JP5554008B2

JP5554008B2 - probe

Info

Publication number: JP5554008B2
Application number: JP2009110602A
Authority: JP
Inventors: 雅彦前川
Original assignee: GSP LAB., INC.
Current assignee: GSP LAB., INC.
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2029-04-30
Also published as: JP2010259336A

Description

本発明は、被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブに関するもので、より具体的には、各染色体（１〜２２番及びＸ、Ｙ染色体の２４種類）に対して、標識が付けられたプローブを用いて前記各染色体を同定し、かつ計数を行う、換言すれば、染色体の数的異常を検出するために用いるプローブに関する。 The present invention relates to a probe used for detecting a numerical abnormality of a test chromosome. More specifically, a label is attached to each chromosome (1 to 22 and 24 types of X and Y chromosomes). The present invention relates to a probe used to identify and count each chromosome using the attached probe, in other words, to detect a numerical abnormality of a chromosome.

従来から、染色体の数的異常は遺伝性疾患や癌などで起こることが知られている。
体外受精で得られる割球、再生医療分野での幹細胞（ｉＰＳ細胞）を培養した場合、培養条件により染色体の不分離が起こり、染色体の数的異常が起こる場合もある。
そこで、染色体の数的異常に起因する遺伝性疾患を防ぐ目的で、体外受精を行うような場合には、従来から各染色体（１〜２２番及びＸ、Ｙ染色体の合計２４種類）の計数を行うことがよく知られていた。 Conventionally, it has been known that a numerical abnormality of a chromosome occurs due to a genetic disease or cancer.
When blastomeres obtained by in vitro fertilization and stem cells (iPS cells) in the field of regenerative medicine are cultured, chromosomal non-separation may occur depending on the culture conditions, and chromosomal abnormalities may occur.
Therefore, when in vitro fertilization is performed for the purpose of preventing genetic diseases caused by numerical abnormalities of chromosomes, counting of each chromosome (1 to 22 and total of 24 types of X and Y chromosomes) has been conventionally performed. It was well known to do.

染色体の数的異常を検出する方法としては、具体的には、染色体に取り付く側、すなわち、検出する側のプローブを、検出したい染色体、すなわち、被検染色体の種類に応じて用意し、これらに予め所定の変性処理を施しておく。
しかる後に、このプローブに所定の溶液、例えば、非特許文献１に記載されているように、５０％ホルムアミド／硫酸デキストラン等を加え、ハイブリダイゼーション液を調合する。
尚、前記プローブには、目的とする染色体（被検染色体）に結合した際、そのことが顕微鏡等を介して容易に観察できるように、例えば、紫外線照射で発光するような蛍光物質等が標識として付加される。 As a method of detecting a numerical abnormality of a chromosome, specifically, a probe that is attached to a chromosome, that is, a probe to be detected is prepared according to the type of the chromosome to be detected, that is, the test chromosome. A predetermined modification treatment is performed in advance.
Thereafter, a predetermined solution such as 50% formamide / dextran sulfate is added to the probe as described in Non-Patent Document 1, and a hybridization solution is prepared.
The probe is labeled with, for example, a fluorescent substance that emits light by ultraviolet irradiation so that it can be easily observed through a microscope or the like when bound to a target chromosome (test chromosome). Added as.

このようなプローブとして、従来は、例えば、非特許文献２に記載されているように、各染色体の動原体に局在する１０から１０００塩基対の連続的な反復配列（アルファサテライトＤＮＡなど）を取り出して、これに蛍光物質等の標識物を取り付けてプローブにし、このプローブで間期核内の被検染色体を同定し、シグナルの数（蛍光数）を計数して、各被検染色体（以下単に染色体という。）の計数を行っていた。 As such a probe, conventionally, as described in Non-Patent Document 2, for example, a continuous repetitive sequence of 10 to 1000 base pairs (alpha satellite DNA or the like) localized in the centromere of each chromosome. , And a label such as a fluorescent substance is attached to this to form a probe. The test chromosome in the interphase nucleus is identified with this probe, the number of signals (the number of fluorescence) is counted, and each test chromosome ( (Hereinafter simply referred to as chromosomes).

細胞工学別冊（臨床ＦＩＳＨプロトコール）株式会社秀潤社、１９９７年１月１０日発行、６５〜７１頁Cell Engineering Separate Volume (Clinical FISH Protocol) Shujunsha Co., Ltd., published on January 10, 1997, pages 65-71 細胞工学別冊（臨床ＦＩＳＨプロトコール）株式会社秀潤社、１９９７年１月１０日発行、１３２〜１３５頁（４−１間期核ＦＩＳＨ法のシグナルカウントの指標と注意点）Cell engineering separate volume (clinical FISH protocol) Shujunsha Co., Ltd., published on January 10, 1997, pp. 132-135 (signal count indicator and precautions for 4-1 interphase nuclear FISH method)

