JP5626717B2 - Fusion protein containing retinoic acid receptor α - Google Patents
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Description
本発明は、白血病の予防又は治療に有用なレチノイン酸受容体αを含む融合タンパク質等に関する。 The present invention relates to a fusion protein containing retinoic acid receptor α, which is useful for the prevention or treatment of leukemia.
白血病は、白血球が腫瘍化して正常に分化・成熟できなくなり、未分化な白血球細胞が血液中に無制限に増加する疾患である。白血病細胞が分化能を失う原因は明らかでないものも多いが、多くの白血病細胞では染色体の欠損や転座が認められる。例えば、全白血病患者の約１０％を占める急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）では、１５番染色体と１７番染色体の相互転座と呼ばれる現象が認められることがある。この転座により、レチノイン酸受容体α（以下、「ＲＡＲα」と表記する場合もある。）とＰＭＬタンパク質が融合タンパク質として発現するため両タンパク質の機能が失われ、その結果、細胞が分化能を失う。 Leukemia is a disease in which leukocytes become tumors and cannot differentiate or mature normally, and undifferentiated white blood cells increase in the blood indefinitely. There are many unclear causes of leukemia cells losing differentiation ability, but many leukemia cells have chromosomal defects and translocations. For example, in acute promyelocytic leukemia (APL), which accounts for about 10% of all leukemia patients, a phenomenon called reciprocal translocation of chromosomes 15 and 17 may be observed. Due to this translocation, retinoic acid receptor α (hereinafter sometimes referred to as “RARα”) and PML protein are expressed as fusion proteins, so that the functions of both proteins are lost. lose.
ここで、模式図を参照してＲＡＲαの機能を説明する。 Here, the function of RARα will be described with reference to a schematic diagram.
まず、図１０（Ａ）に示すとおり、正常な細胞においては、ＲＡＲαはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成し（図１０（１））、標的遺伝子におけるＤＮＡ配列ＡＧＧＴＣＡｎｎｎｎｎＡＧＧＴＣＡ（配列番号：６）を認識してＤＮＡに結合する。レチノイン酸非存在下では、このヘテロ二量体が、転写抑制因子Ｎ−ＣｏＲ／ＳＭＲＴを介してヒストン脱アセチル化酵素（ＨＡＤＣ）と複合体を形成し（同（２））、標的遺伝子の転写を抑制している。 First, as shown in FIG. 10 (A), in normal cells, RARα forms a heterodimer with the retinoid X receptor (RXR) (FIG. 10 (1)), and the DNA sequence AGGTCAnnnnAGGTCA (sequence) in the target gene. Recognizes number: 6) and binds to DNA. In the absence of retinoic acid, this heterodimer forms a complex with histone deacetylase (HADC) via the transcriptional repressor N-CoR / SMRT ((2)), and transcription of the target gene. Is suppressed.
図１０（Ｂ）に示すとおり、レチノイン酸存在下では、レチノイン酸がＲＡＲαとＲＸＲに結合すると（同（３））、Ｎ−ＣｏＲ／ＳＭＲＴ／ＨＤＡＣ複合体がＲＡＲαから離れ（同（４））、代わりにヒストンアセチル化酵素活性を有するｐ３００／ＣＢＰがリクルートされる。ヒストンがアセチル化されると、ヒストンとＤＮＡの親和力が弱まり、ヌクレオソーム構造が緩和される。その結果、標的遺伝子の下流の転写が活性化される（同（５））る。標的遺伝子としては、例えば、ＰＫＡ−Ｒ１α、ＰＫＣ−δ、ＭＡＰ４Ｋ２、ＴＲＩＡＤ１、ＣＤ１１ｂ遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子が発現すると白血球の分化が促進される。 As shown in FIG. 10B, in the presence of retinoic acid, when retinoic acid binds to RARα and RXR (same as (3)), the N-CoR / SMRT / HDAC complex is separated from RARα (same as (4)). Instead, p300 / CBP with histone acetylase activity is recruited. When histone is acetylated, the affinity between histone and DNA is weakened, and the nucleosome structure is relaxed. As a result, transcription downstream of the target gene is activated ((5)). Examples of target genes include PKA-R1α, PKC-δ, MAP4K2, TRIAD1, and CD11b genes. When these genes are expressed, leukocyte differentiation is promoted.
一方、図１０Ｃに示すとおり、急性前骨髄球性白血病においてＰＭＬ／ＲＡＲα融合タンパク質が発現する場合、レチノイン酸存在下でもヒストン脱アセチル化酵素が解離しないので、ヒストンアセチル化酵素活性を有するｐ３００／ＣＢＰをリクルートできず、下流の転写は抑制されたままとなる。その結果、必要なタンパク質が産生されず、白血球が分化能を失う。 On the other hand, as shown in FIG. 10C, when PML / RARα fusion protein is expressed in acute promyelocytic leukemia, histone deacetylase is not dissociated even in the presence of retinoic acid, and thus p300 / CBP having histone acetylase activity. Cannot be recruited, and downstream transcription remains suppressed. As a result, necessary proteins are not produced and leukocytes lose their differentiation ability.
急性前骨髄球性白血病に対しては、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）投与による治療が行われている。レチノイン酸投与による治療では、高濃度のレチノイン酸を投与して、レチノイン酸受容体の機能を向上させる。しかしながら、レチノイン酸受容体の機能障害が顕著な患者には効果がなく、また、長期間投与すると耐性や副作用が生じることもある（例えば、非特許文献１〜４を参照。）。 Acute promyelocytic leukemia is treated by administration of all-trans retinoic acid (ATRA). In the treatment with retinoic acid administration, a high concentration of retinoic acid is administered to improve the function of the retinoic acid receptor. However, it is not effective for patients with significant retinoic acid receptor dysfunction, and resistance and side effects may occur when administered for a long time (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 4).
また、白血病の治療法としてはヒ素を投与することもあるが、ヒ素も耐性や副作用を生じることがある。 In addition, arsenic is sometimes administered as a treatment method for leukemia, but arsenic may cause resistance and side effects.
そこで、本発明は、白血球の分化を促進し、長期間の投与が可能で、レチノイン酸受容体の機能障害が顕著な患者にも効果が得られる白血病の予防又は治療薬を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention aims to provide a prophylactic or therapeutic agent for leukemia that promotes leukocyte differentiation, can be administered for a long period of time, and is effective even for patients with significant dysfunction of retinoic acid receptors. And
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、レチノイン酸受容体に細胞膜透過性モチーフ及び／又は核内移行シグナルを融合した融合タンパク質は、細胞膜を透過し、核内に移行すること；核内でＲＸＲとヘテロ二量体を形成し、標的遺伝子に結合し、レチノイン酸存在下で当該標的遺伝子の転写を活性化すること；及び、当該融合タンパク質を白血病モデル細胞に投与したところ、当該細胞が顆粒球に分化して増殖が抑制され、好中球としての機能を発揮すること等を見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have found that a fusion protein in which a retinoic acid receptor is fused with a cell membrane permeability motif and / or a nuclear translocation signal penetrates the cell membrane and enters the nucleus. Migrating; forming a heterodimer with RXR in the nucleus, binding to the target gene, activating transcription of the target gene in the presence of retinoic acid; and administering the fusion protein to a leukemia model cell As a result, the present inventors have found that the cells differentiate into granulocytes to suppress proliferation and exhibit functions as neutrophils, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は、
〔１〕レチノイン酸受容体αと、核内移行シグナル及び／又は細胞膜透過性モチーフとを含む融合タンパク質；
〔２〕前記細胞膜透過性モチーフが、前記レチノイン酸受容体αのＮ末端側又はＣ末端側に連結している、上記〔１〕に記載の融合タンパク質；
〔３〕レチノイン酸受容体αと、核内移行シグナルと、細胞膜透過性モチーフとを含む、上記〔１〕に記載の融合タンパク質；
〔４〕前記核内移行シグナルが、前記レチノイン酸受容体αのＮ末端側に連結し、前記細胞膜透過性モチーフが、前記レチノイン酸受容体αのＣ末端側又は前記核内移行シグナルのＮ末端側に連結している、上記〔３〕に記載の融合タンパク質；
〔５〕Ｎ末端に精製用タグがさらに連結している、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質；
〔６〕Ｎ末端から、精製用タグ、核内移行シグナル、レチノイン酸受容体α、細胞膜透過性モチーフの順で連結している、上記〔５〕に記載の融合タンパク質；
〔７〕Ｎ末端から、精製用タグ、細胞膜透過性モチーフ、核内移行シグナル、レチノイン酸受容体αの順で連結している、上記〔５〕に記載の融合タンパク質；
〔８〕前記核内移行シグナルが、配列番号：９〜１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドより選択される、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質；
〔９〕前記細胞膜透過性モチーフが、配列番号：１３〜１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドより選択される、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質；
〔１０〕前記精製用タグが、ポリヒスチジンタグ又はＦＬＡＧペプチドである、上記〔５〕から〔７〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質；
〔１１〕配列番号１〜５のいずれか１項に記載のアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；
〔１２〕上記〔１〕から〔１１〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸；
〔１３〕上記〔１２〕に記載の核酸を含む発現ベクター；
〔１４〕上記〔１３〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体；
〔１５〕上記〔１〕から〔１１〕のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物：
〔１６〕レチノイン酸受容体αを含む、急性前骨髄球性白血病の治療または予防薬；及び、
〔１７〕白血病細胞を分化させる方法であって、該白血病細胞にレチノイン酸受容体αを投与することを含む、方法、に関する。
That is, the present invention
[1] a fusion protein comprising a retinoic acid receptor α and a nuclear localization signal and / or a cell membrane permeability motif;
[2] The fusion protein according to [1], wherein the cell membrane permeability motif is linked to the N-terminal side or C-terminal side of the retinoic acid receptor α;
[3] The fusion protein according to [1] above, which contains a retinoic acid receptor α, a nuclear translocation signal, and a cell membrane permeability motif;
[4] The nuclear translocation signal is linked to the N-terminal side of the retinoic acid receptor α, and the cell membrane permeability motif is the C-terminal side of the retinoic acid receptor α or the N-terminal of the nuclear translocation signal. The fusion protein according to [3], which is linked to the side;
[5] The fusion protein according to any one of [1] to [4], wherein a purification tag is further linked to the N-terminus;
[6] The fusion protein according to [5], wherein the purification tag, nuclear localization signal, retinoic acid receptor α, and cell membrane permeability motif are linked in this order from the N-terminus;
[7] The fusion protein according to [5], wherein the purification tag, cell membrane permeability motif, nuclear translocation signal, and retinoic acid receptor α are linked in this order from the N-terminus;
[8] The fusion protein according to any one of [1] to [7] above, wherein the nuclear translocation signal is selected from peptides consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9-12;
[9] The fusion protein according to any one of [1] to [7] above, wherein the cell membrane permeability motif is selected from peptides consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-17;
[10] The fusion protein according to any one of [5] to [7], wherein the purification tag is a polyhistidine tag or a FLAG peptide;
[11] A fusion protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5;
[12] A nucleic acid encoding the fusion protein according to any one of [1] to [11] above;
[13] An expression vector comprising the nucleic acid according to [12] above;
[14] A transformant comprising the expression vector according to [13] above;
[15] A pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of [1] to [11] above:
[16] A therapeutic or prophylactic agent for acute promyelocytic leukemia comprising retinoic acid receptor α; and
[17] A method for differentiating leukemia cells, comprising administering retinoic acid receptor α to the leukemia cells.
本発明に係る融合タンパク質は、細胞膜透過性を有し、核内に移行することができるので、急性前骨髄球性白血病の患者に投与すると、分化能を失った白血病細胞内で正常に機能を発揮する。その結果、白血病細胞内で細胞の分化に必要なタンパク質の転写を活性化することを通じて、白血病細胞を顆粒球に分化させ、異常な増殖を抑制することができる。従って、本発明に係る融合タンパク質は、急性前骨髄球性白血病の予防又は治療薬として有用である。 Since the fusion protein according to the present invention has cell membrane permeability and can be transferred into the nucleus, when it is administered to a patient with acute promyelocytic leukemia, it normally functions in leukemia cells that have lost differentiation ability. Demonstrate. As a result, leukemia cells can be differentiated into granulocytes by activating transcription of proteins necessary for cell differentiation in leukemia cells, and abnormal proliferation can be suppressed. Therefore, the fusion protein according to the present invention is useful as a preventive or therapeutic agent for acute promyelocytic leukemia.
