JP5635779B2

JP5635779B2 - Ｓｔｘ毒性阻害ペプチドおよびＳｔｘに起因する疾患の治療薬

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Publication number: JP5635779B2
Application number: JP2010019728A
Authority: JP
Inventors: 西川　喜代孝; 喜代孝西川; 美帆高橋; 一恵津々木
Original assignee: Doshisha Co Ltd
Current assignee: Doshisha Co Ltd
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: JP2011079808A

Description

本発明は、Ｓｔｘ毒性阻害ペプチドに関するものである。

Shiga toxin (Ｓｔｘ)は、腸管出血性大腸菌が産生する主要な病原因子であり、消化管障害のみならず、その後の一連の微小血管障害である重症合併症〔たとえば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）〕などを引き起こすことが知られている。

さらに、Ｓｔｘは、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２の２つのファミリーから構成されることも知られている。

そして、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２は、いずれも、Ａ−Ｂ_５型の毒素で、Ｂサブユニットが細胞膜上の受容体、Ｇｂ_３（globotriaosylceramide:Ｇａｌα（1−4）−Ｇａｌβ（1−4）−Ｇｌｃβ1−Ｃｅｒａｍｉｄｅ）に結合することにより細胞内に取り込まれること、また、放射対称状に並んだＢサブユニットペンタマーはＧｂ３の糖鎖部（グロボ３糖：Ｇａｌα（１−４）−Ｇａｌβ（１−４）−Ｇｌｃβ１−）を特異的に認識すること、などが解明されるに伴って、Ｂサブユニットと受容体の結合を選択的に阻害する方法が注目され、様々な観点からの検討が進められてきた。

そして、この出願の発明者らは、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のＢサブユニットとグロボ３糖の結合にはクラスター効果が存在するとの知見から、多価型ペプチドライブラリーを利用したスクリーニング方法を確立している（特許文献１）。

ここで、「クラスター効果」とは、ある機能分子とそのリガンドとの相互作用において、１対１の場合に比べて多価対多価の相互作用によって、著しくその結合親和性が亢進する現象をいい、特許文献１では、ペプチドライブラリーを多価にすることによって、Ｓｔｘ２のＢサブユニットとの間にクラスター効果を発揮させ、Ｓｔｘ２との高結合親和性を有するＳｔｘ２阻害ペプチドを特定している。なお、本発明者らがＳｔｘ２阻害剤としてペプチドに着目した理由は、合成が比較的容易であり、また、一般に薬物としての適用に対して安全性が高いからである。

しかしながら、特許文献１のスクリーニング方法は、対象物とライブラリーとの結合からアミノ酸の選択性を導き出すことによってペプチドを特定するものであるため、一般的には、特定されたペプチドの毒性阻害効果までをも予測することは難しかった。そして、特許文献１では、Ｓｔｘ２毒性阻害ペプチドについての検討がなされているが、Ｓｔｘ１毒性阻害ペプチドについては具体的な検討がなされていなかった。

Ｓｔｘ１は、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae Type Ｉ）の産生する志賀毒素と同一であることから、Ｓｔｘ１毒性阻害剤が開発されれば、腸管出血性大腸菌感染症のみならず、赤痢に対する有効な治療薬になり得ると考えられている。実際、アジアでは、年間9100万人が細菌性赤痢に罹患し、そのうち41万人が死亡しているため、Ｓｔｘ１毒性阻害剤の開発が急がれるが、現状では、臨床応用に耐え得るＳｔｘ１毒性阻害剤は開発されていない。

一方、特許文献１でも指摘されているように、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のうち、より重篤な合併症を引き起こすのはＳｔｘ２であり、臨床的には、Ｓｔｘ２毒性阻害剤の開発が重要であると考えることができる。

したがって、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の両方に対して毒性阻害作用を発揮するペプチドを見出すことができれば、このペプチドを薬剤の有効成分とすることで、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する様々な疾患が効果的に治療可能になると考えらえる。

ＷＯ2006/001542

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の両方に対して優れた毒性阻害作用を発揮するペプチド、および、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患の治療薬を提供することを課題としている。