従来の技術においては、上述のとおり、非特許文献２にも開示されているように、プローブの作製に際して、各染色体の動原体あるいはその近傍に局在する１０から１０００塩基対の連続的な反復配列を使用していたためであろうか、目的の染色体以外の染色体との間にも弱いながらも、反応が起こってしまうという問題があった。
このような問題が生じる理由としては、動原体あるいはその近傍に局在する１０から１０００塩基対の連続的な反復配列をプローブとして使った場合には、全く同じではないけれども、類似した塩基配列が別の染色体内にも存在した場合に、検出目的とする染色体以外の染色体に対してもプローブが一部反応してしまい、弱いシグナル（ノイズ）を出してしまう可能性を指摘することができる。
目的とする本来のシグナル以外のに弱いシグナル（ノイズ）が複数発生してしまった場合には、その弱いシグナル（ノイズ）が、目的とする染色体を認識している本来のシグナルなのか、それとも目的以外の染色体を認識しているノイズなのかの判断が極めて難しいものとなってしまう。
その結果、各染色体における、その数のカウント、すなわち、計数の信頼性が低下してしまう、という問題があった。 In the conventional technique, as described above, as disclosed in Non-Patent Document 2, when preparing a probe, a continuous centromere of 10 to 1000 base pairs localized in or near each centromere of each chromosome. There was a problem that the reaction occurred though it was weak because it was using a repetitive sequence, or between chromosomes other than the target chromosome.
The reason why such a problem occurs is that, when a 10-1000 base pair continuous repetitive sequence localized in or near the centromere is used as a probe, it is not the same, but a similar base sequence It can be pointed out that the probe may partially react with a chromosome other than the target chromosome when it is present in another chromosome, producing a weak signal (noise). .
If multiple weak signals (noise) other than the intended original signal are generated, whether the weak signal (noise) is the original signal recognizing the target chromosome or the purpose It becomes extremely difficult to judge whether the noise is recognizing other chromosomes.
As a result, there is a problem that the count of each chromosome, that is, the reliability of the count is lowered.

上述した従来の技術における問題点に鑑み、本発明の目的は、目的とする染色体の同定精度を高め、その染色体の計数をより精度良く行うために用いるプローブを提供することにある。 In view of the above-described problems in the conventional technology, an object of the present invention is to provide a probe used for improving the identification accuracy of a target chromosome and performing counting of the chromosome with higher accuracy.

本発明は、［特許請求の範囲］の［請求項１］〜［請求項３］に記載した事項により特定される。
The present invention is specified by the matters described in [Claim 1] to [Claim 3] of [Claims].

［特許請求の範囲］

［請求項１］
被検染色体と反応した後に被検染色体の少なくとも一部を染色することができる機能を有するプローブにおいて、

プローブとして、
（１）被検染色体の少なくとも一部と相補性を有し、
（２）被検染色体と同種の染色体に存在する特異的なＤＮＡ領域由来であり、
（３）標識物が取り付けられており、
（４）８万〜１００万塩基対
の全ての要件を具備した連続したＤＮＡ断片を使用することにより、

被検染色体の数的異常を検出することができる機能を発揮することができることを特徴とする、
被検染色体数的異常検出用プローブ。

［請求項２］
『（２）被検染色体と同種の染色体に存在する特異的なＤＮＡ領域』が、
その領域の位置表示をＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表し、
Ａを染色体の種類、
ｐを染色体の短腕、
ｑを染色体の長腕、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、及び、Ｅを各々一桁の自然数
としたときに、
Ｂが、
染色体の短腕ｐにあっては、１であり、
染色体の長腕ｑにあっては、１または２
であることを特徴とする、
請求項１に記載した

被検染色体の数的異常を検出することができる機能を発揮することができることを特徴とする、
被検染色体数的異常検出用プローブ。

［請求項３］
『（２）被検染色体と同種の染色体に存在する特異的なＤＮＡ領域』が、
その領域の位置表示をＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表し、
Ａを染色体の種類、
ｐを染色体の短腕、
ｑを染色体の長腕、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、及び、Ｅを各々一桁の自然数
としたときに、
Ｃが、
染色体の短腕ｐにあっては１〜３のいずれかであり、
長腕ｑにあっては１または２

であることを特徴とする請求項１又は２に記載した

被検染色体の数的異常を検出することができる機能を発揮することができることを特徴とする、
被検染色体数的異常検出用プローブ。

[Claims]

[Claim 1]
In the probe having a function capable of staining at least a part of the test chromosome after reacting with the test chromosome,

As a probe,
(1) Complementary to at least a part of the test chromosome,
(2) derived from a specific DNA region present on the same type of chromosome as the test chromosome,
(3) A sign is attached,
(4) By using continuous DNA fragments with all requirements of 80,000 to 1 million base pairs,

It is possible to exhibit a function capable of detecting a numerical abnormality of a test chromosome,
Probe for detecting abnormal number of chromosomes to be examined.

[Claim 2]
“(2) A specific DNA region existing in the same type of chromosome as the test chromosome”
The position display of the area is ApBC. DE or AqBC. DE,
A is the type of chromosome,
p is the short arm of the chromosome,
q is the long arm of the chromosome,
When B, C, D, and E are each a single digit natural number,
B
1 for the short arm p of the chromosome,
1 or 2 for the long arm q of the chromosome
It is characterized by
Claim 1

It is possible to exhibit a function capable of detecting a numerical abnormality of a test chromosome,
Probe for detecting abnormal number of chromosomes to be examined.

[Claim 3]
“(2) A specific DNA region existing in the same type of chromosome as the test chromosome”
The position display of the area is ApBC. DE or AqBC. DE,
A is the type of chromosome,
p is the short arm of the chromosome,
q is the long arm of the chromosome,
When B, C, D, and E are each a single digit natural number,
C
In the short arm p of the chromosome, it is one of 1 to 3,
1 or 2 for long arm q

The method according to claim 1 or 2, wherein

It is possible to exhibit a function capable of detecting a numerical abnormality of a test chromosome,
Probe for detecting abnormal number of chromosomes to be examined.

本発明の請求項１記載の被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブは、被検染色体の一部と相補性を有し、前記被検染色体と反応後前記被検染色体の一部を染色し、被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブであって、該プローブは前記被検染色体と同種の染色体に存在する特異的なＤＮＡ領域から分離された連続した８万〜１００万塩基対のＤＮＡ断片から作製され、かつ標識物が取り付けられていることを特徴とするものである。 A probe used for detecting a numerical abnormality of a test chromosome according to claim 1 of the present invention has a complementarity with a part of the test chromosome, and after reacting with the test chromosome, one of the test chromosomes. A probe used for staining a region and detecting a numerical abnormality of a test chromosome, wherein the probe is a continuous 80,000 sequence isolated from a specific DNA region existing on a chromosome of the same type as the test chromosome. It is produced from a DNA fragment of ˜1 million base pairs and has a label attached thereto.

