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JP5651682B2 - 変化した特性を有するα−アミラーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents
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JP5651682B2 - 変化した特性を有するα−アミラーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents

変化した特性を有するα−アミラーゼ変異体を含む組成物及び方法 Download PDF

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Description

優先権
本出願は、２００９年４月１日に提出した米国仮出願シリアルＮｏ．６１／１６５，８１３に対する優先権を主張する。これによって該出願の全体がそのまま組み込まれている。
対照α−アミラーゼと比較して変化した生化学的特性と有利な性能特性とを有する変異体α−アミラーゼに関する組成物及び方法を記載する。この変異体は、デンプン変換、エタノール生産、洗濯、食器洗浄、パルプ及び紙の生産、繊維糊抜き、並びに／又は、甘味料生産のような様々な工業的用途に使用するに適している。
デンプンは、アミロース（１５乃至３０重量対重量％）とアミロペクチン（７０乃至８５重量対重量％）との混合物である。アミロースは、約６００００乃至約８０００００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合グルコース単位の直鎖からなる。アミロペクチンは、２４個乃至３０個のグルコース単位ごとにα−１，６分岐点を含む分枝状ポリマーである。その分子量は１億に達することもある。
濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、
（１）α−アミラーゼによる固体デンプンの液化（又は粘度低下）による約７から約１０の平均重合度を有するデキストリンの生成、及び、
（２）得られた液化デンプン（即ち、デンプン加水分解物）のアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ又はＧＡとも呼ばれる）による糖化、
を含む酵素の触媒によるプロセスによって生産されている。その得られるシロップは高いグルコース含有量を有する。商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後で、イソシロップとして知られるデキストロース／フルクトース混合物へ酵素によって異性化される。
アルファ（α）−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、内部のα−１，４−グルコシド結合を無作為に切断することによって、デンプン、グリコーゲン及び関連する多糖を加水分解する酵素群である。この酵素のクラスは、例えば、デンプン処理の最初の段階（液化）において、繊維の糊抜きにおいて、再生紙の脱インク処理において、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの修飾において、浸漬穀物の粉砕において、アルコール生産において、甘味料（例えば、糖）の製造において、飲料産業において、醸造において、油田において、動物飼料において、及び、洗剤マトリクス中の洗浄剤として、数多くの重要な商業的用途がある。例えば、このような酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除去するために用いることができる。
α−アミラーゼは、広範囲の細菌類、真菌類、植物及び動物の供給源から単離される。産業的に、多くの重要なα−アミラーゼは、バチルス(Bacilli)から単離されたものである。ある特徴的なα−アミラーゼは、好アルカリ性バチルス属(Bacillus sp.)菌株ＴＳ−２３α−アミラーゼであって、デンプン加水分解活性を有する少なくとも５種類の酵素を生産する(Lin et al., Biotechnol Appl Biochem, 28:61-68, 1998)。バチルス属番号ＴＳ−２３のα−アミラーゼは、広いｐＨ範囲（即ち、ｐＨ４．７からｐＨ１０．８）にわたって安定であが、最適ｐＨが９である。この酵素は例えば１５℃から２０℃のような低い温度でも活性を有するが、最適温度は４５℃である。
変化した生化学的特性を有し、工業的用途において向上した性能を与える変異体アミラーゼ（例えばα−アミラーゼ）の必要性が依然として存在する。
対照α−アミラーゼと比較して変化した生化学的特性及び有利な性能特性を有する変異体α−アミラーゼに関する組成物及び方法を記載する。この変異体は、デンプン変換、エタノール生産、洗濯、食器洗浄、パルプ及び紙の生産、繊維の糊抜き、及び／又は、甘味料の生産のような様々な工業的用途において使用するのに適している。
一態様において、単離されたα−アミラーゼ変異体を提供する。前記変異体は、アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼの成熟形態であり、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１６、１１８、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、１７７、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３６、２３７、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６７、２６９、２７０、２７２、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７０、４７５、４７６、４８３及び４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、前記位置は配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応するものであり、異なるアミノ酸残基に対する１つ又はそれ以上の位置における天然アミノ酸残基の前記置換が、安定性の尺度について１．０を超える性能指数と、活性の尺度について１．０を超える性能指数とを有するα−アミラーゼ変異体を生じさせる。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、７、２９、３５、５３、６０、７２、８７、１０８、１１６、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１５６、１６１、１６５、１７８、１８２、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０２、２１０、２１４、２１７、２２１、２３４、２４６、２６９、３０３、３１０、３３７、３４０、３７４、４３８からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、異なるアミノ酸残基に対する天然アミノ酸残基の前記置換が、安定性の尺度について１．５を超える性能指数と、活性の尺度について１．０を超える性能指数とを有するα−アミラーゼ変異体を生じさせる。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、２、７、２２、２５、２８、３０、３７、７０、７５、８３、８７、９１、９３、１０８、１２８、１６０、１６５、１７８、１８２、１８３、２１７、２６９、２７０、２７９、２８３、２９８、３０５、３０６、３１０、３２０、３７４、３７５、３７６、４０７、４１９、４７５及び４７６からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、異なるアミノ酸残基に対する天然アミノ酸残基の前記置換が、安定性の尺度について１．５を超える性能指数と、活性の尺度について１．０を超える性能指数とを有するα−アミラーゼ変異体を生じさせる。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６及び４８３からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含む。
関連する一態様においては、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６及び４８３からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応するものであり、前記置換が、向上した洗浄性能、向上した洗剤安定性、向上した耐熱性、及び、向上したタンパク発現からなる群より選択される少なくとも１つの有益な効果を与えるα−アミラーゼ変異体を提供する。
他の関連する一態様においては、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼの成熟形態であり、５、３２、８３、９５、１５４、２１４、２２１、２２８、３２２、４０１、４０７、４１９、４４４、４４７、４５９、４７０、４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、前記位置が配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応し、異なるアミノ酸残基に対する天然アミノ酸残基の前記置換が、ｐＨ８における活性、ｐＨ１０における活性、１６℃における活性、及び、３２℃における活性に関して０．５以上の性能指数値と、洗剤中の安定性に関して及び耐熱性に関して０．５以上の性能指数値を有するα−アミラーゼ変異体を生じさせるα−アミラーゼ変異体を提供する。
いくつかの実施形態において、その異なるアミノ酸残基は、その異なるアミノ酸残基が天然アミノ酸残基と異なるという条件で、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、I、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する位置２４３における置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記α−アミラーゼ変異体のいずれかが、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する位置１８０及び／又は位置１８１における欠失をさらに含む。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する１２８、１７８、１８２、１８５及び１８９からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、前記置換は、向上した洗浄性能又は向上した洗剤安定性を与える。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、
（ａ）位置１２５におけるアラニン、
位置１２８におけるシステイン、
位置１３１におけるイソロイシン、
位置１６５におけるイソロイシン、
位置１７８におけるロイシン、
位置１８２におけるグリシン、
位置２０２におけるチロシン、
位置３０５におけるアルギニン、
位置３１９におけるトレオニン、若しくは、
位置４７５におけるアルギニン、
（ｂ）Ｓ１２５Ａ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｆ２０２Ｙ、及び、Ｄ３１９Ｔからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる置換、及び、Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋの置換、又は、
（ｃ）置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は、Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋを含み、
前記変異体は、選択的に、位置２４３における置換、並びに／又は、位置１８０及び／若しくは位置１８１における欠失をさらに含み、
前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置４７５に置換を含む。いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置４７５にアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置２４３における置換、並びに／又は、位置１８０及び／又は位置１８１における欠失をさらに含む。
他の一態様においては、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２３９、２４０、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、４８３及び４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応により番号付けられたα−アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上の位置における置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の位置における置換である。
いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。いくつかの実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群のいずれか１つに対して少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。
他の一態様において、α−アミラーゼ変異体をコードする単離された核酸を提供する。関連する一態様においては、単離された核酸を含む発現ベクターを、プロモータとの作用可能な組み合わせで提供する。更なる一態様において、その発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
他の一態様においては、α−アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この洗浄組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びペルオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる酵素をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はサブチリシンである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はサブチリシンＢＰＮ′又はその変異体である。特定の実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はサブチリシンＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ又はその変異体である。
他の一態様において、布又は硬表面を洗浄する方法であって、布又は硬表面を上記洗浄組成物に接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この洗浄組成物は少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、この洗浄組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びペルオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる酵素をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はサブチリシンである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素はＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンである。
特定の実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は、Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋの置換を含む。
いくつかの関連する実施形態において、本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２３９、２４０、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５，２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、４８３、及び、４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における（好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個以上の）置換を含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたα−アミラーゼ変異体を提供する。一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群のいずれかに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、前記位置は、１、２、３、４、５、７、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５７、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０８、１１２、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０２、２０７、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１，３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４７、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４８３からなる群より選択され、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである。さらに別の実施形態においては、前記位置は、１、２、３、４、５、７、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５７、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、９０、９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０８、１１２、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８５、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０２、２０７、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７３、２７５，２７９、２８３、２８４、２９８、３０１，３０３、３０５、３０６，３１０、３１１、３１８、３１９、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４７、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５及び４８３からなる群より選択され、これらの位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置５８のチロシン及び位置２３６のアラニンを含んでおり、これらの位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置２４３のグルタミン及び位置４７５のリジンを含んでおり、これらの位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである。
本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１８２、１８３、３０５、３２０、３７９、４０７、４１９及び４７５からなる群より選択される１個〜８個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものであるα−アミラーゼ変異体をさらに提供する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択された親α−アミラーゼに由来する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、置換は、Ｘ１８２Ｎ、Ｘ１８３Ｎ、Ｘ３０５Ｑ、Ｘ３２０Ｆ、Ｘ３７９Ａ、Ｘ４０７Ｄ、Ｘ４１９Ｓ及びＸ４７５Ｔからなる群の１個〜８個を含む。これらの実施形態の一部において、置換は、Ｔ１８２Ｎ、Ｇ１８３Ｎ、Ｙ３０５Ｑ、Ｑ３２０Ｆ、Ｐ３７９Ａ、Ｑ４０７Ｄ、Ｔ４１９Ｓ及びＧ４７５Ｔからなる群の１個〜８個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む。
本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、１６０、１８２、１８３、１８９、３０５、３７９及び４７５からなる群より選択される１個〜７個の（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個）位置における置換を含み、これらの位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものであるα−アミラーゼ変異体を提供する。他の一実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群のいずれかに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。他の好ましい一実施形態において、この置換は、Ｘ１６０Ｅ、Ｘ１８２Ｇ、Ｘ１８３Ｎ、Ｘ１８９Ｐ、Ｘ３０５Ｇ、Ｘ３７９Ｅ及びＸ４７５Ｔからなる群の１個〜７個を含む。これらの実施形態の一部において、この置換は、Ｙ１６０Ｅ、Ｔ１８２Ｇ、Ｇ１８３Ｎ、Ｅ１８９Ｐ、Ｙ３０５Ｇ、Ｐ３７９Ｅ及びＧ４７５Ｔからなる群の１個〜７個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個）を含む。
本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１２５、１８２、２１４、２７９、３０５、３１９、３２０、４７５からなる群より選択される１個〜８個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである変異体をさらに提供する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。他の好ましい一実施形態において、置換は、Ｘ１２５Ａ、Ｘ１８２Ａ、Ｘ２１４Ｑ、Ｘ２７９Ｎ、Ｘ３０５Ｒ、Ｘ３１９Ｔ、Ｘ３２０Ｎ及びＸ４７５Ｒからなる群の１個〜８個を含む。これらの実施形態の一部において、置換は、Ｓ１２５Ａ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ２１４Ｑ、Ｔ２７９Ｎ、Ｙ３０５Ｒ、Ｄ３１９Ｔ、Ｑ３２０Ｎ及びＧ４７５Ｒからなる群の１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む。
本開示は、他の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、７、１８２、２９８、３７６、３７９、４０７、４１９、及び、４５３からなる群より選択された１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである変異体を提供する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。他の好ましい一実施形態において、置換は、Ｘ７Ｈ、Ｘ１８２Ｗ、Ｘ２９８Ｑ、Ｘ３７６Ｒ、Ｘ３７９Ｋ、Ｘ４０７Ｗ、Ｘ４１９Ｓ及びＸ４５３Ｗからなる群の１個〜８個を含む。これらの実施形態の一部において、置換は、Ｅ７Ｈ、Ｔ１８２Ｗ、Ｔ２９８Ｑ、Ｙ３７６Ｒ、Ｐ３７９Ｋ、Ｑ４０７Ｗ、Ｔ４１９Ｓ及びＬ４５３Ｗからなる群の１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む。
本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１２８、１７８、１８２及び１８５からなる群より選択される１個〜４個（例えば、１個、２個、３個又は４個）の位置における置換を含み、前記α−アミラーゼ変異体は、位置２４３にセリン又はグルタミンを含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである変異体を提供する。一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択された親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。さらに別の一実施形態においては、置換は、Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ及びＡ１８５Ｄからなる群の１個〜４個（例えば、１個、２個、３個、又は４個）を含む。
