JP5601746B2

JP5601746B2 - 同一の試料を用いた二段階核酸検査方法

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Description

本発明は、試料核酸中に目的の配列が含まれているかどうかを検査する方法に関する。生物が持つＤＮＡの塩基配列は、個体、種、生息地等ごとに異なるので、本発明の検査方法を利用することにより、生物の個体、種、生息地等を判別することができる。また、最近、食品に添付表示しているシールの偽装や遺伝子組換え体の食品への混入などが問題になっているが、本発明の検査方法は、これらの偽装や混入の判定にも利用できる。

一般的にマグロは、太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ、ミナミマグロ、メバチマグロ、キハダマグロおよびビンナガマグロなどに分類することができる。従来、ＤＮＡによるマグロの魚種判別には、Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（例えば、非特許文献１参照。）)と言われる手法が用いられている（例えば、非特許文献２参照）。この手法は、被検ＤＮＡをＰＣＲ法（例えば、非特許文献３参照。）により増幅した後、種や系統や個体に特異的な塩基配列の部位でＤＮＡを切断して判別する方法で、増幅するＤＮＡの領域とＤＮＡを切断する制限酵素の種類、および被ＤＮＡを切断して生じたＤＮＡフラグメントの数および各ＤＮＡフラグメントの長さで種や系統や個体を判別している。たとえば、太平洋産クロマグロでは、ミトコンドリアＤＮＡのＡＴＣＯ領域を選択し、これを被検ＤＮＡとしてＰＣＲ増幅後に制限酵素AluIで切断すると、５つのＤＮＡフラグメントに切断され、各々のＤＮＡフラグメントの長さは、４３２塩基長、２９５塩基長、８１塩基長、６６塩基長、４１塩基長となり、制限酵素MseIで切断すると、８つのＤＮＡフラグメントに切断され、各々のＤＮＡフラグメントの長さは、２５５塩基長、２５４塩基長、１９４塩基長、１１５塩基長、４１塩基長、３２塩基長、１５塩基長、９塩基長となり、制限酵素Tsp509Iで切断すると、６つのＤＮＡフラグメントに切断され、各々のＤＮＡフラグメントの長さは、４１７塩基長、２１７塩基長、１８６塩基長、７２塩基長、１５塩基長、８塩基長となる（例えば、非特許文献２参照）。
また、遺伝子組換え体の判別検査にも、上記と同様の手法も用いられている。

G R Deng、"A sensitive non-radioactive PCR-RFLP analysis for detecting point mutations at 12th codon of oncogene c-Ha-ras in DNAs of gastric cancer." Nucleic Acids Res. 1988 July 11; 16(13): 6231. 独立行政法人農林水産消費技術センター・独立行政法人水産総合研究センター "技術情報マグロ属魚類の魚種判別マニュアル" Mullis K 他5名、 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 Pt 1:263-73.

上述したＰＣＲ−ＲＦＬＰの手法は、制限酵素で切断したＤＮＡフラグメントの数と各ＤＮＡフラグメントの長さの違いで、判別する方法である。具体的には、切断した全てのＤＮＡフラグメントを電気泳動で分離し、分離した各々のＤＮＡフラグメントはバンドとして現れてくる。このとき、分離して現れてきたバンドの本数がＤＮＡフラグメントの数で、電気泳動で泳動した距離がＤＮＡフラグメントの長さとなる。電気泳動はＤＮＡフラグメント長の短いものは速く泳動し、長いものは遅く泳動する作用を利用した分離方法で、泳動した距離で、長さも求めることができる。

しかし、切断してできたＤＮＡフラグメントで、類似した長さのＤＮＡフラグメントが複数あったとき、電気泳動で十分分離できないこととなり、２つのＤＮＡフラグメントが存在しても1個のバンドに見えてしまう（例えば、前出の非特許文献２に掲載されているゲル電気泳動の蛍光染色画像では、２５５塩基長と２５４塩基長の２種類のＤＮＡフラグメントは、３％（w/v）のアガロースゲルを用いて4cm程度の距離を電気泳動しても、一つの太いバンドとしてしか検出できていない。）このため、類似した長さのＤＮＡフラグメントが生成するような条件でＰＣＲ−ＲＦＬＰを行うと、ＤＮＡフラグメントの数の判定を誤る危険性がある。このように、ＰＣＲ−ＲＦＬＰの手法は信頼性が高くないため、重要な検査には向いていないという問題がある。

さらに、このように類似した長さのＤＮＡフラグメントが分離できない現象は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰばかりでなく、電気泳動を用いる検査手法に共通の問題である。したがって、電気泳動を用いてＤＮＡフラグメントの数を求める定性ＰＣＲ法などの検査手法（たとえば、特開2003-009866号公報ＳＩＮＥ法による動物種判別方法、組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（平成１３年３月２７日付け食発第110号）（別添）組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法）この文献は、厚生労働省のホームページよりダウンロード可能である。＜http://www.mhlw.go.jp/topics/idenshi/kensa/050517a.html＞、参照）は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰに限らず信頼性が高くないため、重要な検査には向いていないという問題がある。

一方、最も信頼性の高い検査手法は、ＤＮＡの塩基配列を読み取って検査する方法である（例えば、Sambrook J & Russell DW Chapter12 DNA sequencing. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3^rd Ed. 2001; pp12.1-12.120.参照。）。しかしこの方法は、コストが高価であり、特殊設備や熟練技術者を有する専門機関でしかできないなど、通常の頻回の検査に用いるには適さない検査方法であるという問題がある。
本発明は、このような従来技術の問題に鑑みなされたものであり、ＤＮＡを用いて、従来よりも効率の良い検査方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、試料核酸中に目的の配列が含まれているかどうかを検査する際に、簡易な検査と精密な検査の二段階に分けて検査することにより、低コストで信頼性の高い検査を実施できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供するものである。