本発明に係る融合タンパク質は、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）と、核内移行シグナル及び／又は細胞膜透過性モチーフとを含む。 The fusion protein according to the present invention comprises a retinoic acid receptor α (RARα) and a nuclear translocation signal and / or a cell membrane permeability motif.
本発明に用いられるＲＡＲαは、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマなどの任意の哺乳動物に由来するものを含むが、ヒト又はマウス由来のものが好ましく、特に、本発明の融合タンパク質をヒトに投与する場合には、ヒトに由来するものが好ましい。ヒトのＲＡＲαのアミノ酸配列は配列番号：７に、マウスのＲＡＲαのアミノ酸配列は配列番号：８に記載されたとおりである。 RARα used in the present invention includes those derived from any mammals such as humans, monkeys, mice, dogs, cows, horses, etc., but those derived from humans or mice are preferable, and in particular, the fusion protein of the present invention is used. When administered to humans, those derived from humans are preferred. The amino acid sequence of human RARα is as described in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of mouse RARα is as described in SEQ ID NO: 8.
また、本発明に用いられるＲＡＲαは、以下に述べる本発明の効果を奏する限り、上記ＲＡＲαのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；及び、ＲＡＲα改変体も含む。 RARα used in the present invention is a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of RARα as long as the effects of the present invention described below are exerted; Also included are peptides in which one or several amino acids are conservatively substituted; and RARα variants.
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。本明細書におけるアミノ酸には、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が含まれる。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸(α−メチルアラニンなど)、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。 As used herein, “amino acid” is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives. Amino acids in the present specification include, for example, natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-proteinogenic amino acids such as norleucine, β-alanine, ornithine And chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids. Examples of unnatural amino acids include α-methyl amino acids (such as α-methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, β-hydroxy-histidine, homohistidine, α-fluoromethyl-histidine and α-methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo” amino acids), and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid). . In a preferred embodiment, the amino acid contained in the compound of the present invention consists only of natural amino acids.
本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるタンパク質がＲＡＲα活性を保持する限り特に限定されないが、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度であるか、あるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。 In the present specification, when “one or several amino acids are deleted, substituted or added”, the number of amino acids to be substituted is not particularly limited as long as the resulting protein retains RARα activity. 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably about 1 to 3, or within 20% of the total length, preferably within 10%. The amino acid to be substituted or added can be a natural amino acid, a non-natural amino acid or an amino acid analog, and is preferably a natural amino acid.
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ＲＡＲα活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。 In the present specification, “one or several amino acids of an amino acid are conservatively substituted” means that the amino acid substitution is similar in hydrophilicity index and / or hydrophobicity index to the amino acid substituted with the original amino acid. Substitutions that do not cause a clear decrease or disappearance of RARα activity before and after such substitutions.
本明細書において、「ＲＡＲα改変体」とは、ＲＡＲαタンパク質を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＲＡＲαの１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。 In the present specification, the “RARα variant” is a compound obtained by natural or artificial modification of the RARα protein. Examples of such modification include alkylation of one or more amino acid residues of RARα, Examples include acylation (for example, acetylation), amidation, carboxylation, ester formation, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, phosphorylation, hydroxylation, and binding of a labeling component.
本発明の核内移行シグナル（nuclear localization signal；以下「ＮＬＳ」と表記することもある。）は、本発明の融合タンパク質を細胞の核内に移送できるものである限り特に限定されず、種々の核内移行シグナルを用いることができる。特にリシンやアルギニン残基が集まったペプチドであることが好ましく、例えば、配列番号：９に記載のＳＶ４０Ｔ抗原（ＰＫＫＫＲＫＶ）、配列番号：１０に記載のｃ−ｍｙｃ（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ）、配列番号：１１に記載のｐ５３（ＰＱＰＫＫＫＰ）、配列番号：１２に記載のＮＦ−κＢｐ５０（ＱＲＫＲＱＫ）などが挙げられるがこれらに限定されない。 The nuclear localization signal (hereinafter also referred to as “NLS”) of the present invention is not particularly limited as long as it can transport the fusion protein of the present invention into the nucleus of the cell. Nuclear translocation signals can be used. In particular, a peptide in which lysine and arginine residues are gathered is preferable. For example, the SV40T antigen (PKKRKVV) described in SEQ ID NO: 9; c-myc (PAAKRVKLD) described in SEQ ID NO: 10; Examples thereof include p53 (PQPKKKKP) described above, NF-κBp50 (QRKRQK) described in SEQ ID NO: 12, and the like, but are not limited thereto.
本発明の核内移行シグナルは、本発明の融合タンパク質内のどこに位置してもよく、レチノイン酸受容体αのＮ末端側に連結していても、Ｃ末端側に連結していてもよい。また、核内移行シグナルは、融合タンパク質に２以上含まれていてもよい。 The nuclear localization signal of the present invention may be located anywhere in the fusion protein of the present invention, and may be linked to the N-terminal side or the C-terminal side of retinoic acid receptor α. Moreover, two or more nuclear localization signals may be contained in the fusion protein.
本発明に用いられる細胞膜透過性モチーフ（Membrane translocating motif；以下「ＭＴＭ」と表記することもある。）は、本発明の融合タンパク質に細胞膜透過性を与える限り特に限定されず、種々の細胞膜透過性モチーフを用いることができる。例えば、配列番号：１３に記載のＭＴＭ（Hawiger et al., 2005 Nature Medicine vol.11 No.(8):892-8）、配列番号：１４に記載の１１Ｒ、配列番号：１５に記載の９Ｒ、配列番号：１６に記載のＴａｔ、配列番号：１７に記載のＴａｔ２が挙げられるがこれに限定されない。 The cell membrane permeability motif (Membrane translocating motif; hereinafter sometimes referred to as “MTM”) used in the present invention is not particularly limited as long as it gives cell membrane permeability to the fusion protein of the present invention. Motifs can be used. For example, MTM described in SEQ ID NO: 13 (Hawiger et al., 2005 Nature Medicine vol. 11 No. (8): 892-8), 11R described in SEQ ID NO: 14, 9R described in SEQ ID NO: 15. , Tat described in SEQ ID NO: 16, and Tat2 described in SEQ ID NO: 17, but are not limited thereto.
本発明のＭＴＭは、ＲＡＲαのＮ末端側に連結してもＣ末端側に連結してもよい。また、ＲＡＲαに直接連結していてもよく、ＮＬＳを介してＲＡＲαに連結していてもよい。本発明の融合タンパク質には、ＭＴＭが２以上含まれていてもよい。 The MTM of the present invention may be linked to the N-terminal side or the C-terminal side of RARα. Moreover, it may be directly linked to RARα or may be linked to RARα via NLS. The fusion protein of the present invention may contain two or more MTMs.
融合タンパク質におけるＲＡＲα、ＮＬＳ及びＭＴＭの並び方は、細胞内でそれぞれが機能を発揮する限り特に限定されないが、たとえば、ＮＬＳ−ＲＡＲα−ＭＴＭ、ＭＴＭ−ＮＬＳ−ＲＡＲα、ＮＬＳ−ＲＡＲα、ＭＴＭ−ＲＡＲα、ＲＡＲα−ＭＴＭ等の順序で連結することができる。各ペプチドは、直接連結していてもよく、間に１〜３０、好ましくは５〜２５アミノ酸のペプチドを介して連結していてもよい。 The arrangement of RARα, NLS and MTM in the fusion protein is not particularly limited as long as each of them functions in a cell. For example, NLS-RARα-MTM, MTM-NLS-RARα, NLS-RARα, MTM-RARα, RARα -It can be linked in the order of MTM. Each peptide may be directly linked, or may be linked via a peptide of 1 to 30, preferably 5 to 25 amino acids therebetween.
また、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端に精製用タグがさらに連結していることも好ましい。精製用タグは、本発明の融合タンパク質を発現系で発現させた後、その精製用タグへのアフィニティーを利用して精製できる限り特に限定されないが、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６個のヒスチジンを連結したポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）、チオレドキシン、ＦＬＡＧペプチド等を挙げることができ、生体内に投与する観点からは、ポリヒスチジンタグやＦＬＡＧペプチドが好ましい。 In the fusion protein of the present invention, it is also preferred that a purification tag is further linked to the N-terminus. The purification tag is not particularly limited as long as the fusion protein of the present invention is expressed in an expression system and then purified using the affinity to the purification tag. For example, glutathione-S-transferase (GST), 6 Examples thereof include polyhistidine (His6), thioredoxin, and FLAG peptide linked with a single histidine. From the viewpoint of administration in vivo, a polyhistidine tag and a FLAG peptide are preferable.
ＲＡＲα、ＭＴＭ、ＮＬＳ及び精製用タグを含む本発明に係る融合タンパク質として好ましい例としては、以下の（１）〜（５）が挙げられる。なおｍＲＡＲαはマウスＲＡＲαを示す。
（１）ＨＭＮＲ（配列番号：１）
Ｎ末端からＨｉｓ６−ＭＴＭ−ＮＬＳ−ｍＲＡＲαの順に連結されている。
（２）ＨＮＲＭ（配列番号：２）
Ｎ末端からＨｉｓ６−ＮＬＳ−ｍＲＡＲα−ＭＴＭの順に連結されている。
（３）ＨＮＲ（配列番号：３）
Ｎ末端からＨｉｓ６−ＮＬＳ−ｍＲＡＲαの順に連結されている。
（４）ＨＭＲ（配列番号：４）
Ｎ末端からＨｉｓ６−ＭＴＭ−ｍＲＡＲαの順に連結されている。
（５）ＨＲＭ（配列番号：５）
Ｎ末端からＨｉｓ６−ｍＲＡＲα−ＭＴＭの順に連結されている。
Preferred examples of the fusion protein according to the present invention including RARα, MTM, NLS and purification tag include the following (1) to (5). Note that mRARα represents mouse RARα.
(1) HMNR (SEQ ID NO: 1)
It is connected in the order of His6-MTM-NLS-mRARα from the N-terminus.
(2) MNRM (SEQ ID NO: 2)
It is connected in the order of His6-NLS-mRARα-MTM from the N-terminus.
(3) HNR (SEQ ID NO: 3)
It is connected in the order of His6-NLS-mRARα from the N-terminal.
(4) HMR (SEQ ID NO: 4)
It is connected in the order of His6-MTM-mRARα from the N-terminus.
(5) HRM (SEQ ID NO: 5)
It is connected in the order of His6-mRARα-MTM from the N-terminus.
いずれも各ペプチドの間には、ベクターに由来するペプチドが介在している。なお、ヒトに投与する場合、上記（１）〜（５）においてｍＲＡＲαをヒトＲＡＲαに代えたものがより好ましい。 In any case, a peptide derived from a vector is interposed between the peptides. In addition, when administering to a human, what replaced mRAR (alpha) with human RAR (alpha) in said (1)-(5) is more preferable.
本発明に係る「本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸」は、本発明に係る融合タンパク質をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよく、好ましくはＤＮＡである。かかるＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、所定の細胞・組織に由来するｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーから得ることができ、合成したＤＮＡであってもよい。所定の細胞・組織から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅して得ることもできる。 The “nucleic acid encoding the fusion protein according to the present invention” according to the present invention may be any nucleic acid as long as it contains the base sequence encoding the fusion protein according to the present invention, and is preferably DNA. Such DNA can be obtained from, for example, genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from a predetermined cell / tissue, and cDNA library, and may be synthesized DNA. A total RNA or mRNA fraction can be prepared from a predetermined cell / tissue and amplified by RT-PCR.