上記の課題を解決するため、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドおよびＳｔｘに起因する疾患の治療薬は、以下のことを特徴としている。
＜１＞本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に対する結合性を有するとともに、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性を阻害するペプチドであって、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドが、直接またはスペーサーを介して結合している。
＜２＞本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、スペーサーが、炭素数４〜１０の炭化水素鎖を有する。
＜３＞本発明の治療薬は、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患の治療薬であって、前記＜１＞または＜２＞のＳｔｘ毒性阻害ペプチドを含有する。
＜４＞本発明の治療薬は、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患、すなわち、腸管出血性大腸菌感染症または赤痢の治療薬である。

本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドによれば、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性を阻害することができる。したがって、このＳｔｘ毒性阻害ペプチドを含有する薬剤は、Ｓｔｘ１、２に起因する疾患、例えば、腸管出血性大腸菌感染症（Ｓｔｘ１産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ２産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２両毒素産生性腸管出血性大腸菌感染症を含む）、赤痢に対して極めて有効である。

Ｓｔｘ１に対するＰＰＲ−tet、ＰＰＰ−tetの毒性阻害効果を示す図である。Ｓｔｘ１毒性阻害ペプチドのスクリーニング方法を例示する概要図である。Ｓｔｘ１細胞障害活性に対する阻害効果を示す図である。５種のペプチドモチーフについて検討した。ＭＭＡ−tetが、ＳＴＸ１Ｂサブユニットのサイト１に特異的に結合していることを示す図である。Ｓｔｘ２細胞障害活性に対する阻害効果を示す図である。５種のペプチドモチーフについて検討した。マウスを用いた感染実験の結果を示す図である。

本発明の実施形態について説明する。以下、単に「Ｓｔｘ」という場合は、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２の両方を含むものとする。

本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に強い結合親和性で結合することによって、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性を阻害するものである。具体的には、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基の各々に、ペプチドモチーフとして、配列番号１のMet-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg（以下、ＭＭＡＲＲＲＲと記すことがある）が結合したものである。

すなわち、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、例えば、以下の化学式、

において、ＸＸＸＸ部に、ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）を有するものが例示される。なお、上記化学式１では、分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基の各々に、スペーサーを有する形態を例示しているが、スペーサーを介さず、４つのアミノ基の各々に、直接、ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）を結合させることもできる。スペーサーを設ける場合、Ｓｔｘ毒性阻害活性を損なわないものであればよく、具体的な分子、長さは限定されない。スペーサーとしては、例えば、末端にアミノ酸を有する炭素数４〜１０程度の鎖長のものが好ましく、Ｓｔｘ１毒性阻害活性としては、特に上記化学式１中の「Ｕ」で示される、amino hexanoic acid [NH₂-(CH₂)₅-COOH]が好ましい。また、前記アミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）が例示され、上記ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）と結合する。

さらに、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、４つのペプチドモチーフ、ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）の各々の末端に修飾分子を有していることが好ましい。

なお、上記化学式１で例示するペプチドは、末端にＭＡ（Ｍｅｔ‐Ａｌａ）を有してしているが、これは、後述の実施例において、スクリーニングの際に導入したものを例示しており、上記化学式１のＭＡは、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドにおいては必ずしも必要ではない。

また、ペプチドモチーフの末端にＮＨ_２が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）の各々の末端に、修飾分子としては、電荷がない分子、さらには、疎水性の分子が考慮される。例えば、Ｓｔｘ毒性阻害ペプチド、またはこれを含有する薬剤を経口投与する場合、消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として、末端のＮＨ_２をアセチル基により保護することができる。これによって、Ｓｔｘ毒性阻害活性が増大する。このように、ペプチドモチーフの末端の修飾分子は適宜選択することができる。

そして、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドの作成方法は、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、ペプチド合成装置等を利用するなどの方法によって作製することができる。