（１）試料核酸中に目的の配列が含まれているかどうかを検査する方法であって、最初に試料核酸に対し簡易な検査を行い、目的の配列が含まれていると判定された場合若しくは含まれていないと判定された場合に、同一試料核酸に対し精密な検査を行うことを特徴とする核酸の検査方法。

（２）試料核酸中に目的の配列が規定量以上含まれているかどうかを検査する方法であって、最初に試料核酸に対し簡易な定量的検査を行い、目的の配列が規定量以上含まれていると判定された場合に、同一試料核酸に対し精密な検査を行うことを特徴とする核酸の検査方法。

（３）精密な検査が、試料核酸の塩基配列を読み取る検査であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の核酸の検査方法。

（４）簡易な検査によって目的の配列が含まれていると判定された核酸若しくは含まれていないと判定された核酸、又は簡易な検査によって目的の配列が規定量以上含まれていると判定された核酸を回収し、その核酸に対して精密な検査を行うことを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の核酸の検査方法。

（５）試料核酸に予めタグを付けておき、簡易な検査の終了後に、タグを利用して試料核酸を回収することを特徴とする（４）に記載の核酸の検査方法。

（６）簡易な検査の終了後、試料核酸とその他の物質との物理化学的な相違を利用する方法を用いて試料核酸を回収することを特徴とする（４）に記載の核酸の検査方法。

（７）簡易な検査が、試料核酸を破損させない検査であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか一項に記載の核酸の検査方法。

（８）簡易な検査が、試料核酸の塩基配列を読み取れる状態で保持できる検査であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか一項に記載の核酸の検査方法。

（９）試料核酸を二分し、一方を簡易な検査の試料核酸とし、他方を精密な検査の試料核酸とすることを特徴とする（１）又は（２）に記載の核酸の検査方法。

（１０）目的の配列が、生物種に特異的に存在する配列であることを特徴とする（１）乃至（９）のいずれか一項に記載の核酸の検査方法。

（１１）目的の配列が、遺伝子組み換え体に特異的に存在する配列であることを特徴とする（１）乃至（９）のいずれか一項に記載の核酸の検査方法。

（１２）複数種類の目的配列を１回の簡易な検査で同時に検査できることを特徴とする（１）乃至（９）のいずれか一項に記載の核酸の検査方法。

本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
上記（１）または（２）の方法のように、通常は、特殊設備や熟練技術者が不要で安価で短時間に検査結果が得られるような第１ステージの簡易検査をおこない、問題が発生したときに第２ステージの精密検査をおこなうという二段階での検査手法を実施することにより、効率よく信頼性の高い検査を行うことができる。
また、上記（３）の方法のように、第２ステージの精密検査として核酸の塩基配列を読み取る方法を採用する方式によれば、この方法は最も信頼度の高い核酸の一次構造の解析検査方法であるため、第１ステージの簡易検査にどのような方法を用いても、最終的に高い信頼性の検査を確保することができる。

また、上記（４）の方法のように、簡易検査で使用した試料核酸を回収、再使用して精密な検査を行う方法によれば、検査過程における対象の取り違えなどのミスを減らして、より信頼性の高い検査手段を提供することができる。さらに、再使用により、検査に用いる核酸の量も減らすことができる。

また、上記（５）の方法のように、試料核酸に予め付けたタグを利用して、簡易な検査の終了後に試料核酸を回収する方式によれば、タグの付いていない混在物から効率よく試料核酸を回収することができる。

また、上記（６）の方法のように、試料核酸とその他の物質との物理化学的な相違を利用して簡易な検査の終了後に試料核酸を回収する方式によれば、予め試料核酸にタグを付ける必要なしに試料核酸を回収することができる。

また、上記（７）の方法のように、試料核酸を破損させずに回収できるような簡易検査方法を採用する方式によれば、第１ステージの簡易検査に使用した試料核酸を第２ステージの精密検査に再度使用することができるため、検査過程における対象の取り違えなどのミスを減らして、より信頼性の高い検査手段を提供することができる。さらに、再使用により、検査に用いる核酸の量も減らすことができる。

また、上記（８）の方法のように、核酸の塩基配列を読み取れるような簡易検査方法を採用する方式によれば、第１ステージの簡易検査に使用した試料核酸を第２ステージの核酸の塩基配列を読み取る精密検査に再度使用することができるため、最終的に高い信頼性の検査を確保できると同時に、検査過程における対象の取り違えなどのミスを減らして、より信頼性の高い検査手段を提供することができ、また、再使用により、検査に用いる核酸の量も減らすことができる。

また、上記（９）の方法のように、予め試料核酸を簡易検査用と精密検査用とに分割して保持し、それぞれの検査ごとに用いる検査方法によれば、第１ステージの簡易検査が試料核酸を破損させるような場合にも、第２ステージ用の試料核酸を確保しておくことができる。さらに、分割した各核酸試料を同一のデバイス上に保持しておけば、対象の取り違えなどのミスを減らすこともできる。

また、上記（１２）の方法のように、複数種類の目的配列を1回の簡易な検査で同時に検査できる方法によれば、一回で複数の目的配列の検査を行うことができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の検査方法は、試料核酸中に目的の配列が含まれているかどうかを検査する方法であって、最初に試料核酸に対し簡易な検査を行い、目的の配列が含まれていると判定された場合若しくは含まれていないと判定された場合に、同一試料核酸に対し精密な検査を行うことを特徴とするものである。本発明の第二の検査方法は、試料核酸中に目的の配列が規定量以上含まれているかどうかを検査する方法であって、最初に試料核酸に対し簡易な定量的検査を行い、目的の配列が規定量以上含まれていると判定された場合に、同一試料核酸に対し精密な検査を行うことを特徴とするとするものである。このように検査を二段階に分け、問題があるときだけ精密な検査を行うようにすれば、最適なコストで信頼性の高い検査を提供することができる。この手法は、問題が発生する件数の少ない状況に適した検査方法である。

