張させる糖鎖長の制御剤などとしての新たな用途を提供するものであり、糖鎖工学技術上における反応制御ツールとなる。 Furthermore, the hyaluronidase inhibitor of the present invention can be used as a research reagent in the field of biochemistry, and in particular, it has an inhibitory activity on the transglycosylation activity of endo-β-N-acetylhexosaminidase. The hyaluronidase inhibitor of the invention provides a new use as a terminator for the sugar chain elongation reaction to the acceptor or a control agent for the length of the sugar chain to be elongated, and serves as a reaction control tool in the sugar chain engineering technology.
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is limited to the following description and is not interpreted.
（Ａ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の調製
ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）を用いた出発原料とする多糖の酵素分解と、クロマトグラフィーを用いた精製を行うことによって得た。具体的には、（１）および（２）において規定されるオリゴ糖は、イワシクジラ軟骨由来のコンドロイチン４−硫酸（特許第３７３１１５０号公報に記載の方法によって得たプロテオグリカンからＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（２００２），１８３９７−１８４０３に記載の方法によって調製したもの、分子量：約３２０００）から図１に示すプロトコルに従って得た。（３）および（４）において規定されるオリゴ糖は、サメ軟骨由来のコンドロイチン６−硫酸（上記のイワシクジラ軟骨由来のコンドロイチン４−硫酸の調製方法と同様の方法で調製したもの、分子量：約６４０００）から図２に示すプロトコルに従って得た。（５）および（６）において規定されるオリゴ糖は、微生物由来のヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）から図３に示すプロトコルに従って得た。得られたオリゴ糖の純度は、Ｂｉｏｃｅｍｉｓｔｒｙ，３３（１９９４），６５０３−６５０７、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，２６（１９９４），１５３−１５９、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，９（１９９２），１７４−１７９、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，８（１９９８），７１９−７２４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２５（２００４），３５−４０などに記載の方法に従った高速液体クロマトグラフィーおよびイオンスプレー式質量分析計（パーキンエルマー社、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ−１００）を用いて分析し、標準品との同一性を確認した。定量にはカルバゾール硫酸法を用いた。得られたオリゴ糖の性状はすべて白色粉末であり、分子量は以下の通りである（ただしＮａ塩の分子量については保有するＮａ原子の数によってバリエーションがある）。
（１）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ４Ｓ−４」と略称することもある）
分子量：９６３．８（Ｎａ塩：１０２４．８）
（２）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ４Ｓ−６」と略称することもある）
分子量：１３９６．２（Ｎａ塩：１５２８．２）
（３）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ６Ｓ−４」と略称することもある）
分子量：９６３．８（Ｎａ塩：１０２４．８）
（４）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ６Ｓ−６」と略称することもある）
分子量：１３９６．２（Ｎａ塩：１５２８．２）
（５）において規定されるオリゴ糖（以下「ＨＡ４」と略称することもある）
分子量：７７６．８（Ｎａ塩：８２０．８）
（６）において規定されるオリゴ糖（以下「ＨＡ６」と略称することもある）
分子量：１１５６．２（Ｎａ塩：１２２２．２）
(A) Preparation of oligosaccharides defined in (1) to (6) Enzymatic degradation of polysaccharides as starting materials using bovine testicular hyaluronidase (Sigma Aldrich, Type1-S) and purification using chromatography Obtained by doing. Specifically, oligosaccharides defined in (1) and (2) are chondroitin 4-sulfate derived from sardine whale cartilage (from proteoglycan obtained by the method described in Japanese Patent No. 3731150, J. Biol. Chem. , 277 (2002), 18397-18403, molecular weight: about 32000) and obtained according to the protocol shown in FIG. The oligosaccharides defined in (3) and (4) are chondroitin 6-sulfate derived from shark cartilage (prepared by the same method as that for chondroitin 4-sulfate derived from sardine whale cartilage, molecular weight: about 64000) according to the protocol shown in FIG. The oligosaccharides defined in (5) and (6) were obtained from microorganism-derived hyaluronic acid (Food Chemifa, molecular weight: about 80000) according to the protocol shown in FIG. The purity of the obtained oligosaccharide was determined according to Biochemistry, 33 (1994), 6503-6507, Connective Tissue, 26 (1994), 153-159, Glycoconj. J. et al. , 9 (1992), 174-179, Glycobiology, 8 (1998), 719-724, Anal. Biochem. , 325 (2004), 35-40, etc., using a high performance liquid chromatography and ion spray mass spectrometer (Perkin Elmer, PE-Sciex API-100). Identity was confirmed. The carbazole sulfate method was used for quantification. The properties of the resulting oligosaccharide are all white powder, and the molecular weight is as follows (however, the molecular weight of the Na salt varies depending on the number of Na atoms held).