本開示は、他の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１２５、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９及び４７５からなる群より選択される１個〜９個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個）の位置における置換を含み、前記α−アミラーゼ変異体は、位置３２０にグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号に付けられたものである変異体を提供する。一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置１２５のセリン又はアラニン、位置１８２のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、位置１８３のグリシン又はアスパラギン、位置１８９のグルタミン酸又はプロリン、位置２７９のトレオニン又はアスパラギン、位置３０５のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、位置３１９のアスパラギン酸又はトレオニン、位置３７９のプロリン又はアラニン、及び、位置４７５のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号に付けられたものである。
本開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１２５、１２８、１７８、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９、及び、４７５からなる群より選択される１個〜１１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個）の位置における置換を含み、前記α−アミラーゼ変異体は、位置２４３のセリン又はグルタミンを含み、位置３２０のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである変異体をさらに提供する。一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。好ましい一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼに由来する。他の一実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、位置１２５のセリン又はアラニン、位置１２８のアスパラギン又はシステイン、位置１７８のリジン又はロイシン、位置１８２のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン、位置１８３のグリシン又はアスパラギン、位置１８９のグルタミン酸又はプロリン、位置２７９のトレオニン又はアスパラギン、位置３０５のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン、位置３１９のアスパラギン酸又はトレオニン、位置３７９のプロリン又はアラニン、及び、位置４７５のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含み、前記位置は、配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられたものである。他の好ましい一実施形態において、置換は、Ｎ１２８Ｃ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１３４Ｐ、Ｑ１３８Ｅ、Ｙ１６０Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｔ１６５Ｖ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ１８２Ｃ、Ｔ１８２Ｄ、Ｔ１８２Ｍ、Ｔ１８２Ｆ、Ｔ１８２Ｎ、Ｔ１８２Ｇ、Ｔ１８２Ｐ、Ｔ１８２Ｑ、Ａ１８５Ｄ、Ａ１８５Ｅ、Ｅ１８９Ｐ、Ｓ２４３Ｄ、Ｓ２４３Ｅ及びＳ２４３Ｑからなる群より選択される。
以下に記載するアミノ酸変異は、例示的α−アミラーゼを出発点、つまり、「骨格」として用いて、作成及び試験したが、関連α−アミラーゼにおいて同等なアミノ酸変異を作成することができ、それらが同様の効果を生み、同様の利点を与えることが予想されることは理解されるであろう。本明細書において、骨格として使用される他の例示的α−アミラーゼは特定されたものに限定されない。
本開示は、前記のいずれかのα−アミラーゼ変異体をコードする単離された核酸をさらに提供する。一実施形態においては、単離された核酸を、プロモータとの作用可能な組み合わせにおいて含む発現ベクターが含まれる。他の一実施形態においては、発現ベクターを含む宿主細胞が含まれる。他の一実施形態は、α−アミラーゼ変異体を生産する方法であって、α−アミラーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換するステップと、α−アミラーゼ変異体の生産に適した条件下でその形質転換した宿主細胞をインキュベートするステップとを含む方法を提供する。他の一実施形態においては、前記方法が、生成されたα−アミラーゼ変異体を採取するステップをさらに含む繊維洗浄方法である。さらに別の一実施形態は、宿主細胞としてバチルス属を含み、また別の一実施形態においては、そのバチルス属がバチルスサブチリスである。
本開示は、前記のいずれかのα−アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物であって、少なくとも１つのさらなる酵素をさらに含む洗浄組成物を提供する。一実施形態において、追加酵素は、プロテアーゼ（サブチリシン、中性メタロプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼなどを含むがこれらに限定されない）、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ及びペルオキシダーゼからなる群より選択される。他の一実施形態において、この洗浄組成物は洗濯用洗剤であり、また別の一実施形態において、この洗浄組成物は食器用洗剤である。他の一実施形態において、この洗浄組成物は、漂白剤を含む洗濯用及び／又は食器用洗剤である。他の一実施形態において、この洗浄組成物は、例えば、洗浄前用途のような、布のための前処理剤である。他の一実施形態において、この洗浄組成物は、洗濯用洗剤又は食器用洗剤の添加剤である。本開示は、α−アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物に布を含む表面及び／又は品物を接触させるステップを含む洗浄方法をさらに提供する。一実施形態において、この方法は、食器洗浄方法であって、以下のステップ：ｉ）食器洗浄組成物及びｉｉ）洗浄を必要とする食器を提供するステップと、皿の洗浄を提供するのに有効な条件下で前記食器を前記食器洗浄組成物に接触させるステップとを含む。他の一実施形態において、この方法は、以下のステップ：ｉ）布洗浄組成物及びｉｉ）洗浄を必要とする洗濯物を提供するステップと、洗濯物の洗浄を提供するのに有効な条件下で前記洗濯物を前記布洗浄組成物に接触させるステップとを含む。他の一実施形態において、この方法は、繊維糊抜きなどの場合において、織布中の糸に由来する材料を除去するステップを含む。
これらの組成物及び方法のこれらの態様及び他の態様並びに実施形態は、明細書を考慮して明らかにされる。
図１は、配列番号２及び配列番号５−１４としてそれぞれ記載されている様々な対照アミラーゼの成熟形態の配列比較を提供する。配列は、MUSCLE3.7複数配列比較アルゴリズム(Edgar, Nucleic Acids Research, 32:1792-1797, 2004)を用いて整列した。
図２は、バチルスリケニフォルミスＬＡＴプロモータ（Ｐｌａｔ）と、レプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、及び、ブレオマイシン抵抗性マーカ（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０(McKenzie et al., Plasmid, 15: 93-103, 1986)に由来するさらなるエレメントとを含むｐＨＰＬＴベクターのマップを提供する。
図３は、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドのマップを提供する。
図４は、ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑプラスミドのマップを提供する。
図５は、洗濯用洗剤用途における複数のα−アミラーゼの洗浄性能を示すグラフを与える。試験を行った酵素は、Ｗ９（ＢＡＳＥ−Ｓ１２５Ａ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｔ２７９Ｎ−Ｄ３１９Ｔ−Ｑ３２０Ｎ−Ｇ４７５Ｒ）、Ｗ１０（ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｒ）、Ｗ１１（ＢＡＳＥ−Ｓ１２５Ａ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｑ−Ｙ３０５Ｒ−Ｇ４７５Ｒ）、及び、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋである。
図６は、洗濯用洗剤用途における複数のα−アミラーゼの洗浄性能を示すグラフを提供する。試験を行った酵素は、ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ、ＢＡＳＥ−Ｗ１０ＥＫ、ＡＣＥ−ＱＫ、及び、コントロール（標準商用酵素）である。
図７Ａは、ＡＣＥα−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯用途における相乗作用を示すグラフを提供する。 図７Ｂは、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯用途における相乗作用を示すグラフを提供する。
図８は、ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（Ｗ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ）α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯用途における相乗作用を示すグラフを提供する。
図９は、ＢＡＳＥ Ｗ１０ＥＫ（ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯用途における相乗作用を示すグラフを提供する。
図１０は、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯用途における相乗作用を示すグラフを提供する。
アミラーゼ変異体、特にバチルスα−アミラーゼ変異体に関する組成物及び方法を記載する。本明細書に記載されているアミラーゼ変異体は、変化した生化学的特性を有し、様々な工業的用途（例えば、洗濯及び食器洗浄）において高い性能を示す。これらの変異体のこれらの特徴及び他の特徴、並びに、これらの変異体を使用する方法を詳細に説明する。
１．α−アミラーゼ変異体用、定義及び命名法
本明細書において異なるように定義されていなければ、本明細書において使用されている技術用語及び科学用語のすべては、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。「Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)」及び「Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)」は、本明細書において使用されている用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
これらの組成物及び方法のいくつかの態様は、遺伝子工学及び分子生物学の分野において使用されるルーティーン的な技術及び方法に頼っている。以下の資料：Sambrook et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (2nd Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990)、及び、Ausubel et al., Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994)は、本発明の組成物及び方法に従った有用な一般的方法論の説明を含む。これらの一般資料は、当業者に知られている定義及び方法を提供する。しかしながら、記載されている特定の技術、プロトコル及び試薬は変更してもよいので、本発明の組成物及び方法がこれらのいずれかに限定されることは意図されていない。本発明の組成物及び方法の実施又は試験においては、本明細書に記載されているものと類似又は均等のいかなる方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。
タンパク及びそれらのタンパクをコードする遺伝子を記載するときに、遺伝子の名前は一般にイタリック体にして大文字にせず、タンパクの名前は一般にイタリック体にせずに頭文字を大文字にする。
単数形の「１つの(a)」、「１つの(an)」、及び、「その(the)」は、別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「酵素(an enzyme)」への言及は、複数のそのような酵素を含み、「配合物(the formulation)」への言及は、当業者に知られた１つ以上の配合物及びその均等物への言及などを含む。
本明細書で引用されている特許及び刊行物のすべては、そのような特許及び刊行物において開示されているすべての配列を含めて、参照することによって明示的に組み込まれている。
１．１ 定義
明確性のために以下の用語を定義する。
本明細書において用いられているように、「デンプン」という用語は、Ｘが任意の数であり得る式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、アミロースとアミロペクチンとで構成された、植物性複合多糖炭水化物で構成された任意の材料を表す。特に、この用語は、限定されるものではないが、穀類、草、塊茎及び根、特に、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、コウベイ、モロコシ、ふすま、カッサバ、ミレット、ジャガイモ、サツマイモ、及び、タピオカを含む任意の植物をベースとする材料を表す。
本明細書で用いられているように、「アミラーゼ」は、デンプンの分解を触媒することができる酵素を表す。一般に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１、α−Ｄ−（１→４）グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子中のα−Ｄ−（１→４）Ｏグリコシド結合をランダムな方法で開裂するエンド型酵素である。対照的に、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２、α−Ｄ−（１→４）グルカンマルトヒドラーゼ）のようなエキソ型デンプン分解酵素、及び、マルトース生成型α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）のようないくつかの生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元性末端からデンプン分子を開裂する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０、α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３、α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、及び、生成物特異的アミラーゼは、デンプンから特定の長さのマルトオリゴ糖を生じさせることができる。本明細書で用いられているように、アミラーゼは、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及び、バチルス属(例えば、バチルスリケニフォルミス及びバチルスサチリス）等の野生型α−アミラーゼを含むあらゆる／すべてのアミラーゼを含む。一方で、α−アミラーゼは、これらの酵素の部分集合を含む。
本明細書で用いられているように、「バチルス種株ＴＳ−２３α−α−アミラーゼ」及び同様のフレーズは、バチルス種に由来するα−アミラーゼを表す。α−アミラーゼをコードする遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいし、又は、α−アミラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドであってもよい。バチルス種株ＴＳ−２３の成熟したα−アミラーゼは、以下（アミノ基からカルボキシ基方向）（配列番号１）の通りである。
NTAPINETMM QYFEWDLPND GTLWTKVKNE AANLSSLGIT ALWLPPAYKG 50
TSQSDVGYGV YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TKTQYIQAIQ AAKAAGMQVY 100
ADVVFNHKAG ADGTEFVDAV EVDPSNRNQE TSGTYQIQAW TKFDFPGRGN 150
TYSSFKWRWY HFDGTDWDES RKLNRIYKFR STGKAWDWEV DTENGNYDYL 200
MFADLDMDHP EVVTELKNWG TWYVNTTNID GFRLDAVKHI KYSFFPDWLT 250
YVRNQTGKNL FAVGEFWSYD VNKLHNYITK TNGSMSLFDA PLHNNFYTAS 300
KSSGYFDMRY LLNNTLMKDQ PSLAVTLVDN HDTQPGQSLQ SWVEPWFKPL 350
AYAFILTRQE GYPCVFYGDY YGIPKYNIPG LKSKIDPLLI ARRDYAYGTQ 400
RDYIDHQDII GWTREGIDTK PNSGLAALIT DGPGGSKWMY VGKKHAGKVF 450
YDLTGNRSDT VTINADGWGE FKVNGGSVSI WVAKTSNVTF TVNNATTTSG 500
QNVYVVANIP ELGNWNTANA IKMNPSSYPT WKATIALPQG KAIEFKFIKK 550
DQAGNVIWES TSNRTYTVPF SSTGSYTASW NVP 583
本明細書で用いられているように、「α−アミラーゼ変異体」及び同様のフレーズは、対照α−アミラーゼの変種／変異体であって、対照α−アミラーゼの親（野生型、対照）アミノ酸配列に対してアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含むものを表す。「変異体（variant）」という用語は、「変異体（mutant）」という用語と互いに区別なく使用される。変異体α−アミラーゼは、親シグナル配列に関してシグナル配列中に変異を含み得る。さらに、変異体α−アミラーゼは、バチルスリケニフォルミス（ＬＡＴ）等に由来する異種起源α−アミラーゼシグナル配列を含む融合タンパクの形態であってもよい。
本明細書で用いられているように、「親バチルス種株ＴＳ−２３ α−アミラーゼ」、「野生型バチルス種株ＴＳ−２３ α−アミラーゼ」、「対照バチルス種株ＴＳ−２３ α−アミラーゼ」、及び、同様のフレーズは、バチルス種株ＴＳ−２３のポリペプチドを表す。この用語は、便宜上、「親酵素」、「野生型酵素」、「親ポリペプチド」、及び、「対照ポリペプチド」と略すことができる。親バチルス種株ＴＳ−２３ α−アミラーゼは、親ポリペプチドのシグナル配列中に変異を含んでいてもよい。さらに、親バチルス種株ＴＳ−２３ α−アミラーゼは、バチルスリケニフォルミス（ＬＡＴ）等に由来する異種起源α−アミラーゼシグナル配列を含む融合タンパクの形態であってもよい。
本明細書で用いられているように、「親核酸／ポリヌクレオチド」、「野生型核酸／ポリヌクレオチド」又は「対照核酸／ポリヌクレオチド」は、親ポリペプチドをコードする核酸配列及びそれに対して相補的な核酸を表す。
本明細書で用いられているように、「変異体の核酸／ポリヌクレオチド」は、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列若しくはそれに対して相補的な核酸、又は、親ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの塩基の置換、挿入又は欠失を有するポリヌクレオチド配列若しくはそれに対して相補的な核酸を表す。そのような核酸は、特定の場合には、対照配列に対して特定の程度の相同性を有するもの、又は、例えば、ストリンジェント条件［例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ３シトレート、ｐＨ７．０）］又は、高度なストリンジェント条件［例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ３シトレート、ｐＨ７．０）］において、対照配列に対してハイブリダイズできるものを含んでいてもよい。変異体核酸は、メチロトローフ酵母（例えば、ピチア、ハンゼヌラなど）若しくは糸状菌（例えばトリコデルマ（例えばトリコデルマリーゼイ）など）、又は、他の発現宿主（例えばバチルス、ストレプトミセスなど）のような特定の宿主生物のための好ましいコドン使用を考慮するように最適化されたものであってもよい。
本明細書で用いられているように、「組換」という用語は、対象の細胞、核酸、タンパク又はベクターについて使用されたときに、その対象が異種起源の核酸若しくはタンパクの導入によって又は天然の核酸若しくはタンパクの変性によって修飾されること、又は、その細胞がそのように修飾された細胞に由来することを表す。従って、例えば、組換細胞は、その細胞の天然（非組換）形態においてはみられない遺伝子を発現するか、又は、天然の遺伝子を過剰発現、過少発現若しくは全く発現しない。
本明細書で用いられているように、「回収された」、「単離された」、及び、「分離された」という用語は、化合物、タンパク、細胞、核酸又はアミノ酸であって、それらに天然に付随し、かつ、天然においてみられる少なくとも１つの成分から除去されたものを表す。
本明細書で用いられているように、「精製される」という用語は、相対的に純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は、少なくとも約９９％純粋である材料（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）を表す。
本明細書で用いられているように、「熱安定性」及び「耐熱性」という用語は、酵素が高温への暴露の後に活性を保持する能力を表す。α−アミラーゼ酵素のような酵素の耐熱性は、定義された条件下で酵素活性の半分が失われる分、時間又は日数において与えられる半減期（ｔ１／２）によって測定される。この半減期は、高温への暴露（すなわち、高温による試験）の後に残存α−アミラーゼ活性を測定することによって算出することができる。
本明細書で用いられているように、「ｐＨ領域」は、酵素が触媒能力を示すｐＨの範囲を表す。
本明細書で用いられているように、「ｐＨ安定」及び「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が所定時間（例えば、１５分、３０分、１時間など）にわたって広範囲のｐＨで活性を保持する能力に関する。
本明細書で用いられているように、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」、「タンパク」及び「ペプチド」という用語と同義であり、互いに区別なく用いる。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合には、それらを「酵素」と称することができる。本明細書においては、アミノ酸残基のための従来の１文字又は３文字のコードを使用する。