検査の対象とする配列は特に限定されないが、本発明の検査方法は、主に生物の種等の判別や遺伝子組換え体の判定などに利用されるので、生物の種、生息地、個体に特異的に存在する配列や遺伝子組換え体に特異的に存在する配列などを検査の対象とすることができる。このような特異的な配列に関する情報は広く知られている。例えば、マグロの種、生息地に特異的な配列の情報は、前述した非特許文献３（この文献は、独立行政法人農林水産消費技術センターのホームページよりダウンロード可能である。＜URL:http://www.cfqlcs.go.jp/technical_information/hinpyou/pdf/maguro_manual.pdf＞）に記載されている。また、タラバガニとアブラガニの種特異的な配列の情報は、宇山博人、池田実、谷口順彦、“mtＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰによるタラバガニとアブラガニの判別”、水産育種 2005；34:111.に記載されており、アイナメ科魚類の種特異的な配列の情報は、柳本卓、濱津友紀、 “日本産アイナメ科魚類7種のmtＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析による種判別”、日本水産学会誌 2003;69(5):726、に記載されている。また、タイの魚種に特異的な配列の情報は、“技術情報マダイ、チダイ及びキダイの魚種判別マニュアル”（この文献は、独立行政法人農林水産消費技術センターのホームページよりダウンロード可能である。＜URL: http://www.cfqlcs.go.jp/technical_information/hinpyou/pdf/madai_manual.pdf＞）に記載されており、スズキ及びナイルバーチの魚種に特異的な配列の情報は、“スズキ、タイリクスズキおよびナイルパーチの魚種判別マニュアル”（この文献は、独立行政法人農林水産消費技術センターのホームページよりダウンロード可能である。＜URL: http://www.cfqlcs.go.jp/technical_information/hinpyou/pdf/suzuki_manual.pdf＞）に記載されている。また、日本産サバ属の種特異的な配列の情報は、特開2002-345498号公報日本産サバ属の種判別方法．に記載されている。さらに、遺伝子組換え体に特異的な配列の情報については、カルタヘナ法に基づく第1種および第2種使用規程の承認を受けた遺伝子組換え体について、ＬＭＯ関連情報“カルタヘナ法に基づき承認された遺伝子組み換え生物検索システム”（この文献は、バイオセーフティクリアリングハウス（Ｊ−ＢＣＨ）のホームページよりダウンロード可能である。＜URL：https://ch.biodic.go.jp/bch/OpenSearch.do＞）を参照することにより、入手することができる。

これら以外の特異的な配列の情報も、当業者であれば容易に入手することが可能である。なお、検査対象とする配列にはＤＮＡの配列のほか、ＲＮＡの配列も含まれる。

簡易な検査の方法は特に限定されないが、簡易な検査によって目的の配列が含まれていると判定された核酸若しくは含まれていないと判定された核酸を回収して、精密な検査の対象とするような場合には、試料核酸を破損させない方法とすることが望ましい。試料核酸を二分し、一方を簡易な検査の試料核酸とし、他方を精密な検査の試料核酸とするような場合には、試料核酸を破損させる方法、試料核酸を破損させない方法のいずれであってもよい。試料核酸を破損させる方法の具体例としては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＡＦＬＰ法、サザンブロッティング法、Chemical Cleavage of Mismatch（ＣＣＭ）法、ヌクレアーゼを利用する方法などを例示できるが、これらに限定されるわけではない。また、試料核酸を破損させない方法の具体例としては、溶液中でのハイブリダイゼーションを利用する方法、リアルタイムＰＣＲ法、プライマー伸長法、シークエンス法、増幅断片多型法（Random amplified polymorphic DNA法）、Taqmanアッセイ、Invaderアッセイなどを例示できるが、これらに限定されるわけではない。

核酸の回収方法は特に限定されないが、試料核酸に予めタグを付けておき、簡易な検査の終了後に、そのタグを利用して試料核酸を回収する方法が好ましい。また、簡易な検査の終了後、試料核酸とその他の物質との物理化学的な相違を利用して、試料核酸を回収してもよい。ここで物理化学的な相違を利用した回収方法としては、カラムの利用、電気泳動、有機溶媒による抽出などを例示できる。

また、マイクロフルイディクス技術などを用いて第1ステージの簡易な検査のデバイスをマイクロチップ化することにより、小型機器による自動検査が可能となり、さらに簡易な検査の終了後、回収する試料核酸をマイクロチップ内に封入したままで、マイクロチップごと保存したり第２ステージの精密な検査の場へと容易に安全に伝達したりすることが可能となる。精密な検査にあたっては、このマイクロチップから試料核酸を回収し、これを用いて検査を行うことができる。

精密な検査の方法も特に限定されないが、試料核酸の塩基配列を読み取る検査方法が好ましい。
以下、本発明の検査方法の好ましい態様を図を用いて説明する。

図１は、本発明の検査方法において、簡易な検査として試料核酸を破損させない手法を採用し、簡易な検査に用いた試料ＤＮＡを回収する場合の流れを説明したものである。まず、検査対象となる生物（S101）から試料核酸を含むＤＮＡを抽出し（S102）、これを用いて第１ステージの簡易検査を行う（S103）。続いて簡易検査の結果を判断し（S104）、問題がなければ、その結果を持って結論とし、検査を終了する（S105）。簡易検査の結果に問題がある場合には、第１ステージの簡易検査で問題があると判定された試料核酸を回収し精製して（S106）、これを用いて第２ステージの精密検査を行い（S107）、結果を判断して終了する（S108）。