例えば、ＭＴＭ、ＮＬＳ、などの短いペプチドをコードする核酸は、アミノ酸配列に基づいて塩基配列を決定し、当該塩基配列に基づいて合成したＤＮＡを用いることができる。また、ＲＡＲαをコードする核酸は、例えば、細胞から抽出したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得たｃＤＮＡを用いることができる。それぞれの核酸は連結してから発現ベクターに挿入することもできるし、それぞれの核酸を発現ベクターのクローニングサイトに挿入することによって融合タンパク質が発現されるように連結してもよく、いずれの場合も本発明の「融合タンパク質をコードする核酸」に含まれる。「融合タンパク質が発現されるように」連結するとは、ＲＡＲα、ＭＴＭ、ＮＬＳ、精製用タグをコードする核酸フレームを合わせて（ｉｎ ｆｒａｍｅで）連結することを意味する。 For example, for a nucleic acid encoding a short peptide such as MTM and NLS, a base sequence can be determined based on the amino acid sequence, and DNA synthesized based on the base sequence can be used. As the nucleic acid encoding RARα, for example, cDNA extracted by RT-PCR using RNA extracted from cells can be used. Each nucleic acid can be ligated and then inserted into the expression vector, or each nucleic acid can be ligated so that the fusion protein is expressed by inserting it into the cloning site of the expression vector. It is included in the “nucleic acid encoding a fusion protein” of the present invention. Ligation "so that the fusion protein is expressed" means that the nucleic acid frames encoding RARα, MTM, NLS, and purification tag are joined together (in frame).
本発明に係る「発現ベクター」は、上述の本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクターである。発現ベクターは、宿主中で自己複製能を有し、宿主細胞と容易に区別しうる表現系の遺伝子を有し、制限酵素切断部位を少なくとも一つ有し、宿主細胞外では生存できないという条件を満たす限り、どのようなものを用いてもよく、宿主との組み合わせで選択することができる。例えば、宿主を大腸菌とする場合には、ｐＢＲ系ベクター、ｐＵＴ系ベクター、ｐＥＴ系ベクター、ｐＱＥ系ベクター等のプラスミドが好ましく用いられ、その他、酵母由来プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いることもできる。 An “expression vector” according to the present invention is a vector into which a nucleic acid encoding the fusion protein according to the present invention is inserted. An expression vector has a condition that it has a self-replicating ability in a host, has a gene of an expression system that can be easily distinguished from a host cell, has at least one restriction enzyme cleavage site, and cannot survive outside the host cell. Any material can be used as long as it is satisfied, and can be selected in combination with the host. For example, when the host is Escherichia coli, plasmids such as pBR vectors, pUT vectors, pET vectors, and pQE vectors are preferably used. In addition, yeast-derived plasmids, phage vectors, virus vectors, cosmid vectors, yeast Artificial chromosomes (YAC) can also be used.
発現ベクターには、宿主で機能するプロモーターが組み込まれ、プロモーターの制御下に本発明の核酸が挿入される。発現ベクターには、例えば、複製起点、ターミネーター領域、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子等も挿入される。選択マーカー遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子が用いられる。 A promoter that functions in the host is incorporated into the expression vector, and the nucleic acid of the present invention is inserted under the control of the promoter. For example, a replication marker, a terminator region, a selection marker gene for selecting a transformant, and the like are also inserted into the expression vector. As the selectable marker gene, for example, antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, kanamycin are used.
本発明に係る「形質転換体」は、上述した本発明の発現ベクターを用いて形質転換した宿主をいう。宿主としては、例えば、大腸菌、バチルス属菌、その他細菌類等を用いることができるが、本発明の融合タンパク質の大量生産にも適する大腸菌が好ましい。 The “transformant” according to the present invention refers to a host transformed with the expression vector of the present invention described above. As the host, for example, Escherichia coli, Bacillus, and other bacteria can be used, but Escherichia coli suitable for mass production of the fusion protein of the present invention is preferred.
次に、本発明に係る融合タンパク質の製造方法について説明する。 Next, a method for producing a fusion protein according to the present invention will be described.
本発明の融合タンパク質は、上述した本発明の核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換し、当該宿主を培養して融合タンパク質を発現させ、当該融合タンパク質を精製して得ることができる。 The fusion protein of the present invention can be obtained by transforming a host using the expression vector containing the nucleic acid of the present invention described above, culturing the host to express the fusion protein, and purifying the fusion protein. .
本発明の発現ベクターで宿主を形質転換する方法には、公知の方法を用いることができ、例えば、宿主が大腸菌の場合、塩化マンガンや塩化カルシウムで処理してコンピテント細胞を作製し、懸濁液に発現ベクターを混ぜてヒートショックにより取り込ませる方法、エレクトロポレーション法、ファージベクターを用いる場合には宿主にファージを感染させる方法等を挙げることができる。 As a method for transforming a host with the expression vector of the present invention, a known method can be used. For example, when the host is Escherichia coli, a competent cell is prepared by treatment with manganese chloride or calcium chloride and suspended. Examples include a method in which an expression vector is mixed with a solution and incorporated by heat shock, an electroporation method, and a method in which a phage is infected in a host when a phage vector is used.
こうして得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とする融合タンパク質を発現させることができる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定することができる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。 By culturing the transformant thus obtained in an appropriate medium, the target fusion protein can be expressed. Conditions such as medium composition, culture temperature, time, addition of inducer, etc. can be determined by those skilled in the art according to known methods so that the transformant grows and the fusion protein is efficiently produced. For example, when an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, a transformant can be selected by adding an antibiotic to the medium.
産生された融合タンパク質は、公知の方法に従って精製することができる。例えば、宿主を緩衝液に懸濁して超音波破砕等の方法で破壊する。続いて、融合タンパク質に精製用タグが融合されている場合は、まず当該精製用タグに特異的な親和性を有するアフィニティーカラム等を通し、カラムに吸着された融合タンパク質を緩衝液で溶出することによって精製することができる。得られた融合タンパク質溶液を遠心処理等によって濃縮し、再度アフィニティーカラムを通す工程を複数回繰り返すことによって、さらに純度を高めることが可能である。 The produced fusion protein can be purified according to a known method. For example, the host is suspended in a buffer solution and destroyed by a method such as ultrasonic disruption. Subsequently, when a purification tag is fused to the fusion protein, first, the affinity protein having a specific affinity for the purification tag is passed through, and the fusion protein adsorbed on the column is eluted with a buffer solution. Can be purified by. It is possible to further increase the purity by concentrating the obtained fusion protein solution by centrifugation or the like and repeating the step of passing through the affinity column a plurality of times.
特に本発明の融合タンパク質を医薬として用いる場合には、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましいところ、本発明の融合タンパク質が精製用タグを含む場合、このような純度を容易に達成することができる。 In particular, when the fusion protein of the present invention is used as a pharmaceutical, it is preferable to use a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more. Such purity can be easily achieved when the fusion protein of the present invention contains a purification tag.
精製用タグにポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）を用いる場合、発現タンパク質を封入体として発現させ、アフィニティーカラムに通す前に、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、界面活性剤で処理することも好ましい。変性して精製した融合タンパク質は、リフォールディングすることによって、適切に機能を発揮させることができる。リフォールディングは、例えば、過剰量のアルギニンを含む緩衝液で希釈することや同緩衝液での透析によって行うことができる。 When polyhistidine (His6) is used for the purification tag, it is also preferred that the expressed protein is expressed as inclusion bodies and treated with a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride or a surfactant before passing through the affinity column. The denatured and purified fusion protein can appropriately function by refolding. The refolding can be performed, for example, by diluting with a buffer containing an excessive amount of arginine or by dialysis with the same buffer.
本発明の医薬組成物は、本発明の融合タンパク質を含む。 The pharmaceutical composition of the present invention comprises the fusion protein of the present invention.
本発明の融合タンパク質は、細胞膜透過性及び核内移行性を有するので、本発明の医薬組成物を、分化能を失った白血病細胞に投与すると、分化能が回復され、増殖が抑制される。従って、急性前骨髄性白血病の予防又は治療薬として、特に、レチノイン酸レセプターの機能障害が顕著な患者において有用である。本発明の融合タンパク質は、もともと生体内に存在するタンパク質なので、生体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性も低いことが予想される。 Since the fusion protein of the present invention has cell membrane permeability and nuclear translocation, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered to leukemia cells that have lost differentiation ability, differentiation ability is recovered and proliferation is suppressed. Therefore, it is useful as a prophylactic or therapeutic agent for acute promyelocytic leukemia, particularly in patients with significant dysfunction of retinoic acid receptor. Since the fusion protein of the present invention is originally a protein present in the living body, it is expected that the possibility of exhibiting side effects or antigenicity is low even when administered in vivo.
本発明の医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤化される。このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by using ordinary fillers, fillers, binders, moistening agents, disintegrating agents, surfactants, lubricants and other diluents or excipients. Formulated in the form of a composition. Examples of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections, and the like.
医薬組成物中に含有される本発明の融合タンパク質の量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の融合タンパク質を１〜７０重量％含有させるのが好ましい。本発明の融合タンパク質を有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。 The amount of the fusion protein of the present invention contained in the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range. Usually, the amount of the fusion protein of the present invention in the pharmaceutical composition is 1 to 70 wt. % Content is preferable. The pharmaceutical composition containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient can further contain other active ingredients, or can be used in combination with a pharmaceutical composition containing other active ingredients.
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。 There is no restriction | limiting in particular as the administration method of the pharmaceutical composition based on this invention, It administers by the method according to various formulation forms, patient's age, sex, disease state, and other conditions. Examples of the administration method in the case of tablets, pills, liquids, suspensions, emulsions, granules and capsules include oral administration. In the case of an injection, it can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally alone or mixed with a normal fluid such as glucose or amino acid. In the case of a suppository, it is administered intrarectally.
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、経口投与する場合、通常、成人（６０ｋｇ）に対し、１回あたり、本発明の融合タンパク質を約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。また、注射剤として投与する場合、成人（６０ｋｇ）に対し、１回当たり、本発明の融合タンパク質を約０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ投与する。 The dosage of the above pharmaceutical composition may be appropriately selected according to usage, patient age, sex, degree of disease, and other conditions. When administered orally, it is usually for an adult (60 kg) per dose. The fusion protein of the present invention is administered at about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered as an injection, the fusion protein of the present invention is about 0.1 mg to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per dose for an adult (60 kg). Administer 10 mg.
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回等の頻度で投与することができる。 The number of administrations of the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to the usage, patient age, sex, degree of disease, and other conditions. For example, once every two weeks, once a month, every two months It can be administered as frequently as once.
本発明は、従来行われてきたレチノイン酸の投与ではなく、レチノイン酸受容体αを投与することによって白血病細胞に分化能を与えるという新たな知見に基づくものであり、レチノイン酸受容体αの新規な用途を提供するものである。従って、本発明は、レチノイン酸受容体αを含む、急性前骨髄球性白血病の治療または予防薬も包含する。レチノイン酸受容体αは、白血病細胞内で機能してその分化を促進する限り、どのような形態で投与してもよい。 The present invention is based on the new finding that leukemia cells are differentiated by administering retinoic acid receptor α instead of the conventional administration of retinoic acid, and the novel retinoic acid receptor α Provide various uses. Accordingly, the present invention also encompasses a therapeutic or prophylactic agent for acute promyelocytic leukemia comprising retinoic acid receptor α. Retinoic acid receptor α may be administered in any form as long as it functions in leukemia cells and promotes its differentiation.
また、本発明は、白血病細胞を分化させる方法であって、白血病細胞にレチノイン酸受容体αを投与することを含む方法も提供する。本方法においても、レチノイン酸受容体αは、白血病細胞内で機能してその分化を促進する限り、どのような形態で投与してもよい。また、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血病細胞を分化させる方法も、ｉｎ ｖｉｖｏで白血病細胞を分化させる方法も含む。 The present invention also provides a method for differentiating leukemia cells, comprising administering retinoic acid receptor α to leukemia cells. Also in this method, retinoic acid receptor α may be administered in any form as long as it functions in leukemia cells and promotes its differentiation. The method also includes a method for differentiating leukemia cells in vitro and a method for differentiating leukemia cells in vivo.
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
1. mouseRARα発現ベクターの構築
（概要）
本発明の発現ベクターとしてpET28a-HMNR、pET28a-HNRM、pET28a-HNR、pET28a-HMR及びpET28a-HRMを、比較例の融合タンパク質を発現させる発現ベクターとしてpET28a-HRを作製した。各発現ベクターの構成を表１に示す。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to these at all.
1. Construction of mouseRARα expression vector (outline)
PET28a-HMNR, pET28a-HNRM, pET28a-HNR, pET28a-HMR and pET28a-HRM were prepared as expression vectors of the present invention, and pET28a-HR was prepared as an expression vector for expressing the fusion protein of the comparative example. The structure of each expression vector is shown in Table 1.