このようにしてなる請求項１記載のプローブによれば、従来の動原体あるいはその近傍に局在する１０から１０００塩基対の連続的な反復配列を用いたプローブと異なり、被検染色体以外の染色体中により類似の少ない特異的な塩基配列を有するＤＮＡ断片を選択し易くなる。
それ故、目的とする染色体以外の染色体とは、その一部にあっても反応し難くなり、結果的に弱いシグナルが現れ難くなる。
そのため、目的とする染色体の同定精度も高まり、その計数精度も向上させることができる。
加えて、取り出すＤＮＡ断片の長さも８万〜１００万塩基対と比較的長いため、プローブに十分な発光量を確保できる標識、すなわち、蛍光物質を取り付けることもできる。それ故、本発明のプローブが目的とする染色体、すなわち、被検染色体と反応した場合には、十分な発光量も得られる。この点からも染色体の同定がよりやり易くなり、その数も数え易くなる。 According to the probe according to claim 1 thus formed, unlike a probe using a continuous repetitive sequence of 10 to 1000 base pairs localized in or near a conventional centromere, other than the test chromosome It becomes easier to select a DNA fragment having a specific base sequence with less similarity in the chromosome.
Therefore, it is difficult to react even with a part of the chromosome other than the target chromosome, and as a result, a weak signal hardly appears.
Therefore, the identification accuracy of the target chromosome can be increased and the counting accuracy can be improved.
In addition, since the length of the DNA fragment to be taken out is relatively long, 80,000 to 1,000,000 base pairs, a label capable of securing a sufficient amount of light emission, that is, a fluorescent substance can be attached to the probe. Therefore, when the probe of the present invention reacts with a target chromosome, that is, a test chromosome, a sufficient amount of luminescence can be obtained. From this point as well, chromosome identification becomes easier and the number can be easily counted.

本発明の請求項２記載の被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブは、請求項１記載の被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブにおいて、前記被検染色体と同種の染色体に存在する前記特異的なＤＮＡ領域は、その領域の位置表示をＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表し、Ａを染色体の種類、ｐを染色体の短腕、ｑを染色体の長腕、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを各々一桁の数字であるとしたとき、染色体の短腕ｐにあっては前記Ｂは１であり、長腕ｑにあっては１または２であることを特徴とするものである。 A probe used for detecting a numerical abnormality of a test chromosome according to claim 2 of the present invention is the probe used for detecting a numerical abnormality of a test chromosome according to claim 1, wherein the test chromosome and The specific DNA region present in the same type of chromosome is indicated by ApBC. DE or AqBC. Denoted as DE, where A is the type of chromosome, p is the short arm of the chromosome, q is the long arm of the chromosome, and B, C, D, and E are each a single digit number. The B is 1, and the long arm q is 1 or 2.

請求項２に記載のプローブによれば、プローブとして用いるＤＮＡ断片の取り出し領域の位置表示をＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表し、Ａを染色体の種類、ｐを染色体の短腕、ｑを染色体の長腕、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを各々一桁の数字であるとしたとき、染色体の短腕ｐにあってはＢを１、長腕ｑにあってはＢを１または２であるようにしているため、ＤＮＡ断片の取り出し領域を最初から極めて狭い範囲に絞り込むことができ、プローブの作製が容易になる。
加えて染色体の短腕ｐにあってはＢは１、長腕ｑにあってはＢが１または２であることからわかるように、いずれの領域も動原体の位置に極めて近い短腕、長腕の端部、すなわち、動原体の近傍に存在する。
それ故、動原体あるいはその近傍からＤＮＡ断片を取り出してプローブを作製していた従来の検出方法をほぼそのまま踏襲したやり方で本発明のプローブを用いた計数検出作業を行うことができるという利点もある。 According to the probe of claim 2, the position display of the DNA fragment extraction region used as the probe is displayed on the ApBC. DE or AqBC. Denoted as DE, where A is the type of chromosome, p is the short arm of the chromosome, q is the long arm of the chromosome, and B, C, D, and E are each a single digit number. Since B is 1 and B is 1 or 2 for the long arm q, the DNA fragment extraction region can be narrowed down to a very narrow range from the beginning, and the probe can be easily prepared. .
In addition, as can be seen from the fact that B is 1 for the short arm p of the chromosome and B is 1 or 2 for the long arm q, the short arm is very close to the location of the centromere, It exists at the end of the long arm, that is, near the centromere.
Therefore, there is also an advantage that the counting detection operation using the probe of the present invention can be performed in a manner that almost follows the conventional detection method in which a DNA fragment is taken out from the centromere or its vicinity to produce a probe. is there.

本発明の請求項３記載の被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブは、請求項２記載の被検染色体の数的異常を検出するために用いるプローブにおいて、前記Ｃは、染色体の短腕ｐにあっては１〜３のいずれかであり、長腕ｑにあっては１または２であることを特徴とするものである。 The probe used for detecting the numerical abnormality of the test chromosome according to claim 3 of the present invention is the probe used for detecting the numerical abnormality of the test chromosome according to claim 2, wherein the C is a chromosome. The short arm p is any one of 1 to 3, and the long arm q is 1 or 2.