図２は、本発明の検査方法において、簡易な検査として試料核酸を破損させてしまう手法を採用した場合の流れを説明したものである。まず、検査対象となる生物（S201）から試料ＤＮＡを含むＤＮＡを抽出する（S202）。次に、予め試料ＤＮＡを同一デバイス上に分割して保存し（S203）、分割した試料ＤＮＡの一部分を用いて第１ステージの簡易検査を行う（S204）。続いて簡易検査の結果を判断し（S205）、問題がなければ、その結果を持って結論とし、検査を終了する（S206）。簡易検査の結果に問題があると判断された場合には、分割保存されていた第２ステージ用の試料ＤＮＡを用いて（S207）第２ステージの精密検査を行い（S208）、結果を判断して終了する（S209）。

以上のことから、本発明を実施するための好ましい形態によれば、専門的な機器や技術者を必要とせず簡易に安価に行える第１ステージの簡易検査を行い、その結果に問題があれば、同じ試料ＤＮＡを再使用して、信頼性の高い第２ステージの精密検査を行うという二段階検査が可能となるため、これまでよりもはるかに信頼性の高い検査を提供することができる。なお、本発明では、第２ステージの精密検査として、現在最も信頼性の高いＤＮＡの塩基配列を読み取る方法を採用する。このことにより、第１ステージの簡易検査で問題があっても、最終的には最も信頼性の高い検査結果を提供することができる。

次に、試料ＤＮＡを破損させることなく行える方法を用いて第１ステージの簡易検査を行い、そこから回収した試料ＤＮＡを用いて第２ステージの精密検査を行う方法を実施するための最良の形態について説明する。

図３は、検査対象生物の試料ＤＮＡを準備する流れを説明したものであり、図４は、第１ステージの検査Ａに用いた試料ＤＮＡを回収し再使用して第２ステージの検査Ｂを行う場合の、検査手法の流れを説明したものである。まず、図３（ａ）に例示したような様々な被検査生物群１から、既知の手法（例えば、Sambrook J & Russell DW Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3^rd Ed. 2001; pp6.1-6.64、及びSambrook J & Russell DW Chapter7 Extraction, purification, and analysis of mRNA from eukaryotic cells. Molecular Cloning : A laboratory manual. 3^rd Ed. 2001; pp7.1-7.94.を参照）によって（ｂ）のような被検査生物の核酸２を抽出する。被検査生物は、この図に示す以外のものであっても構わない。これを必要に応じて部分的に増幅および／あるいは逆転写し、（ｃ）のように必要量の試料ＤＮＡ３を得る。この試料ＤＮＡ３が、図４（ａ）に示すように、目的塩基配列部分４を含んでいるかどうかを同定するのが本発明の検査方法の目的である。図４では、試料ＤＮＡを破損させない第１ステージの簡易検査Ａの例として、ＤＮＡハイブリダイゼーション、第２ステージの精密検査ＢとしてＤＮＡ塩基配列の読み取りによって、両ステージで同じ試料ＤＮＡ３を用いてそれぞれの検査を行う場合の流れを説明している。ハイブリダイゼーションは試料ＤＮＡを破損させず、ＤＮＡの塩基配列の解析よりも反応系がはるかに単純であり、コストも安価であるため、検査後に試料ＤＮＡを回収するような簡易検査に適した検査方法である。

まず、図４の（ｂ）に示すように、検査に先立って、試料ＤＮＡ３の末端に磁気ビーズ５を結合させてビーズ結合した試料ＤＮＡ６を作製し、この構造を持つ分子群であるビーズ結合した試料ＤＮＡ群７を用いて、二段階の検査を行う。この操作により、第１ステージの検査Ａ終了後、この分子群のみを磁石の引力により夾雑物中から精製して回収し、第２ステージの検査Ｂに用いることができる。

ビーズ結合した試料ＤＮＡ群７を作製後、まず第１ステージの簡易検査であるＤＮＡハイブリダイゼーションを行う。このためには、（ｃ）に示すように、目的塩基配列部分４に相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ９の末端に蛍光色素８を結合した蛍光標識プローブ１０を作製し、それらの分子群である蛍光標識プローブ群１１の溶液とビーズ結合した試料ＤＮＡ群７の溶液とを同一の反応漕に入れ混和する。この際、蛍光標識プローブ群１１の分子数は、ビーズ結合した試料ＤＮＡ群７の分子数よりも過剰量とする。これを反応漕ごと加熱後徐冷し適温で保持することにより、（ｄ）に示すように、反応液中でビーズ結合した試料ＤＮＡ６中の目的塩基配列部分４と蛍光標識プローブ１０とをハイブリダイゼーションさせ、二重鎖形成１３を行わせることができる。この二重鎖形成１３により、蛍光色素８を、間接的に目的塩基配列部分４に結合させることができ、それらの蛍光色素が発する蛍光を検出すれば、反応液中に目的塩基配列部分４が存在することを検出できる。