1.1 MTMタグのクローニング
pET28aプラスミド(Novagen社)に、MTM(Membran Translocating Motif)配列（Hawigerら、2005 Nature Medicine vol.11 No.(8):892-8.報告の配列；配列番号：１３）をコードするオリゴDNAを組み込んだ。
1.1 Cloning of MTM tags
Oligo DNA encoding the MTM (Membran Translocating Motif) sequence (Hawiger et al., 2005 Nature Medicine vol.11 No. (8): 892-8. reported sequence; SEQ ID NO: 13) was added to the pET28a plasmid (Novagen). Incorporated.
RARαのN末端側にMTMタグを融合するための発現ベクター（pET28a-HMR及びpET28a-HMNR）の作製用に、NdeI-BamHIサイトに組み込めるようにMTMをコードする以下のオリゴDNAを合成し(SIGMA社)、アニーリング後ライゲーションした。得られたプラスミドを以下「pET28a(H/MTM/MCS)」と呼ぶ。
5’-TATG GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC G-3’（配列番号：１８）
5’-GATCC GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC CA-3’（配列番号：１９）
For the preparation of expression vectors (pET28a-HMR and pET28a-HMNR) for fusing the MTM tag to the N-terminal side of RARα, the following oligo DNA encoding MTM was synthesized so that it could be incorporated into the NdeI-BamHI site (SIGMA ) And ligated after annealing. The obtained plasmid is hereinafter referred to as “pET28a (H / MTM / MCS)”.
5'-TATG GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC G-3 '(SEQ ID NO: 18)
5'-GATCC GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC CA-3 '(SEQ ID NO: 19)
また、RARαのC末端側にMTMタグを融合するための発現ベクター（pET28a-HRM及びpET28a-HNRM）の作製用に、NotI-XhoIサイトに組み込めるようにMTMをコードする以下のオリゴDNAを合成し(SIGMA社)、アニーリング後ライゲーションした。得られたプラスミドを以下「pET28a(H/MCS/MTM)」と呼ぶ。
5’-GGC CGC GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC TAA C-3’（配列番号：２０）
5’- TC GAG TTA GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC GC-3’（配列番号：２１）
In addition, for the preparation of expression vectors (pET28a-HRM and pET28a-HNRM) for fusing the MTM tag to the C-terminal side of RARα, the following oligo DNA encoding MTM was synthesized so that it could be incorporated into the NotI-XhoI site. (SIGMA), ligation after annealing. The obtained plasmid is hereinafter referred to as “pET28a (H / MCS / MTM)”.
5'-GGC CGC GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC TAA C-3 '(SEQ ID NO: 20)
5'-TC GAG TTA GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC GC-3 '(SEQ ID NO: 21)
なお、MCSはマルチクローニングサイトを意味し、この領域にはpET28aプラスミドの配列がそのまま残っている。
1.2 mRARαのクローニング
（概要）
RAW細胞(マウス)から抽出したRNAより、RT-PCRでmRARαのcDNAを得た。このcDNAを、pET28a(H/MTM/MCS)、pET28a(H/MCS/MTM)、及びMTMを組み込んでいないpET28aプラスミド（以下、「pET28a(H/MCS)」と呼ぶ）に組み込んだ。以下に各工程を詳細に説明する。
1.2.1 mRARαクローニング用primerの設計
mRARαのクローニングに用いたprimerは、NCBIのデータベース（BC010216）より得た全長塩基配列をもとに設計した。5’primerは、Tm値が74℃になるように、mRARαの5’末端側の24塩基の配列を用いた。5’末端には制限酵素BamHIの配列（GGATCC）を付け、その前に余剰な3塩基(ATA)を付加した。3’primerは、Tm値76℃になるように、mRARαの3’末端側の23塩基の配列を用いた。3’末端には制限酵素HindIIIの配列（AAGCTT）を付け、その前に余剰な3塩基(ATA)を付加した。
MCS means a multiple cloning site, and the sequence of the pET28a plasmid remains as it is in this region.
1.2 Cloning of mRARα (Overview)
From the RNA extracted from RAW cells (mouse), cDNA for mRARα was obtained by RT-PCR. This cDNA was incorporated into pET28a (H / MTM / MCS), pET28a (H / MCS / MTM), and a pET28a plasmid not incorporating MTM (hereinafter referred to as “pET28a (H / MCS)”). Each step will be described in detail below.
1.2.1 Design of mRARα cloning primer
The primer used for the cloning of mRARα was designed based on the full-length nucleotide sequence obtained from the NCBI database (BC010216). As the 5 ′ primer, a 24 base sequence on the 5 ′ end side of mRARα was used so that the Tm value was 74 ° C. A restriction enzyme BamHI sequence (GGATCC) was added to the 5 ′ end, and an extra 3 bases (ATA) were added before that. As the 3 ′ primer, a sequence of 23 bases on the 3 ′ end side of mRARα was used so that the Tm value was 76 ° C. The restriction enzyme HindIII sequence (AAGCTT) was added to the 3 ′ end, and an extra 3 bases (ATA) were added before that.
pET28a(H/MCS/MTM)に組み込むfragmentは、3’末端側のMTMにつなげるためにストップコドンをはずし、フレームを合わせる必要がある。そのため3’nonstop-primerとして、ストップコドンを除いて3’末端から23塩基を用い、一塩基(C)を付加したプライマーを作製した。primerの合成はSIGMA社に依頼した。
5’primer : ATAGGATCCATGGCCAGCAATAGCAGTTCCTGC （配列番号：２２）
3’primer : ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC （配列番号：２３）
3’nonstop-primer : ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG （配列番号：２４）
1.2.2 mRARαのクローニング
mouse total RNAを鋳型にして、RT-PCRでmRARαのcDNAを得た。primerは3’primerを用い、以下の反応系とPCRプログラムで反応を行った。RT-PCRはAccess RT-PCRsystem (Promega)を用いて行った。条件を下表に示す。
The fragment to be incorporated into pET28a (H / MCS / MTM) needs to remove the stop codon and match the frame in order to connect to the MTM on the 3 ′ end side. Therefore, a primer added with one base (C) was prepared as 3 ′ nonstop-primer using 23 bases from the 3 ′ end excluding the stop codon. The synthesis of primer was requested from SIGMA.
5'primer: ATAGGATCCATGGCCAGCAATAGCAGTTCCTGC (SEQ ID NO: 22)
3'primer: ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC (SEQ ID NO: 23)
3'nonstop-primer: ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG (SEQ ID NO: 24)
1.2.2 Cloning of mRARα
mRARα cDNA was obtained by RT-PCR using mouse total RNA as a template. The primer was 3'primer, and the reaction was performed with the following reaction system and PCR program. RT-PCR was performed using Access RT-PCRsystem (Promega). The conditions are shown in the table below.
1.2.3 mRARαfragmentのPCR増幅
RT産物を鋳型にして、mRARαfragmentのPCR増幅を行った。反応はPyrobest DNA polymerase (TaKaRa)を用いた。2回目のPCR反応では、pET28a(H/MTM/MCS)、pET28a(H/MCS)、pET28a(H/MCS/MTM)のそれぞれに挿入するために、3’stop-primerと3’nonstop-primerを用いた。2回目のPCR増幅後にアガロースゲル電気泳動を行い、fragmentの増幅を確認した所、非特異的なスメアバンドが多く見られたため、1400bp付近のバンドを切り出して精製し、再びPCR反応を行った。条件を下表に示す。
1.2.3 PCR amplification of mRARαfragment
PCR amplification of mRARαfragment was performed using the RT product as a template. Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa) was used for the reaction. In the second PCR reaction, 3'stop-primer and 3'nonstop-primer were inserted for insertion into pET28a (H / MTM / MCS), pET28a (H / MCS), and pET28a (H / MCS / MTM), respectively. Was used. After the second PCR amplification, agarose gel electrophoresis was performed and fragment amplification was confirmed. As a result, many non-specific smear bands were observed. Therefore, the band around 1400 bp was cut out and purified, and the PCR reaction was performed again. The conditions are shown in the table below.
1.2.4 mRARα、各種pET28aのDigestと断片の精製
増幅させたPCR産物は、制限酵素BamHIとHindIIIでdouble digestを行った。同時にpET28a(H/MTM/MCS、pET28a(H/MCS/MTM)、及びpET28a(H/MCS))も同じ制限酵素で消化した。制限酵素処理は以下の反応系で行い、37℃オーバーナイトで反応させた。制限酵素はFermentas社の製品を使用した。
1.2.4 Digest of mRARα and various pET28a and purification of fragments The amplified PCR products were double digested with restriction enzymes BamHI and HindIII. At the same time, pET28a (H / MTM / MCS, pET28a (H / MCS / MTM), and pET28a (H / MCS)) was digested with the same restriction enzymes. The restriction enzyme treatment was performed in the following reaction system, and the reaction was performed overnight at 37 ° C. The restriction enzyme used was a product from Fermentas.
1.2.5 アガロースゲルからのDNA抽出及び精製
制限酵素処理したサンプルを1.0％アガロース/1×TAEで電気泳動し、EtBrで染色し、トランスイルミネーター上でバンドの位置をカッターで切り出した。これをサンプルチューブに移し、QIAEX II gel extraction kit (Qiagen)を用いてcDNAの精製を行った。
1.2.5 DNA extraction and purification from agarose gel The restriction enzyme-treated sample was electrophoresed with 1.0% agarose / 1 × TAE, stained with EtBr, and the band position was cut out with a cutter on a transilluminator. This was transferred to a sample tube, and cDNA was purified using QIAEX II gel extraction kit (Qiagen).
700μlのQX1 BufferとQIAEXII（レジン）10μlを添加し、50℃ヒートブロックで10分間インキュベートし、ゲルを溶かしだした。2000rpm、R.T.1分で遠心分離を行って上清を捨て、QX1 300μlを添加した。50℃で10分間インキュベートし、2000rpm、R.T.1分で遠心分離を行って上清を捨てた。ここにPE Buffer 500μlを添加し、2000rpm、R.T.1分で遠心分離を行って上清を捨てた。再びPE Buffer 300μlを添加し、2000rpm、R.T.1分で遠心分離を行って上清を捨て、5分間風乾させた。次にH2Oを50μl添加し、50℃で5分間インキュベートし、溶出させた。2000rpm、R.T.1分で遠心分離し、上清を回収した。再びH2O 50μlを添加して溶出し、全量100μlとした。このサンプルのエタノール沈殿を行った。サンプルに10μlの3M酢酸ナトリウムと100％エタノール250μlを添加し、13000rpm、4℃、15分で遠心分離した。上清を除去し、70％エタノール 80μlを添加し、13000rpm、4℃、15分で遠心分離した。上清を除去し、風乾させ、38.75μlのH2Oに溶かした。PCR増幅３回目は、２回目と同じ反応系とPCRプログラムで行った。3回目PCR産物5μlを1.0％アガロース/1×TAEで電気泳動し、cDNAの増幅を確認した後に、上述のようにエタノール沈殿を行った。沈殿を風乾させた後、15μlのH2Oに溶かした。
1.2.6 mRARαと各種pET28aとのligation
制限酵素処理したmRARαとpET28a（pET28a(H/MTM/MCS)、pET28a(H/MCS/MTM)、及びpET28a(H/MCS)）の断片をligation反応で結合させた。反応にはLigation high (TOYOBO)を使用した。
stop-mRARαとpET28a(H/MTM/MCS)を結合させてpET28a-HMRを、
nonstop-mRARαとpET28a(H/MCS/MTM)を結合させてpET28a-HRMを、
stop-mRARαとpET28a(H/MCS)を結合させてpET28a-HRを、それぞれ作製した。
700 μl of QX1 Buffer and 10 μl of QIAEXII (resin) were added and incubated in a 50 ° C. heat block for 10 minutes to dissolve the gel. Centrifugation was performed at 2000 rpm and RT for 1 minute, the supernatant was discarded, and 300 μl of QX1 was added. The mixture was incubated at 50 ° C. for 10 minutes, centrifuged at 2000 rpm and RT for 1 minute, and the supernatant was discarded. To this, 500 μl of PE Buffer was added, centrifuged at 2000 rpm and RT for 1 minute, and the supernatant was discarded. Again, 300 μl of PE Buffer was added, centrifuged at 2000 rpm and RT for 1 minute, the supernatant was discarded, and air-dried for 5 minutes. Next, 50 μl of H 2 O was added and incubated at 50 ° C. for 5 minutes to elute. Centrifugation was performed at 2000 rpm and RT for 1 minute, and the supernatant was recovered. Again, 50 μl of H 2 O was added and eluted to make a total volume of 100 μl. This sample was ethanol precipitated. 10 μl of 3M sodium acetate and 250 μl of 100% ethanol were added to the sample and centrifuged at 13000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed, 80 μl of 70% ethanol was added, and centrifuged at 13000 rpm, 4 ° C., 15 minutes. The supernatant was removed, air-dried and dissolved in 38.75 μl H 2 O. The third PCR amplification was performed with the same reaction system and PCR program as the second. A third PCR product (5 μl) was electrophoresed with 1.0% agarose / 1 × TAE, and after confirming cDNA amplification, ethanol precipitation was performed as described above. The precipitate was air dried and then dissolved in 15 μl of H 2 O.