本明細書で用いられているように、「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び、ポリペプチドをコードすることができる合成分子を包含する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、化学修飾されたものであってもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互いに区別なく用いる。遺伝子コードが縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするために１つよりも多いコドンを使用することができ、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。別段の定めがない限り、核酸は、左から右へ５′から３′の方向で記載されており、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシへそれぞれ記載されている。
本明細書で用いられているように、「同族体（homologue）」という用語は、対照のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対する特定程度の同一性又は他の特定の共通の構造的又は機能的特徴を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列を表す。相同配列は、従来の配列比較手段（例えばＣｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて対象配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むように理解される。一般に、同族体は、別段の定めがない限り、対象アミノ酸配列と同一の活性部位残基を含むであろう。
本明細書で用いられているように、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法の間に生じるような、核酸塩基の一本鎖が相補鎖とペアになるプロセスを表す。
本明細書で用いられているように、「合成」分子は、生物によってではなく、インビトロにおける化学的な又は酵素的な合成によって生じる。
本明細書で用いられているように、細胞に関して使用された「形質転換された」、「安定的に形質転換された」及び「トランスジェニック」という用語は、その細胞のゲノムへ統合された、又は、複数世代を経て維持されるエピゾームのプラスミドとして伝えられる非天然（例えば、異種起源）の核酸配列をその細胞が有することを意味する。
当業界において知られているように、細胞内に核酸配列を挿入するという文脈における「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「トランスダクション」を意味する。
本明細書で用いられているように「宿主株」又は「宿主細胞」という用語は、発現ベクター、ファージ、ウイルス、又は、対象のポリペプチド（例えば、変異体α−アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む他のＤＮＡ構築物を導入した生物を表す。典型的な宿主株は細菌細胞である。「宿主細胞」という用語は、バチルス属等の細胞から生成された原形質体を含む。
本明細書で用いられているように、ポリヌクレオチド又はタンパクに関する「異種起源（heterologous）」という用語は、宿主細胞中に天然には生じないポリヌクレオチド又はタンパクを表す。
本明細書で用いられているように、ポリヌクレオチド又はタンパクに関する「内因性の（endogenous）」という用語は、宿主細胞中に天然に生じるポリヌクレオチド又はタンパクを表す。
本明細書で用いられているように、「発現（expression）」用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスを表す。このプロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
本明細書で用いられているように、「選択マーカー（selective marker）」又は「選択可能なマーカー（selectable marker）」は、その遺伝子を有する宿主細胞の選択を容易にするように宿主において発現され得る遺伝子を表す。選択マーカーの例は、限定されるものではないが、抗菌剤（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン又はネオマイシン）、及び／又は、宿主細胞に栄養的優位のような代謝的優位を与える遺伝子を含む。
本明細書で用いられているように、「インキュベート（culturing）」は、液体又は固形の培地において適切な条件下で微生物細胞の個体群を育てることを表す。インキュベートは、（一般に管又は反応器の中で）粒状デンプンを含むデンプン基質の発酵による最終生成物への生物学的変換を含む。
本明細書で用いられているように、「発酵（fermentation）」は、微生物による有機物質の酵素的分解であって、より単純な有機化合物を生じる酵素的分解である。発酵は一般に嫌気条件下で生じるが、発酵は酸素の存在下においても生じるので、この用語が厳密な嫌気条件のみに限定されるようには意図されていない。
本明細書で用いられているように、「遺伝子（gene）」は、ポリペプチドの生産に関与し、かつ、コード領域、コード領域の前後の部位、及び、個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含むＤＮＡ断片を表す。
本明細書で用いられているように、「ベクター（vector）」は、１つ以上の細胞種の中へ核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド配列を表す。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、及び、カセット等を含む。
本明細書で用いられているように、「発現ベクター（expression vector）」は、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、適切な宿主においてそのＤＮＡの発現を可能にする適切な制御配列に作用可能な状態で結合したＤＮＡ構築物を表す。そのような制御配列は、転写を達成するためのプロモータ、転写を制御するための選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、並びに、転写及び翻訳の終了を制御するエンハンサ及び配列を含んでいてもよい。
本明細書で用いられているように、「プロモータ（promoter）」は、遺伝子の転写を開始させるためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する調節配列である。プロモータは、誘導可能なプロモータ又は常時発現のプロモータであってもよい。典型的なプロモータは、バチルスリケニフォルミスα−アミラーゼ（ＡｍｙＬ）プロモータである。
本明細書で用いられているように、「作用可能な状態で連結した（operably linked）」という用語は、特定の成分が意図された態様で機能できる関係（並置を含むが、これに限定されるものではない）にあることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列の発現がその調節配列の制御下に置かれるように、そのコード配列に作用可能な状態で連結される。
本明細書で用いられているように、「転写制御下（under transcriptional control）」という用語は、ポリヌクレオチド配列（通常はＤＮＡ配列）の転写が、転写の開始に寄与する又は転写を促進する因子にその配列が作用可能な状態で連結されていることに依存することを意味する。
本明細書で用いられているように、「翻訳制御下（under translational control）」という用語は、ポリヌクレオチド配列（通常はＲＮＡ配列）からポリペプチドへの翻訳が、翻訳の開始に寄与する又は翻訳を促進する因子にその配列が作用可能な状態で結合していることに依存することを意味する。
本明細書で用いられているように、「シグナル配列（signal sequence）」は、タンパクのＮ末端部位に付着したアミノ酸の配列であって、細胞外へのそのタンパクの分泌を容易にする配列である。細胞外タンパクの成熟形態はシグナル配列を欠いており、そのシグナル配列は分泌プロセス中に切断される。
本明細書で用いられているように、「生物学的に活性である（biologically active）」は、酵素活性のような特定の生物学的活性を有する配列を表す。本発明のアミラーゼの場合、活性がα−アミラーゼ活性である。
本明細書で用いられているように、「水の硬度（water hardness）」は、水中に存在する無機質（例えばカルシウム及びマグネシウム）の量である。
本明細書で用いられているように、「冷水（cold water）」という用語は、温度が約２５℃より低い水を表す。特定の場合、冷水は、温度が約２０℃より低い水を表す。典型的な冷水の温度範囲は、約１５℃から約２５℃、及び、約１５℃から約２０℃である。
本明細書で用いられているように、「性能指数（performance index）（ＰＩ）」という用語は、親又は対照のアミラーゼに対する変異体の性能の比を表す。性能指数（すなわち特性）の測定値は、熱安定性、洗浄能力、及び、発現レベルなどを含むものであり、文脈から明らかにされる。
本明細書で用いられているように、性能を向上させる変異は、「上昇変異（up mutations）」として知られており、特定の特性についてＰＩ＞１を有する。「中間変異（Neutral mutations）」は、特定の特性についてＰＩ＞０．５を有する。「非有害変異（Non-deleterious mutations）」は、特定の特性についてＰＩ＞０．０５を有する。「有害変異（Deleterious mutations）」は、特定の特性についてＰＩ≦０．０５を有する。「組み合わせ可能変異（Combinable mutations）」は、少なくとも１つの特性についてＰＩ≧０．５を有し、すべての特性についてＰＩ＞０．０５を有する。少なくとも１つの有益な特性を有する酵素を生産するために、同一の変異体中に、複数の組み合わせ可能な変異が同時に存在してもよい。
本明細書で用いられているように、「活性の測定値（measure of activity）」という用語は、本明細書に記載されているような酵素活性の測定値を表す。活性のそのような測定は、ｐＨ８における洗浄性能、ｐＨ１０における洗浄性能、１６℃における洗浄性能、３２℃における洗浄性能、及び、合成基質を使用した活性を含む。
本明細書で用いられているように、「安定性の尺度（measure of stability）」という用語は、本明細書に記載されているような酵素の安定性の測定値を表す。安定性のそのような尺度には、洗剤及び耐熱性中の安定性が含まれる。
本明細書で用いられているように、「共配合（co-formulation）」という用語は、酵素のような対象成分が同一の液体、半固形又は乾燥組成物の中に一緒に存在することを意味する。
本明細書で用いられているように、「糖化（saccharification）」は、デンプンからグルコースへの酵素による変換を表す。
本明細書で用いられているように、「ゼラチン化（gelatinization）」は、粘性懸濁液を作成するための煮沸によるデンプン分子の可溶化を表す。
本明細書で用いられているように、「液化（liquefaction）」は、デンプン変換において、ゼラチン化されたデンプンを加水分解して低分子量の可溶性デキストリンを与える段階を表す。
本明細書で用いられているように、「第一の液化（primary liquefaction）」という用語は、スラリーの温度がそのゼラチン化温度に上昇したとき又はそのゼラチン化温度の近くに上昇したときの液化の１ステップを表す。温度の上昇の後に、スラリーは、２００乃至３００°Ｆ（例えば、２２０乃至２３５°Ｆ）の温度熱交換器又はジェットを通るように送られる。熱交換又はジェット温度への作用の後に、そのスラリーをその温度で３乃至１０分間にわたって保持する。２００乃至３００°Ｆでスラリーを保持するこのステップが第一の液化である。
本明細書で用いられているように、「第２の液化（secondary liquefaction）」という用語は、第一の液化（２００乃至３００°Ｆに加熱）の後の液化ステップであって、スラリーを大気温度に冷ますときを表す。この冷却ステップは、３０分乃至１８０分（３時間）、例えば、９０分乃至１２０分（２時間）である。
本明細書で用いられているように、「第２の液化の分間（minutes of secondary liquefaction）」という用語は、第２の液化の開始からデキストロース当量を測定する時までに経過した時間を表す。
本明細書で用いられているように、「重合度（degree of polymerization）（ＤＰ）」という用語は、所定の糖類中のアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）を表す。ＤＰ１の例はグルコース及びフルクトースのような単糖類である。ＤＰ２の例はマルトース及びスクロースのような二糖類である。ＤＰ＞３は、３を超える重合度を有するポリマーを表す。
デンプン変換に関して本明細書で用いられているように、「最終生成物（end-product）」及び「所望の最終生成物（desired end-product）」という用語は、特定の炭素源に由来する分子であって、デンプン基質から酵素によって変換された分子を表す。
本明細書で用いられているように、「乾燥固形分含量（dry solids content）（ｄｓ）」という用語は、乾燥重量％で表されたスラリー中の全固形物を表す。
本明細書で用いられているように、「スラリー（slurry）」という用語は、不溶性固体を含む水溶性混合物を表す。
本明細書で用いられているように、「残余デンプン（residual starch）」という用語は、デンプン含有基質の発酵又は酵素加水分解の後の組成物中の残りのデンプン（可溶性又は不溶性）を表す。
本明細書で用いられているように、「再利用するステップ（a recycling step）」は、マッシュ成分の再利用を表すものであり、マッシュ成分は、デンプンを含む基質を発酵させるための残余デンプン、酵素及び／又は微生物を含んでいる可能性がある。
本明細書で用いられているように、「マッシュ（mash）」という用語は、発酵可能な炭素源（例えば炭水化物）を含む水溶性混合物であって、アルコールなどの発酵した生成物を生産するために使用することができるものを表す。「ビール（beer）」及び「マッシュ（mash）」という用語は、互いに区別なく用いることができる。
本明細書で用いられているように、「蒸留廃液（stillage）」という用語は、発酵しなかった固体及び水分の混合物を表し、発酵液からアルコールを除去した後の残留物を表す。
本明細書で用いられているように、「蒸留乾燥穀類（distillers dried grain）（ＤＤＧ）」、「可溶性物質を含む蒸留乾燥穀類（distillers dried grain with solubles）（ＤＤＧＳ）」という用語は、穀類発酵の有用な副産物を表す。
本明細書で用いられているように、「エタノール生産性微生物（ethanologenic microorganism）」は、糖又はオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物を表す。エタノール生産性微生物は、糖を個別に又は一緒にエタノールに変換する１つ又はそれ以上の酵素を発現する能力によってエタノール生産性である。
本明細書で用いられているように、「エタノール生産者（ethanol producer）」又は「エタノールを生産する微生物（ethanol producing microorganism）」という用語は、ヘキソース又はペントースからエタノールを生産することができるあらゆる生物又は細胞を表す。一般に、エタノールを生産する細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。微生物を生産するエタノールの例には、酵母菌などの真菌性微生物が含まれる。好ましい酵母菌には、サッカロミセスの株、特にサッカロミセスセレビシエが含まれる。
アミラーゼ酵素及びそれらの基質に関して本明細書で用いられているように、「接触させる（contacting）」という用語は、酵素が基質を最終生成物に変換することを可能にするのに充分な程度に基質の近くに酵素を置くことを表す。この接触は混合を含んでいてもよい。
本明細書で用いられているように、「から由来する（derived from）」という用語は、文脈に応じて、「から生じた（originated from）」、「に基づいた（based on）」、「から得た（obtained from）」、「から入手可能（obtainable from）」、又は、「から単離された（isolated from）」を意味する。
本明細書で用いられているように、「酵素変換（enzymatic conversion）」という用語は、一般に、酵素活性（例えばアミラーゼ）による基質（例えばデンプン）の修飾を表す。
本明細書で用いられているように、「解体（disintegration）」という用語は、生物膜中の個々の微生物細胞を一緒に連結及び結合する生物膜マトリクス中の多糖類の加水分解であって、それによって生物膜から微生物細胞を解放及び除去できるものを表す。
本明細書で用いられているように、「サンプル（swatch）」は、布などの材料の一片であって、組成物の洗浄効率を評価するために染色を適用することができるものである。
本明細書で用いられているように、「比活性（specific activity）」という用語は、特定条件下において酵素製剤によって単位時間当たりに生成物に変換される基質のモル数を表す。比活性はタンパクの単位（Ｕ）／ｍｇとして表される。
本明細書で用いられているように、「生産量（yield）」という用語は、プロセスによって生産される最終生成物の量を表すものであり、例えば、出発材料の濃度、体積、量、又は、パーセンテージで表される。
本明細書で用いられているように、「ＡＴＣＣ」は、マナッサス、バージニア州２０１０８（ＡＴＣＣ）に位置する米国インキュベート菌保存施設（American Type Culture Collection）を表す。
本明細書で用いられているように、「ＮＲＲＬ」は、ピオリア、イリノイ州のAgricultural Research Service Culture Collection、National Center for Agricultural Utilization Research（USDA Northern Regional Research Laboratoryとして従来知られている）を表す。
数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。
一般に、見出しは説明的なものであって、限定するものとして意図されていない。
１．２ 命名法
本明細書及び特許請求の範囲においては、アミノ酸残基を表す従来の１文字及び３文字のコードを使用する。参照のし易さのために、本発明の組成物及び方法のα−アミラーゼ変異体を以下の命名法を使用することによって記載する。
元のアミノ酸：位置：置換したアミノ酸
この命名法によれば、例えば、位置２４２におけるアラニンによるセリンの置換は、Ｓｅｒ２４２Ａｌａ又はＳ２４２Ａのように示される。位置３０におけるアラニンの欠失は、Ａｌａ３０＊又はＡ３０＊、又は、ΔＡ３０のように示される。リジンなどのさらなるアミノ酸残基の挿入は、Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫのように示される。
アミノ酸残基３０−３３のようなアミノ酸残基の連続した範囲の欠失は、（３０−３３）＊又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）又はΔ３０−３３として示される。アミノ酸残基Ｒ１８０−Ｓ１８１のような２つの連続したアミノ酸の欠失は、ΔＲＳ又はΔ１８０−１８１として示される。
特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼと比較して「欠失」を含んでおり、そのような位置に挿入がなされている場合、これは、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入について、＊３６Ａｓｐ又は＊３６Ｄのように示される。
複数の変異はプラス又はマイナスの記号によって分離される。Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ、Ａｌａ３０Ａｓｐ−Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ−Ｅ３４Ｓは、位置３０及び３４においてそれぞれアラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンで置換する変異を表す。
所定位置の残基に代えて１つ以上の代替アミノ酸残基を用いることができるとき、それは、Ａ３０Ｎ，Ｅ、又は、Ａ３０Ｎ若しくはＡ３０Ｅのように示される。
さらに、本明細書においていかなる特定の修飾も示唆されることなく修飾に適した位置が同定されているときは、その位置に存在するアミノ酸残基に代えてあらゆるアミノ酸残基を用いることができることは理解されるに違いない。したがって、例えば、位置３０におけるアラニンの修飾が言及されているが、特定されていないときには、そのアラニンが削除されてもよいし、又は、他のあらゆるアミノ酸（すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つ）で置換されてもよいことが理解されるに違いない。
さらに、「Ａ３０Ｘ」は、Ａ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ若しくはＡ３０Ｖ、又は、短く、Ａ３０Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖの置換のいずれか１つを意味する。
不特定の親アミラーゼのある位置のアミノ酸残基であって、その位置が配列番号２として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応によって番号付けられている場合は、以下の命名法を使用する。例えば、Ｎ又はＶの１つが変異体アミラーゼの位置３０に存在し、２０種の標準アミノ酸の１つが親アミラーゼ（例えば野性型又は変異体酵素）中に存在する場合には、「Ｘ３０Ｎ」又は「Ｘ３０Ｎ，Ｖ」である。
１．３ アミノ酸残基の特性
帯電した酸には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及び、Ｈｉｓが含まれる。負に帯電したアミノ酸（最も負に帯電している残基は初めのものである）はＡｓｐ及びＧｌｕである。正に帯電したアミノ酸（最も正に帯電している残基は初めのものである）はＡｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓである。
中性アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及び、Ｐｒｏが含まれる。
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性の残基を最後に記載する）には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及び、Ｔｒｐが含まれる。
親水性アミノ酸（最も親水性の残基を最後に記載する）には、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、及び、Ａｓｎが含まれる。
１．４ 相同性（同一性）
他の配列との配列同一性の特定のパーセント（例えば７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、９９％）を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、位置合わせをしたときに、２つの配列の比較において塩基又はアミノ酸残基のパーセンテージが同じであることを意味する。この配列比較及び相同性又は同一性のパーセントは、当業界で知られているあらゆる適切なソフトウェアプログラム、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18)に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいプログラムには、Vector NTI Advance(商標) 9.0 (Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)、GCG Pileupプログラム、FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)、及び、BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., and Altschul et al., (1997) NAR 25:3389-3402)が含まれる。他の好ましい配列比較プログラムはALIGN Plus(Scientific and Educational Software、ペンシルベニア州)であり、好ましくはデフォルトパラメータを使用する。使用できる他のシーケンスソフトプログラムは、シーケンスソフトウェアパッケージバージョン６．０（Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）において利用可能なTFASTA Data Searching Programである。