しかし、この反応液中には、蛍光標識プローブ群１１の方がビーズ結合した試料ＤＮＡ群７よりも過剰量存在するため、目的塩基配列部分４と二重鎖形成１３を行えない余剰の未反応の蛍光標識プローブ群１２が残存しており、これらも蛍光を発する。このため、これらの未反応の蛍光標識プローブ群１２を除去し、二重鎖形成を行った蛍光標識プローブ１０による蛍光だけを検出することで、正確な検査を行えるようにする必要がある。このために、本発明では、磁気ピペット１４を用いて反応液中の磁気ビーズを磁力により引き付け固定する。これにより、（ｅ）に示すように、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６およびこの内部に存在する目的塩基配列部分４と二重鎖を形成している蛍光標識プローブ１０のみを、磁気ピペットで回収することができるため、反応液中に含まれる未反応の蛍光標識プローブ群１２を反応漕に残して、必要な分子だけを回収することができる。この後、（ｆ）に示すように、回収したビーズ結合した試料ＤＮＡ６およびこれと二重鎖形成した蛍光標識プローブ１０を、新たな溶液中に懸濁する。この溶液の蛍光を検出することにより、試料ＤＮＡ３中に目的塩基配列部分４が存在することを検出することができる。この検査結果に問題があれば、試料ＤＮＡを回収して第２ステージの検査Ｂを行う。

この段階で、第１ステージの簡易検査Ａ終了後の溶液中には、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６およびこの内部に存在する目的塩基配列部分４と二重鎖を形成している蛍光標識プローブ１０が存在している。このうち第２ステージの精密検査Ｂに必要なのは、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６のみであり、蛍光標識プローブ１０は第２ステージの精密検査Ｂを阻害する夾雑物となるため、第２ステージの精密検査Ｂに先立って、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６のみを精製して回収する必要がある。このため本発明では、第１ステージの検査Ａ終了後、（ｇ）に示すように、反応漕ごと溶液を加熱して二重鎖を形成している水素結合を熱変性によって解離させた後、（ｈ）に示すように、磁気ピペット１４を用いて反応液中のビーズ結合した試料ＤＮＡ６のみを回収することにより、反応液中に含まれる解離した蛍光標識プローブ１０を反応漕に残して、必要な分子だけを回収することができる。

この後、（ｉ）に示すように、ビーズ結合した試料ＤＮＡを塩基配列読み取りのための溶液に懸濁し、これを再度用いて、既知の方法（例えば、前述したSambrook Jらの文献参照）により、第２ステージの精密検査ＢであるＤＮＡ塩基配列の読み取りを行い、試料ＤＮＡ３中の目的塩基配列部分４の塩基配列１５が存在することを検出する（ｊ）。

以上のことから、本実施の形態によれば、第１ステージの検査Ａを簡易かつ安価に行い、結果に問題があれば、第１ステージＡに用いた試料ＤＮＡを回収し再使用して、信頼性の高い第２ステージの精密検査Ｂを行うことができる。

次に、第１ステージの簡易検査Ａで試料ＤＮＡを破損させるような手法を用いる場合に、試料ＤＮＡを予め同一のデバイス上に第１ステージＡ用と第２ステージＢ用とに取り分けて保存し、各検査ごとに取り分けられた試料ＤＮＡを用いて精密検査を行うための、好ましい形態について説明する。図５は、第１ステージの簡易検査ＡとしてＤＮＡの切断を含むＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いる場合の、分割保存した試料ＤＮＡを用いた二段階検査の流れを説明したものである。

まず、試料ＤＮＡを再使用する前述の場合と同様に、検査対象生物の試料ＤＮＡを準備する流れを説明した図３にしたがって、必要量の試料ＤＮＡ３を得る。これを検査の出発材料とする（図５（ａ））。これを（ｂ）で示すように、第１ステージの簡易検査Ａ用と第２ステージの精密検査Ｂ用とに分割し、それぞれの部分を、（ｃ）のように、同一デバイス上の異なる場所（Ａ）および（Ｂ）に保存する。これらのうちから第１ステージの簡易検査Ａ用に（Ａ）に取り分けた試料ＤＮＡ３に制限酵素を加えて切断を行う。この結果、試料ＤＮＡ３は、（ｄ）に示すように、切断された長いＤＮＡフラグメント１６、切断された中程度の長さのＤＮＡフラグメント１７、および、切断された短いＤＮＡフラグメント１８に切り分けられる。次に、（ｅ）に示すように、これらのＤＮＡフラグメントを含む溶液を電気泳動ゲル１９にアプライした後、電気泳動装置２０を用いて電気泳動を行い、ゲル上で３種類のＤＮＡフラグメントを分離する。核酸を染色できる色素でゲルを染色し、予想通りの電気泳動パターンが得られれば、試料ＤＮＡ３中に目的塩基配列部分４が存在すると判断する。この検査結果に問題があれば、以下のように、第２ステージの検査Ｂを行う。

第１ステージのＰＣＲ−ＲＦＬＰ検査に用いた試料ＤＮＡ３は、検査に際して、切断された長いＤＮＡフラグメント１６、切断された中程度の長さのＤＮＡフラグメント１７、および、切断された短いＤＮＡフラグメント１８に切り分けられたため、これらを回収しても、第２ステージの精密検査であるＤＮＡの塩基配列を読み取ることができない。そこで、（ｃ）で（Ｂ）に分割保存しておいた第２ステージの精密検査Ｂ用の試料ＤＮＡを用いて（ｆ）、既知の方法（例えば、前述したSambrook Jらの文献参照）により、第２ステージの精密検査ＢであるＤＮＡ塩基配列の読み取りを行い、試料ＤＮＡ３中の目的塩基配列部分４の塩基配列１５が存在することを検出する（ｇ）。

以上のことから、本実施の形態によれば、第１ステージの検査Ａを簡易かつ安価に行い、結果に問題があれば、予め同一デバイス上に分割保存した試料ＤＮＡを使用して、信頼性の高い第２ステージの精密検査Ｂを行うことができる。
なお、試料ＤＮＡを回収し再使用する場合においても、また、分割保存し検査ごとに使用する場合においても、第１ステージの簡易検査は、本実施の形態で説明したものに限定されるわけではない。この他、1種類または複数種類の特定のＤＮＡの塩基配列を同定できる手法であれば、いかなるものも採用することができる。