以上のとおり、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドは、ペプチドモチーフ、ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）を４つ有する４価のペプチドであり、クラスター効果によって、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に対して強い結合親和性を有しており、効果的にＳｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性を阻害することができるため、本発明のＳｔｘ毒性阻害ペプチドを含有する薬剤によれば、Ｓｔｘ１、２に起因する疾患、例えば、腸管出血性大腸菌感染症（Ｓｔｘ１産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ２産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２両毒素産生性腸管出血性大腸菌感染症を含む）、赤痢を効果的に治療することができる。

以下、本発明の実施形態として、上記のＳｔｘ毒性阻害ペプチドを含有する疾患の治療薬について説明する。ここでは、Ｓｔｘ毒性阻害ペプチド自体についての説明は省略する。

Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患の治療薬には、上記Ｓｔｘ毒性阻害ペプチド以外に、任意の製薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより調製され保存される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度において患者に非毒性であることを条件として、剤形や投与経路に応じて適宜に選択することができる。例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；およびｍ-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）またはトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、およびポリエチレングリコール（PEG）等の非イオン性界面活性剤等である。

なお、体内に投与される薬剤は無菌でなければならない。また、徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状）である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸およびγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸等である。

このようにして製剤化した治療薬は、例えば、疾患の種類や症状に応じて、経口投与、局所投与、あるいは静脈等を介して全身投与することができる。投与量は、患者の体重、症状等に応じて決定することができ、例えば、１回当たり約５〜１００mg／Kg、目安としては、約５〜１０mg／Kg程度とすることができる。

そして、本発明の治療薬によれば、Ｓｔｘ１産生性腸管出血性大腸菌感染症、赤痢に対して極めて有効であるとともに、より症状の重篤化と関係の深いＳｔｘ２産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ１ならびにＳｔｘ２両毒素産生性腸管出血性大腸菌感染症等の治療が可能となる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜実施例１＞
（１）Ｓｔｘ１とＳｔｘ２は、アミノ酸レベルで６０％近いホモロジーを有することから、特許文献１で同定されたＳｔｘ２阻害ペプチドのうち、特に阻害効果が強かったペプチドのＳｔｘ１に対する効果を検討した。

具体的には、次式

で表される３つのリジン（Ｌｙｓ）が結合して形成された分子核構造の両端に、位置する４つのアミノ基の各々に、スペーサーを介して、ＸＸＸＸ部分に、以下のペプチド、
配列番号２：Pro-Pro-Arg-Arg-Asn-Arg-Arg (ＰＰＲＲＮＲＲ)
配列番号３：Pro-Pro-Pro-Arg-Arg-Arg-Arg（ＰＰＰＲＲＲＲ）
が結合した４価ペプチドを使用して、Ｓｔｘ１に対する効果を検討した。

以下、便宜的に、配列番号２のペプチドモチーフを有する４価ぺプチドを「PPR−tet」、配列番号３のペプチドモチーフを有する４価ぺプチドを「PPP−tet」と記す。

なお、上記化学式１の末端のＭＡ（Met‐Ala）は、アミノ酸シークエンスを確認するために、スクリーニングの際に導入されるものであり、スペーサー長は、Ｓｔｘに最適化されている。具体的には、スペーサーとして、amino hexanoic acid [NH₂-(CH₂)₅-COOH]を使用した。
（２）結果を図１に示す。図１に示されるように、ＰＰＲ−tet、ＰＰＰ−tetは、Ｓｔｘ１に対しては毒性阻害効果が低いことが確認された。

このように、Ｓｔｘ２阻害性が確認されているＰＰＲ−tet、ＰＰＰ−tetがＳｔｘ１に対する阻害効果が低い理由は、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２のＢサブユニットの受容体結合表面に表面電荷がわずかに異なる領域が存在するためであると考えられる。

＜実施例２＞
（１）実施例１の結果を受け、以下の方法で、Ｓｔｘ１毒性阻害ペプチドの特定を試みた。

Ｓｔｘ１毒性阻害ペプチドを開発するためには、まず、どの結合サイトを標的とするかが問題となる。グロボ３糖結合サイトは、Ｓｔｘ１Ｂサブユニットのサイト１、サイト２およびサイト３からなることが知られている。また、Ｓｔｘ１Ｂサブユニットは、放射対称状に並んでペンタマーを形成するが、サイト１、サイト２は、Ｂサブユニットの辺縁部、サイト３は、Ｂサブユニットの中心に近い位置に存在していることが知られている。