相同性は、第１の配列が第２の配列から由来したことを示す２つの配列間の同一性の程度として決定することができる。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージ（上述）において提供されているＧＡＰのような当業界に知られたコンピュータプログラムによって適切に決定することができる。したがって、ＧＡＰ ＧＣＧ ｖ８は、同一性のためのデフォルトスコアリングマトリクス、及び、以下のデフォルトパラメータ：核酸配列比較のためにそれぞれ５．０のギャップクリエーションペナルティ及び０．３のギャップエクステンションペナルティ、及び、タンパク配列比較のためにそれぞれ３．０のギャップクリエーションペナルティ及び０．１のギャップエクステンションペナルティと共に使用することができる。ＧＡＰは、配列比較を行って同一性を算出するために、Needleman and Wunsch, (1970), J.Mol.Biol. 48:443-453の方法を使用する。
ＢＡＳＥ（配列番号２）又はＢＡＳＥ変異体と、例えば他のα−アミラーゼとの間の構造的配列比較は、ＡｍｙＴＳ２３と、例えば、約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の高い程度の相同性を有する他のα−アミラーゼにおける同等の／対応する位置を同定するために使用することができる。構造的配列比較を得る１つの方法は、ギャップペナルティのデフォルト値（すなわち、３．０のギャップクリエーションペナルティ及び０．１のギャップエクステンションペナルティ）を用いて、ＧＣＧパッケージから提供されるPile Upプログラムを使用することである。他の構造的配列比較方法には、疎水性クラスター分析（hydrophobic cluster analysis）(Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155)、及び、リバーススレッディング(Huber and Torda, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No.1 pp. 142-149 (1998)が含まれる。
様々な対照アミラーゼの成熟形態の典型的な配列比較を図１として与える。対照アミラーゼには：本明細書においてＡｍｙＴＳ２３ｔ又はＢＡＳＥと称される、先端を切断したバチルス種ＴＳ−２３ α−アミラーゼ、配列番号２（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＡ６３９００）；本明細書においてＡｍｙＬ又はＬＡＴと称される、バチルスリケニフォルミス（B. licheniformis）α−アミラーゼ、配列番号５（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＡ２２２４０）；ゲオバチルス（Geobacillus ）（以前はバチルス）ステアロサーモフィルス（stearothermophilus）α−アミラーゼＡｍｙＳ、配列番号６（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＡ２２２４１）、バチルスアミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）α−アミラーゼＢＡＣＡＭ、配列番号７（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＡ２２１９１）；本明細書においてＡｍｙＧ６又はＡｍｙ＃７０７と称される、バチルス種＃７０７α−アミラーゼ、配列番号８（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＡ２２２３１）；バチルスメガテリウム（B. megaterium）α−アミラーゼ ＡｍｙＧ５又はＡｍｙＢｍ、配列番号９（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＫ００５９８）；バチルス種α−アミラーゼＡＬＢＡ、配列番号１０（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＣＡＬ４８１５５及びＷＯ２００６／０３７４８４）；バチルスハルマパルス（B. halmapalus）アミラーゼＡｍｙＢｈ、配列番号１１（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＥ００４３２及び米国特許第５，８５６，１６４号）；バチルス種アミラーゼＡＡ５６０、配列番号１２（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＣＡＣ１６４８６及びＷＯ２０００／０６００６０）；バチルス種ＫＳＭ−ＡＰ１３７８α−アミラーゼＡｍｙＫＳＭ１３７８、配列番号１３（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＣＡＤ３５９８５及びＥＰ１１９９３５６Ａ）；及び、バチルス種ｐＨＳＰ−Ｋ３８アミラーゼＡｍｙＫ３８、配列番号１４（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＣＡＪ０００４０及びＷＯ２００５／０４５０４５）が含まれる。MUSCLE 3.7複数配列比較アルゴリズム（multiple sequence alignment algorithm）(Edgar, Nucleic Acids Research, 32:1792-1797, 2004)を用いて配列を比較した。図１の配列比較のα−アミラーゼのパーセント同一性を示すマトリクスを表１に与える。
表１ α−アミラーゼパーセント同一性マトリクス＊
Figure 0005651682
１．５ ハイブリダイゼーション
前記ＡｍｙＴＳ２３の特性評価において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、問題のα−アミラーゼの完全な又は部分的なヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて適切に調製することができる。
ハイブリダイゼーションを試験するのに適した条件は、５×ＳＳＣにあらかじめ浸すステップと、２０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、及び、５０ｍｇの変性させた超音波処理された子ウシ胸腺ＤＮＡの溶液中で４０℃で１時間予備ハイブリダイズさせるステップと、次いで、１００ｍＭのＡＴＰを追加した同じ溶液中において４０℃での１８時間のハイブリダイゼーションと、次いで、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で４０℃で３０分間（低い厳格性）、より好ましくは５０℃（中程度の厳格性）、さらに好ましくは６５℃（高い厳格性）、さらに好ましくは７５℃（非常に高い厳格性）でフィルタを３回洗浄するステップとを含む。ハイブリダイゼーション方法に関するさらなる詳細は、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989において見つけることができる。
本明細書の文脈において、「から由来する（derived from）」は、問題の生物種によって生産される又は生産することができるα−アミラーゼだけでなく、そのような種から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、かつ、そのＤＮＡ配列で形質転換した宿主生物において生産されるα−アミラーゼも示すことが意図されている。最後に、この用語は、合成の及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によってコードされ、かつ、問題のα−アミラーゼの同定特性を有するα−アミラーゼを示すように意図されている。また、この用語は、親α−アミラーゼが、天然に存在するα−アミラーゼの変異体、すなわち、天然に存在するα−アミラーゼの１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果物である変異体であってもよいことも示すように意図されている。
当業者は、例示されている塩基配列（例えば配列番号４）とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力によって、本明細書の組成物及び方法によって包含される配列が定義されることを認識であろう。核酸の一本鎖の形態が適切な温度条件及び溶液イオン強度の下で他の核酸にアニールすることができるとき、核酸は他の核酸配列にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、当業界において広く知られている（例えば、Sambrook (1989) supra、特にチャプター9及び11を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ストリンジェント条件は、６５℃の温度及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する。
１．６ 親α−アミラーゼ
本明細書の開示に従って、あらゆるα−アミラーゼを親α−アミラーゼ（すなわち、骨格）として使用することができる。好ましい一実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）である。
１．７ 変化した特性
以下の段落は、本明細書に記載されている変異体アミラーゼ中に存在する変異と、その変異から生じ得る（親α−アミラーゼの特性と比較した）特性における所望の変化との関係を記載する。本発明の組成物及び方法によって包含される変異体は、明細書に詳細に記載されており、以下の段落は単なる概説である。
上述したように、組成物及び方法の態様は、親アミラーゼと比較して変化した特性を有する変種／変異体を含むバチルス種株のα−アミラーゼから由来する又は由来し得るα−アミラーゼに関する。親アミラーゼは、上記親α−アミラーゼ、並びに、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列などのα−アミラーゼの少なくとも一部を含むハイブリッドのアミラーゼ若しくはキメラのアミラーゼである。
ＢＡＳＥα−アミラーゼ（配列番号２）は変異体アミラーゼについての検討のための出発点として用いられているが、このＢＡＳＥα−アミラーゼに対して高い程度の相同性を有する他のバチルスα−アミラーゼが、組成物及び方法の範囲を無効化することなく、親アミラーゼとしての役割を果たすことができることは理解されるに違いない。このことは、本開示の主題である、置換、欠失又は挿入を含まないＢＡＳＥα−アミラーゼと比較してわずかな配列の相違のみを含む他の天然バチルスα−アミラーゼに特に当てはまる。
本発明の組成物及び方法の第１の態様において、親バチルス種α−アミラーゼの変異体を提供する。いくつかの実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、アミラーゼ活性を有し、かつ、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８２、８３、８７、９０，９１、９３、９４、９５、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１５９，１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３，１９５、１９７、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３７、２３８、２３９、２４０、２４３、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７３、２７５，２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０，３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７９、４７５、４８３、及び、４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上（好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個以上）の位置における置換を含む成熟形態である。別段の定めがなければ、これらの位置は、配列番号２（ＢＡＳＥ）として記載されている対照α−アミラーゼのアミノ酸配列との対応（例えば、図１に提供されているそのようなα−アミラーゼ配列の配列比較における同じ位置）によって番号付けられたものである。いくつかの好ましい実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。他の好ましい実施形態において、α−アミラーゼ変異体は、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群の任意のものに対して少なくとも７５％（好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼから由来する。いくつかの実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、位置５８のチロシン及び位置２３６のアラニンを含む。いくつかの実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、位置２４３のグルタミン及び位置４７５のリジンを含む。
また、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有する成熟形態であり、かつ、１８２、１８３、３０５、３２０、３７９、４０７、４１９、及び、４７５からなる群より選択される１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含む変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来するものであり、及び／又は、その置換が、Ｔ１８２Ｎ、Ｇ１８３Ｎ、Ｙ３０５Ｑ、Ｑ３２０Ｆ、Ｐ３７９Ａ、Ｑ４０７Ｄ、Ｔ４１９Ｓ及びＧ４７５Ｔからなる群の１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む（例えば、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ１の変異体）。
さらに、本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、１６０、１８２、１８３、１８９、３０５、３７９、及び、４７５からなる群より選択される１個〜７個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個）の位置における置換を含む成熟形態である変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態おいて、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼから由来するものであり、及び／又は、その置換が、Ｙ１６０Ｅ、Ｔ１８２Ｇ、Ｇ１８３Ｎ、Ｅ１８９Ｐ、Ｙ３０５Ｇ、Ｐ３７９Ｅ、及び、Ｇ４７５Ｔからなる群の１個〜７個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個）を含む（例えば、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ２の変異体）。
本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、１２５、１８２、２１４、２７９、３０５、３１９、３２０、及び、４７５からなる群より選択される１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含む成熟形態である変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼから由来するものであり、及び／又は、その置換が、Ｓ１２５Ａ、Ｔ１８２Ａ、Ｔ２１４Ｑ、Ｔ２７９Ｎ、Ｙ３０５Ｒ、Ｄ３１９Ｔ、Ｑ３２０Ｎ、及び、Ｇ４７５Ｒからなる群の１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む（例えば、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ３の変異体）。
さらに、本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、７、１８２、２９８、３７６、３７９、４０７、４１９、及び、４５３からなる群より選択される１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）の位置における置換を含む成熟形態である変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来するものであり、及び／又は、その置換が、Ｅ７Ｈ、Ｔ１８２Ｗ、Ｔ２９８Ｑ、Ｙ３７６Ｒ、Ｐ３７９Ｋ、Ｑ４０７Ｗ、Ｔ４１９Ｓ、及び、Ｌ４５３Ｗからなる群の１個〜８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）を含む（例えば、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ４の変異体）。
本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、１２８、１７８、１８２、及び、１８５からなる群より選択される１個〜４個（例えば、１個、２個、３個又は４個）の位置における置換を含む成熟形態であり、また、位置２４３にセリン又はグルタミンを含むα−アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼから由来するものであり、及び／又は、その置換が、Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ及びＡ１８５Ｄからなる群の１個〜４個（例えば、１個、２個、３個又は４個）を含む（例えば、ＢＡＳＥ−Ｓ１乃至ＢＡＳＥ−Ｓ３２変異体）。
さらなる実施形態において、本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、１２５、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９、及び、４７５からなる群より選択される１個〜９個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個）の位置における置換を含む成熟形態であり、位置３２０にグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含むα−アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、位置１２５のセリン又はアラニン；位置１８２のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン；位置１８３のグリシン又はアスパラギン；位置１８９のグルタミン酸又はプロリン；位置２７９のトレオニン又はアスパラギン；位置３０５のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン；位置３１９のアスパラギン酸又はトレオニン；位置３７９のプロリン又はアラニン；及び、位置４７５のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含む（例えば、ＢＡＳＥ−Ｐ１乃至ＢＡＳＥ−Ｐ１２変異体）。
また、本明細書の開示は、単離されたα−アミラーゼ変異体であって、アミラーゼ活性を有し、かつ、１２５、１２８、１７８、１８２、１８３、１８９、２７９、３０５、３１９、３７９、及び、４７５からなる群より選択される１個〜１１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個）の位置における置換を含む成熟形態であり、位置２４３のグルタミン又はセリン、並びに、位置３２０のグルタミン、フェニルアラニン又はアスパラギンを含むα−アミラーゼ変異体を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、ＢＡＳＥ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｑ及びＡＣＥ−ＱＫからなる群より選択される親α−アミラーゼに由来する。いくつかの好ましい実施形態において、このα−アミラーゼ変異体は、位置１２５のセリン又はアラニン；位置１２８のアスパラギン又はシステイン；位置１７８のリジン又はロイシン；位置１８２のトレオニン、アスパラギン、グリシン又はアラニン；位置１８３のグリシン又はアスパラギン；位置１８９のグルタミン酸又はプロリン；位置２７９のトレオニン又はアスパラギン；位置３０５のチロシン、グルタミン、グリシン又はアルギニン；位置３１９のアスパラギン酸又はトレオニン；位置３７９のプロリン又はアラニン；及び、位置４７５のグリシン、トレオニン又はアルギニンを含む（例えば、ＢＡＳＥ−Ｗ１乃至ＢＡＳＥ−Ｗ１３変異体）。特許請求の範囲に記載されている組成物及び方法に使用するための多数の典型的なα−アミラーゼ変異体が開示されている。次のα−アミラーゼ変異体：ＢＡＳＥ ＳＥＬ変異体、ＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬ変異体、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ１変異体、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ２変異体、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ３変異体、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ４変異体、ＢＡＳＥ−Ｓ１乃至Ｓ３２組み合わせ変異体、ＢＡＳＥ−Ｐ１乃至Ｐ１２コンビナトリアル変異体、ＢＡＳＥ−Ｗ１乃至Ｗ１３コンビナトリアル変異体、及び、ＡＣＥ−ＱＫ変異体は、典型的なα−アミラーゼ変異体である。しかしながら、本明細書の開示のα−アミラーゼ変異体は、典型的な変異体に限定されるものではなく、対応する位置に置換を有する他のバチルス種親α−アミラーゼの変異体を含む。本明細書で提供されている配列比較及び他のデータに基づいて他のα−アミラーゼポリペプチドの中に（つまり、他の「骨格」の中に）対応する置換を作成することができること、及び、得られるアミラーゼ変異体が例示されているものと同様の特性を有すると予想されることは、理解されるに違いない。
１．７．１ 安定性
本明細書に記載されている変異体の文脈において、変化した（つまり、より高い又はより低い）安定性、特に、特別に高い温度（すなわち、７０℃乃至１２０℃）及び／又は極端なｐＨ（すなわち、低い又は高いｐＨ、すなわち、それぞれ、ｐＨ４乃至６、ｐＨ８乃至１１）、特に、遊離した（すなわち、結合していない、従って溶液中の）６０ｐｐｍ未満のカルシウム濃度における向上した安定性の達成に関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載されている変異のあらゆるものを含む。下記「方法」のセクションに記載されているように安定性を測定することができる。
１．７．２ Ｃａ２＋安定性
変化したＣａ２＋安定性は、Ｃａ２＋枯渇条件下における酵素の安定性が向上したこと、すなわち、より高い又はより低い安定性を意味する。本明細書に記載されている変異体の文脈において、変化したＣａ２＋安定性の達成、つまり、より高い又はより低い安定性の達成、特に、高いｐＨ（すなわちｐＨ８乃至１０．５）における安定性の達成に関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載されている変異のあらゆるものを含む。
１．７．３ 比活性
さらなる一態様において、変化した比活性を示す変異体、特に１０乃至６０℃、好ましくは２０乃至５０℃、特に３０乃至４０℃の温度において上昇した又は低下した比活性を示す変異体を得ることに関して重要な変異（アミノ酸の置換及び欠失を含む）は、本明細書に記載されている変異のあらゆるものを含む。下記「方法」のセクションに記載されているように比活性を決定することができる。
１．７．４ 酸化安定性
記載されている変異体は、親α−アミラーゼと比較して変化した酸化安定性（特に、より高い酸化安定性）を有する可能性がある。向上した酸化安定性は、例えば、界面活性剤組成物において有利であり、低下した酸化安定性は、デンプン液化用組成物において有利である可能性がある。下記「方法」のセクションに記載されているように酸化安定性を測定することができる。
１．７．５ 変化したｐＨプロファイル
変化したｐＨプロファイルを有する変異体、特に、高ｐＨ（すなわち、ｐＨ８乃至１０．５）又は低ｐＨ（すなわち、ｐＨ４乃至６）において向上した活性を有する変異体を得ることに関しての重要な位置及び変異は、活性部位残基に接近するアミノ残基の変異を含む。好ましい変異は本明細書に記載されている変異である。適切な分析方法は、以下の「方法」セクションに記載されている。
１．７．６ 洗浄性能
特に高いｐＨ（すなわちｐＨ８．５乃至１１）において向上した洗剤性能を有する変異体を得ることに関して重要な位置及び変異は、本明細書に記載されている特定の変異を含む。「方法」セクションにおいて後述されているように洗剤性能を試験することができる。