また、図６に、上記のような二段階の検査に含まれる簡易の検査をマイクロフルイディクスの技術を用いて行う際のデバイスを例示した。平板に、図のようにＤＮＡ抽出部２１、検出部２２、およびＤＮＡ保存部２３を彫り込み、それらの間を細い溝を掘り込んで連結してある。このデバイスにやはり平板の蓋２４を被せ、蓋２４にはＤＮＡ抽出部の上部に試料挿入用の穴２５を開けてある。簡易の検査を行う際には、試料挿入用の穴２５から試料、例えばマグロの切り身の一部を入れる。入れられた試料からＤＮＡ抽出部２１でＤＮＡを抽出し、これを細い溝を通して検出部２２へと移動させ、ここで簡易の検査による検出を行う。第２ステージの精密検査のために分割保存が必要な場合には、抽出したＤＮＡの一部を、検出部２２へ送ると同時に、別の細い溝を通してＤＮＡ保存部２３へも移動させ、そこに保存する。簡易の検査を行った結果、精密検査が必要な場合には、このデバイスごと精密検査を行う場所へ試料を送ることができる。このデバイスごとの試料を受け取って精密検査を行う際には、図７に示すように、デバイスの蓋２４を開け、ＤＮＡ保存部２３および／または検出部２２に保持してあるＤＮＡを回収して、精密検査に用いる。このようなデバイスを利用することにより、試料の取り違いやＤＮＡの紛失、夾雑物の混入などを防ぎ、微量で簡便な簡易な検査と信頼度の高い精密検査を行うことができる。

また、本発明は上述の実施の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他の種々の構成を採り得ることはもちろんである。

次に、本発明にかかる第一の実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。

図８に示す目的塩基配列i２７が試料ＤＮＡの塩基配列２６の中に存在するかどうかを、本発明の検査方法で調べた。第１ステージの簡易検査であるＤＮＡハイブリダイゼーション法には、図８に示すように、検査対象のＤＮＡの塩基配列i２７に完全に相補的なプローブ塩基配列２８を持つプローブＤＮＡを蛍光色素Cy5で標識した蛍光標識プローブを用いた。また、第２ステージの精密検査であるＤＮＡ塩基配列の読み取りには、やはり図８に示すように、試料ＤＮＡの塩基配列２６の一部分に完全に相補的なシークエンスプライマーの塩基配列２９を持つシークエンスプライマーを、それぞれ用いた。

図４の流れに従い、まず、試料ＤＮＡの塩基配列２６を持ち5’末端をビオチン修飾したＤＮＡ200pmolと、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Bio-Adembeads Streptavidin，品番0312、Ａdemtech）100μgとを、50μlのＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0）に加えて攪拌した後、室温で30分間放置して、ＤＮＡの5’末端と磁気ビーズを結合させた。磁気マイクロピペットPickPen（BIO-NOBILE）により溶液中の磁気ビーズを引き付けて回収し、別のチューブに入れたＴＥ緩衝液50μl中に磁気ビーズを遊離させ攪拌して、磁気ビーズおよびこれに結合したＤＮＡの洗浄を行った。この洗浄を3回繰り返して未反応のＤＮＡを除いた後、別のチューブに入れた50μlのＴＥ緩衝液に懸濁して、ビーズ結合したＤＮＡの懸濁液を作製した（図４（ｂ））。

次に、プローブ塩基配列２８を持ち5’末端を蛍光色素Cy5で標識したプローブＤＮＡの100pmolの水溶液2μlを、ビーズ結合したＤＮＡの懸濁液50μlに加えた（図４（ｃ））。この混合液を、94℃で30秒間、ついで55℃で5分間保持して、ハイブリダイゼーションを行った（図４（ｄ））。

ハイブリダイゼーション反応後、室温で、PickPenにより溶液中の磁気ビーズを引き付けて回収し（ｅ）、別のチューブに入れたＴＥ緩衝液50μl中に磁気ビーズを遊離させ攪拌して、ビーズ結合したＤＮＡとこれにハイブリダイズしたプローブの洗浄を行った。この洗浄を3回繰り返して未反応のＤＮＡを除いた後、別のチューブに入れた50μlのＴＥ緩衝液に懸濁した（図４（ｆ））。この懸濁液の蛍光を、ＦＬＡ５０００フルオロ・イメージアナライザー（冨士写真フィルム）で、励起波長635nm、R665フィルター使用の条件で検出した。この結果を、第１ステージの簡易検査であるハイブリダイゼーションの蛍光検出による結果とした。図９で示すように、この懸濁液の蛍光強度は、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６のみの懸濁液の蛍光強度よりも明らかに強かった。また、この懸濁液の蛍光強度は、試料ＤＮＡに相補的な塩基配列を持たないがプローブＤＮＡと同じ長さの陰性対照プローブ塩基配列３０を持ち、5’末端をCy5で標識した陰性対照プローブを用いて同様のハイブリダイゼーションを行った場合の蛍光強度よりも、明らかに強かった。この結果、プローブ塩基配列２８を持つプローブＤＮＡ９を用いたハイブリダイゼーション反応により、試料ＤＮＡの塩基配列２６中に検査対象の塩基配列i２７が含まれていることを検出できることが示された。