そして、本発明者らは、サイト１が、Ｓｔｘ１とグロボ３糖（Ｇｂ３）との結合に最も寄与していること、この結合には、サイト１に存在するフェニルアラニン３０の芳香環の疎水的な相互作用が重要であること、に着目し、サイト１をＳｔｘ１毒性阻害ペプチドの標的サイトとして、Ｆ30Ａ（Ｐｈｅ30をＡｌａで置換）のミュータントを作成し、特許文献１と同様の多価型ペプチドライブラリー法を用いて、Ｓｔｘ１毒性阻害ペプチドをスクリーニングした。
（２）スクリーニング方法は、特許文献１に記載の方法に準じるが、具体的には、上記の多価型ペプチドライブラリーを用いて行った。その概要を図２に示す。

上記化学式１と図２に示す多価型ペプチドライブラリーのＸＸＸＸ部は、Ｃｙｓ以外の１９種のアミノ酸のミックスチャーからなるdegenerate positionを示す。

まず、野生型Ｓｔｘ１Ｂサブユニット、ならびにサイト１に変異を有するＦ30Ａ（約1 mg）を固定したアフィニィティーカラムを調整し、１次スクリーニングとして、500μg程度の前記ライブラリーを添加して十分に結合させた。そのあと、ＰＢＳ等で十分に洗浄し、結合しなかったライブラリーを洗い出し、最後に、カラムに留まっているライブラリーを３０％酢酸で溶出させ、回収された画分を乾燥させ、アミノ酸配列解析を行った。

その結果、各々のdegenerate positionで得られたアミノ酸について、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されるか、数値化された結果が得られた。

すなわち、野生型Ｓｔｘ１Ｂサブユニットを用いるときに、前記のようにして得られた、各degenerate positionの各アミノ酸の値を、mutant type：Ｆ３０Ａを用いたときに、前記のようにして得られた、対応するdegenerate positionの、対応するアミノ酸の値で割り、その結果、そのアミノ酸が野生型Ｓｔｘ１ＢサブユニットではＦ３０Ａにくらべて何倍選択されるようになったかが数値化された結果を得た。そして、１９種のアミノ酸の値をすべてたすと１９になるように標準化した。このとき、各アミノ酸の間で、選択性に差がないと値は１となる。この値が１．３を越えると強い選択性がみられたと判断した。結果を［表１］の１st-libraryの下段に示す。

１次クリーニングで、degenerate position：５〜７にアルギニン（Ｒ）が強く選択されたことから、このアルギニン（Ｒ）をlocking positionとして、上記［表１］に示す２nd-librariesを作製し、２次スクリーニングを行った。locking positionの導入によって、library全体としてのＳｔｘ１Ｂサブユニットに対する結合性が増加するので、より特異的なモチーフが得られやすくなる。この２nd-libraryを用いて、前記と同様にwild type ＳＴＸ１Ｂ−サブユニットに結合するペプチドモチーフを、またサイト１のmutant ＳＴＸ１Ｂ−サブユニットに結合するペプチドモチーフを決定した。

結果は、上記［表１］の２nd-libraries下段に示すとおり、degenerate position：５〜７は、アルギニン（Ｒ）と特定した。そして、degenerate position：１〜３では、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）が強く選択された。

この結果、以下の４つ、
配列番号１：Met-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg（ＭＭＡＲＲＲＲ）
配列番号４：Met-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg (ＭＡＡＲＲＲＲ)
配列番号５：Ala-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg (ＡＭＡＲＲＲＲ)
配列番号６：Ala-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg (ＡＡＡＲＲＲＲ)
のペプチドモチーフが特定された。