２． α−アミラーゼ変異体を調製する方法
本発明の組成物及び方法の一態様は、特定の置換、欠失、トランスバージョン、挿入、及び、これらの組み合わせを有する本発明のα−アミラーゼ変異体を調製する方法である。これらの変異体は、向上したｐＨ安定性、向上した温度安定性、Ｃａ２＋に対する低減された要件、向上した比活性、向上した食器洗浄又は洗濯性能、向上した溶解度、向上した貯蔵安定性、又は、これらの組み合わせなどの有利な特徴を有する可能性がある。
遺伝子に変異を導入し、それらの遺伝子によってコードされる変異したポリペプチドを発現させるいくつかの方法は、当業界において知られている。α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングの簡単な検討の後に、α−アミラーゼをコードする配列中の特定部位に変異を生じさせる方法を検討する。
２．１ α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列をクローニング
親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界で広く知られた様々な方法を使用して、問題のα−アミラーゼを生産するあらゆる細胞又は微生物から単離することができる。最初に、研究しようとするα−アミラーゼを生産する生物から得た染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを構築することができる。次に、α−アミラーゼのアミノ酸配列がわかっていれば、ラベルされた相同なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、問題の生物から調製したゲノムライブラリからα−アミラーゼをコードするクローンを同定するためにそのプローブを使用することができる。あるいは、より低い厳格性のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を使用して、α−アミラーゼをコードするクローンを特定するためのプローブとして、既知のα−アミラーゼ遺伝子に相同な配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。
α−アミラーゼをコードするクローンを特定するためのさらに別の方法は、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を挿入ステップと、得られたゲノムＤＮＡライブラリでα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換するステップと、次に、α−アミラーゼのための基質を含む寒天の上に形質転換された細菌に被覆させ、それによってα−アミラーゼを発現するクローンが特定されることを可能にするステップとを含む。
あるいは、この酵素をコードするＤＮＡ配列を、確立された標準分析法、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）によって記載された亜リン酸アミダイト法又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）によって記載された方法によって合成的に調製することができる。亜リン酸アミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置内で合成され、精製、アニーリング、及び、リゲートされ、適切なベクター中にクローンされる。
最後に、そのＤＮＡ配列は、ゲノム由来と合成由来との混合物、合成由来とｃＤＮＡ由来との混合物、又は、ゲノム由来とｃＤＮＡ由来との混合物であって、標準的技術に従って、合成由来、ゲノム由来、又は、ｃＤＮＡ由来の断片（必要に応じて全ＤＮＡ配列の様々な部分に対応する断片）をリゲートすることによって調製されたものであってもよい。ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４６８３２０２号又はＲ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）に記載されているように特異的プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
２．２ 部位特異的な変異誘発
α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を単離し、変異のための所望の部位を特定すれば、合成オリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含んでおり、変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの合成中に挿入される。特定の方法においては、α−アミラーゼ遺伝子を運ぶベクターの中に、α−アミラーゼをコードする配列にわたるＤＮＡ一本鎖ギャップを作成する。その後、一本鎖ＤＮＡの相同部分に、所望の変異を有する合成ヌクレオチドをアニーリングする。その後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断片）で残りのギャップを埋め、Ｔ４リガーゼを使用してその構築物をリゲートする。この方法の特定の例は、Morinaga et al.(1984)に記載されている。米国特許第４７６００２５号は、カセットのわずかな変更を実行することによって複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、様々な長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるので、Morinagaの方法によっていつでもさらに多様な変異を導入することができる。
α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に変異を導入する他の方法は、Nelson and Long(1989)に記載されている。この方法は、ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして化学的に合成されたＤＮＡ鎖を使用することによって導入された所望の変異を含むＰＣＲ断片の３ステップの生成を含む。ＰＣＲで生成された断片から、変異を運ぶＤＮＡ断片を、制限酵素を用いた開裂によって分離し、発現プラスミド中に再挿入することができる。
変異体を提供するための他の方法には、例えばWO95/22625(Affymax Technologies N.V.から)又はWO96/00343(Novo Nordisk A/S)などの遺伝子シャフリング、又は、例えば置換及び／又は欠損などの問題の変異を含むハイブリッド酵素が得られる他の対応する技術が含まれる。
２．３ α−アミラーゼ変異体の発現
上記方法又は当業界において知られているあらゆる方法によって生産されるα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列は、一般にプロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、並びに、選択的に、抑制遺伝子又は様々なアクチベータ遺伝子などの制御配列を含む発現ベクターを使用して、変異体α−アミラーゼ（すなわち酵素）を発現させるために使用することができる。
α−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を運ぶ組み換え発現ベクターは、組換ＤＮＡ手法に簡易に供することができるあらゆるベクターであり得る。また、ベクターの選択は、多くの場合、そのベクターを導入しようとする宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外存在物として存在するベクターであって、その複製が、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、染色体外因子、微小染色体、又は、人工染色体などの染色体の複製に依存しないベクターであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、組み込まれたその染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、適切なプロモータ配列に作用可能な状態で連結されるべきである。プロモータは、最適な宿主細胞において転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であってもよく、また、宿主細胞に対して相同な又は非相同なタンパクをコードする遺伝子に由来するものであってもよい。特に細菌宿主において、本発明の組成物及び方法のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指令する適切なプロモータの例は、大腸菌のラックオペロンのプロモータ、ストレプトマイセスセリカラー・アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモータ、バチルス・リケニフォルミス・α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモータ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスマルトース生成型アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモータ、バチルス・アミロリケファシエンス・α−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモータ、並びに、バチルス・サチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子などのプロモータである。真菌性宿主における転写について、有用なプロモータの例は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ・アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスぺルギルスニガー中性α−アミラーゼ、アスぺルギルスニガー酸安定α−アミラーゼ、アスぺルギルスニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス・ニデュランス・アセタミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
この発現ベクターは、本発明の組成物及び方法のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能な状態で連結された適切な転写終結因子、及び、真核生物においてはポリアデニル化配列をさらに含んでいてもよい。終止配列及びポリアデニル化配列は、プロモータと同じ源から適切に由来するものであってもよい。
ベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞において複製できるようにするＤＮＡ配列をさらに含んでいてもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７、プラスミドｐＵＢ１１０、プラスミドｐＥ１９４、プラスミドｐＡＭＢ１及びプラスミドｐＩＪ７０２の複製起点である。
ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、バチルスサブチリス若しくはバチルスリケニフォルミスに由来するｄａｌ遺伝子などのようにその遺伝子の産物が宿主細胞において欠損を補う遺伝子、又は、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与える遺伝子を含んでいてもよい。さらに、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣなどのアスペルギルス選択マーカー、若しくは、ヒグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでいてもよいし、又は、例えばＷＯ９１／１７２４３に記載されているような同時形質転換によって選択を実行することもできる。
いくつかの点において細胞内発現が有利であるが、例えば宿主細胞として特定の細菌を使用する場合には、一般に発現が細胞外であることが好ましい。一般に、本明細書において言及されているバチルスα−アミラーゼは、培地中に発現されたプロテアーゼの分泌を可能にする前領域又はシグナル配列含む。必要に応じて、この前領域は、異なる前領域又はシグナル配列によって置換されてもよく、その置換は、各前領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって簡易に達成される。
α−アミラーゼ変異体、プロモータ、ターミネータ及び他の因子をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれリゲートするために、及び、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に広く知られている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989参照）。
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターを含む細胞は、α−アミラーゼ変異体の組換え体製造において宿主細胞として好適に使用される。宿主染色体にＤＮＡ構築物（１つ又はそれ以上のコピー）を組み込むことによって簡単に、本発明の組成物及び方法の変異体をコードするＤＮＡ構築物で細胞を形質転換することができる。この組み込みは、ＤＮＡ配列が細胞内においておそらくより安定に維持されるので、一般に有利であると考えられる。宿主染色体中へのＤＮＡ構築物の組み込みは、従来の方法によって（例えば、相同組み換え又は、非相同組み換えよって）実行することができる。あるいは、異なる種類の宿主細胞に関しては、上述されているような発現ベクターで細胞を形質転換することができる。細胞は、哺乳動物のような高等生物又は昆虫の細胞であってもよいが、微生物細胞（例えば、細菌性細胞、真菌性細胞（酵母菌を含む））であることが好ましい。
適切な細菌の例は、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、又は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）若しくはストレプトミセス・ミュリナス（Streptomyces murinus）などのグラム陽性菌、又は、大腸菌などのグラム陰性菌である。細菌の形質転換は、例えば、原形質体形質転換によって、又は、それ自体は公知の方法で受容細胞を使用することによって達成することができる。
酵母生物は、例えばサッカロマイセスセレヴィシエなどのサッカロミケス又はシゾサッカロミセスの１種から好適に選択されるものであってもよい。糸状菌は、例えば、アスペル・ギルスオリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのように、アスペルギルスの１種に属するものであることが好ましい。真菌性細胞は、原形質体形成及びその原形質体の形質転換とその後の公知の方法による細胞壁の再生とを含むプロセスによって形質転換することができる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ＥＰ２３８０２３に記載されている。
細胞をインキュベートするために使用する培地は、問題の宿主細胞を育成すること、また、α−アミラーゼ変異体の発現を得ることに適したあらゆる従来の培地であり得る。適切な溶剤は、商業的供給業者から入手することもできるし、又は、公表されている製法によって（例えば、米国インキュベート菌保存施設（American Type Culture Collection）のカタログに記載されているように）調製することもできる。
宿主細胞から分泌されたα−アミラーゼ変異体は、遠心分離又は濾過によって培地から細胞を分離すること、硫酸アンモニウムなどの塩を使用して培地のタンパク成分を沈殿させること、及び、その後にイオン交換クロマトグラフィ及び親和性クロマトグラフィなどのクロマトグラフィ手段を使用することを含む、周知の方法によって培地から簡便に回収することができる。
３．工業的利用
本発明のα−アミラーゼ変異体は、様々な工業的利用を可能にする有利な特性を有する。特に、酵素変異体は、洗濯用組成物、食器洗浄用組成物、及び、硬表面洗浄用組成物中の成分として利用することができる。
この変異体は、デンプン処理、特に、デンプン変換、とりわけ、デンプンの液化のために使用することができる（例えば、米国特許第３９１２５９０号、欧州特許出願第２５２７３０号及び第６３９０９号、並びに、ＷＯ９９／１９４６７及びＷＯ９６／２８５６７を参照されたい。また、これによってすべての参考文献は参照することによって組み込まれている。）。デンプン変換目的のための組成物も意図されており、本発明の組成物及び方法の変異体は、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ及び他のα−アミラーゼをさらに含んでいてもよい。
変異体は、例えばデンプン又は全穀粒から、甘味料、並びに、燃料又は飲料用／工業用エタノールなどのエタノールを生産する（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれている米国特許第５２３１０１７号参照）ために使用することができる。一例はビールの製造時又は醸造時である。
変異体は、繊維、布及び衣服の糊抜き（例えば、参照することによって組み込まれているＷＯ９５／２１２４７、米国特許第４６４３７３６号、及び、ＥＰ１１９９２０参照）のために、パルプの生産において、及び、紙の生産において使用することもできる。
３．１ デンプン変換
液化プロセス及び糖化プロセスなどの従来のデンプン変換プロセスは、例えば、参照することによって組み込まれれている米国特許第３９１２５９０号、欧州特許公報第２５２７３０号及び第６３９０９号に記載されている。デンプンを糖又は脂肪代替素材などの低分子量炭水化物成分に分解するデンプン変換プロセスは、脱分岐させるステップを含む。
３．２ デンプンから糖への変換
デンプンを糖に変換する場合、デンプンが解重合される。そのような解重合プロセスは、前処理ステップと、液化プロセス、糖化プロセス、及び、（所望の最終生成物に依存して）選択的な異性化プロセスなどの２つ又は３つの連続的な生産工程とからなるものであってもよい。
３．３ 天然デンプンの前処理
天然のデンプンは、室温で水に溶けない顕微鏡的顆粒からなる。水溶性デンプンスラリーを加熱すると、その顆粒が膨張して最後には破裂し、デンプン分子を溶液中に分散させる。この「ゼラチン化」プロセス中に、粘度が劇的に上昇する。典型的な工業的プロセスにおいて固形分濃度が３０乃至４０％であるときには、処理することができるようにデンプンを希釈又は「液化」しなければならない。この粘度の低減は、現在、主として酵素による分解によって達成されている。
３．４ 液化
液化ステップ中に、長鎖のデンプン分子は、α−アミラーゼによってより短い分岐した分子及び直線分子（マルトデキストリン）に分解される。一般に、液化プロセスは、ｐＨ５．５〜６．２において、１０５℃乃至１１０℃で５分間〜１０分間実行し、その後に、９５℃で１乃至２時間実行する。これらの条件下において最適な酵素安定性を確保するために、一般に１ｍＭのカルシウム（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）を加える。この処理の後に、液化されたデンプンは、約１０乃至約１５「デキストロース当量」（ＤＥ）を有するであろう。
３．５ 糖化
液化プロセスの後に、マルトデキストリンは、グルコアミラーゼ（例えば、ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００）、並びに、イソアミラーゼ（米国特許第４３３５２０８号）又はプルラナーゼなどの脱分枝酵素の添加によってデキストロースに変換される。このステップの前に、α−アミラーゼの液化を不活性化するための高温（９５℃超）を維持しながらｐＨを４．５より低い値にし、それによって、脱分枝酵素によって適切に加水分解することができない「パノース前駆体」と呼ばれる短いオリゴ糖の生成を低減する。温度を６０℃に低下させ、グルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を加える。この糖化プロセスを２４時間〜７２時間続ける。
通常、液化ステップの後にα−アミラーゼを変性させるときに、糖化産物の約０．２％〜約０．５％は、分岐した三糖類Ｇｌｃｐα１−６Ｇｌｃｐα１−４Ｇｌｃ（パノース）であり、これはプルラナーゼによって分解することができない。液化ステップに由来する活性アミラーゼが糖化中に存在する（すなわち、変性させない）場合には、このレベルが１％−２％になることがあり、それは糖化生成率を著しく低下させるので、極めて望ましくない。
３．６ 異性化
例えば所望の最終糖産物が高フルクトースシロップであるとき、デキストロースシロップをフルクトースに変換することができる。糖化プロセスの後に、ｐＨを６乃至８の範囲内の値に、好ましくはｐＨ７．５に上昇させ、イオン交換によってカルシウムを除去する。その後、例えば、固定したグルコースイソメラーゼ（ＧＥＮＳＷＥＥＴ（登録商標）ＩＧＩ−ＨＦ等）を使用してデキストロースシロップを高フルクトースシロップに変換する。
３．７ エタノール生産
全穀粒からのアルコール（エタノール）の生産は、一般に、粉砕、液化、糖化、及び、発酵の４つの主たるステップに分けることができる。
３．７．１ 粉砕
粒子は、その構造を開いてさらなる処理を可能にするために粉砕される。使用する２つのプロセスは湿式粉砕又は乾式粉砕である。乾式粉砕において、全穀粒は、粉砕されて処理の残りの部分において使用される。湿式粉砕は、胚と粉末と（デンプン粒子とタンパクと）を非常によく分離することができ、若干の例外はあるものの、シロップの平行的生産が存在する位置において利用される。
３．７．２ 液化
液化プロセスにおいて、デンプン粒子は、加水分解することによって主として４を超える重合度のマルトデキストリンにして可溶性される。加水分解は、酸処理によって又はα−アミラーゼによって酵素的に実行することができる。酸加水分解は限られた回数で使用される。原料は、粉砕された全穀粒であってもよいし又はデンプン処理に由来する副流（side stream）であってもよい。
酵素の液化は、一般に、３つのステップの高温スラリープロセスとして実行される。スラリーを６０℃〜９５℃、好ましくは８０℃〜８５℃に加熱し、酵素を加える。その後、スラリーを９５℃〜１４０℃、好ましくは１０５℃〜１２５℃でジェットクックし、６０℃〜９５℃に冷まし、最終加水分解物を得るためにさらに酵素を加える。液化プロセスは、ｐＨ４．５乃至ｐＨ６．５において、典型的には５乃至６のｐＨにおいて実行される。粉砕及び液化された粒子はマッシュとしても知られている。
３．７．３ 糖化
酵母によって代謝されることが可能な低分子の糖（重合度１乃至３）を生産するために、液化から得たマルトデキストリンをさらに加水分解しなければならない。加水分解は、典型的にはグルコアミラーゼによって酵素的に実行されるが、α−グルコシダーゼ又は酸性α−アミラーゼを使用することもできる。完全な糖化ステップは最大７２時間続くこともあるが、通常は、４０分乃至９０分の予備糖化を行い、その後、発酵中に糖化を完結させること（ＳＳＦ）が一般的である。糖化は、一般に３０℃乃至６５℃の温度で、典型的には約６０℃でｐＨ４．５において実行する。
３．７．４ 発酵
一般にはサッカロミケス種に由来する酵母をマッシュに加え、２４時間乃至９６時間、典型的には３５時間乃至６０時間にわたって発酵を継続する。温度は、２６℃乃至３４℃、典型的には約３２℃であり、ｐＨは、ｐＨ３乃至６、好ましくはおよそｐＨ４乃至５である。
最も広く使用されているプロセスが、糖化のための保持段階がない同時の糖化及び発酵（ＳＳＦ）プロセスであり、酵母と酵素とを一緒に加えることを意味することに留意されたい。ＳＳＦを行うときは、発酵の直前に、５０℃超の温度における予備糖化ステップを導入することが一般的である。
糖化工程及び醗酵工程は同時に又は別々に実行することができる。
３．８ 蒸留
発酵の後に、エタノールを抽出するためにマッシュを蒸留する。このプロセスによって得られるエタノールは、例えば、燃料エタノール；飲料エタノール、すなわち、飲用ニュートラルスピリッツ；又は、工業用エタノールとして使用することができる。
３．９ 副産物
発酵に由来する残留物は、一般に飼料中において液体の形態で又は乾燥して使用される。液化、糖化、発酵、蒸留、及び、エタノールの回収を実行する方法についてのさらなる詳細は、当業者に広く知られている。
３．１０ パルプ及び紙の生産
特に、７を超えるｐＨにおいて再パルプ化が生じる場合、及び、アミラーゼが補強デンプンの分解を通じて廃棄物の分解を容易にする場合には、本発明のα−アミラーゼは、デンプン補強された廃紙及び厚紙から、パルプ、紙及び厚紙などのリグノセルロース材料を生産することに使用可能である。このα−アミラーゼは、デンプンをコーティングした印刷用紙から製紙用パルプを生産するプロセスにおいて特に有用である。このプロセスは、ＷＯ９５／１４８０７に記載されているように、下記工程：ａ）パルプを生産するために紙を分解するステップと、ｂ）ステップａの前、ステップａの間又はステップａの後にデンプン分解酵素を用いて処理を行うステップと、ｃ）ステップａ及びｂの後にパルプからインク粒子を分離するステップとを含むように実行することができる。