Oligosaccharides defined in (1) (hereinafter sometimes abbreviated as “Ch4S-4”)
Molecular weight: 963.8 (Na salt: 1024.8)
Oligosaccharides defined in (2) (hereinafter sometimes abbreviated as “Ch4S-6”)
Molecular weight: 1396.2 (Na salt: 1528.2)
Oligosaccharides defined in (3) (hereinafter sometimes abbreviated as “Ch6S-4”)
Molecular weight: 963.8 (Na salt: 1024.8)
Oligosaccharides defined in (4) (hereinafter sometimes abbreviated as “Ch6S-6”)
Molecular weight: 1396.2 (Na salt: 1528.2)
Oligosaccharides defined in (5) (hereinafter sometimes abbreviated as “HA4”)
Molecular weight: 776.8 (Na salt: 820.8)
Oligosaccharides defined in (6) (hereinafter sometimes abbreviated as “HA6”)
Molecular weight: 1156.2 (Na salt: 1222.2)
（Ｂ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖のヒアルロニダーゼ阻害活性の評価（その１：糖鎖加水分解活性に対する阻害活性）
（実験１：方法）
ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）のヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）を基質とする糖鎖加水分解活性に対する阻害活性によって評価した。反応緩衝液として１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）−１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用い、各種濃度の被験オリゴ糖を添加し、３７℃で１時間反応させた。被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解生成物の４糖と６糖の生成量を高速液体クロマトグラフィーで検出されたピーク面積からそれぞれ求め、その総和を糖鎖加水分解活性が１００％とし、同様にして求めた被験オリゴ糖を添加した場合における糖鎖加水分解生成物の４糖と６糖の生成量の総和からその糖鎖加水分解活性を被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解活性に対する相対値として算出し、被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解活性（１００％）から被験オリゴ糖を添加した場合における糖鎖加水分解活性を差し引いた数値を糖鎖加水分解活性に対する阻害活性（％）とした。なお、高速液体クロマトグラフィーによる反応生成物の分析は以下の条件で行った。
・ カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ＩＩカラム（ワイエムシー社、ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
・ 溶出液：５０ｍＭ−２４６ｍＭのリン酸二水素ナトリウムの直線勾配
・ 流速：１．０ｍＬ／分
・ 検出：２１５ｎｍにおける吸光度による
（実験１：結果）
図４に示す。なお、図４には、コンドロイチン４−硫酸（（Ａ）において調製した分子量が約３２０００のもの）とヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）のそれぞれを出発原料として、化学処理（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（１９８４），１４３−１５１）によって調製した、２糖からなるＮ−アセチルコンドロシン（Ｃｈ２：硫酸基は脱離によって持たない）とヒアロビウロン酸（ＨＡ２）の糖鎖加水分解活性に対する阻害活性もあわせて示す。図４から明らかなように、Ｃｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６は、ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性を濃度依存的に阻害したが、ＨＡ４，ＨＡ６は阻害活性を有していなかった。また、Ｃｈ２，ＨＡ２も阻害作用を有していなかった。各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図５に示す。図中の４〜１２の数値はそれぞれ糖鎖加水分解生成物の構成糖の数とその溶出位置を意味し、添加したＣｈ４Ｓ−６の濃度が高くなるにつれて、糖鎖加水分解生成物の生成量の減少（ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性に対する濃度依存的な阻害活性）が見て取れる。
(B) Evaluation of the hyaluronidase inhibitory activity of the oligosaccharide defined in (1) to (6) (Part 1: Inhibitory activity on sugar chain hydrolyzing activity)
(Experiment 1: Method)
It was evaluated by the inhibitory activity on the glycosylation activity of bovine testicular hyaluronidase (Sigma Aldrich, Type 1-S) using hyaluronic acid (Food Chemifa, molecular weight: about 80,000) as a substrate. Using 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) -150 mM sodium chloride as a reaction buffer, various concentrations of the test oligosaccharide were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. In the case where the test oligosaccharide is not added, the production amounts of tetrasaccharide and hexasaccharide of the glycan hydrolysis product are obtained from the peak areas detected by high performance liquid chromatography, respectively, and the total is defined as glycan hydrolysis activity of 100%. The sugar chain hydrolysis activity in the case where the test oligosaccharide is not added is determined from the sum of the production amounts of the tetrasaccharide and hexasaccharide of the sugar chain hydrolysis product when the test oligosaccharide obtained in the same manner is added. Calculated as a relative value to the degradation activity, the value obtained by subtracting the sugar chain hydrolysis activity when the test oligosaccharide was added from the sugar chain hydrolysis activity when the test oligosaccharide was not added (100%) Inhibitory activity (%). The analysis of the reaction product by high performance liquid chromatography was performed under the following conditions.