＜実施例３＞
（１）上記のペプチドモチーフ：ＭＭＡＲＲＲＲ（配列番号１）、ＭＡＡＲＲＲＲ（配列番号４）、ＡＭＡＲＲＲＲ（配列番号５）、ＡＡＡＲＲＲＲ（配列番号６）の各々を、３つのリジン（Ｌｙｓ）が結合して形成された分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基に、スペーサーを介して結合させ、上記各々のペプチドモチーフによる、ＳＴＸ１Ｂサブユニットへの結合親和性（Ｋ_Ｄ値）を調べた。以下、配列番号１、４―６のペプチドモチーフを有する４価ペプチドを、それぞれ、「ＭＭＡ−tet」、「ＭＡＡ−tet」、「ＡＭＡ−tet」、「ＡＡＡ−tet」と記す。また、コントロールとして、ペプチドモチーフを持たない核構造だけの化合物ＭＡ-tetについも、同様に結合親和性を（Ｋ_Ｄ値）を調べた。Ｋ_Ｄ値の測定は、BIAcore^TMシステム（BIAcore, Uppsala, Sweden）を用いておこなった。本システムでは、センサーチップ上にＳＴＸ１Ｂサブユニットを固定し、ここに種々の濃度の４価ペプチドを流すことにより結合量を測定する。解析はBIAEVALIATION 3.0（BIAcore）により行い、最大結合量（RUmax）ならびにＫ_Ｄ値を算出した。

なお、上記化学式１では、末端にＭＡ（Ｍｅｔ‐Ａｌａ）が結合しているが、これは、スクリーニングの際に導入したものであって、本発明のＳｔｘ１毒性阻害ペプチドにおいては必ずしも必要ではない。また、スペーサーの具体的構成、長さもこの実施例に限定されることはない。
（２）結果を［表２］に示す。Ｋ_Ｄ値が低いほど、結合親和性が高いことを示している。

［表２］に示されるように、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetはいずれも、Stx1Bサブユニットに対し非常に高い結合親和性を示すことが確認された。一方、ＭＡ-tetでは結合は観察されなかった。このことから、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetはペプチドモチーフ依存的にＳＴＸ１Ｂサブユニットに強く結合することが示された。なお、ＲＵ_ＭＡＸ（ＡＵ）は、最大結合量を示している。

＜実施例４＞
（１）実施例３で、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetのＳＴＸ１Ｂサブユニットに対する結合親和性が確認されたことから、前記各々のペプチドによるＳＴＸ１細胞毒性の阻害効果について検討した。

具体的な、実験条件は、ＳＴＸに対して感受性が高いVero細胞を用い、1 pg/mlのＳＴＸ１ならびに、各濃度の４価ペプチドの共存下、３日間培養を行い、生存細胞の割合を測定した。

また、ＰＰＰ−tetについてもＳＴＸ１による細胞毒性活性に対する阻害効果を検討した。
（２）結果は、図３に示すように、ＭＭＡ−tetは、濃度依存的に、ＳＴＸ１細胞毒性を顕著に阻害することが確認された。具体的には、ペプチド濃度100μg/mlで、細胞生存率は100％となった。IC50値は25μg/mlであった。

一方、ＡＭＡ−tet、ＰＰＰ-tetでは阻害効果は低下し、IC50値はそれぞれ100μg/ml、130μg/mlであった。ＭＡＡ−tet、ＡＡＡ−tetではさらに阻害効果は低下し、IC50値はそれぞれ250μg/ml、300μg/mlであった。さらに、ＭＭＡ−tet は、これまでに同定したＳＴＸ２阻害ペプチドＰＰＰ−tetに比べ、５倍以上の強いＳＴＸ１毒性阻害活性を示すことが明らかとなった。

以上のとおり、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetは、いずれもＳＴＸ１Ｂサブユニットに対する結合親和性を有するものの、中でも、ＭＭＡ−tetは、その他のペプチドと比較して、ＳＴＸ１の細胞毒性阻害効果が際立って顕著であった。すなわち、ＳＴＸ１に対する結合親和性（表２）と細胞毒性阻害効果（図３）には必ずしも相関関係がないことが示された。