請求項３記載のプローブによれば、前記請求項１、請求項２の発明の効果に加え、プローブに用いるＤＮＡ断片の切り出し位置をより一層狭い範囲に絞り込んでいるため、希望するプローブ作製用ＤＮＡ断片をより確実に、かつ迅速に用意することができる。 According to the probe of claim 3, in addition to the effects of the inventions of claims 1 and 2, the DNA fragment used for the probe is narrowed down to a narrower range. Fragments can be prepared more reliably and quickly.

本発明のプローブによれば、目的とする染色体以外の染色体に反応する弱いシグナルを大幅に減少させることができる。そのため、検出目的とする染色体の同定精度を向上させ、その計数をより正確に行うことができる。 According to the probe of the present invention, weak signals that react with chromosomes other than the target chromosome can be greatly reduced. Therefore, it is possible to improve the identification accuracy of the target chromosome for detection and perform the counting more accurately.

本発明を実施するための最良の形態について、以下に詳細に説明する。 The best mode for carrying out the present invention will be described in detail below.

［用語「特異的なＤＮＡ領域」なる語の概念］
本発明における「特異的なＤＮＡ領域」とは、例えば、１番染色体を例に表現すると、１番染色体に対して特異的なＤＮＡ領域とは、１番染色体の所定位置にしか反応しないＤＮＡ領域という意味であり、より具体的に、１番染色体のＤＮＡ領域である、例えば、１ｐ１１．２という領域に特異的なＤＮＡ断片といった場合には、１ｐ１１．２の領域内にしかハイブリダイゼーション（結合反応）しないＤＮＡ断片という意味である。 [The concept of the term “specific DNA region”]
The “specific DNA region” in the present invention is, for example, the case of expressing chromosome 1 as an example. The DNA region specific to chromosome 1 is a DNA region that reacts only at a predetermined position of chromosome 1. More specifically, in the case of a DNA fragment specific to the DNA region of chromosome 1, for example, the region of 1p11.2, hybridization (binding reaction) only within the region of 1p11.2. ) Means no DNA fragment.

『被検染色体と同種の染色体に存在する特異的なＤＮＡ領域』については、その領域の位置表示をＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表すことができる。
ここで、Ａは染色体の種類を、ｐは染色体の短腕を、ｑは染色体の長腕を意味し、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及び、Ｅは各々一桁の自然数により表される。
好ましくは、Ｂは、染色体の短腕ｐにあっては、１であり、染色体の長腕ｑにあっては、１または２である。
好ましくは、Ｃは、染色体の短腕ｐにあっては１〜３のいずれかであり、長腕ｑにあっては１または２である。 As for “specific DNA region existing in the same type of chromosome as the test chromosome”, the position indication of the region is ApBC. DE or AqBC. It can be expressed as DE.
Here, A means the type of chromosome, p means the short arm of the chromosome, q means the long arm of the chromosome, and B, C, D, and E are each represented by a single digit natural number.
Preferably, B is 1 for the short arm p of the chromosome and 1 or 2 for the long arm q of the chromosome.
Preferably, C is any one of 1 to 3 for the short arm p of the chromosome and 1 or 2 for the long arm q.

本発明に係るプローブを作製する最初のステップは、まず検出対象、すなわち、検出目的とする染色体と同種の染色体を分離し、続いてこの染色体における特異的なＤＮＡ領域を定め、その特異的なＤＮＡ領域から十分な量の、具体的には、８万〜１００万塩基対からなる連続的な配列を有するＤＮＡ断片（以下単にＤＮＡという）を分離、抽出することである。
次に、抽出したＤＮＡを標準的な遺伝子工学技術を用いて必要な量だけクローニングする。これらをもとにプローブを作製することになる。
ここで検出目的とする染色体（被検染色体）と同種の染色体、という意味は、検出目的とする染色体が、いま仮にヒト染色体の１番染色体であった、とした場合、これと同種とは、検出目的とする染色体とは別のヒト染色体の１番染色体を意味する。 The first step of producing the probe according to the present invention is to first isolate a detection target, that is, a chromosome of the same type as the target chromosome for detection, then determine a specific DNA region in this chromosome, A sufficient amount, specifically, a DNA fragment (hereinafter simply referred to as DNA) having a continuous sequence consisting of 80,000 to 1,000,000 base pairs is separated and extracted from the region.
The extracted DNA is then cloned in the required amount using standard genetic engineering techniques. A probe is produced based on these.
Here, the meaning of the same type of chromosome as the target chromosome for detection (test chromosome) means that the target target chromosome is now the first chromosome of the human chromosome. It means the first chromosome of a human chromosome different from the target chromosome for detection.

抽出されたＤＮＡは、ベクター中でクローニングするか、あるいはまたこのＤＮＡを細胞系で増殖して増幅すればよい。
本発明にあっては、特異的でかつ連続的なＤＮＡ配列を選択して、これを３クロ−ンから５クローン抽出して全長３２０ｋｂ〜１０００ｋｂのプローブを作製した。
因みに、前記３個から５個のクローンについては、目的以外の染色体を認識しないか否かを個々のクローン毎に確認しているため、クローン１個ずつ用いても良いし、前述したように３クロ−ンから５クローンの連続体を使用してもよい。
尚、１クローンの長さは８０ｋｂ（８万塩基対分の長さに相当）から２００ｋｂ（２０万塩基対分の長さに相当）であるから、前記特異的な塩基対の長さは１クローン分の長さである８万塩基対から５クローン分の長さである１００万塩基対であれば染色体の種類の同定及び計数を行うには十分である。 The extracted DNA can be cloned in a vector or can be amplified in a cell line and amplified.
In the present invention, a specific and continuous DNA sequence was selected, and 5 clones were extracted from 3 clones to prepare a probe having a total length of 320 kb to 1000 kb.
Incidentally, with respect to the 3 to 5 clones, it is confirmed for each clone whether or not a chromosome other than the target is not recognized. Therefore, one clone may be used, or 3 as described above. A clone of 5 clones from the clone may be used.
Since the length of one clone is 80 kb (corresponding to the length of 80,000 base pairs) to 200 kb (corresponding to the length of 200,000 base pairs), the length of the specific base pair is 1 A length of 80,000 base pairs, which is the length of a clone, to 1 million base pairs, which is a length of 5 clones, is sufficient for identifying and counting chromosome types.