製紙において炭酸カルシウム、カオリン及び粘土などのアルカリ性充填材と共に、酵素修飾されたデンプンを使用する場合に、デンプンを修正するためにα−アミラーゼを使用することができる。本発明の組成物及び方法のα−アミラーゼを用いれば、充填材の存在下でデンプンを修正することを可能にし、従って、より簡単な総合プロセスを可能にする。
３．１１ 繊維、布及び衣服の糊抜き
本発明のα−アミラーゼは、繊維、布又は衣服の糊抜きにおいても非常に有用であり得る。繊維加工産業において、製織中に横糸の保護コーティングとして機能するデンプン含有糊剤の除去を容易にするために、α−アミラーゼは、糊抜きプロセスにおいて補助剤として伝統的に使用されている。糊剤コーティングの製織後の完全な除去は、布を洗浄、漂白及び染色するその後の工程において最適な結果を保証するために重要である。酵素のデンプン分解は、繊維材料に対する悪影響を伴わないので好ましい。処理コストを低減し、かつ、工場の生産量を増加させるために、糊抜処理は、洗浄ステップ及び漂白ステップと時折一体化される。そのような場合、従来のα−アミラーゼは高いｐＨレベル及び漂白剤とあまり相性がよくないので、デンプンを分解するために、アルカリ剤又は酸化剤などの非酵素性補助剤が一般に使用される。デンプン糊剤の非酵素的分解は、使用されるやや腐食性の化学物質のせいで、ある程度は線維にダメージを与える。従って、アルカリ性溶液中で向上した性能を有するので、本発明の組成物及び方法のα−アミラーゼを使用することが望ましい。セルロースを含む布又は繊維を糊抜きするときに、α−アミラーゼは、単独で又はセルラーゼと組み合わせて使用することができる。
糊抜プロセス及び漂白プロセスは当業界において広く知られている。例えば、そのようなプロセスは、ＷＯ９５／２１２４７、米国特許第４６４３７３６号、ＥＰ１１９９２０に記載されており、これらの文献はこれによって参照することによって組み込まれている。また、糊抜用の市販製品には、Genencor社のOPTISIZE（登録商標）FLEXが含まれる。
本発明のα−アミラーゼ変異体の１つ以上を使用して布を処理する（例えば、繊維を糊抜きする）組成物及び方法も意図されている。当業界において公知のあらゆる布処理方法（例えば米国特許第６０７７３１６号参照）においてこの酵素を使用することができる。例えば、一態様において、布の手触り及び外観は、溶液中で布をα−アミラーゼに接触させるステップを含む方法によって向上する。一態様において、布は、加圧条件下で溶液を用いて処理される。
一態様において、酵素は、繊維の製織の間に若しくはその後に、又は、糊抜段階中に若しくは１つ以上のさらなる布処理ステップ中に、利用される。繊維の製織中に、糸は相当な機械的歪みに晒される。機械の織機で織る前に、縦糸は、引張強度を高めて破損を防止するために、多くの場合、糊付けデンプン又はデンプン誘導体でコーティングされる。これらの酵素は、これらの糊付けデンプン又はデンプン誘導体を除去するために利用することができる。繊維を織った後に、糊抜段階に布を移すことができる。この後に１つ以上のさらなる布処理ステップを続けることができる。糊抜きは繊維から糊剤を除去する行為である。製織の後に、均質な洗浄耐性の結果を保証するために、布をさらに処理する前に糊剤コーティングを除去しなければならない。α−アミラーゼの作用によって糊剤を酵素的に加水分解するステップを含む糊抜方法を提供する。
これらの酵素は、単独で、又は、他の糊抜化学物質及び／若しくは糊抜酵素と共に、例えば水性組成物中で、洗剤添加剤として、綿を含む布を含む生地を糊抜きするために使用することができる。α−アミラーゼは、藍染めしたデニムの生地及び衣類にストーンウォッシュした外観を与えるための組成物及び方法において使用することができる。衣類の生産に関して、生地は、切断し、縫合して衣服又は衣類にすることができ、これらは後で仕上げされる。特に、デニムジーンズの生産については、様々な酵素による仕上げ方法が開発されてきた。一般に、デニム衣類の仕上は、生地に柔軟性を与え、かつ、綿をその後の酵素による仕上げステップに使用できるようにするために、衣類をデンプン分解酵素の作用に供する、酵素による糊抜きステップで開始される。これらの酵素は、デニム衣類の仕上げ（例えば、「バイオストーニングプロセス」）、生地の酵素による糊抜き及び生地への柔軟性の提供、並びに及び／又は、仕上げプロセスの方法において使用することができる。アミラーゼの量はプロセスの種類に応じて変わる。少ない量は、多量の同じ酵素よりもさらに長い時間を必要とするであろう。しかしながら、溶液の物理的制限によって規定される以外には、糊抜アミラーゼの量に対する上限は存在しない。したがって、酵素の限界は、溶液中に溶解できる量となり得る。一般に、α−アミラーゼなどの糊抜酵素は、処理組成物中に、生地の重量で約０．００００１％乃至約２％の酵素タンパク；又は、生地の重量で約０．０００１％乃至約１％の酵素タンパク；又は、生地の重量で約０．００１％乃至約０．５％の酵素タンパク；また、他の実施例においては、生地の重量で約０．０１％乃至約０．２％の酵素タンパクの量で含まれる。
３．１２ ビール製造
上で検討されているように、本発明のα−アミラーゼは、糖化プロセス中に酵素を加えるビール生産プロセスにおいても有用であり得る。
３．１３ 界面活性剤成分
本発明のα−アミラーゼは、界面活性剤中に加えることもでき、従って、界面活性剤成分の一成分になり得る。この界面活性剤組成物は、手動若しくは機械の洗濯用洗剤組成物、着色した生地の前処理に適した洗濯添加剤組成物、リンスを追加した生地柔軟剤組成物、一般家庭用硬表面洗浄のための界面活性剤成分、又は、手動若しくは機械の食器洗浄組成物として配合することができる。
一実施形態において、本明細書に記載されている変異体酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤及び界面活性剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素（例えば、他のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成型アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ及び／又はセルロース）、マンナナーゼ（Danisco U.S.A.社、Genencor Division社製のMANNASTAR（商標）等）、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ、及び／又は、ラッカーゼなどの１つ以上の他の酵素を含んでいてもよい。
一般に、選択した酵素の特性は、選択した洗剤と両立するもの（すなわち、ｐＨ最適条件、他の酵素成分及び非酵素成分等との両立性）であるべきであり、また、酵素は有効な量で存在すべきである。
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のものが含まれる。微生物由来のものが好ましい。化学的に修飾された又はタンパク工学により作成された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであってもよく、好ましくは、アルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼ又はキモトリプシン様プロテアーゼであってもよい。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシンであり、特にバチルス、例えば、サブチリシンレンタス（subtilisin lentus）、サブチリシンアミロリクエファシエンス（subtilisin amyloliquefaciens）、サブチリシンノボ（subtilisin Novo）、サブチリシンカールスバーグ（subtilisin Carlsberg）、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８（ＷＯ８９／０６２７９に記載されている）に由来するものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、（例えば、ブタ又はウシ由来の）トリプシン、及び、ＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３に記載されているフザリウムプロテアーゼ（Fusarium protease）である。
有用なプロテアーゼの例は、限定されるものではないが、米国特許ＲＥ３４６０６、５８０１０３９、５３４０７３５、５５００３６４、５８５５６２５、５９５５３４０、５７００６７６、６３１２９３６、及び、６４８２６２８、米国特許公開公報第２００８／００９０７４７号、並びに、国際公開公報ＷＯ９８／２３７３２、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ９２／１９７２９、ＷＯ９８／２０１１５、ＷＯ９８／２０１１６、ＷＯ９８／３４９４６、ＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ９２／２１７６０及びＷＯ８９／０６２７０に記載されている変異体、特に２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４の位置に１つ又はそれ以上の置換を有する変異体を含む。
典型的な市販のプロテアーゼ酵素は、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ社製）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ、ＭＡＸＡＰＥＭ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（登録商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）及びＦＮ４（登録商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、並びに、ＢＬＡＰ（商標）（Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien、デュッセルドルフ、ドイツ）を含む。
いくつかのさらなる実施形態においては、限定されるものではないが、ＷＯ０７／０４４９９３に記載されている中性メタロプロテアーゼを含むメタロプロテアーゼは、本発明において用途がみいだされる。
リパーゼ：適切なリパーゼには、細菌由来又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された又はタンパク工学により作成された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、限定されるものではないが、例えばEP258068及びEP305216に記載されているようなＨ．ラヌギノサ(H. lanuginosa)（Ｔ．ラヌギノサス(T. lanuginosus)）に由来する又はWO96/13580に記載されているようなＨ．インソレンズ(H. insolens)に由来するフミコラ(Humicola)(別名サーモミセス)から得られるリパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス(P. alcaligenes)又はＰ．シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)(EP218272)等に由来するシュードモナス・リパーゼ、Ｐ．セパシア（P. cepacia)(EP331376)、Ｐ．スツッツェリ(P.stutzeri)(GB1372034)、Ｐ．フルオレッセンス(P. fluorescens)、シュードモナス種株ＳＤ７０５(WO95/06720及びWO96/27002)、Ｐ．ウィスコンシネンシス(P. wisconsinensis)(WO96/12012)、バチルス・リパーゼ（例えば、バチルス・サチリスに由来するもの(Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360)）、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)(JP64/744992)、又は、Ｂ．プミルス(B. pumilus)(WO91/16422)を含む。配合物中で使用するように意図されているさらなる典型的なリパーゼ変異体には、ＷＯ９２／０５２４９、ＷＯ９４／０１５４１、ＥＰ４０７２２５、ＥＰ２６０１０５、ＷＯ９５／３５３８１、ＷＯ９６／００２９２、ＷＯ９５／３０７４４、ＷＯ９４／２５５７８、ＷＯ９５／１４７８３、ＷＯ９５／２２６１５、ＷＯ９７／０４０７９及びＷＯ９７／０７２０２に記載されているものが含まれる。商業的に入手可能なリパーゼ酵素には、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（商標）（Novozymes A/S社製）が含まれる。
ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼは組成物中に含まれていてもよい。適切なポリエステラーゼには、例えば、ＷＯ０１／３４８９９及びＷＯ０１／１４６２９に記載されているものが含まれる。
アミラーゼ：（本明細書に記載されている変異体アミラーゼに加えて）１つ又はそれ以上のさらなるアミラーゼがさらに含まれていてもよい。適切なアミラーゼ（α及び／又はβ）には、細菌由来又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された又はタンパク工学により作成された変異体が含まれる。アミラーゼには、例えば、バチルス、例えば、ＧＢ１２９６８３９により詳細に記載されているバチルス・リケニフォルミスの特別な株から得られるα−アミラーゼが含まれる。有用なα−アミラーゼの例は、ＷＯ９４／１８３１４、ＷＯ９６／３９５２８、ＷＯ９４／０２５９７、ＷＯ９４／１８３１４、ＷＯ９６／２３８７３及びＷＯ９７／４３４２４に記載されている変異体、特に１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び、４４４の位置の１つ以上に置換を有する変異体である。商業的に入手可能なα−アミラーゼは、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＬIＱＵＥＺＹＭＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）ＰＬＵＳ、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）ＵＬＴＲＡ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ社製）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）である。
セルラーゼ：セルラーゼを組成物中に加えることができる。適切なセルラーゼには、細菌由来又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された又はタンパク工学により作成された変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、限定されるものではないが、例えば、米国特許第４４３５３０７号、米国特許第５６４８２６３号、米国特許第５６９１１７８号、米国特許第５７７６７５７号及びＷＯ８９／０９２５９に開示されているフミコラインソレンズ(Humicola insolens)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)及びフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)から生産される真菌性セルラーゼ等のような、バチルス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、チエラビア(Thielavia)、アクレモニウム(Acremonium)種に由来するセルラーゼを含む。典型的なトリコデルマリーゼイセルラーゼは、米国特許第４６８９２９７号、米国特許第５８１４５０１号、米国特許第５３２４６４９、ＷＯ９２／０６２２１及びＷＯ９２／０６１６５に開示されている。典型的なバチルスセルラーゼは米国特許第６５６２６１２号に開示されている。商業的に入手可能なセルラーゼには、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ社製）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸ ＨＡ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒインターナショナル社）、並びに、ＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（Ｋａｏ株式会社）が含まれる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物由来、細菌由来又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された又はタンパク工学により作成された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例は、ＷＯ９３／２４６１８、ＷＯ９５／１０６０２及びＷＯ９８／１５２５７に記載されているもののような、コプリナス（例えばＣ．シネレウス(C. cinereus)）に由来するペルオキシダーゼ及びその変異体が含まれる。商業的に入手可能なペルオキシダーゼにはＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（登録商標）（Novozymes A/S社製）が含まれる。
洗浄酵素は、１つ又はそれ以上の酵素を含む別々の添加剤を加えることによって、又は、これらの酵素のすべてを含む混合添加剤を加えることによって、界面活性剤組成物中に含まれていてもよい。本発明の組成物及び方法の洗剤添加剤（すなわち、別々の添加剤又は混合した添加剤）は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどの製剤形態であってもよい。好ましい洗剤添加剤の製剤形態は、顆粒であり、特に非粉塵性顆粒、液体であり、特に、安定化された液体又はスラリーである。
非粉塵性顆粒は、例えば、米国特許第4106991号及び第4661452号に開示されているように生産することができ、また、選択的に、当業界で知られている方法によってコーティングされたものであってもよい。ワックスコーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６個〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化されたノニルフェノール；アルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、かつ、１５個〜８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化された脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；並びに、脂肪酸のモノグリセリド、脂肪酸のジグリセリド、及び、脂肪酸のトリグリセリドである。流動層技術による応用に適したフィルム形成用コーティング材料の例は、GB1483591に与えられている。液体の酵素製剤は、例えば、プロピレングリコール等の多価アルコール、糖若しくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸の添加によって確立された方法に従って安定化することができる。保護された酵素は、EP238216に開示されている方法によって調製することができる。
一般に、洗剤組成物は、都合のよいあらゆる形態（例えば、固体、錠剤、粉末、顆粒、ペースト、液体）で存在してもよい。液体洗剤は、水性であってもよく、一般に、最大約７０％の水分と０％乃至約３０％の有機溶媒とを含む。圧縮洗剤ゲルは、例えば約３０％以下の水分を含んでいた。
パーシル(Persil)、タイド(TIDE)（登録商標）２×コールドウォータ−、及び、アリエール(Ariel)洗剤は、典型的なα−アミラーゼ変異体を試験するために本明細書において使用されている典型的な洗剤である。本発明のα−アミラーゼ変異体は、一般的に用いられる広範な洗浄組成物の存在下で実用的であるように意図されているので、典型的な組成物に限定されない。
洗剤組成物は１つ又はそれ以上の界面活性剤を含み、その界面活性剤は、半極性を含む非イオン、及び／又は、陰イオン性、及び／又は、陽イオン性、及び／又は、双性イオン性であってもよい。この界面活性剤は一般に０．１重量％乃至６０重量％の濃度で存在する。典型的なα−アミラーゼ変異体を、陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤とを含む洗剤組成物中で試験した。本明細書に記載されているα−アミラーゼ変異体は、洗剤中で一般に用いられる他の界面活性剤を含む組成物中において活性であるように意図されている。
この洗剤は、含まれている場合には、通常、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪族アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第２級アルカンスルフォナート、α−スルフォ脂肪酸メチルエステル、コハク酸アルキル若しくはコハク酸アルケニル、又は、石鹸などの約１％乃至約４０％の陰イオン性界面活性剤を含むであろう。
この洗剤は、含まれる場合、通常、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミン酸化物、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又は、グルコサミン（「グルカミド」）のＮ−アシルＮ−アルキル誘導体等の約０．２％乃至約４０％の非イオン性界面活性剤を含むであろう。
この洗剤は、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフォネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、コハク酸アルキル若しくはコハク酸アルケニル、可溶性シリケート、又は、階層状のシリケート（例えば、Hoechst社のSKS-6）等の０％乃至６５％の洗剤ビルダ又は錯化剤を含んでいてもよい。
この洗剤は１つ又はそれ以上のポリマーを含んでいてもよい。具体例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート等のポリカルボキシラート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及び、メタクリル酸ラウリル／アクリル酸コポリマーである。
この洗剤は、過酸素酸を生成する漂白剤アクチベータ（例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルフォナート）と混合させることができる過ホウ酸塩又は過炭酸塩等のＨ２Ｏ２源で構成され得る漂白系を含んでいてもよい。あるいは、この漂白系は、ペルオキソ酸（例えば、アミド、イミド又はスルホンタイプのペルオキソ酸）で構成されたものであってもよい。また、この漂白系は酵素による漂白系であってもよい。例えば、ＷＯ０５／０５６７８２を参照されたい。
本発明の組成物及び方法の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロール等の多価アルコール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は、例えば芳香族ホウ酸エステル若しくは４−ホルミルフェニルホウ酸のようなフェニルホウ酸誘導体等のホウ酸誘導体等の従来の安定化剤を用いて安定化されたものであってもよい。前記組成物は、例えば、ＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載されているように製剤することができる。
この洗剤は、例えば、粘土、起泡力増進剤、泡抑制剤、耐腐食剤、汚れ懸濁剤(soil-suspending agents)、汚れ再付着防止剤(anti-soil re-deposition agents)、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、変色防止剤、又は、香料を含む仕上げ剤等の他の従来の洗剤成分をさらに含んでいてもよい。
本発明のα−アミラーゼは、洗浄液１リットル当たり約０．０１ｍｇ乃至約１００ｍｇの酵素タンパク、例えば、洗浄液１リットル当たり約０．０５ｍｇ乃至約５．０ｍｇの酵素タンパク、又は、洗浄液１リットル当たり約０．１ｍｇ乃至約１．０ｍｇの酵素タンパクに対応する量で加えることができる。
本発明のα−アミラーゼは、ＷＯ９７／０７２０２に開示されている洗浄製剤中にさらに組み入まれてもよい。これによってこの文献は参照として組み込まれる。
４．組成物及び使用