また、図３に示される、ＭＭＡ−tet、ＡＭＡ−tetおよびＭＡＡ−tetの阻害活性の比較から、ＭＭＡ−tetのペプチドモチーフである配列番号１の２つのMet（Ｍ）はともに阻害活性に必要であること、しかしながら２番目のMet（Ｍ）のほうが１番目のMet（Ｍ）よりもＳＴＸ１毒性阻害活性により重要な働きをしていること、が明らかとなった。

以上のことから、ＭＭＡ−tetを含有する薬剤は、Ｓｔｘ１に起因する疾患、例えば、腸管出血性大腸菌感染症、赤痢の治療薬として有効であることが示された。

＜実施例５＞
（１）実施例４の結果を受け、ＭＭＡ−tetのＳＴＸ１に対する結合特異性をＥＬＩＳＡ法により検討した。

具体的な、実験条件は、各濃度のＭＭＡ−tetをＥＬＩＳＡプレートに固定し、野生型ＳＴＸ１と、ＳＴＸ１Ｂサブユニットのサイト１に変異を有する前記Ｆ３０Ａ各々を結合させた。その後洗浄し、特異的に結合した各Bサブユニット量を特異的抗体を用いて定量した。
（２）結果を、図４に示す。縦軸は、490nmの光の吸光度である。ＭＭＡ−tetのＦ３０Ａに対する結合活性は、野生型ＳＴＸ１への結合に比べ、約１/１０に低下していた。このことから、ＭＭＡ−tetは、ＳＴＸ１Ｂサブユニットのサイト１に特異的に結合していることが確認された。

＜実施例６＞
前記の特許文献１に記載されているように、これまでにも、本発明者は、ＳＴＸＢサブユニットに結合し、その毒性を阻害する化合物として、カルボシランデンドリマーを核構造としてグロボ３糖部を集積させた化合物を創案し、例えば、グロボ３糖部を６個有する化合物をSUPER TWIG(1) 6などと命名している。特許文献１では、ＳＴＸ２Ｂサブユニットのサイト１、サイト２、サイト３の各々にmutationを導入し、各mutantと、前記SUPER TWIG(1) 6と結合親和性の比較から、SUPER TWIG(1) 6とＳＴＸ２Ｂサブユニットとの結合には、サイト３が使用されているとの知見を得、この知見に基づいて、ＳＴＸ２Ｂのサイト３を標的にしたペプチドライブラリー法を利用し、ＳＴＸ２に対して高結合親和性を発揮するペプチドモチーフ（ＰＰＰ−tet、ＰＰＲ−tetなど）を決定し、その毒性阻害作用の検討を進めてきた。

そして、前記実施例４、５において、ＭＭＡ−tetのＳＴＸ１毒性阻害活性およびＳＴＸ１Ｂサブユニットのサイト１に対する特異的結合性が確認されたことから、新たに本実施例において、ＭＭＡ−tetならびにＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetによるＳＴＸ２Ｂサブユニットに対する結合親和性およびＳＴＸ２毒性阻害活性についての検討を試みた。
（１）結合親和性
実施例３と同様の方法で、ＭＭＡ−tetならびにＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetによるＳＴＸ２Ｂサブユニットに対する結合親和性（Ｋ_Ｄ値）を調べた。また、ＰＰＰ−tet、ＰＰＲ−tet、およびコントロールとして、ペプチドモチーフを持たない核構造だけの化合物ＭＡ-tetについても、同様に結合親和性を（Ｋ_Ｄ値）を調べた。この結果を［表３］に示す。

［表３］に示されるように、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetはいずれも、ＳＴＸ２Ｂサブユニットに対する結合親和性が確認された。このことから、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetはペプチドモチーフ依存的にＳＴＸ２Ｂサブユニットに強く結合することが示された。

また、同じ条件下で、ＰＰＰ−tet、ＰＰＲ−tetについてもＳＴＸ２Ｂサブユニットに対する結合親和性が確認された。結合親和性においては、ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetと顕著な違いは確認されなかった。