ここで具体的な例を挙げて説明する。
１番染色体を同定し、計数するプローブを作製するために、１番染色体の動原体に近い位置からプローブ作製用のＤＮＡを分離・抽出した。
因みに、分離したＤＮＡは、いわゆる、特異的なＤＮＡ領域から分離した特異的な配列を有するＤＮＡであることは予め確認されているものである。
ここで、具体的に分離した位置を１番染色体のバンデイングで記すと、１ｑ２１．３の位置、すなわち、長腕にあって動原体に極めて近い位置である１ｑ２１．３の位置から連続する５クローン分の長さのＤＮＡを選択して、分離・抽出した。これを所定濃度になるように公知の方法でクローニング化し、増殖した。 Here, a specific example will be described.
In order to prepare a probe for identifying and counting chromosome 1, DNA for probe preparation was separated and extracted from a position close to the centromere of chromosome 1.
Incidentally, it has been confirmed in advance that the separated DNA is a DNA having a specific sequence separated from a so-called specific DNA region.
Here, when the specifically separated position is described by the banding of chromosome 1, 5q which is continuous from the position of 1q21.3, that is, the position of 1q21.3 which is located in the long arm and very close to the centromere. DNA having the length of the clone was selected, separated and extracted. This was cloned to a predetermined concentration by a known method and proliferated.

尚、前述したようにプローブとして１個のクローンを用いてもよいが、連続する３個または５個のクローンを使用すると、その長さが長くなる分標識となる蛍光物質をより多くプローブに取り付けることが可能になる。このようにしておくと、検出目的の染色体とこのプローブがハイブリダイゼーション（結合反応）した際、発光量が大きくなり、より識別が容易になる、という利点がある。
すなわち、より安定した同定解析、計数解析を行い易くなる。 As described above, a single clone may be used as a probe. However, when three or five consecutive clones are used, a longer fluorescent substance is attached to the probe as the length increases. It becomes possible. By doing so, there is an advantage that when the detection target chromosome and this probe are hybridized (binding reaction), the amount of luminescence is increased and the identification becomes easier.
That is, it becomes easy to perform more stable identification analysis and counting analysis.

前述したように、１番染色体の１ｑ２１．３の位置から、特異的なＤＮＡ領域として８万〜１００万塩基対からなる連続的な配列を有するＤＮＡを分離、抽出して作製した本発明のプローブは、いわゆるシングルコピープローブになっていて、目的とする染色体の標的領域に含まれるシングルコピー配列に相補的である核酸断片の集合体になっている。
換言すると、本発明のプローブの構成は、標的領域をクローニングにより形成した、いわゆるＤＮＡライブラリーになっている。
このように、本発明のプローブは、シングルコピープローブであるから、計数目的とする染色体の相補的部分以外とは原則的にハイブリダイゼーション（結合反応）しないようになっている。 As described above, the probe of the present invention prepared by separating and extracting DNA having a continuous sequence of 80,000 to 1,000,000 base pairs as a specific DNA region from the position of 1q21.3 of chromosome 1. Is a so-called single copy probe, which is an assembly of nucleic acid fragments that are complementary to a single copy sequence contained in the target region of the target chromosome.
In other words, the structure of the probe of the present invention is a so-called DNA library in which the target region is formed by cloning.
Thus, since the probe of the present invention is a single copy probe, in principle, hybridization (binding reaction) is not performed except for the complementary portion of the chromosome to be counted.

本発明のプローブのハイブリダイゼーション（結合反応）が、目的とする染色体との間でのみ行われるかどうか、すなわち、ハイブリダイゼーションの特異性は、公知の方法であるインシトゥハイブリダイゼーションにより試験し、確認することができる。
適宜のハイブリダイゼーション条件のもとで、本発明のプローブが目的とする染色体の標的領域と特異的に結合するならば、プローブとして使用可能であることが確認できる。
因みに、前述した１ｑ２１．３から得られたものは、この試験により目的とする１番染色体の１ｑ２１．３領域のある部分としか反応しないことが確認されている。 Whether hybridization (binding reaction) of the probe of the present invention is performed only with the target chromosome, that is, the specificity of hybridization is tested and confirmed by in-situ hybridization, which is a known method. be able to.
If the probe of the present invention specifically binds to the target region of the target chromosome under appropriate hybridization conditions, it can be confirmed that it can be used as a probe.
Incidentally, it was confirmed by this test that the product obtained from 1q21.3 mentioned above reacts only with a part of the 1q21.3 region of the target chromosome 1.

この試験は公知の方法であるから説明は簡単にする。
例えば、１〜１０［ｎｇ／μｌ］の範囲で本発明のプローブを所定濃度含み、例えば、非特許文献１に記載されているように、５０％ホルムアミド／硫酸デキストラン等が加えられ調合されているハイブリダイゼーション液は、検体に加えられる前に、プローブを変性するために３７℃の温度で２４時間放置される。 Since this test is a known method, the explanation will be simplified.
For example, the probe of the present invention contains a predetermined concentration in the range of 1 to 10 [ng / μl], and is prepared by adding 50% formamide / dextran sulfate or the like as described in Non-Patent Document 1, for example. The hybridization solution is left for 24 hours at a temperature of 37 ° C. to denature the probe before being added to the specimen.