1.2.6 Ligation between mRARα and various pET28a
The restriction enzyme-treated mRARα and fragments of pET28a (pET28a (H / MTM / MCS), pET28a (H / MCS / MTM), and pET28a (H / MCS)) were ligated by a ligation reaction. Ligation high (TOYOBO) was used for the reaction.
pET28a-HMR by combining stop-mRARα and pET28a (H / MTM / MCS)
pET28a-HRM by combining nonstop-mRARα and pET28a (H / MCS / MTM)
pET28a-HR was prepared by combining stop-mRARα and pET28a (H / MCS).
それぞれの条件を下表に示す。 Each condition is shown in the table below.
1.2.7 Ligation反応液のトランスフォーメーション
ligationしたサンプルをコンピテントセルDH5α（TOYOBO）にトランスフォームした。DH5αを-80℃からゆっくりと解凍し、DH5α 70μlとligation反応液1μlを混合した。氷上に20分放置し、42℃30秒のヒートショックを与え、氷上で2分放置した。SOC培地500μlを添加し、37℃ 1時間 振盪培養器でインキュベートした。LB［Kanamycin(Kan)(30mg/l)］寒天培地に150μlを塗布し、37℃オーバーナイトで培養した。
1.2.8 大腸菌コロニーのスクリーニング
pET28aにmRARαのcDNAが挿入されているかを確かめるため、コロニーPCRと制限酵素による確認を行った。
i) コロニーPCR
TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)を用いてコロニーPCRを行った。5’primerはpET28a T7promoter領域のprimerを使用し、3’primerには、pET28a-HMR及びpET28a-HRではmRARα reverse-stop、pET28a-HRMではmRARα reverse-nonstopを使用した。以下のように反応系を調整し、プレート上のコロニーの一部を植菌した。下表に示すPCRプログラムでPCR増幅させ、1.0％アガロース/1xTAEで電気泳動し、増幅を確認した。
5’primer T7 promoter : CGCGAAATTAATACGACTCACTATA（配列番号：２５）
3’primer mRARα reverse-stop : ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC（配列番号：２６）
3’primer mRARα reverse-nonstop : ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG（配列番号：２７）
1.2.7 Transformation of Ligation reaction solution
The ligated sample was transformed into competent cell DH5α (TOYOBO). DH5α was thawed slowly from −80 ° C., and 70 μl of DH5α and 1 μl of ligation reaction solution were mixed. The plate was left on ice for 20 minutes, subjected to a heat shock of 42 ° C. for 30 seconds, and left on ice for 2 minutes. 500 μl of SOC medium was added and incubated in a shaking incubator at 37 ° C. for 1 hour. 150 μl of LB [Kanamycin (Kan) (30 mg / l)] agar medium was applied and cultured at 37 ° C. overnight.
1.2.8 E. coli colony screening
In order to confirm whether the cDNA of mRARα was inserted into pET28a, confirmation by colony PCR and restriction enzyme was performed.
i) Colony PCR
Colony PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (TaKaRa). The 5'primer used a pET28a T7promoter region primer, the 3'primer used pET28a-HMR and pET28a-HR, mRARα reverse-stop, and pET28a-HRM used mRARα reverse-nonstop. The reaction system was adjusted as follows, and a part of the colonies on the plate was inoculated. PCR amplification was performed using the PCR program shown in the table below, and electrophoresis was performed with 1.0% agarose / 1xTAE to confirm amplification.
5'primer T7 promoter: CGCGAAATTAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 25)
3'primer mRARα reverse-stop: ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC (SEQ ID NO: 26)
3'primer mRARα reverse-nonstop: ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG (SEQ ID NO: 27)
ii)制限酵素によるmRARα配列挿入の確認
プラスミドの増幅をおこなうために、ミニプレップ（アルカリSDS法）を行った。QIAGEN社のMaxi kitで以下のように行った。コロニーの菌をTB［Kanamycin(Kan)(30mg/l)］6mlに植菌し、37℃オーバーナイトで培養した。6000rpm 4℃ 2分で遠心分離し、菌体を回収した。P1 Solution 150μlを添加してvortexし、菌体を再懸濁した。次にP2 Solution 150μlを加えてゆっくり撹拌し、P3 Solutionを加えて中和させた。これに450μlのフェノール・クロロホルムを添加し、13000rpm、20℃で5分遠心分離した。上清を別の新しいチューブに移し、100％エタノール 1mlを添加して-30℃に30分置いた。13000rpm、4℃で15分遠心分離し、上清を除去した後、70％エタノール 300μlを添加した。13000rpm、4℃で1分遠心分離し、上清を除去して風乾させ、RNase(10μg/ml RNase/TE)を加え、37℃で30分インキュベートした。このサンプルをエタノール沈殿し、digestionに用いた。サンプルにTE buffer 350μl、3M酢酸ナトリウム40μl、100％エタノール 1mlを添加し、13000rpm、4℃で15分遠心分離した。上清を除去した後、70％エタノール 300μlを添加した。13000rpm、4℃で5分遠心分離し、上清を除去して風乾させ、20μlのH2Oに溶かした。このサンプルを制限酵素BamHI、HindIIIでdouble digestし、1.0％アガロース/1×TAEで電気泳動して、cDNAの増幅を確認した。制限酵素はFermentas社の製品を使用した。
ii) Confirmation of insertion of mRARα sequence by restriction enzyme In order to amplify the plasmid, miniprep (alkaline SDS method) was performed. The QIAGEN Maxi kit was used as follows. Colony bacteria were inoculated into 6 ml of TB [Kanamycin (Kan) (30 mg / l)] and cultured overnight at 37 ° C. Centrifugation was performed at 6000 rpm 4 ° C. for 2 minutes to recover the cells. 150 μl of P1 Solution was added and vortexed to resuspend the cells. Next, 150 μl of P2 Solution was added and stirred slowly, and P3 Solution was added to neutralize. 450 μl of phenol / chloroform was added thereto, and the mixture was centrifuged at 13000 rpm and 20 ° C. for 5 minutes. The supernatant was transferred to another new tube, 1 ml of 100% ethanol was added and placed at -30 ° C for 30 minutes. After centrifuging at 13000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes and removing the supernatant, 300 μl of 70% ethanol was added. Centrifugation was performed at 13000 rpm and 4 ° C. for 1 minute, the supernatant was removed and air-dried, RNase (10 μg / ml RNase / TE) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. This sample was ethanol precipitated and used for digestion. To the sample, 350 μl of TE buffer, 40 μl of 3M sodium acetate and 1 ml of 100% ethanol were added and centrifuged at 13000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. After removing the supernatant, 300 μl of 70% ethanol was added. Centrifugation was performed at 13000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, the supernatant was removed, air-dried, and dissolved in 20 μl of H 2 O. This sample was double digested with restriction enzymes BamHI and HindIII, and electrophoresed with 1.0% agarose / 1 × TAE to confirm cDNA amplification. The restriction enzyme used was a product from Fermentas.
電気泳動で、cDNAの増幅を確認できたサンプルをシークエンスに用いるために、Polyethylene Glycol沈殿を行ってRNA分子を取り除いた。50μlのPEG溶液（13％ PEG 8000/1.6M NaCl）を添加し、13000rpm、4℃で15分遠心分離した。上清を除去した後、70％エタノール 600μlを添加した。13000rpm、4℃で5分遠心分離し、上清を除去して風乾させ、10μlのH2Oに溶かした。
1.2.9 発現プラスミドのDNA塩基配列解析
Big Dye Terminator v1.1 Cycle sequencing kitを用いてシークエンス用PCRを行った。Primer はSIGMA社の合成オリゴ（50μM）を希釈し、以下の反応系とPCRプログラムで反応させた。primer T7 promoterとT7 terminatorはPCRのアニーリング温度を60℃で行い、primer mRARαは63℃で行った。
5’primer T7 promoter : CGCGAAATTAATACGACTCACTATA（配列番号：２８）
3’primer T7 terminator : GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGG（配列番号：２９）
5’primer mRARαforward : ATAGGATCCATGGCCAGCAATAGCAGTTCCTGC（配列番号：３０）
3’primer mRARα reverse-stop : ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC（配列番号：３１）
3’primer mRARα reverse-nonstop : ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG（配列番号：３２）
In order to use a sample in which cDNA amplification was confirmed by electrophoresis, a polyethylene glycol precipitation was performed to remove RNA molecules. 50 μl of PEG solution (13% PEG 8000 / 1.6M NaCl) was added and centrifuged at 13000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. After removing the supernatant, 600 μl of 70% ethanol was added. Centrifugation was performed at 13000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, the supernatant was removed, air-dried, and dissolved in 10 μl of H 2 O.
1.2.9 DNA sequence analysis of expression plasmid
Sequencing PCR was performed using the Big Dye Terminator v1.1 Cycle sequencing kit. Primer diluted SIGMA's synthetic oligo (50 μM) and reacted with the following reaction system using the PCR program. Primer T7 promoter and T7 terminator were PCR annealed at 60 ° C and primer mRARα was 63 ° C.
5'primer T7 promoter: CGCGAAATTAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 28)
3'primer T7 terminator: GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 29)
5'primer mRARαforward: ATAGGATCCATGGCCAGCAATAGCAGTTCCTGC (SEQ ID NO: 30)
3'primer mRARα reverse-stop: ATAAAGCTTTCATGGGGATTGGGTGGCTGGGC (SEQ ID NO: 31)
3'primer mRARα reverse-nonstop: ATAAAGCTTCTGGGGATTGGGTGGCTGGGCTG (SEQ ID NO: 32)
PCR反応後のサンプルは1.5mlチューブに移し、エタノール沈殿を行った。サンプルに3M酢酸ナトリウム 2μl、100%エタノール 50μlを添加し、暗所室温で15分置いた。13000rpm、4℃で15分遠心分離し、上清を除去した後、70％エタノール 50μlを添加した。13000rpm、4℃で5分遠心分離し、上清を除去して暗所で風乾させた。Hi-Dyホルムアミド20μlを加えてボルテックスをかけ、95℃で2分煮沸し、ただちに氷水につけた。これをABI PRISM 310 Genetic analyzer専用のサンプルチューブに移した。シークエンサーはABI PRISM 310 Genetic analyzer (Applied biosystems)を用いて、ロングキャピラリーで140分解析した。解析したシークエンスデータはDNASISを用いてNCBIデータベースの配列とマッチングさせ、mRARαの配列が正しいことを確認した。また、制限酵素の配列も正しくライゲーションされたことも確認した。
1.3 NLS（核移行シグナル）の融合
核移行シグナルのアミノ酸配列(PKKKRKV；配列番号：９)は下記合成オリゴDNAにより(SIGMA社)、pET28a-HMR、pET28a-HRM、pET28a-HRのいずれにも BamHI-EcoRIサイトで挿入した。
5’-GATCC CCA AAG AAG AAG CGT AAG GGT G-3’（配列番号：３３）
5’-AATTC AAC CTT ACG CTT CTT CTT TGG G-3’（配列番号：３４）
pET28a-HNR、pET28a-HMNR作製のために、一度、pET28a-HMRのBamHI、HindIIIサイトでmRARα cDNAを切り出し、pUC19（TAKARA）にligationした。さらに、pUC19-mRARαのEcoRI、HindIIIサイトでmRARα cDNAを切り出し、pET28a-NLS-MCS、pET28a-MTM-NLS-MCSの同じサイトに挿入した。
The sample after the PCR reaction was transferred to a 1.5 ml tube and ethanol precipitation was performed. To the sample, 2 μl of 3M sodium acetate and 50 μl of 100% ethanol were added and left at room temperature in the dark for 15 minutes. After centrifugation at 13000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes and removing the supernatant, 50 μl of 70% ethanol was added. Centrifugation was performed at 13000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was removed and air-dried in the dark. 20 μl of Hi-Dy formamide was added, vortexed, boiled at 95 ° C. for 2 minutes, and immediately immersed in ice water. This was transferred to a sample tube dedicated to the ABI PRISM 310 Genetic analyzer. The sequencer was analyzed with a long capillary using an ABI PRISM 310 Genetic analyzer (Applied biosystems) for 140 minutes. The analyzed sequence data was matched with the sequence of NCBI database using DNASIS to confirm that the sequence of mRARα was correct. It was also confirmed that the restriction enzyme sequence was correctly ligated.