一方、ＭＡ-tetでは結合は観察されなかった。なお、ＲＵ_ＭＡＸ（ＡＵ）は、最大結合量を示している。
（２）細胞毒性阻害効果
ＭＭＡ−tet、ＭＡＡ−tet、ＡＭＡ−tet、ＡＡＡ−tetによるＳＴＸ２による細胞毒性阻害効果について検討した。具体的な実験条件は、実施例４と同様に、Vero細胞を用い、1 pg/mlのＳＴＸ２ならびに、各濃度のペプチドの共存下、３日間培養を行い、生存細胞の割合を測定した。

また、ＰＰＰ−tetについてもＳＴＸ２による細胞毒性活性に対する阻害効果を検討した。

具体的には、図５に示すように、ＭＭＡ−tetは、濃度依存的に、ＳＴＸ２細胞毒性を顕著に阻害することが確認された。１４０％の生存率を最大効果とすると、IC50値は17 μg/mlであった。

一方、ＡＭＡ−tet、ＰＰＰ-tetでは阻害効果は低下し、IC50値はそれぞれ62μg/ml、42μg/mlであった。ＭＡＡ−tet、ＡＡＡ−tetではさらに阻害効果は低下し、IC50値はそれぞれ140μg/ml、130μg/mlであった。すなわち、ＭＭＡ−tet は、これまでに同定したＳＴＸ２阻害ペプチドＰＰＰ−tetに比べ、約2.5倍の強いＳＴＸ2毒性阻害活性を示すことが明らかとなった。

このように、ＭＭＡ−tetは、ＳＴＸ２Ｂを標的にして同定されたＰＰＰ−tetよりも優れた毒性阻害作用を発揮することが明らかになった。
＜実施例７＞
実施例４、６において、ＭＭＡ−tetは、ＳＴＸ１およびＳＴＸ２による細胞毒性に対する強い阻害活性があること確認された。このような結果を踏まえ、実際にマウスを用いた感染実験を行った。

マウスは、低蛋白飼育Ｃ５７ＢＬ/６（ＳＰＦ，female）を使用し、感染菌は、STEC strain N9-D6 (stx1⁺,stx2⁺)を7.5×10⁶cfu使用した。そして、感染第２日病日〜第５日病日のマウスに１日２回、Ａｃ−ＭＭＡ−tet（0.15 mg/mouse、0.5mg/mouse）を経口投与した。消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として、ＭＭＡの末端にアセチル基を修飾した。

具体的には、以下の３グループに分けた。
グループ１（0.15 mg/mouse群）：平均体重20.3ｇ（６匹）
グループ２（0.5mg/mouse群）：平均体重20.3ｇ（６匹）
グループ３（control mouse群）：平均体重21.4ｇ（８匹）
結果を図６に示す。図６に示されるように、control mouse群は、10日〜13日しか生存しなかったのに対し、グループ１（0.15 mg/mouse群）では５匹が、グループ２（0.5mg/mouse群）では６匹すべてが６０日以上生存した。したがって、Ａｃ−ＭＭＡ−tetの投与によってＳｔｘ１、２毒性が阻害され、感染マウスの疾患が改善された結果、マウスの生存が維持されたと考えられる。

すなわち、ＭＭＡ−tetを含有する薬剤によって、Ｓｔｘ１に起因する疾患、例えば、Ｓｔｘ１産生性腸管出血性大腸菌感染症、赤痢に対して極めて有効であるとともに、より症状の重篤化と関係の深いＳｔｘ２産生性腸管出血性大腸菌感染症、Ｓｔｘ１ならびにＳｔｘ２両毒素産生性腸管出血性大腸菌感染症が治療可能であることが示された。

Claims

Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に対する結合性を有するとともに、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性を阻害するペプチドであって、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の両端に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドが、直接またはスペーサーを介して結合していることを特徴とするＳｔｘ毒性阻害ペプチド。
スペーサーは、炭素数４〜１０の炭化水素鎖を有することを特徴とする請求項１のＳｔｘ毒性阻害ペプチド。
Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患の治療薬であって、請求項１または２のＳｔｘ毒性阻害ペプチドを含有することを特徴とする治療薬。
Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に起因する疾患が、腸管出血性大腸菌感染症または赤痢であることを特徴とする請求項３の治療薬。