さらに本発明のプローブには、１番染色体側のＤＮＡの所定領域、すなわち、１ｑ２１．３領域内のある部分に反応し、結合した際、その位置が顕微鏡等を介して容易に観察できるように、例えば、紫外線照射で発光するような蛍光物質等が標識として付加されている。
具体的には、変更されたヌクレオチドまたは特定の正常なヌクレオチドがニックトランスレーション法等を用いて標識として付加されている。 Furthermore, the probe of the present invention reacts with a predetermined region of DNA on the chromosome 1 side, that is, a certain part in the 1q21.3 region, and when it is bound, its position can be easily observed through a microscope or the like. For example, a fluorescent substance that emits light when irradiated with ultraviolet rays is added as a label.
Specifically, altered nucleotides or specific normal nucleotides are added as labels using a nick translation method or the like.

さらにプローブとして使用される前に、蛋白質を除去する試薬で処理される。この試薬は酵素または塩酸を含んでいる。
酵素としては、プロテナーゼ、ペプシン、プロテナーゼＫ等がしばしば使用される。典型的な酸処理は０．０２−０．２ＮＨＣｌでなされ、続いて高温（例えば、７０℃）で洗浄される。脱タンパク質の効率をどうするかは、ハイブリダイゼーション、すなわち、目的とする染色体との反応を最高にするプロテナーゼ濃度と分解時間との組合せを検討した上で、形態学的詳細(morphological detail)が損なわれないような条件設定で行われる。
尚、最適の条件は組織型及び固定方法により異なる。また、プロテナーゼ処理後の付加的固定は有用である。 Further, it is treated with a reagent for removing proteins before being used as a probe. This reagent contains an enzyme or hydrochloric acid.
As the enzyme, proteinase, pepsin, proteinase K and the like are often used. A typical acid treatment is 0.02-0.2N HCl followed by a high temperature (eg, 70 ° C.) wash. The efficiency of deproteinization is determined by examining the combination of proteinase concentration and degradation time to optimize hybridization, i.e., the reaction with the target chromosome, and the morphological detail is impaired. It is done with no condition setting.
The optimum conditions differ depending on the tissue type and the fixing method. In addition, additional fixation after proteinase treatment is useful.

ところでホルムアミドと熱は主要な変性要因であり、加えたホルムアミドの除去は溶剤による幾度かの洗浄により行われる。かかる溶剤として、例えば、７０％、８５％、１００％の冷エタノールが使用される。
変性物質の組成は、他の構成物の付加または適宜の溶剤での洗浄のいずれかにより調整される。
ハイブリダイゼーション液中のプローブの濃度は重要な要因であって、この濃度は十分に高くなければならない。濃度を十分高くすることで目的とする染色体の結合座位との反応を適当な時間内（数時間〜数日）で完了させることができるようになる。 By the way, formamide and heat are the main denaturing factors, and the added formamide is removed by washing with a solvent several times. As such a solvent, for example, 70%, 85%, 100% cold ethanol is used.
The composition of the modifying substance is adjusted either by adding other components or by washing with an appropriate solvent.
The concentration of the probe in the hybridization solution is an important factor and this concentration must be high enough. By sufficiently increasing the concentration, the reaction with the target chromosomal binding locus can be completed within an appropriate time (several hours to several days).

以上のように１番染色体の１ｑ２１．３の領域から、８万〜１００万塩基対からなる連続的な配列を有する特異的なＤＮＡを分離・抽出し、これに所定の変性処理等を施して本発明のプローブを作製した。
このプローブを用いて、間期核内に存在する検出目的とする１番染色体の計数検出を行った。
その結果、本発明のプローブは、従来のものと異なり、その特異性が際立っていて、１番染色体の１ｑ２１．３内の所定位置にしか反応せず、それ故、反応後の状態を顕微鏡で確認した際、従来のように弱いシグナルは見当たらず、しかもその長さが長く十分な蛍光物質が付加されていることと相俟って、明確な明るさのシグナルしか観察されなかった。よって１番染色体を確実に同定し、その数を間違うことなく、かつ容易に数えることができた。 As described above, specific DNA having a continuous sequence of 80,000 to 1,000,000 base pairs is separated and extracted from the 1q21.3 region of chromosome 1, and subjected to predetermined denaturation treatment or the like. The probe of the present invention was produced.
Using this probe, the count detection of the 1st chromosome for the detection purpose which exists in an interphase nucleus was performed.
As a result, the probe of the present invention differs from the conventional probe in that its specificity is outstanding, and it reacts only at a predetermined position within 1q21.3 of chromosome 1; When confirmed, a weak signal was not found as in the prior art, and in addition to the addition of a sufficiently long fluorescent substance, only a signal with a clear brightness was observed. Therefore, it was possible to reliably identify chromosome 1 and to easily count it without making a mistake.

前述した本発明の実施例では、１番染色体の１ｑ２１．３の領域内から分離・抽出して作製したプローブについてのみ説明してきたが、本発明者は１番染色体の長腕のみならず、短腕についても、また１番染色体以外の２番〜２２番染色体、さらにはＸ染色体やＹ染色体についても、長腕や短腕にあって、動原体に近いバンデイングを有し、かつ連続する８万〜１００万塩基対からなるＤＮＡを一つ一つ丹念に調べ、特異的なＤＮＡ領域の有無を確認した。
そして、本発明のプローブとして使用可能な各染色体毎の特異的なＤＮＡの所在位置を決定した。その成果を表１に示す。 In the above-described embodiment of the present invention, only the probe prepared by separating and extracting from the 1q21.3 region of chromosome 1 has been described, but the present inventor has not only limited the long arm of chromosome 1, but also the short arm. As for the arm, the 2nd to 22nd chromosomes other than the 1st chromosome, as well as the X and Y chromosomes, are in the long arm and the short arm and have a banding close to the centromere and are continuous 8 The DNA consisting of 10,000 to 1,000,000 base pairs was carefully examined one by one to confirm the presence or absence of a specific DNA region.
And the location of the specific DNA for every chromosome which can be used as a probe of this invention was determined. The results are shown in Table 1.