Column: YMC-Pack Polyamine II column (YMC Corporation, ID 4.6 mm × 250 mm)
Eluent: linear gradient of 50 mM-246 mM sodium dihydrogen phosphate Flow rate: 1.0 mL / min Detection: by absorbance at 215 nm (Experiment 1: Results)
As shown in FIG. In FIG. 4, chemical treatment (J. et al.) Was conducted using chondroitin 4-sulfate (having a molecular weight of about 32,000 prepared in (A)) and hyaluronic acid (Food Chemifa, molecular weight: about 80,000) as starting materials. Biochem.Biophys.Methods, 10 (1984), 143-151) N-acetylchondrosin consisting of two sugars (Ch2: the sulfate group is not lost) and hyalobiuronic acid (HA2) sugar chain hydrolysis The inhibitory activity against the degradation activity is also shown. As is clear from FIG. 4, Ch4S-4, Ch4S-6, Ch6S-4, and Ch6S-6 inhibited the sugar chain hydrolysis activity of hyaluronidase in a concentration-dependent manner, whereas HA4 and HA6 have inhibitory activity. I did not. Ch2 and HA2 also had no inhibitory action. FIG. 5 shows a representative chromatogram chart summarizing the experimental results with and without the addition of various concentrations of Ch4S-6. The numbers 4 to 12 in the figure indicate the number of constituent sugars of the sugar chain hydrolysis product and the elution position thereof, respectively, and the amount of sugar chain hydrolysis product produced as the concentration of added Ch4S-6 increases. (Concentration-dependent inhibitory activity on the sugar chain hydrolysis activity of hyaluronidase) can be seen.
（実験２：方法）
ヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）にかわりに、ヒアルロン酸に由来する８糖からなるオリゴ糖（（Ａ）における（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の調製の際に得られたもの）を基質として用いること以外は実験１と同様の実験を行った。
（実験２：結果）
図６に示す。図６から明らかなように、この実験２によっても、実験１とほぼ同様の結果が得られた。各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図７に示す。
(Experiment 2: Method)
Instead of hyaluronic acid (Food Chemifa Corporation, molecular weight: about 80,000), an oligosaccharide consisting of eight sugars derived from hyaluronic acid (in preparation of the oligosaccharide defined in (1) to (6) in (A)) The same experiment as in Experiment 1 was performed except that the obtained product was used as a substrate.
(Experiment 2: Results)
As shown in FIG. As is clear from FIG. 6, the result similar to Experiment 1 was obtained in Experiment 2 as well. FIG. 7 shows a representative chromatogram chart summarizing the experimental results with and without the addition of various concentrations of Ch4S-6.