次に、懸濁液を94℃で2分加熱した後5分間氷冷して2本鎖を解離させた（図４（ｇ））。その後、PickPenにより溶液中の磁気ビーズを引き付けて回収し、別のチューブに入れた蒸留水50μl中に磁気ビーズを遊離させ攪拌して、ビーズ結合した試料ＤＮＡ６の洗浄を行った。この洗浄を３回繰り返して解離したプローブＤＮＡを除いた。

回収したビーズ結合した試料ＤＮＡ６とシークエンスプライマーの塩基配列２９をもつシークエンスプライマー、およびＡＢＩ社製のBigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing Kitを用いて、キットの説明に従ってシークエンシング反応を行い、ABI PRISMR 310 Genetic Analyzerを用いて、試料ＤＮＡ６のシークエンシングを行った。

この結果、図１０のように、得られた塩基配列の一部分に目的塩基配列i２７が検出され、簡易検査に用いた試料ＤＮＡ３を回収して精密検査に用いる手法により、目的塩基配列を検出できることが示された。

以上のことから、本実施例によれば、特異的なＤＮＡ塩基配列の検出を行うため、ハイブリダイゼーション法による簡易検査を行った後、検査に使用した試料ＤＮＡを回収し、これを用いて、精密検査としてＤＮＡ塩基配列の読み取りを行って、簡便で信頼度の高い検査を行うことができる。

次に、本発明にかかる第二の実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
図１１に示す目的塩基配列ii３１が試料ＤＮＡの塩基配列２６の中に存在する相対量を定量的に検出できるかどうかを、本発明の検査方法で調べた。第１ステージの簡易検査としてリアルタイムＰＣＲ法を、第二ステージの簡易検査としてはＤＮＡ塩基配列の読み取りを、それぞれ用いた。リアルタイムＰＣＲ法は、前述のように試料ＤＮＡを破損させない検査法であるが、使用する試料ＤＮＡが極端に少量で行える検査法のため、ここでは検査後に試料ＤＮＡを回収せず、予め試料ＤＮＡを二分してその片方を第一ステージのリアルタイムＰＣＲに用い、もう片方を第二ステージの塩基配列の読み取りに用いた。

リアルタイムＰＣＲには、図１１に示すように、検査対象のＤＮＡの塩基配列ii３１の５’末端に完全に相同な塩基配列３２を持つRTプライマー〔１〕、および、検査対象のＤＮＡの塩基配列ii３１の３’末端に完全に相補的な塩基配列３３を持つRTプライマー〔２〕のペアを用いた。また、第２ステージの精密検査であるＤＮＡ塩基配列の読み取りには、やはり図１１に示すように、試料ＤＮＡの塩基配列２６の３´末端に完全に相補的でRTプライマー〔２〕の塩基配列３３より5塩基短いシークエンスプライマーの塩基配列２９を持つシークエンスプライマーを、それぞれ用いた。

まず、図５に従って、試料ＤＮＡの塩基配列２６を持ち5’末端をビオチン修飾したＤＮＡの濃度100μMの溶液を二つに分け（図５（ｂ））、各々を８連のＰＣＲ用チューブ（Optical Tubes (8 Tubes/Strip)、品番4316567、ABI）の別々のチューブ（Ａ）および（Ｂ）に分注し、フタ（ABI PRISM OpticalCap, 8 caps/strips(Flat)、品番4323032、ABI）で密封し保存した（図５（ｃ））。

このうちチューブ（Ａ）から2μlずつ３度取り分け、それぞれを蒸留水で希釈して、2pM、20fMおよび0.2fMの溶液を作成した。これら各々の溶液各2μl （各々4afmol、40zmol、400ymolの試料ＤＮＡを含む）に、それぞれ10ｘEX Taq 緩衝液（Takara EX Taq添付品、品番RR001A、タカラバイオ）5μl、2.5mM dNTP mix（Takara EX Taq添付品、品番RR001A、タカラバイオ） 4μl、各々10μMのRTプライマー〔１〕およびRTプライマー〔２〕各1μl（各10pmol）、Taqポリメラーゼ（Takara ExTaq、品番RR001A、タカラバイオ）1.25unit、およびSYBR Green I（品番F0512、タカラバイオ）3,500倍希釈液 5 μlを混合し、それぞれ50μlの水溶液とした。これらを、各々96穴のマイクロタイタープレート（Micro Amp Optical 96-well Reaction Plate、品番N801-0560、ABI）に入れ、キャップ（ABI PRISM OpticalCap, 8 caps/strips(Flat)、品番4323032、ABI）で密封した。この検体を、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System（ABI）を用いて、95℃で2分間保持した後、95℃15秒間保持と60℃1分間保持の2ステップを40回繰り返してPCR反応を行い、その間、SYBR Green Iの蛍光強度を測定することにより、ＤＮＡの増幅をモニターした。測定結果をグラフに作成したところ、図１２に示すように、試料ＤＮＡの濃度が高いほどＰＣＲ産物の量は少ないサイクル数で増加し始め、少ないサイクル数でプラトーに達した。試料ＤＮＡと相補性のないＲＴプライマーを用いた陰性対照の実験では、ＰＣＲ産物の有意な増幅は認められないことから、RTプライマー〔１〕および〔２〕を用いた増幅が、特異的なものであることを確認できた。なお、反応終了後、95℃15秒間ついで60℃1分間保持し、その後20分間かけて95℃まで温度を上昇させ、融解曲線分析を行った。この結果、図１３に示した相対蛍光値の負の一次微分曲線から、増幅されたＤＮＡはどれも同じTm値を持つ1種類の配列であることが示せた。試料ＤＮＡと相補性のないＲＴプライマーを用いた陰性対照の実験では、融解曲線は温度依存性のない基底レベルの直線となり、ＰＣＲ産物は認められないため、ここでもRTプライマー〔１〕および〔２〕を用いた増幅が特異的なものであることを確認できた。さらに、図１２をもとにして作成した検量線は、図１４に示すように、試料ＤＮＡ量の対数値とCt値とが直線関係となった。したがって、試料中に目的塩基配列ii２６が含まれ手いることを確認し、さらにその量を、リアルタイムＰＣＲの手法を用いて、定量的に検査できることが示された。なお、リアルタイムＰＣＲの手法を用いると、定量的な検査と同様に定性的な検査も行えることは当然である。