本発明のα−アミラーゼは、洗剤組成物及び洗浄に関する方法において、特に、洗濯用洗剤組成物、食器用洗剤組成物、硬表面洗浄組成物、繊維、布又は衣類を糊抜きするための組成物、パルプ及び紙を生産するための組成物、ビール生産、エタノール生産、及び、デンプン変換等において使用することができる。
４．１ 洗濯用洗剤組成物及び使用
本発明のα−アミラーゼの組成物及び方法の一実施形態は、洗濯用洗剤組成物及びその使用方法である。この洗剤組成物は、非粉塵性顆粒、安定化された液体、又は、保護された酵素の形態であり得る。乾燥製剤は顆粒又は微小顆粒の形態であり得る。この非粉塵性顆粒は、例えば、米国特許第4106991号及び第4661452号に開示されているように生産することができ、また、選択的に当業界で知られている方法によってコーティングすることができる。ワックスコーティング材料の例は、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６個〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化されたノニルフェノール；アルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、かつ、１５個〜８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；並びに、脂肪酸のモノグリセリド、脂肪酸のジグリセリド及び脂肪酸のトリグリセリドである。流動層技術による利用に適したフィルム形成用コーティング材料の例は、例えば、ＧＢ特許第1483591号に与えられている。液体の酵素製剤は、例えば、プロピレングリコール等の多価アルコール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、又は、ホウ酸等の添加によって、確立された方法に従って安定化することができる。他の酵素安定剤は当業界で広く知られている。保護された酵素は、例えば、欧州特許出願第２３８２１６号に開示されている方法に従って調製することができる。長い間、多価アルコールは、タンパクの溶解度を向上させるだけでなく、タンパクの安定化剤として認められている。例えば、J. K. Kaushik et al.# J. Biol.Chem. 278: 26458-65 (2003)及びこの文献で引用されている文献、並びに、Monica Conti et al.# J. Chromatography 757: 237-245(1997)を参照されたい。
この組成物は、主たる酵素成分、例えば、単一成分の組成物として本発明のアミラーゼの１つ以上を含んでいてもよい。あるいは、この組成物は、以下に検討されている他の酵素のみならず、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシル移転酵素、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又は、キシラナーゼ等の複数の酵素活性で構成されたものであってもよい。このさらなる酵素は、アスペルギルス、トリコデルマ、フミコラ（例えば、Ｈ．インソレンズ）及びフザリウムの種に属する微生物によって生産可能なものであってもよい。アスペルギルス種の典型的なものには、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)が含まれる。フザリウム種の典型的なものには、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェルエンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミニアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディニス(Fusarium negundinis)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロセウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイズ(Fusarium trichothecioides)、及び、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)が含まれる。
この洗剤組成物は、あらゆる有用な形態、例えば、粉末、顆粒、ペースト、液体で存在してもよい。液体洗剤は、水溶性であってもよく、一般的に最大約７０％の水分と０％乃至約３０％の有機溶媒とを含んでいてもよい。この洗剤組成物は、約３０％のみの水分を含む圧縮ゲルタイプの形態で存在してもよい。酵素は、その酵素の安定性と両立するあらゆる洗剤組成物中で使用することができる。一般に、酵素は、例えば、顆粒化又はヒドロゲル中における隔離等のようなカプセル化の既知の形態によって有害な成分から保護されるようにすることができる。酵素、特にα−アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄の用途に限定されないが、表面洗浄剤、デンプンからのエタノール生産、又は、バイオマスにおいて使用可能である。
洗剤組成物は１つ又はそれ以上の界面活性剤を含み、その各界面活性剤は、陰イオン性、非イオン、陽イオン性又は両性イオン性であり得る。この洗剤は、通常、直鎖アルキルベンゼンスルフォネート（ＬＡＳ）；α−オレフィンスルフォネート（ＡＯＳ）；アルキルスルフェート（脂肪族アルコールスルフェート）（ＡＳ）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）；第２級アルカンスルフォネート（ＳＡＳ）；α−スルフォ脂肪酸メチルエステル；コハク酸アルキル若しくはコハク酸アルケニル；又は、石鹸等の陰イオン性界面活性剤を０％乃至約５０％含むであろう。この組成物は、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル基が導入されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ基が導入された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又は、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、WO92/06154に記載されている）等の非イオン性界面活性剤を０％乃至約４０％を含んでいてもよい。
この洗剤組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又は、ラッカーゼ等の他の酵素の１つ又はそれ以上をあらゆる組み合わせでさらに含んでいてもよい。上記を参照されたい。
この洗剤は、選択的に、ゼオライト、ジフォスフェート、トリフォスフェート、フォスフォネート、シトレート、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、コハク酸アルキル若しくはコハク酸アルケニル、可溶性シリケート、又は、階層状シリケート（例えば、Hoechst社製のSKS-6）等の洗剤ビルダー又は錯化剤を約１％乃至約６５％含んでいてもよい。この洗剤は、助剤が加えられていないもの、つまり、洗剤ビルダーを実質的に含まないものであってもよい。
この洗剤は選択的に１つ又はそれ以上のポリマーを含んでいてもよい。具体例には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、並びに、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸共重合体、及び、メタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体等のポリカルボキシレートが含まれる。
この洗剤は選択的に漂白系を含んでいてもよく、その漂白系は過ホウ酸塩又は過炭酸塩等のＨ２Ｏ２源であって、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルフォナート（ＮＯＢＳ）等のように過酸を生じさせる漂白剤アクチベータと混合することができるものを含んでいてもよい。あるいは、この漂白系は、例えば、アミド、イミド又はスルホンタイプのペルオキシ酸を含んでいてもよい。この漂白系は、例えば、WO2005/056783に記載されているように、酵素による漂白系であって、ペルヒドロラーゼが過酸化物を活性化する漂白系であってもよい。
この洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール若しくはグリセロール等の多価アルコール；糖若しくは糖アルコール；乳酸；ホウ酸、若しくは、例えば芳香族ホウ酸エステル等のホウ酸誘導体；等の従来の安定化剤を使用して安定化されたものであってもよい。この組成物を例えばWO92/19709及びWO92/19708に記載されているように配合することができる。
この洗剤は、例えば、粘土、起泡力増進剤、泡抑制剤、耐腐食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再析出防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、又は、香料を含む仕上げ剤等の他の従来の洗剤成分をさらに含んでいてもよい。
ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定される）は、通常、中性又はアルカリ性（例えば、ｐＨ約７．０乃至約１１．０）である。
上記α−アミラーゼ変異体を含む洗剤組成物の特定の形態は、下記１）乃至１９）を含むように製剤されたものであってもよい。
１）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約７％乃至約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約１％〜約４％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８のアルコール、１個〜２個のエチレンオキシド（ＥＯ））又はアルキルスルフェート（例えば、Ｃ１６−１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４−１５のアルコール（７ＥＯ）；約１４％〜約２０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約２％〜約６％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約１５％〜約２２％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；０％〜約６％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）；約１１％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約６％のＴＡＥＤ；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋な酵素として計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素タンパク；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色剤）含む洗剤組成物。
２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約６％〜約１１％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約１％〜約３％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８のアルコール、１〜２ＥＯ）又はアルキルスルフェート（例えば、Ｃ１６〜１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、炭素数１４〜１５のアルコール、７ＥＯ）；約１５％〜約２１％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２４％〜約３４％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約４％〜約１０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１％〜６％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；０％〜５％の少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を含む洗剤組成物。
３）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約５％〜約９％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約７％〜約１４％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ）；約１％〜約３％の脂肪酸（例えば、Ｃ１６〜２２の脂肪酸）等の石鹸；約１０％〜約１７％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３等）；約３％〜約９％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２３％〜約３３％のゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４等）；０％〜約４％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約８％〜約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約１％のフォスフォネート（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋なタンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；０％〜５％の少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）含む洗剤組成物。
４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約８％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約１０％〜約２５％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ）；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３等）；約１％〜約５％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２５％〜約３５％のゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）；０％〜約１０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１％〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸重合体、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を含む洗剤組成物。
５）水性液洗剤組成物であって、（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約１２％〜約１８％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ）又はＣ１２〜１５のアルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１３％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）等の石けん；０％〜約１３％のコハク酸アルケニル（Ｃ１２−１４）；約８％〜約１８％のアミノエタノール；約２％〜約８％のクエン酸；０％〜約３％のフォスフォネート；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；０％〜約２％のホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）；０％〜約３％のエタノール；約８％〜約１４％のプロピレングリコール；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液洗剤組成物。
６）構造化された水性液体洗浄組成物であって、（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；３％〜９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ）又はＣ１２〜１５のアルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１０％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）等の石鹸；約１４％〜約２２％のゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４等）；約９％〜約１８％のクエン酸カリウム；０％〜約２％のホウ酸塩（例えばＢ４Ｏ７）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）；例えばメタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体等の０％〜約３％の固着ポリマー、モル比２５：１、ＭＷ３８００；０％〜約５％のグリセロール；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む組成物。
７）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、約５％から約１０％の脂肪族アルコールスルフェート；約３％〜約９％のエトキシ化された脂肪酸モノエタノールアミド；０％〜３％の脂肪酸等の石鹸；約５％〜約１０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２０％〜約４０％のゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）；約２％〜約８％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約１２％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約７％のＴＡＥＤ；約１％〜約５％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば蛍光増白剤、泡抑制剤、香料）を含む洗剤組成物。
８）顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約８％〜約１４％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約５％〜約１１％のエトキシ化された脂肪酸モノエタノールアミド；０％〜約３％の脂肪酸等の石鹸；約４％〜約１０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性シリケート（Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約３０％〜約５０％のゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）；約３％〜約１１％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約５％〜約１２％のクエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸共重合体、ＰＥＧ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）を含む洗剤組成物。
９）顆粒として配合された洗剤組成物であって、（酸として計算して）約６％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約１％〜約４％の非イオン性界面活性剤；脂肪酸等の約２％〜約６％の石鹸；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１８％〜約３２％のゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）；約５％〜約２０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約３％〜約８％のクエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）；約４％〜約９％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約１％〜約５％の漂白剤アクチベータ（例えば、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボキシレート又はＰＥＧ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、蛍光増白剤、香料）を含む洗剤組成物。
１０）水性液体洗剤組成物であって、（酸として計算して）約１５％〜約２３％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；約８％〜約１５％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、２〜３ＥＯ）；約３％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ、又は、Ｃ１２〜１５のアルコール、５ＥＯ）；０％〜約３％の脂肪酸（例えば、ラウリン酸）等の石鹸；約１％〜約５％のアミノエタノール；約５％〜約１０％のクエン酸ナトリウム；約２％〜約６％のヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）；０％〜約２％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約１％のカルボキシメチルセルロース；約１％〜約３％のエタノール；約２％〜約５％のプロピレングリコール；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
１１）水性液体洗剤組成物であって、（酸として計算して）約２０％〜約３２％の直鎖アルキルベンゼンスルフォネート；６％〜１２％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５のアルコール、７ＥＯ、又は、Ｃ１２〜１５のアルコール、５ＥＯ）；約２％〜約６％のアミノエタノール；約８％〜約１４％のクエン酸；約１％の約３％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体、及び、例えば、メタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体等の固着ポリマー）；約３％〜約８％のグリセロール；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
１２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、約２５％〜約４０％の陰イオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルフォネート、アルキルスルフェート、α−オレフィンスルフォネート、α−スルフォ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルフォネート、石鹸）；約１％〜約１０％の非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）；約８％〜約２５％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約５％〜約１５％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；０％〜約５％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約１５％〜約２８％のゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４）；０％〜約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏ）；約０％〜約５％の漂白剤アクチベータ（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；０％〜３％の少量成分（例えば、香料、蛍光増白剤）を含む洗剤組成物。
１３）上記１）〜１２）に記載されている洗剤組成物であって、直鎖アルキルベンゼンスルフォネートのすべて又は一部がアルキルスルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８）で置き換えられた洗剤組成物。