（Ｃ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖のヒアルロニダーゼ阻害活性の評価（その２：糖転移活性に対する阻害活性）
（方法）
６糖からなるピリジルアミノ（ＰＡ）化ヒアルロン酸構成オリゴ糖（（Ａ）において得られたＨＡ６をＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０（１９９１），１３２−１３５に記載の方法でピリジルアミノ化したもの）をアクセプターとし、ヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）をドナーとする、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）の糖転移活性に対する阻害活性によって評価した。反応緩衝液として１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、各種濃度の被験オリゴ糖を添加し、３７℃で１時間反応させた。被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移生成物（６糖〜２０糖の偶数糖からなるＰＡ化ヒアルロン酸構成オリゴ糖）の生成量を高速液体クロマトグラフィーで検出されたピーク面積からそれぞれ求め、その総和を糖転移活性が１００％とし、同様にして求めた被験オリゴ糖を添加した場合における糖転移生成物の生成量の総和からその糖転移活性を被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移活性に対する相対値として算出し、被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移活性（１００％）から被験オリゴ糖を添加した場合における糖転移活性を差し引いた数値を糖転移活性に対する阻害活性（％）とした。なお、高速液体クロマトグラフィーによる反応生成物の分析は以下の条件で行った。
・ カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ＩＩカラム（ワイエムシー社、ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
・ 溶出液：５０ｍＭ−２４６ｍＭのリン酸二水素ナトリウムの直線勾配
・ 流速：１．０ｍＬ／分
・ 検出：３２０ｎｍの励起波長と４００ｎｍの蛍光波長でのＰＡのモニタリングによる
（結果）
図８に示す。なお、図８には、コンドロイチン４−硫酸（（Ａ）において調製した分子量が約３２０００のもの）とヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）のそれぞれを出発原料として、化学処理（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（１９８４），１４３−１５１）によって調製した、２糖からなるＮ−アセチルコンドロシン（Ｃｈ２：硫酸基は脱離によって持たない）とヒアロビウロン酸（ＨＡ２）の糖転移活性に対する阻害活性もあわせて示す。図８から明らかなように、Ｃｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６に加え、ＨＡ４，ＨＡ６も、ヒアルロニダーゼが有する糖転移活性を濃度依存的に阻害したが、Ｃｈ２，ＨＡ２は阻害作用をほとんど有していなかった。各種濃度のＨＡ６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図９に示す。図中の６〜２０の数値はそれぞれ糖転移生成物の構成糖の数とその溶出位置を意味し、添加したＨＡ６の濃度が高くなるにつれて、糖転移生成物の生成量の減少（ヒアルロニダーゼが有する糖転移活性に対する濃度依存的な阻害活性）が見て取れる。
(C) Evaluation of the hyaluronidase inhibitory activity of the oligosaccharide defined in (1) to (6) (Part 2: Inhibitory activity on glycosyl transfer activity)
(Method)
A pyridylamino (PA) -modified hyaluronic acid oligosaccharide consisting of hexasaccharides (HA6 obtained in (A) was pyridylaminated by the method described in J. Biochem., 110 (1991), 132-135) as an acceptor. Evaluation was made by the inhibitory activity on the transglycosylation activity of bovine testicular hyaluronidase (Sigma Aldrich, Type 1-S) using hyaluronic acid (Food Chemifa, molecular weight: about 80,000) as a donor. Using 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) as a reaction buffer, various concentrations of the test oligosaccharide were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. In the case where the test oligosaccharide is not added, the amount of transglycosylation product (PA-containing hyaluronic acid-constituting oligosaccharide composed of an even number of 6 to 20 sugars) is determined from the peak areas detected by high performance liquid chromatography, The total sugar transfer activity is assumed to be 100%, and when the test oligosaccharide obtained in the same manner is added, the total amount of glycosyl transfer product produced is added to the transglycosylation activity when no test oligosaccharide is added. Calculated as a relative value, a value obtained by subtracting the transglycosylation activity when the test oligosaccharide was added from the transglycosylation activity (100%) when the test oligosaccharide was not added was defined as the inhibitory activity (%) for the transglycosylation activity. The analysis of the reaction product by high performance liquid chromatography was performed under the following conditions.
Column: YMC-Pack Polyamine II column (YMC Corporation, ID 4.6 mm × 250 mm)
Eluent: 50 mM-246 mM sodium dihydrogen phosphate linear gradient Flow rate: 1.0 mL / min Detection: by monitoring PA at 320 nm excitation wavelength and 400 nm fluorescence wavelength (results)
As shown in FIG. In FIG. 8, chemical treatment (J. et al.) Was conducted using chondroitin 4-sulfate (having a molecular weight of about 32,000 prepared in (A)) and hyaluronic acid (Food Chemifa, molecular weight: about 80000) as starting materials. Biochem. The inhibitory activity against is also shown. As apparent from FIG. 8, in addition to Ch4S-4, Ch4S-6, Ch6S-4, and Ch6S-6, HA4 and HA6 also inhibited the transglycosylation activity of hyaluronidase in a concentration-dependent manner, but Ch2 and HA2 It had almost no inhibitory effect. FIG. 9 shows a representative chromatogram chart summarizing experimental results with and without addition of various concentrations of HA6. The numbers 6 to 20 in the figure indicate the number of constituent sugars of the glycosylated product and the elution position thereof, respectively, and as the concentration of added HA6 increases, the amount of glycosylated product produced decreases (has hyaluronidase possessed). A concentration-dependent inhibitory activity on the transglycosylation activity) can be seen.