1.3 Fusion of NLS (nuclear translocation signal) The amino acid sequence of the nuclear translocation signal (PKKKRKV; SEQ ID NO: 9) is obtained from the following synthetic oligo DNA (SIGMA), BamHI for any of pET28a-HMR, pET28a-HRM, and pET28a-HR. -Inserted at EcoRI site.
5'-GATCC CCA AAG AAG AAG CGT AAG GGT G-3 '(SEQ ID NO: 33)
5'-AATTC AAC CTT ACG CTT CTT CTT TGG G-3 '(SEQ ID NO: 34)
For preparation of pET28a-HNR and pET28a-HMNR, mRARα cDNA was cut out once at the BamHI and HindIII sites of pET28a-HMR and ligated to pUC19 (TAKARA). Furthermore, mRARα cDNA was cut out at the EcoRI and HindIII sites of pUC19-mRARα and inserted into the same sites of pET28a-NLS-MCS and pET28a-MTM-NLS-MCS.
pET28a-HNRM作製のために、pET28a-HRMのBamHI、HindIIIサイトでmRARαcDNAを切り出し、pUC19（TAKARA）にligationした。さらに、pUC19-mRARαのEcoRI、HindIIIサイトでmRARαを切り出し、pET28a-NLS-MCS-MTMの同じサイトに挿入した。
2.発現
作製した6種類の発現ベクター（pET28a-HMR、pET28a-HRM、pET28a-HR、pET28a-HMNR、pET28a-HNRM、及びpET28a-HNR）をE.coli(BL21) DE3（Novagen）にトランスフォームした。LB［Kanamycin(Kan)(30ｍg/ml)］液体培地で37℃にてO.D.600値0.4まで培養して、0.1mM IPTGでmRARαタンパク質の発現誘導を行った。3時間37℃で振盪培養した後に菌体を回収した。
For preparation of pET28a-HNRM, mRARα cDNA was excised at the BamHI and HindIII sites of pET28a-HRM and ligated to pUC19 (TAKARA). Furthermore, mRARα was excised at the EcoRI and HindIII sites of pUC19-mRARα and inserted into the same site of pET28a-NLS-MCS-MTM.
2. Expression Transform the 6 types of expression vectors (pET28a-HMR, pET28a-HRM, pET28a-HR, pET28a-HMNR, pET28a-HNRM, and pET28a-HNR) into E. coli (BL21) DE3 (Novagen) did. The culture was cultured in LB [Kanamycin (Kan) (30 mg / ml)] liquid medium at 37 ° C. to an OD600 value of 0.4, and expression of mRARα protein was induced with 0.1 mM IPTG. The cells were collected after shaking culture at 37 ° C. for 3 hours.
発現させた6種類の融合タンパク質の模式図を図１に示す。MTMもNLSも含まないHRは比較例とする。
3.精製
菌体をTris-HCl Buffer (20mM Tris HCl[pH7.5], 150mM NaCl, 0.1mM PMSF, 0.1% triton-X 100)に溶解し、超音波破砕した。不溶性画分から得た封入体タンパク質をグアニジン塩酸含有リン酸Buffer（6M guanidine、20mMSodium Phosphate、500mM NaCl [pH7.8]）で変性させ、室温でオーバーナイトインキュベーションして可溶化させた。10000G、4℃で10分遠心分離し、上清をHisタグ特異的なNi NTA Agarose(Invitrogen)に結合させた。8M Urea / リン酸Buffer(8M Urea、20mMSodium Phosphate、500mM NaCl、pH7.8)で4回Washし、このBufferのpHを6.0に下げたものでさらに4回Washし、非特異的に結合するタンパクを取り除いた。700G、4℃で1分遠心分離し、沈殿にイミダゾール含有8M Urea / リン酸Buffer（500mM Imidazole、8M Urea、20mMSodium Phosphate、１M NaCl[pH7.8]）1〜5ml/1L Cultureを添加し、室温で1時間反応させ、レジンからタンパク質を溶出した。700G、4℃で1分遠心分離し、上清を回収した。この操作を３回行った。溶出サンプルはSDS-PAGEで電気泳動し、CBB染色してバンドの濃さからタンパク質濃度を算出した。電気泳動の結果を図２に示す。これをもとにAmicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000(Millipore)を用いて2mg/mlまで濃縮した。
4.リフォールディング
2mg/mlまで濃縮した溶出サンプルに、アルギニンBuffer（１Ｍ L-Arginine、50mM Sodium diphosphate、2mMDTT、0.2mM ZnCl2）を100μg/mlになるように添加し、透析膜（Viskase Companies）の中に入れた。タッパーに、透析膜内の10倍の容量のアルギニンBufferを満たして、ここに透析膜サンプルを浮かべ、15℃でオーバーナイト置いた。その後、Tris-HCl Buffer（20mM Tris-HCl[pH7.5])、150mM NaCl、0.1mM PMSF、2mM DTT、20% Glycerol、 0.2mM ZnCl2）で2時間おきに6回交換した（6回目オーバーナイト）。10000G、4℃で10分遠心分離し、上清を-80℃で凍結保存した。1L Cultureあたりの産生量を表２２に示す。
A schematic diagram of the six types of fusion proteins expressed is shown in FIG. HR without MTM or NLS is a comparative example.
3. Purification The cells were dissolved in Tris-HCl Buffer (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.1 mM PMSF, 0.1% triton-X 100) and sonicated. The inclusion body protein obtained from the insoluble fraction was denatured with guanidine hydrochloride-containing phosphate buffer (6M guanidine, 20 mM NaCl Phosphate, 500 mM NaCl [pH 7.8]) and solubilized by overnight incubation at room temperature. Centrifugation was performed at 10000 G at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was bound to His tag-specific Ni NTA Agarose (Invitrogen). Wash 4 times with 8M Urea / Phosphate Buffer (8M Urea, 20mMSodium Phosphate, 500mM NaCl, pH 7.8), and then wash this buffer 4 times with the pH of this buffer lowered to 6.0. Removed. Centrifuge at 700G for 1 minute at 4 ° C, and add 1-5ml / 1L Culture of imidazole-containing 8M Urea / phosphate buffer (500mM Imidazole, 8M Urea, 20mM Sodium Phosphate, 1M NaCl [pH7.8]) to room temperature For 1 hour to elute the protein from the resin. Centrifugation was performed at 700 G at 4 ° C. for 1 minute, and the supernatant was collected. This operation was performed three times. The eluted sample was electrophoresed by SDS-PAGE, stained with CBB, and the protein concentration was calculated from the intensity of the band. The result of electrophoresis is shown in FIG. Based on this, it concentrated to 2 mg / ml using Amicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000 (Millipore).
4. Refolding
Arginine Buffer (1M L-Arginine, 50mM Sodium diphosphate, 2mMDTT, 0.2mM ZnCl2) was added to the elution sample concentrated to 2mg / ml to 100μg / ml and placed in a dialysis membrane (Viskase Companies). . The tapper was filled with 10 times the volume of arginine buffer in the dialysis membrane, and the dialysis membrane sample was floated here and placed at 15 ° C. overnight. After that, it was changed 6 times every 2 hours with Tris-HCl Buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5]), 150 mM NaCl, 0.1 mM PMSF, 2 mM DTT, 20% Glycerol, 0.2 mM ZnCl2 (6th overnight). ). Centrifugation was performed at 10000 G at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was stored frozen at −80 ° C. Table 22 shows the production amount per 1 L Culture.
タンパク質は、使用時にAmicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000(Millipore)を用いて、10倍量のPBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, 1mM EDTA[pH8.0])で3回置き換え、SDS-PAGEで濃度を測定して細胞に添加した。 The protein is 3 times with PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 1 mM EDTA [pH 8.0]) using Amicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000 (Millipore) at the time of use. The concentration was measured by SDS-PAGE and added to the cells.
5.ゲルシフトアッセイ
（RXRαタンパク質精製）
ｍRARαはmRXRαとヘテロ二量体を形成して特異的DNA配列に結合するため、GST-mRXRαΔAB／pGEXベクターからmRXRαのタンパク質発現、精製を行った。E.coli(BL21)にGST-mRXRαΔAB／pGEXベクターをトランスフォームし、LB［Ampicillin (Amp)(50mg /l)］液体培地で培養して、0.1mM IPTGでGST-mRXRαタンパク質の発現誘導を行った。
5. Gel shift assay (RXRα protein purification)
Since mRARα forms a heterodimer with mRXRα and binds to a specific DNA sequence, mRXRα protein was expressed and purified from the GST-mRXRαΔAB / pGEX vector. E. coli (BL21) was transformed with GST-mRXRαΔAB / pGEX vector, cultured in LB [Ampicillin (Amp) (50 mg / l)] liquid medium, and GST-mRXRα protein expression was induced with 0.1 mM IPTG. It was.
30℃で3時間培養後、菌体を1×PBS(10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4 [pH7.3], 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10%グリセロール, 1mM DTT, 0.5mM PMSF)で溶解して超音波破砕し、可溶性画分から得たタンパク質をGlutathione-Sepharose 4B（GEヘルスケア）レジンに結合させ、1xPBSでwashを行った。その後、Thrombin(GEヘルスケア)でGSTとの連結部位の消化を行い、GSTを除去した。
（Cy5標識プローブの調整）
Cy5標識したDR5配列5’-Cy5-GTACAGGGTAGGGTTCACCGAAAGTTCACTC-3’（配列番号：３５）とこれの対称の配列5’-TCGAGAGTGAACTTTCGGTGAACCCTACCCT-3’(Cy5標識なし；（配列番号：３６）)と、Mutation-DR5配列5’-Cy5-GTACAGGGTAGGGAACACCGAAAGAACACTC-3’ （配列番号：３７）と対称の配列5’-TCGAGAGTGTTCTTTCGGTGTTCCCTACCCT-3’（配列番号：３８）の合成を、SIGMA社に依頼した。
After culturing at 30 ° C for 3 hours, the cells are lysed with 1 × PBS (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 [pH 7.3], 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF). The protein obtained from the sonication and soluble fraction was bound to Glutathione-Sepharose 4B (GE Healthcare) resin and washed with 1 × PBS. Thereafter, the GST-linked site was digested with Thrombin (GE Healthcare) to remove GST.
(Cy5 labeled probe adjustment)
Cy5-labeled DR5 sequence 5'-Cy5-GTACAGGGTAGGGTTCACCGAAAGTTCACTC-3 '(SEQ ID NO: 35) and its symmetrical sequence 5'-TCGAGAGTGAACTTTCGGTGAACCCTACCCT-3' (Cy5 unlabeled; (SEQ ID NO: 36)) and Mutation-DR5 SIGMA was requested to synthesize the sequence 5′-Cy5-GTACAGGGTAGGGAACACCGAAAGAACACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 37) and the symmetric sequence 5′-TCGAGAGTGTTCTTTCGGTGTTCCCTACCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 38).
50pmolのオリゴ各10μlとTNE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.1mM NaCl[pH8.0])80μlを混合し、沸騰させた鍋に入れ、火を消して2時間置いてアニーリングさせた。TNE bufferで50fMに希釈して実験に用いた。
（オリゴヌクレオチド-タンパク質複合体の形成）
Binding Buffer(10mM HEPES pH8.0, 18% glycerol, 50mM DTT, 0.05% NP-40, 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 10μg / ml poly dI-dC, 0.1 mg / ml BSA)に、精製したmRARα融合タンパク質、mRXRα各30ngを添加し、室温で15分間反応させた。ここに50fmolのDR5を添加し、室温で15分間反応させた。反応は全量10μlの系で行った。ここに6xLoading dye を2μl添加し、サンプル化した。反応後、4%非変性ポリアクリルアミドゲル(4％アクリルアミド, 0.5×TBE)を用い、100Vで35分間泳動し、Cy5の発光強度をTyphoonで検出した。
50 μmol of each oligo (10 μl) and TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM NaCl [pH 8.0]) 80 μl were mixed, put into a boiling pan, put out the fire and left for 2 hours for annealing. It diluted to 50 fM with TNE buffer and used for experiment.