次に、上記のように前もってチューブ（Ｂ）に分注しておいた試料ＤＮＡの塩基配列２６を持つ試料ＤＮＡ2pmol、シークエンスプライマーの塩基配列２９をもつシークエンスプライマー、およびＡＢＩ社製のBigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing Kit（品番4337449、ABI）を用いて、キットの説明に従ってシークエンシング反応を行い、ABI PRISMR 310 Genetic Analyzerを用いて、試料ＤＮＡのシークエンシングを行った。

この結果、図１５のように、得られた塩基配列の一部分に目的塩基配列i３１に完全に相補的な塩基配列３４が検出でき、目的塩基配列を検出できることが示せた。

目的塩基配列が複数種類ある場合には、一つの反応漕内で同時に複数種類の目的塩基配列に対してリアルタイムＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡの増幅が検出されるか否かを判定することにより、目的塩基配列の有無を判定する。目的塩基配列のいずれかの増幅が検出された場合には、第２ステージの精密検査を行い、存在する目的塩基配列の種類を同定する。この場合、簡易検査では、目的塩基配列の有無のみを検出するため、複数種類のリアルタイムＰＣＲ反応を行う際に用いる蛍光色素は、１種類でも複数種類でも構わない。

二段階ＤＮＡ検査手法のうち、第１ステージの簡易検査に試料ＤＮＡを破損させない手法を用いた場合の流れを説明したものである。二段階ＤＮＡ検査手法のうち、第１ステージの簡易検査に試料ＤＮＡを破損させる手法を用いた場合の流れを説明したものである。検査対象生物の試料ＤＮＡを準備する流れを示した図である。第１ステージの簡易検査に使用した試料ＤＮＡを回収して第２ステージの精密検査を行う二段階検査の流れを示した図である。検査前に同一デバイス上に分割保存した試料ＤＮＡの一部ずつを用いて、第１ステージの簡易検査および第２ステージの精密検査を行う、二段階検査の流れを示した図である。マイクロフルイディクスを用いた検査デバイスを示した図である。図６の検査デバイスの蓋を開けた状態を示した図である。実施例１の検査に用いた各ＤＮＡの塩基配列と相補性を示した図である。実施例１の第１ステージの簡易検査の結果を示した図である。実施例１の第２ステージの精密検査の結果を示した図である。実施例２の検査に用いた各ＤＮＡの塩基配列と相補性を示した図である。実施例２の第１ステージの簡易検査の結果の増殖曲線を示した図である。実施例２の第１ステージの簡易検査でＤＮＡの増幅が成功したことを示す図である。実施例２の第1ステージの簡易検査の結果から描いた検量線の図である。実施例２の第２ステージの精密検査の結果を示した図である。

符号の説明

１・・・被検査生物群、２・・・被検査生物の核酸、３・・・試料ＤＮＡ、４・・・目的塩基配列部分、５・・・磁気ビーズ、６・・・ビーズ結合した試料ＤＮＡ、７・・・ビーズ結合した試料ＤＮＡ群、８・・・蛍光色素、９・・・プローブＤＮＡ、１０・・・蛍光標識プローブ、１１・・・蛍光標識プローブ群、１２・・・未反応の蛍光標識プローブ群、１３・・・二重鎖形成、１４・・磁気ピペット、１５・・・ＤＮＡ塩基配列、１６・・・切断された長いＤＮＡフラグメント、１７・・・切断された中程度の長さのＤＮＡフラグメント、１８・・・切断された短いＤＮＡフラグメント、１９・・・電気泳動ゲル、２０・・・電気泳動装置、２１・・・ＤＮＡ抽出部、２２・・・検出部、２３・・・ＤＮＡ保存部、２４・・・蓋、２５・・・試料挿入用の穴、２６・・・試料ＤＮＡの塩基配列、２７・・・目的塩基配列i、２８・・・プローブ塩基配列、２９・・・シークエンスプライマーの塩基配列、３０・・・陰性対照プローブ塩基配列、３１・・・目的塩基配列ii、３２・・・ＲＴプライマー〔１〕の塩基配列、３３・・・ＲＴプライマー〔２〕の塩基配列、３４・・・目的塩基配列iiの相補鎖の塩基配列

Claims

試料核酸中に目的の配列が含まれているかどうかを検査する方法であって、最初に試料核酸に対しマイクロチップ化したデバイス上で簡易な検査を行い、目的の配列が含まれていると判定された場合若しくは含まれていないと判定された場合に、同一試料核酸に対し精密な検査を行う核酸の検査方法であって、試料核酸を二分し、一方を簡易な検査の試料核酸とし、他方を精密な検査の試料核酸とし、それらを前記同一デバイス上に保持しておくことを特徴とし、簡易な検査がＤＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、又はリアルタイムＰＣＲ法による検査であり、精密な検査がＤＮＡ塩基配列の読み取りによる検査である核酸の検査方法。
目的の配列が、生物種に特異的に存在する配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の検査方法。
目的の配列が、遺伝子組み換え体に特異的に存在する配列であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の検査方法。
複数種類の目的配列を１回の簡易な検査で同時に検査できることを特徴とする請求項１に記載の核酸の検査方法。