（Ｄ）まとめ
以上の結果から、ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性と糖転移活性のいずれに対しても阻害活性を有する物質として、初めてＣｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６が見出された。また、ＨＡ４，ＨＡ６は、糖転移活性に対してのみ選択的に阻害活性を有することがわかった。例えばＣｈ４Ｓ−６とＨＡ６は、化学構造上、ヘキソサミンの４位の置換基とその立体配置の相違しかないにもかかわらず、ヒアルロニダーゼが有する酵素活性に対する阻害活性に大きな相違があることは、予想をはるかに超える事実であった。
(D) Summary From the above results, Ch4S-4, Ch4S-6, Ch6S-4, and Ch6S-6 are the first substances having inhibitory activity against both the sugar chain hydrolysis activity and the transglycosylation activity of hyaluronidase. Was found. In addition, it was found that HA4 and HA6 have selective inhibitory activity only for transglycosylation activity. For example, it is expected that Ch4S-6 and HA6 have a large difference in inhibitory activity against the enzymatic activity of hyaluronidase, despite the difference in the chemical structure between the 4-position substituent of hexosamine and its configuration. It was a fact that far exceeded.
製剤例１：錠剤
以下の組成で各成分を混合し、打錠して、（１）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩を５０ｍｇ含む５００ｍｇの錠剤４００個を製造した。
（１）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩 ・・・ ２０ｇ
馬鈴薯澱粉 ・・・ ６ｇ
ステアリン酸タルク ・・・ ４ｇ
６％ＨＰＣ乳糖 ・・・ １７０ｇ
（合計２００ｇ）
Formulation Example 1: Tablets Each component was mixed with the following composition and tableted to produce 400 500 mg tablets containing 50 mg of the oligosaccharide sodium salt defined in (1).
Sodium salt of oligosaccharide defined in (1) 20 g
Potato starch ... 6g
4g of talc stearate
6% HPC lactose ... 170g
(Total 200g)
製剤例２：顆粒剤
以下の組成で各成分を混合し、圧縮成形し、粉砕し、整粒して、２０〜５０メッシュの５％顆粒剤を製造した。
（４）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩 ・・・ １０ｇ
乳糖 ・・・ １８７ｇ
ステアリン酸マグネシウム ・・・ ３ｇ
（合計２００ｇ）
Formulation Example 2: Granules Each component was mixed in the following composition, compression molded, pulverized, and sized to produce a 20% to 50 mesh 5% granule.
Sodium salt of oligosaccharide defined in (4) ... 10 g
Lactose ・ ・ ・ 187g
Magnesium stearate 3g
(Total 200g)
製剤例３：注射剤
（５）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩１．５ｇを生理食塩水１００ｍＬに溶解し（合計１．５ｇ／１００ｍＬ）、バイアルに充填した後、加熱殺菌を行って、静注用注射剤を製造した。
Formulation Example 3: Injection (1.5) Oligosaccharide sodium salt specified in (5) is dissolved in 100 mL of physiological saline (total 1.5 g / 100 mL), filled in a vial, and then heat sterilized. An intravenous injection was produced.
本発明は、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
The present invention is capable of ensuring homogeneity as a chemical substance as an active ingredient of a pharmaceutical product, and has a hyaluronidase containing an oligosaccharide having an inhibitory activity on sugar chain hydrolysis activity and / or transglycosylation activity as an active ingredient It has industrial applicability in that an inhibitor can be provided.
Claims (4)
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。 A hyaluronidase inhibitor comprising at least one selected from the following (1) to (4) as an active ingredient.
(1) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] are linked.
(2) [4GlcUAβ1-3GalNAc (4S) β1] oligosaccharide consisting of 6 saccharides linked to 3 disaccharide units or a salt thereof.
(3) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked.
(4) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 saccharides in which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GalNAc (6S) β1] are linked .
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。(5) An oligosaccharide or a salt thereof comprising a tetrasaccharide in which two disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。(6) An oligosaccharide or a salt thereof consisting of 6 sugars to which 3 disaccharide units of [4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1] are linked.
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