(Formation of oligonucleotide-protein complex)
Purified mRARα fusion protein in Binding Buffer (10 mM HEPES pH 8.0, 18% glycerol, 50 mM DTT, 0.05% NP-40, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 μg / ml poly dI-dC, 0.1 mg / ml BSA) 30 ml each of mRXRα was added and allowed to react at room temperature for 15 minutes. 50 fmol DR5 was added here, and it was made to react at room temperature for 15 minutes. The reaction was carried out in a system with a total volume of 10 μl. Here, 2 μl of 6 × Loading dye was added and sampled. After the reaction, 4% non-denaturing polyacrylamide gel (4% acrylamide, 0.5 × TBE) was used and electrophoresed for 35 minutes at 100 V, and the luminescence intensity of Cy5 was detected with Typhoon.
結果を図３に示す。図示されるとおり、レーン4では分子量が増加し、実施例及び比較例の融合タンパク質（RARα‐MTM）とRXRαとが二量体をなし、かつ、DR5を特異的に認識して結合することが示された。
6.細胞導入
（融合タンパク質のFITC標識）
EZ-label FITC protein labeling kit(PIERCE)を用いて、融合タンパク質のFITC標識を行った。リフォールディングした融合タンパク質を、Amicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000(Millipore)を用いてPBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4 [pH8.0])にbufferを置き換えた。FITC 1mgに対して100μlのDMFを添加し、これをmRARαサンプルに添加し、暗所室温で１時間反応させた。その後、Amicon ultraを用いてPBSへの置き換え、13000rpm、4℃で5分遠心分離し、上清をFITCラベリングサンプルとした。
（FITC標識タンパク質の細胞投与）
NB4細胞は、1×105細胞をPBSでwashし、終濃度0.25μMになるようにFITCで標識した融合タンパク質を添加した。HeLa細胞は、カバーガラス上で80％コンフルエントに達するまで培養し、PBSでwashして、終濃度0.1μMになるようにFITCで標識した融合タンパク質を添加した。タンパク質添加後、レチノイン酸10-6Mを添加し、37℃、5％CO2で1時間反応させた。反応後、PBS 200μlでwashし、proteinaseK（Wako）を反応させ、細胞膜表面に付着したタンパク質を取り除いた。PBS 200μlでwashし、4%パラホルムアルデヒド200μlを添加して室温で5分反応させ、細胞の固定を行った。再びPBS200μlでwashし、8μlのVECTASHIELD(VECTOR)を添加し、スライドガラス上で封入を行った。NB4細胞は浮遊系細胞であるため、これらの動作をサンプルチューブ内で、2000rpm R.T. 30秒で遠心分離しながら行い、VECTASHIELDを加えスライドガラス上で封入を行った。共焦点レーザー顕微鏡FV300(OLYMPUS)を用いてFITCの発光をレーザーで検出し、x60での画像を撮影した。
The results are shown in FIG. As shown in the figure, in Lane 4, the molecular weight increases, the fusion protein (RARα-MTM) of Example and Comparative Example and RXRα form a dimer, and DR5 is specifically recognized and bound. Indicated.
6. Cell transfer (FITC labeling of fusion protein)
The fusion protein was labeled with FITC using the EZ-label FITC protein labeling kit (PIERCE). The refolded fusion protein was replaced with PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4 [pH 8.0]) using Amicon ultra centrifugal filter device MWCO 10,000 (Millipore). 100 μl of DMF was added to 1 mg of FITC, which was added to the mRARα sample and allowed to react for 1 hour at room temperature in the dark. Then, it replaced with PBS using Amicon ultra, and centrifuged at 13000 rpm and 4 degreeC for 5 minutes, and let the supernatant be a FITC labeling sample.
(Cell administration of FITC-labeled protein)
For NB4 cells, 1 × 10 5 cells were washed with PBS, and a fusion protein labeled with FITC was added to a final concentration of 0.25 μM. HeLa cells were cultured on a cover glass until reaching 80% confluence, washed with PBS, and a fusion protein labeled with FITC to a final concentration of 0.1 μM was added. After protein addition, 10-6 M retinoic acid was added and reacted at 37 ° C., 5% CO 2 for 1 hour. After the reaction, the plate was washed with 200 μl of PBS and reacted with proteinase K (Wako) to remove the protein adhering to the cell membrane surface. The cells were washed with 200 μl of PBS, 200 μl of 4% paraformaldehyde was added and reacted at room temperature for 5 minutes to fix the cells. The plate was again washed with 200 μl of PBS, 8 μl of VECTASHIELD (VECTOR) was added, and the mixture was sealed on a slide glass. Since NB4 cells are floating cells, these operations were performed in a sample tube while centrifuging at 2000 rpm RT for 30 seconds, added with VECTASHIELD, and sealed on a slide glass. Using a confocal laser microscope FV300 (OLYMPUS), FITC emission was detected with a laser, and an image at x60 was taken.
結果を図４に示す。図示されるとおり、ほとんどの融合タンパク質が核内に移行していることが確認された。NLSを含まない融合タンパク質（HR、HMR、HRM）は、NLSを含む融合タンパク質（HNR、HMNR、HNRM）よりも全体的に核内への移行が弱く、特に、MTMも含まないHR（比較例）は移行が不十分であった。MTM及びNLSの両方を含む融合タンパク質（HMNR及びHNRM）は、核内への移行が特に良好であった。MTMを含まないHNRも十分に細胞導入可能であり、核移行も確認された。
7. Luciferase assay
（DR5-pGL3レポータープラスミドの作製）
5’-GATCTAGGGTAGGGTTCACCGAAAGTTCACTCCCCGGGTATAA-3’（配列番号：３９）とこれに対称の配列5’-AGCTTTATACCCGGGGAGTGAACTTTCGGTGAACCCTACCCTA-3’（配列番号：４０）を混合し、T4 Polynucleotide Kinaseを用いて37℃で30分間反応させて5’末端にリン酸基を添加した。その後、1分間煮沸し、温度を下げてアニーリングを行った。これを、XhoIとBglIIの制限酵素サイトで切断したpGL3-enhancer（Promega）とライゲーションし、レポータープラスミドを作製した。
The results are shown in FIG. As shown in the figure, it was confirmed that most of the fusion proteins were transferred into the nucleus. Fusion proteins that do not contain NLS (HR, HMR, HRM) are generally less translocated into the nucleus than fusion proteins that contain NLS (HNR, HMNR, HNRM), especially HR that does not contain MTM (comparative example) ) Was not fully migrated. Fusion proteins containing both MTM and NLS (HMNR and HNRM) performed particularly well into the nucleus. HNR without MTM could be introduced into cells sufficiently, and nuclear translocation was confirmed.
7. Luciferase assay
(Preparation of DR5-pGL3 reporter plasmid)
5'-GATCTAGGGTAGGGTTCACCGAAAGTTCACTCCCCGGGTATAA-3 '(SEQ ID NO: 39) and the symmetrical sequence 5'-AGCTTTATACCCGGGGAGTGAACTTTCGGTGAACCCTACCCTA-3' (SEQ ID NO: 40) are mixed and reacted at 37 ° C for 30 minutes using T4 Polynucleotide Kinase. A phosphate group was added to the 5 ′ end. Then, it boiled for 1 minute and annealed by reducing temperature. This was ligated with pGL3-enhancer (Promega) cleaved at the restriction enzyme sites of XhoI and BglII to prepare a reporter plasmid.
HEK293を24wellplateで二晩培養後、RARαの応答配列であるDR-5をホタルルシフェラーゼアッセイ用ベクターpGL3-enhancerにサブクローニングしたプラスミド、およびウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.74（Promega）をlipofectamin2000（invitrogen）によりco-transfectionを行った。12時間培養後、Amicon Ultra-15（Millipore）を用いてPBSに置換し、融合タンパク質を終濃度0.5μMになるよう添加した。12時間培養後、レチノイン酸を添加した。24時間培養後、Dual-luciferase reporter Assay System（Promega）およびveritasTM Microplate Luminometer（Promega）を用いてassayを行った。結果を図５に示す。いずれの融合タンパク質も、全トランス型レチノイン酸(ATRA)の添加により、細胞内で標的遺伝子の転写を活性化する機能を発揮できることが確認された。特にHNRとHNRMの転写活性化機能が高かった。以降の実験にはゲルシフトアッセイ活性も高いHNRMを使用した。
8. 細胞増殖
24well プレートに3.0x103個/400μlで白血病細胞であるNB4細胞及びNB4-R2細胞を播種し、レチノイン酸及び融合タンパク質HNRMを添加した。5% CO2、37℃の下、経日的にサンプルを回収した。測定は、CellTiter-Glo(Promega)を培養液と同量添加し、暗所で10分間インキュベート後、Veritas Microplate Luminometer(Promega)で測定した。
After overnight culture of HEK293 in a 24-well plate, a plasmid obtained by subcloning DR-5, which is a response element of RARα, into a firefly luciferase assay vector pGL3-enhancer, and a Renilla luciferase reporter vector pGL4.74 (Promega) using lipofectamin2000 (invitrogen) Co-transfection was performed. After culturing for 12 hours, PBS was substituted with Amicon Ultra-15 (Millipore), and the fusion protein was added to a final concentration of 0.5 μM. After culturing for 12 hours, retinoic acid was added. After culturing for 24 hours, assay was performed using Dual-luciferase reporter Assay System (Promega) and veritas ™ Microplate Luminometer (Promega). The results are shown in FIG. All of the fusion proteins were confirmed to be capable of exerting a function of activating transcription of the target gene in cells by adding all-trans retinoic acid (ATRA). In particular, the transcriptional activation function of HNR and HNRM was high. In subsequent experiments, HNRM having high gel shift assay activity was used.
8. Cell proliferation
NB4 cells and NB4-R2 cells, which are leukemia cells, were seeded at 3.0 × 10 3 cells / 400 μl in a 24-well plate, and retinoic acid and the fusion protein HNRM were added. Samples were collected daily under 5% CO2, 37 ° C. For measurement, CellTiter-Glo (Promega) was added in the same amount as the culture solution, incubated for 10 minutes in the dark, and then measured with a Veritas Microplate Luminometer (Promega).
結果を図６に示す。いずれもレチノイン酸単独では高濃度（10-6M）添加しなければ細胞の増殖を抑制できなかったが、融合タンパク質HNRMを添加した場合、レチノイン酸10-9Mでも十分に増殖を抑制した。特にレチノイン酸受容体に機能障害を有する細胞であるNB4-R2細胞においても、レチノイン酸10-6M条件下で融合タンパク質が機能して細胞増殖を抑制することが確認された。
9. ギムザ染色
形態学的変化の確認のため、ギムザ染色を行った。24well プレートに3.0x103個/400μlでNB4細胞及びNB4-R2細胞を播種し、レチノイン酸及び融合タンパク質HNRM又は比較例としてPBSを添加した。5% CO2、37℃の下5日間培養後、細胞を回収し、スライドグラスに塗抹した。5分間メタノールに浸し、細胞を固定した。風乾後1時間4% ギムザ液に浸し染色した。これを倒立型リサーチ顕微鏡（OLYMPUS）により観察した。
The results are shown in FIG. In either case, retinoic acid alone could not inhibit cell growth unless high concentration (10-6M) was added, but when the fusion protein HNRM was added, retinoic acid 10-9M sufficiently inhibited proliferation. In particular, also in NB4-R2 cells, which are dysfunctional retinoic acid receptors, it was confirmed that the fusion protein functions under retinoic acid 10-6M conditions and suppresses cell proliferation.