尚、表１において「―」となっている箇所は、動原体に近い位置で本発明のおけるプローブとして使用できるような特異的なＤＮＡ領域を見つけることができなかったことを示している。ところでこの表１を整理すると、以下のことがわかる。
例えば、１〜２２番染色体及びＸ染色体やＹ染色体にそれぞれ存在する特異的なＤＮＡ領域、すなわち本発明におけるプローブとして使用できる領域のバンデイングをＡｐＢＣ．ＤＥまたはＡｑＢＣ．ＤＥと表示し、Ａを染色体の種類（１番〜２２番染色体、Ｘ染色体及びＹ染色体のいずれか）、ｐを染色体の短腕、ｑを染色体の長腕、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを各々一桁の数字であるとしたとき、染色体の短腕ｐにあってはＢは１であり、長腕ｑにあっては１または２であることがわかる。 In Table 1, “-” indicates that a specific DNA region that can be used as a probe in the present invention could not be found at a position close to the centromere. By the way, when this Table 1 is arranged, the following can be understood.
For example, banding of specific DNA regions existing in the 1st to 22nd chromosomes and the X and Y chromosomes, that is, the regions that can be used as probes in the present invention, is described in ApBC. DE or AqBC. DE is indicated, A is the type of chromosome (1 to 22 chromosomes, X chromosome or Y chromosome), p is the short arm of the chromosome, q is the long arm of the chromosome, B, C, D, E Assuming that each is a single digit, B is 1 for the short arm p of the chromosome and 1 or 2 for the long arm q.

これをさらに絞ってその位置を明確にすると、バンデイングをＡｐＢＣ．ＤＥと表したときのＣは、染色体の短腕ｐにあっては１〜３のいずれかであり、長腕ｑにあっては１または２であることがわかる。
また、表１において、このバンデイングに代えてＮＣＢＩＢｕｉｌｄ３６．３にしたがって表示したものを短腕、長腕各欄の最右欄に記してある。これにより本発明に用いるプローブの分離・抽出領域の位置がより明確になっている。
それ故、本発明に用いるプローブを分離・抽出する場合には、計数を目的とする染色体の種類が決まったら、その種類に応じた染色体のバンデイングあるいはＮＣＢＩＢｕｉｌｄ３６．３の欄を見て、その位置を確認し、その位置から特異的で、かつ連続する８万〜１００万塩基対のＤＮＡを分離・抽出し、以下前述したような公知の方法や手段によってプローブを作製すればよい。 If this is further squeezed and the position is clarified, the banding is ApBC. It can be seen that C when expressed as DE is either 1 to 3 for the short arm p of the chromosome and 1 or 2 for the long arm q.
In Table 1, what is displayed according to NCBI Build 36.3 instead of this banding is shown in the rightmost column of each of the short arm and long arm columns. This makes the position of the separation / extraction region of the probe used in the present invention clearer.
Therefore, when isolating / extracting the probe used in the present invention, if the type of chromosome to be counted is determined, refer to the column of chromosome banding or NCBI Build 36.3 according to the type, and its position. Then, a specific and continuous 80,000 to 1,000,000 base pair DNA is separated and extracted from the position, and a probe may be prepared by a known method or means as described below.

ところで、表１が示すように、いずれのプローブの分離位置も動原体の位置に極めて近い短腕、長腕の端部、すなわち、動原体の近傍に存在する。
それ故、動原体あるいはその近傍からＤＮＡ断片を取り出してプローブを作製していた従来の検出方法をほぼそのまま踏襲したやり方で本発明のプローブを用いた計数検出作業を行うことができるという利点もある。
言い換えると、本発明のプローブを用いた場合にあっても、検出目的とする染色体を同定する際には、従来と同様に染色体の動原体近傍に目を凝らして観察していればよいのである。 By the way, as shown in Table 1, the separation position of any probe exists at the end of the short arm and long arm that are very close to the position of the centromere, that is, in the vicinity of the centromere.
Therefore, there is also an advantage that the counting detection operation using the probe of the present invention can be performed in a manner that almost follows the conventional detection method in which a DNA fragment is taken out from the centromere or its vicinity to produce a probe. is there.
In other words, even in the case of using the probe of the present invention, when identifying the chromosome to be detected, it is only necessary to keep an eye on the vicinity of the centromere of the chromosome as in the conventional case. is there.

ところで近年の多数の研究は、特定の病気の診断に役立ち、また病気それ自身の遺伝学的性質への手がかりを提供し、原因となる染色体の数的異常を明らかにした。また今日にあっては、特定の悪性腫瘍の遺伝学的性質が次第によく知られてきている。そこで本発明のプローブを用いれば、これらの研究や解析がますます容易になるものと期待される。
また本発明のプローブは、例えば、体外受精で得たれる受精卵から数個の細胞を解析することや、再生医療での幹細胞（ｉＰＳ）細胞の数的染色体異常の検出にも適用可能であることはいうまでもない。 By the way, many recent studies have helped diagnose certain diseases and provide clues to the genetic nature of the disease itself, revealing the causal chromosome aberrations. Also today, the genetic nature of certain malignant tumors is becoming increasingly well known. Therefore, using the probe of the present invention, it is expected that these studies and analyzes will become easier.
In addition, the probe of the present invention can be applied to, for example, analyzing several cells from a fertilized egg obtained by in vitro fertilization, or detecting numerical chromosomal abnormalities of stem cells (iPS) cells in regenerative medicine. Needless to say.