9. Giemsa staining Giemsa staining was performed to confirm morphological changes. NB4 cells and NB4-R2 cells were seeded on a 24-well plate at 3.0 × 10 3 cells / 400 μl, and retinoic acid and fusion protein HNRM or PBS as a comparative example was added. After culturing at 5% CO 2 and 37 ° C. for 5 days, the cells were collected and smeared on a slide glass. Cells were fixed by soaking in methanol for 5 minutes. After air-drying, the cells were stained in 4% Giemsa solution for 1 hour. This was observed with an inverted research microscope (OLYMPUS).
結果を図７に示す。全トランス型レチノイン酸（ATRA）及び融合タンパク質HNRMを添加すると、NB4細胞及びNB4-R2細胞のいずれも顆粒球に分化することが確認された（図７Ａ(iv)及びＢ（iii））。
10. NBT Assay
24well プレートに3.0x103個/400μlでNB4細胞及びNB4-R2細胞を播種し、レチノイン酸及び融合タンパク質HNRM又は比較例としてPBSを添加した。5% CO2 37℃の下3日間培養後、培地と同量のNBT solution (1mg/ml NBTをPBSに溶き、0.1μg/mlのPMA(phorbol myristate acetate)を添加したもの)を添加し、5% CO2、37℃の下1時間培養した。これを倒立型リサーチ顕微鏡（OLYMPUS）により観察し、300個の細胞をカウントし、ホルマザン沈澱を生じて青く染色されている細胞の割合を算出した。
The results are shown in FIG. When all-trans retinoic acid (ATRA) and fusion protein HNRM were added, it was confirmed that both NB4 cells and NB4-R2 cells differentiated into granulocytes (FIGS. 7A (iv) and B (iii)).
10. NBT Assay
NB4 cells and NB4-R2 cells were seeded on a 24-well plate at 3.0 × 10 3 cells / 400 μl, and retinoic acid and fusion protein HNRM or PBS as a comparative example was added. After culturing at 37% for 5% CO2 for 3 days, add the same amount of NBT solution (1mg / ml NBT dissolved in PBS and 0.1μg / ml PMA (phorbol myristate acetate)). The cells were cultured at% CO2, 37 ° C for 1 hour. This was observed with an inverted research microscope (OLYMPUS), 300 cells were counted, and the percentage of cells that had formed formazan precipitates and stained blue was calculated.
結果を図８に示す。融合タンパク質を添加すると、低濃度（10-9M）のレチノイン酸を添加しても、NB4細胞が、NBT還元能を有する顆粒球に分化することが確認された。また、レチノイン酸受容体機能障害を有するNB4-R2細胞も、高濃度（10-6M）のレチノイン酸とHNRMの添加により、好中球に分化することが確認された。
11. フローサイトメトリー
12well プレートに6.0x103個/800μlでNB4細胞及びNB4-R2細胞を播種し、レチノイン酸及び融合タンパク質HNRMを添加した。5% CO2、37℃の下5日間培養後、細胞をサンプルチューブに回収し、1000rpm、4℃で5分間の遠心分離して上清を除いた。これにPBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, 1mM EDTA, pH8.0)50μlに沈殿した細胞を溶解させた。細胞懸濁液を25μlずつに二分し、蛍光標識された抗体をそれぞれ添加した。一方はネガティブコントロールマウスIgG2a抗体、他方はヒトCD11b抗体各5μlと混合し、氷中暗所で30分間反応させた。1000rpm 4℃ 5分間の遠心分離で上清を除いた後、PBS 500μlで2回washを行った。上清を50μl残して除き、PBSで0.5％まで希釈した4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液500μlを添加し、細胞を固定した。セルストレーナー・キャップ付きチューブを用いて細胞を濾過し、フローサイトメーター BD FACSCalibur で細胞を取り込み、測定を行った。その後FlowJo (Flow Cytometry Analysis Software)で解析を行った。
The results are shown in FIG. When the fusion protein was added, it was confirmed that NB4 cells differentiated into granulocytes having NBT reducing ability even when a low concentration (10-9M) of retinoic acid was added. It was also confirmed that NB4-R2 cells having retinoic acid receptor dysfunction differentiated into neutrophils by the addition of high concentrations (10-6M) of retinoic acid and HNRM.
11. Flow cytometry
NB4 cells and NB4-R2 cells were seeded at 6.0 × 10 3 cells / 800 μl in a 12-well plate, and retinoic acid and the fusion protein HNRM were added. After culturing at 5% CO 2 and 37 ° C. for 5 days, the cells were collected in a sample tube and centrifuged at 1000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes to remove the supernatant. The cells precipitated in 50 μl of PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 1 mM EDTA, pH 8.0) were lysed. The cell suspension was divided into 25 μl aliquots, and each fluorescently labeled antibody was added. One was mixed with negative control mouse IgG2a antibody and the other was mixed with 5 μl each of human CD11b antibody, and reacted for 30 minutes in the dark in ice. The supernatant was removed by centrifugation at 1000 rpm 4 ° C. for 5 minutes, and then washed twice with 500 μl of PBS. The supernatant was removed except 50 μl, and 500 μl of 4% paraformaldehyde phosphate buffer diluted to 0.5% with PBS was added to fix the cells. The cells were filtered using a tube with a cell strainer cap, and the cells were taken in with a flow cytometer BD FACSCalibur for measurement. After that, it was analyzed with FlowJo (Flow Cytometry Analysis Software).
結果を図９に示す。NB4細胞、NB4-R2細胞のいずれにおいても、融合タンパク質HNRMを添加すると、好中球分化マーカーであるCD11bの発現が上昇することが確認された。 The results are shown in FIG. In both NB4 cells and NB4-R2 cells, it was confirmed that the expression of CD11b, which is a neutrophil differentiation marker, increased when the fusion protein HNRM was added.
配列番号：１は、本発明の融合タンパク質HMNRのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the fusion protein HMNR of the present invention.
配列番号：２は、本発明の融合タンパク質HNRMのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the fusion protein HNRM of the present invention.
配列番号：３は、本発明の融合タンパク質HNRのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the fusion protein HNR of the present invention.
配列番号：４は、本発明の融合タンパク質HMRのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the fusion protein HMR of the present invention.
配列番号：５は、本発明の融合タンパク質HRMのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the fusion protein HRM of the present invention.
配列番号：６は、RARαとレチノイドX受容体とのヘテロ二量体が、標的遺伝子において認識する塩基配列である。 SEQ ID NO: 6 is a nucleotide sequence recognized by a heterodimer of RARα and a retinoid X receptor in a target gene.
配列番号：７は、ヒトRARαのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of human RARα.
配列番号：８は、マウスRARαのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of mouse RARα.
配列番号：９は、NLSの一例であるSV40T抗原のアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of SV40T antigen, which is an example of NLS.
配列番号：１０は、NLSの一例であるc-mycのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of c-myc, which is an example of NLS.
配列番号：１１は、NLSの一例であるp53のアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of p53, which is an example of NLS.
配列番号：１２は、NLSの一例であるNF-κB p50のアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of NF-κB p50, which is an example of NLS.
配列番号：１３は、Hawigerらの文献によるMTMのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of MTM according to Hawiger et al.
配列番号：１４は、MTMの一例である11Rのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of 11R, which is an example of MTM.
配列番号：１５は、MTMの一例である9Rのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of 9R, which is an example of MTM.
配列番号：１６は、MTMの一例であるTatのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence of Tat, which is an example of MTM.
配列番号：１７は、MTMの一例であるTat2のアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 17 is the amino acid sequence of Tat2, which is an example of MTM.
配列番号：１８は、pET28aプラスミドのNdeI-BamHIサイトにMTMをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 18 is the base sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding MTM into the NdeI-BamHI site of pET28a plasmid.
配列番号：１９は、pET28aプラスミドのNdeI-BamHIサイトにMTMをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding MTM into the NdeI-BamHI site of the pET28a plasmid.
配列番号：２０は、pET28aプラスミドのNotI-XhoIサイトにMTMをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 20 is the base sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding MTM into the NotI-XhoI site of the pET28a plasmid.
配列番号：２１は、pET28aプラスミドのNotI-XhoIサイトにMTMをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 21 is the base sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding MTM into the NotI-XhoI site of pET28a plasmid.
配列番号：２２は、mRARαのクローニング用の5’-プライマーの塩基配列である。 SEQ ID NO: 22 is the base sequence of 5'-primer for cloning mRARα.
配列番号：２３は、mRARαのクローニング用の3’-プライマーの塩基配列である。 SEQ ID NO: 23 is the base sequence of 3′-primer for cloning of mRARα.
配列番号：２４は、mRARαのクローニング用の3’-ノンストッププライマーの塩基配列である。 SEQ ID NO: 24 is the base sequence of 3′-nonstop primer for cloning mRARα.
配列番号：２５は、pET28aにmRARαのcDNAが挿入されたことを確かめるためのコロニーPCR用5'-プライマーT7プロモーターの塩基配列である。 SEQ ID NO: 25 is the base sequence of 5′-primer T7 promoter for colony PCR for confirming that the cDNA of mRARα was inserted into pET28a.
配列番号：２６は、pET28aにmRARαのcDNAが挿入されたことを確かめるためのコロニーPCR用3'-プライマーmRARα reverse-stopの塩基配列である。 SEQ ID NO: 26 is the base sequence of the 3′-primer mRARα reverse-stop for colony PCR for confirming that the cDNA of mRARα was inserted into pET28a.
配列番号：２７は、pET28aにmRARαのcDNAが挿入されたことを確かめるためのコロニーPCR用3'-プライマーmRARα reverse-nonstopの塩基配列である。 SEQ ID NO: 27 is the base sequence of 3R-primer mRARα reverse-nonstop for colony PCR for confirming that the cDNA of mRARα was inserted into pET28a.
配列番号：２８は、発現ベクターのシークエンスPCR用5'-プライマー T7プロモーターの塩基配列である。 SEQ ID NO: 28 is the base sequence of 5′-primer T7 promoter for sequence PCR of expression vector.
配列番号：２９は、発現ベクターのシークエンスPCR用3'-プライマー T7ターミネーターの塩基配列である。 SEQ ID NO: 29 is the base sequence of 3′-primer T7 terminator for sequence PCR of expression vector.
配列番号：３０は、発現ベクターのシークエンスPCR用5'-プライマー mRARα forwardの塩基配列である。 SEQ ID NO: 30 is the base sequence of 5′-primer mRARα forward for sequence PCR of an expression vector.
配列番号：３１は、発現ベクターのシークエンスPCR用3'-プライマー mRARα reverse-stopの塩基配列である。 SEQ ID NO: 31 is the base sequence of 3′-primer mRARα reverse-stop for sequence PCR of expression vector.
配列番号：３２は、発現ベクターのシークエンスPCR用3'-プライマー mRARα reverse-nonstopの塩基配列である。 SEQ ID NO: 32 is the base sequence of 3′-primer mRARα reverse-nonstop for sequence PCR of expression vector.
配列番号：３３は、pET28aプラスミドのBamHI-EcoRIサイトにNLSをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 33 is the base sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding NLS into the BamHI-EcoRI site of the pET28a plasmid.
配列番号：３４は、pET28aプラスミドのBamHI-EcoRIサイトにNLSをコードするDNAを挿入するためのDNAフラグメントの塩基配列である。 SEQ ID NO: 34 is the base sequence of a DNA fragment for inserting DNA encoding NLS into the BamHI-EcoRI site of the pET28a plasmid.
配列番号：３５は、Cy5標識したDR5の塩基配列である。 SEQ ID NO: 35 is the base sequence of Cy5 labeled DR5.
配列番号：３６は、Cy5標識したDR5配列と相補的な配列である。 SEQ ID NO: 36 is a sequence complementary to a Cy5-labeled DR5 sequence.
配列番号：３７は、Cy5標識した変異DR5の塩基配列である。 SEQ ID NO: 37 is the base sequence of Cy5-labeled mutant DR5.
配列番号：３８は、Cy5標識した変異DR5の塩基配列と相補的な配列である。 SEQ ID NO: 38 is a sequence complementary to the base sequence of mutant DR5 labeled with Cy5.
配列番号：３９は、DR5-pGL3レポータープラスミド作製用フラグメントである。 SEQ ID NO: 39 is a fragment for preparing a DR5-pGL3 reporter plasmid.
配列番号：４０は、DR5-pGL3レポータープラスミド作製用フラグメントである。 SEQ ID NO: 40 is a fragment for preparing a DR5-pGL3 reporter plasmid.
Claims (9)
A transformant comprising the expression vector according to claim 8 .
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