以上に述べたように本発明のプローブによれば、目的とする染色体の同定精度を高め、その染色体の計数をより精度良く行うことができる。 As described above, according to the probe of the present invention, the identification accuracy of the target chromosome can be increased, and the chromosome can be counted more accurately.

Claims

In chromosome 1, the position of chromosome banding is 1p13.3 and NCBI Build36.3 is 109.6 Mb-110.6 Mb,
In chromosome 1, the position of chromosome banding is 1q21.3 and NCBI Build36.3 is 152.2 Mb-152.9 Mb,
In chromosome 2, the chromosome banding is 2p11.2 and the position of NCBI Build 36.3 is 85.0 Mb-85.8 Mb,
In chromosome 2, the position of chromosome banding is 2q11.2 and NCBI Build36.3 is 97.8 Mb-98.5 Mb,
In chromosome 3, the position of chromosome banding is 3q12.1 and NCBI Build36.3 is 97.9 Mb-98.5 Mb,
In chromosome 4, the position of chromosome banding is 4p13 and NCBI Build 36.3 is 44.9Mb-45.6Mb,
In chromosome 4, the position of chromosome banding is 4q12 and NCBI Build36.3 is 57.4 Mb-58.2 Mb,
In chromosome 5, the position of chromosome banding is 5p12 and NCBI Build 36.3 is 40.6 Mb-41.2 Mb,
In chromosome 5, the position of chromosome banding is 5q11.2 and NCBI Build36.3 is 51.9 Mb-52.7 Mb,
In chromosome 6, the position of chromosome banding is 6p12.1 and NCBI Build36.3 is 54.4 Mb-55.2 Mb,
In chromosome 7, the position of chromosome banding is 7q11.21 and NCBI Build36.3 is 64.9Mb-65.9Mb,
In chromosome 8, the position of chromosome banding is 8p11.2 and NCBI Build36.3 is 40.1Mb-40.7Mb,
In chromosome 8, the position of chromosome banding is 8q11.2 and NCBI Build36.3 is 49.4Mb-50.0Mb
In chromosome 9, the position of chromosome banding is 9q21 and NCBI Build36.3 is 70.3 Mb-70.9 Mb,
In chromosome 10, the position of chromosome banding is 10p11.22 and NCBI Build36.3 is 31.3Mb-32.0Mb,
In chromosome 10, the position of chromosome banding is 10q11.21 and NCBI Build36.3 is 48.9Mb-49.5Mb,
In chromosome 11, the position of chromosome banding is 11p11.12 and NCBI Build36.3 is 46.9Mb-47.6Mb,
In chromosome 11, the position of chromosome banding is 11q12.1 and NCBI Build36.3 is 58.2 Mb-59.0 Mb,
In chromosome 12, the position of chromosome banding is 12p11.22 and NCBI Build36.3 is 29.7 Mb-30.3 Mb,
In chromosome 12, the position of chromosome banding is 12q12 and NCBI Build36.3 is 41.7 Mb-42.4 Mb,
In chromosome 13, the position of chromosome banding is 13q12.11 and NCBI Build36.3 is 26.5 Mb-27.1 Mb,
In chromosome 14, the position of chromosome banding is 14q11.2 and NCBI Build 36.3 is 31.9 Mb-32.4 Mb,
In chromosome 15, the position of chromosome banding is 15q11.2 and NCBI Build36.3 is 29.2Mb-30.0Mb,
In chromosome 16, the position of chromosome banding is 16p11.2 and NCBI Build36.3 is 30.7Mb-31.1Mb,
In chromosome 16, the position of chromosome banding is 16q12.1 and NCBI Build36.3 is 47.3Mb-48.1Mb,
In chromosome 17, the position of chromosome banding is 17q11.2 and NCBI Build36.3 is 29.4Mb-30.0Mb,
In chromosome 18, the position of chromosome banding is 18p11.21 and NCBI Build36.3 is 13.3Mb-14.1Mb,
In chromosome 18, the position of chromosome banding is 18q11.2 and NCBI Build 36.3 is 28.3 Mb-29.0 Mb,
In chromosome 19, the position of chromosome banding is 19p12 and NCBI Build 36.3 is 21.1 Mb-21.7 Mb,
In chromosome 19, the position of chromosome banding is 19q12 and NCBI Build36.3 is 33.5 Mb-34.2 Mb,
In chromosome 20, the position of chromosome banding is 20p11.2 and NCBI Build36.3 is 21.9Mb-22.4Mb,
In chromosome 20, the position of chromosome banding 20q11.23 and NCBI Build 36.3 is 35.3 Mb-36.1 Mb,
In chromosome 21, the position of chromosome banding is 21q11.2 and NCBI Build36.3 is 22.8 Mb-23.4 Mb,
In chromosome 22, the position of chromosome banding 22q11.22 and NCBI Build 36.3 is 23.5 Mb-24.2 Mb, and
In the Y chromosome, the position of the chromosomal banding is Yp11.2 and NCBI Build36.3 is 9.9 Mb to 10.4 Mb,
Separated and extracted from at least one DNA region selected from the group consisting of :
By using a DNA fragment of 80,000 to 1,000,000 base pairs attached with a label,
It reduces the weak signal that reacts to chromosomes other than the target chromosome , specifically binds to the target region, and can exhibit a function that can detect a numerical abnormality of the test chromosome,
Probe for detecting abnormal number of chromosomes to be examined.

A method for detecting a numerical abnormality of a chromosome using the probe according to claim 1 .

A recombinant vector obtained by cloning any of the DNA fragments according to claim 1 .