１４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、約９％〜約１５％のアルキルスルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８）；約３％〜約６％のアルコールエトキシレート；約１％〜約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド；約１０％〜約２０％のゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）；１０％〜約２０の層状二珪酸塩(例えば、Hoechst社製のSK56）；約３％〜約１２％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；０％〜約６％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約４％〜約８％のクエン酸ナトリウム；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；約３％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボキシレート及びＰＶＰ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜５％の少量成分（例えば、蛍光増白剤、光退色剤、香料、泡抑制剤）を含む洗剤組成物。
１５）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物であって、約４％〜約８％のアルキルスルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８）；約１１％〜約１５％のアルコールエトキシレート；約１％〜約４％の石鹸；約３５％〜約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ；約２％〜約８％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３等）；０％〜約４％の可溶性シリケート（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；１％〜８％のＴＡＥＤ；０％〜約３％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ポリカルボキシレート及びＰＶＰ）；（純粋な酵素タンパクとして計算して）０．０００１％〜０．１％の酵素；及び、０％〜３％の少量成分（例えば、蛍光増白剤、フォスフォネート、香料）を含む洗剤組成物。
１６）上記１）〜１５）に記載されている洗剤製剤であって、さらなる一成分として、又は、既に特定された漂白剤系の代替として、安定化された又はカプセル化された過酸素酸を含む洗剤製剤。
１７）上記１）、３）、７）、９）及び１２）に記載されている洗剤組成物であって、過ホウ酸塩を過炭酸塩で置き換えた洗剤組成物。
１８）上記１）、３）、７）、９）、１２）、１４）及び１５）に記載されている洗剤組成物であって、マンガン触媒をさらに含む洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば、Hage et al., Nature 369:637-639(1994)に記載されている化合物の１つである。
１９）非水性の洗剤液として配合された洗剤組成物であって、例えば、直鎖のアルコキシル化された第１級アルコール、ビルダー系（例えば、ホスフェート）、酵素、及び、アルカリ等の液体の非イオン性界面活性剤を含む洗剤組成物。この洗剤は、陰イオン性界面活性剤及び／又は漂白剤系をさらに含んでいてもよい。
本発明のα−アミラーゼの１つ以上は、洗剤中で従来用いられる濃度で組み入むことができる。洗剤組成物中に、（純粋な酵素タンパクとして計算して）洗剤液１リットル当たり０．００００１ｍｇ〜１．０ｍｇの酵素に対応する量でα−アミラーゼ又はその変異体を加えることができることが本発明において意図されている。
他の一実施形態において、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼは、洗剤組成物中に組み入んで、家庭及び／又は産業の生地／洗濯物に存在する生物膜の除去／洗浄に使用することができる。
例えば、この洗剤組成物は、着色した布の前処理に適した洗濯添加剤組成物、及び、洗い流し液を加えた布柔軟仕上げ剤組成物を含む手動又は機械による洗濯の洗剤組成物として配合されたものであってもよいし、又は、一般家庭用硬表面洗浄作業において使用される洗剤組成物として配合されたものであってもよいし、又は、手動又は機械による洗濯作業のために配合されたものであってもよい。
特定の態様において、この洗剤組成物は、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼと、本発明のα−アミラーゼ変異体の１つ又はそれ以上に加えて１つ又はそれ以上のさらなるα−アミラーゼと、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／若しくは、ペルオキシダーゼ等の１つ又はそれ以上の他の洗浄酵素と、並びに／又は、これらの組み合わせをさらに含んでいてもよい。
一般に、選択した酵素の特性は、選択した洗剤（例えば、ｐＨ最適条件、他の酵素成分及び非酵素成分との適合性等）と適合性であるべきであり、また、その酵素が有効な量で存在すべきである。
４．２ 食器用洗剤組成物
本発明のα−アミラーゼは、下記のものを含む食器用洗剤組成物中で使用することもできる。
１）粉末自動食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 ０．４％−２．５％
メタ珪酸ナトリウム ０％−２０％
二珪酸ナトリウム ３％−２０％
三リン酸ナトリウム ２０％−４０％
炭酸ナトリウム ０％−２０％
過ホウ酸ナトリウム ２％−９％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） １％−４％
硫酸ナトリウム ５％−３３％
酵素 ０．０００１％−０．１％
２）粉末自動食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 １％−２％
（例えば、アルコールエトキシレート）
二珪酸ナトリウム ２％−３０％
炭酸ナトリウム １０％−５０％
フォスフォン酸ナトリウム ０％−５％
クエン酸三ナトリウム二水和物 ９％−３０％
ニトリロトリナトリウムアセテート（ＮＴＡ） ０％−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 ５％−１０％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） １％−２％
ポリアクリレートポリマー ６％−２５％
（例えば、マレイン酸／アクリル酸共重合体）
酵素 ０．０００１％−０．１％
香料 ０．１％−０．５％
水 ５％−１０％
３）粉末自動食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 ０．５％−２．０％
二珪酸ナトリウム ２５％−４０％
クエン酸ナトリウム ３０％−５５％
炭酸ナトリウム ０％−２９％
重炭酸ナトリウム ０％−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 ０％−１５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） ０％−６％
マレイン酸／アクリル酸共重合体 ０％−５％
粘土 １％−３％
ポリアミノ酸 ０％−２０％
ポリアクリル酸ナトリウム ０％−８％
酵素 ０．０００１％−０．１％
４）粉末自動食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 １％−２％
ゼオライトＭＡＰ １５％−４２％
二珪酸ナトリウム ３０％−３４％
クエン酸ナトリウム ０％−１２％
炭酸ナトリウム ０％−２０％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 ７％−１５％
テトラアセチルエチレン ０％−３％
ジアミン（ＴＡＥＤ）ポリマー ０％−４％
マレイン酸／アクリル酸共重合体 ０％−５％
有機ホスホン酸塩 ０％−４％
粘土 １％−２％
酵素 ０．０００１％−０．１％
硫酸ナトリウム 残り
５）粉末自動食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 １％−７％
二珪酸ナトリウム １８％−３０％
クエン酸三ナトリウム １０％−２４％
炭酸ナトリウム １２％−２０％
モノ過硫酸塩 １５％−２１％
（２ＫＨＳＯ５、ＫＨＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４）
漂白剤安定化剤 ０．１％−２％
マレイン酸／アクリル酸共重合体 ０％−６％
ジエチレントリアミン五酢酸五ナトリウム ０％−２．５％
酵素 ０．０００１％−０．１％
硫酸ナトリウム、水 残り
６）洗浄界面活性剤系を有する粉末及び液体の食器洗浄組成物
非イオン性界面活性剤 ０％−１．５％
オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物 ０％−５％
オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物と
ヘキサデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物と
の８０重量：２０重量のＣ１８／Ｃ１６混合物 ０％−４％
オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物と
ヘキサデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物と
の７０重量：３０重量のＣ１８／Ｃ１６混合物 ０％−５％
３の平均エトキシ化度のを有する
Ｃ１３−Ｃ１５アルキルエトキシスルフェート ０％−１０％
３の平均エトキシ化度を有する ０％−５％
Ｃ１２−Ｃ１５アルキルエトキシスルフェート
１２の平均エトキシ化度を有する ０％−５％
エトキシ化されたＣ１３−Ｃ１５アルコール
９の平均エトキシ化度を有する ０％−６．５％
エトキシ化されたＣ１２−Ｃ１５アルコールの混合物
３０の平均エトキシ化度を有する
エトキシ化されたＣ１３−Ｃ１５アルコールの混合物 ０％−４％
二珪酸ナトリウム ０％−３３％
三リン酸ナトリウム ０％−４６％
クエン酸ナトリウム ０％−２８％
クエン酸 ０％−２９％
炭酸ナトリウム ０％−２０％の
過ホウ酸ナトリウム一水和物 ０％−１１．５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） ０％−４％
マレイン酸／アクリル酸共重合体 ０％−７．５％
硫酸ナトリウム ０％−１２．５％
酵素 ０．０００１％−０．１％
７）非水性液体自動食器洗浄組成物
液体の非イオン性界面活性剤 ２．０％−１０．０％
（例えば、アルコールエトキシレート）
アルカリ金属ケイ酸塩 ３．０％−１５．０％
アルカリ金属リン酸塩 ２０．０％−４０．０％
高級のグリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体 ２５．０％−４５．０％
安定剤 ０．５％−７．０％
（例えば、リン酸とＣ１６−Ｃ１８アルカノールとの部分エステル）
泡抑制剤（例えば、シリコン） ０％−１．５％
酵素 ０．０００１％−０．１％
８）非水性液体食器洗浄組成物
液体の非イオン性界面活性剤 ２．０％−１０．０％
（例えば、アルコールエトキシレート）
ケイ酸ナトリウム ３．０％−１５．０％
アルカリ金属炭酸塩 ７．０％−２０．０％
クエン酸ナトリウム ０．０％−１．５％
安定剤系 ０．５％−７．０％
（例えば、細かく分離したシリコンと低分子量のジアルキルポリグリコールエーテルとの混合物）
低分子重量ポリアクリレートポリマー ５．０％−１５．０％
粘土ゲル増粘剤（例えば、ベントナイト） ０．０％−１０．０％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー ０．０％−０．６％
酵素 ０．０００１％−０．１％
高級のグリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体 残り
９）チキソトロピー性の液体自動食器洗浄組成物
Ｃ１２−Ｃ１４脂肪酸 ０％−０．５％
ブロック共重合体界面活性剤 １．５％−１５．０％
クエン酸ナトリウム ０％−１２％
三燐酸ナトリウム ０％−１５％
炭酸ナトリウム ０％−８％
トリスステアリン酸アルミニウム ０−０．１％
クメンスルホン酸ナトリウム ０％−１．７％
ポリアクリレート増粘剤 １．３２％−２．５％
ポリアクリル酸ナトリウム ２．４％−６．０％
ホウ酸 ０％−４．０％
ギ酸ナトリウム ０％−０．４５％
カルシウム蟻酸塩 ０％−０．２％
ｎ−デシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム ０％−４．０％
モノエタノールアミン（ＭＥＡ） ０％−１．８６％
水酸化ナトリウム（５０％） １．９％−９．３％
１，２−プロパンジオール ０％−９．４％
酵素 ０．０００１％−０．１％
泡抑制剤、染料、香料、水 残り
１０）液体の自動食器洗浄組成物
アルコールエトキシレート ０％−２０％
脂肪酸エステルスルフォネート ０％−３０％
ドデシル硫酸ナトリウム ０％−２０％
アルキルポリグリコシド ０％−２１％
オレイン酸 ０％−１０％
二珪酸ナトリウム一水和物 １８％−３３％
クエン酸ナトリウム二水和物 １８％−３３％
ステアリン酸ナトリウム ０％−２．５％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 ０％−１３％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） ０％−８％
マレイン酸／アクリル酸共重合体 ４％−８％
酵素 ０．０００１％−０．１％
水 残り
１１）保護された漂白剤粒子を含む液体自動食器洗浄組成物
ケイ酸ナトリウム ５％−１０％
ピロリン酸四カリウム １５％−２５％
三リン酸ナトリウム ０％−２％
炭酸カリウム ４％−８％
保護された漂白剤粒子、例えば、塩素 ５％−１０％
重合体増粘剤 ０．７％−１．５％
水酸化カリウム ０％−２％
酵素 ０．０００１％−０．１％
水 残り
１１）上記１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載されているような自動食器洗浄組成物であって、過ホウ酸塩が過炭酸塩で置き換えられたもの。
１２）上記１）−６）に記載されているような自動食器洗浄組成物であって、マンガン触媒をさらに含むもの。このマンガン触媒は、例えば、Hage et al., Nature 369:637-639(1994)に記載されている化合物の１つであってもよい。
４．３ 生物膜除去組成物及び使用
他の一実施形態において、生物膜を除去又は分解するための組成物であって、本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上を含む組成物を提供する。この組成物は、唯一の酵素活性として本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上を含んでいてもよく、それによって生物膜を除去又は分解に使用するための単一成分組成物となる。代替的に、この組成物は、複数のアミラーゼ等の複数の酵素活性を含むものであってもよいし、又は、下記：アミノペプチダーゼ、アミラーゼ（β又はα又はグルコ−アミラーゼ）、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシル移転酵素、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及び／若しくは、キシラナーゼのあらゆる組み合わせを含む酵素の混合物であってもよいし、又は、生物膜を除去するためのこれらのあらゆる組み合わせであり得る。特別な酵素は、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼである。追加酵素は、アスペルギルス、トリコデルマ、フミコラ（例えばＨ．インソレンズ）及びフザリウムの種に属する微生物によって生産可能なものであってもよい。アスペルギルスの典型的なものには、Ａ．アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、Ａ．アワモリ( A. awamori)、Ａ．ニガー(A. niger)及びＡ．オリザエ(A. oryzae)が含まれる。フザリウム種の典型的なものには、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェルエンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミニアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディニス(Fusarium negundinis)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロセウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイズ(Fusarium trichothecioides)、及び、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)が含まれる。
生物膜を除去又は分解する組成物は、液体の又は乾燥した組成物の形態であってもよい。α−アミラーゼは、例えば、顆粒又は微小顆粒の形態で存在していてもよいし、又は、当業界で知られている方法に従って安定化されたものであってもよい。生物膜は一般に表面に存在しており、生物膜の分解は、例えば、本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上を含む水性媒体でその表面を浸漬、被覆、又は、噴射することによって、その表面を接触するようにさせることによって達成することができる。この組成物は、例えば、パルプ化及び製紙業における白濁水等の粘液を加水分解するために使用することができる。
α−アミラーゼは、０．０００１〜１００００ｍｇ／Ｌ、０．００１−１０００ｍｇ／Ｌ、０．０１−１００ｍｇ／Ｌ、又は、０．１−１０ｍｇ／Ｌの量で存在することができる。さらなる酵素及び酵素変異体は、同様の量又はそれより少ない量で存在することができる。
このプロセスは、おおよそ環境温度から約７０℃までの温度で適切に実行することができる。典型的な温度範囲には、約３０℃乃至約６０℃、例えば、約４０℃乃至約５０℃が含まれる。
生物膜を加水分解するのに適したｐＨは、約３．５〜約８．５に存在する。典型的なｐＨ範囲には、約５．５〜約８、例えば、約６．５〜約７．５が含まれる。生物膜を有効に除去するための酵素の接触時間又は反応時間は、生物膜の特性、及び、酵素単独で又は他の生物膜分解酵素と組み合わせで表面を処理する頻度に応じて、かなり変化する可能性がある。典型的な反応時間には、約０．２５時間乃至約２５時間、約１間乃至約１０時間、例えば約２時間が含まれる。
α−アミラーゼは、酵素又は非酵素の生物致死剤等の抗生剤とさらに組み合わされてもよい。例えば、酵素の生物致死剤は、例えば、ＰＣＴ出願WO97/42825及びDK97/1273に記載されているように、酸化還元酵素（例えば、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、特にハロペルオキシダーゼ）、及び、選択的にアルキルシリンゲート等の促進剤を含む組成物である。
例えば生物膜を除去／又は剥離する対象となり得る表面は、定義上は微生物に対して実質的に非浸透性のあらゆる表面に関連する硬表面である。表面の例は、例えばステンレススチール合金等の金属、プラスチック／合成高分子、ゴム、ボード、ガラス、木、紙、繊維、コンクリート、岩、大理石、セッコウ、及び、セラミックの材料から作られた表面であり、該表面は、選択的に、例えば、塗料、エナメル、及び、ポリマー等でコーティングされたものであってもよい。従って、この表面は、給水設備、食品加工設備、冷却設備、化学処理設備又は製薬処理設備等のように、水溶液を保持、輸送、処理する設備、又は、水溶液に接触する設備の構成部材であってもよい。この組成物、並びに、パルプ産業及び／又は製紙産業等の木材産業における生物膜の除去のための該組成物の使用方法。従って、上記酵素及び上記酵素を含む組成物は、従来の定置洗浄（C-I-P）設備において有用である。この表面は、パイプ、タンク、ポンプ、膜、フィルタ、熱交換器、遠心機、蒸発装置、ミキサー、噴霧塔、バルブ及び反応装置等の設備単位の構成部材であってもよい。また、この表面は、汚染した内視鏡、人工器官又は医療用インプラント等のような医学及び産業において使用される器具であってもよいし、又は、該器具の一部分であってもよい。
生物膜を除去するための組成物は、金属表面（例えば配水管）が微生物の生物膜によって攻撃されるときに生じるいわゆる生物腐食を防ぐこと、すなわち、生物膜を分解することによって、その生物膜の微生物細胞が、その細胞が付着した金属表面を腐食する生物膜環境を構築するのを防ぐことも意図されている。
抗生物膜組成物のための他の一用途は口腔ケアである。しかしながら、表面は、粘膜、皮膚、歯、毛、爪などのような生物由来のものであってもよい。
歯垢が付着した歯（例えば、練り歯磨きに酵素を混合することによって）及び汚れたコンタクトレンズは、表面として包含される。従って、本発明のα−アミラーゼの１つ以上は、人間又は動物の歯に存在する歯垢を分解するための薬剤を作成するための組成物及びプロセスに使用可能である。さらなる使用は、嚢胞性繊維症を患う患者の肺内の生物膜等のような、粘膜に由来する生物膜の分解である。
従って、さらに別の一態様は、あらゆる活性汚染物質が実質的に含まれない精製された酵素などのように、組み換え酵素を含む口腔ケア組成物に関する。口腔ケア組成物は、所定量の組み換え酵素を適切に含んでいてもよい。
他の生物膜を分解する酵素であって、口腔ケア組成物に使用するための酵素は、口腔ケア組成物中の２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ活性を含むが、これに限定されない。意図されている酵素活性は、デキストラナーゼ；ミュータン分解酵素；グルコースオキシダーゼ及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ等のオキシダーゼ、例えばWO95/10602に記載されているコプリナス種のペルオキシダーゼ若しくはラクトペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、特に、クルブラリア（Curvularia)種、特にＣ．バールキュロサ(C.verruculosa)及びＣ．イナエクアリアス(C.inaequalis)に由来するハロペルオキシダーゼ；ラッカーゼ；パパイン等のプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ（例えば、WO95/02044に記載されている酸性プロテアーゼ）、エンドクロコシダーゼ、リパーゼ、ＡＭＧ(Novo Nordisk A/S社製)等のアミログルコシダーゼを含むアミラーゼ；抗微生物酵素、及び、これらの混合物を含む酵素の群に由来する活性を含む。
口腔ケア組成物は、あらゆる適切な物理的形態（すなわち、粉末、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等）を有し得る。「口腔ケア組成物」には、歯垢及び歯石の形成を予防し、歯垢及び歯石を除去し、歯の病気を予防及び／又は治療することなどによって、人間及び動物の口内において口腔衛生を維持又は向上するために使用することができる組成物が含まれる。少なくとも本文脈において、口腔ケア組成物には、義歯、人工歯等を洗浄するための製品が含まれる。そのような口腔ケア組成物の例には、練り歯磨き、デンタルクリーム、ゲル若しくは歯磨き粉、歯骨口内洗剤、ブラッシング前用の又はブラッシング後用の洗浄配合物、チューインガム、ロゼンジ、及び、キャンディが含まれる。練り歯磨き及び歯磨きジェルには、一般に、研磨性の磨き剤、発泡剤、香料、保湿剤、バインダ、増粘剤、甘味料、白色化／漂白／着色除去の薬剤、水、及び、選択的にさらなる酵素及び酵素の組み合わせが含まれる。
歯垢除去液を含む口内洗浄液は、一般に、水／アルコール溶液、香味、保湿剤、甘味料、発泡剤、着色剤、及び、選択的にさらなる酵素若しくは酵素の組み合わせを含む。
歯磨剤等のような研磨性磨き材料を口腔ケア組成物中に組み込むこともできる。研磨性の磨き剤には、αアルミナ三水和物等のようなアルミナ及びその水化物；三ケイ酸マグネシウム；炭酸マグネシウム；カオリン；焼成された珪酸アルミニウム及び珪酸アルミニウム等のアルミノシリケート；炭酸カルシウム；ケイ酸ジルコニウム；ポリ塩化ビニル等の粉末プラスチック；ポリアミド；ポリメタクリル酸メチル；ポリスチレン；フェノール・ホルムアルデヒド樹脂；メラミン・ホルムアルデヒド樹脂；尿素・ホルムアルデヒド樹脂；エポキシ樹脂；粉末ポリエチレン；シリカキセロゲル；ヒドロゲル、及び、エーロゲル等が含まれる。ピロリン酸カルシウム；不水溶性のアルカリメタリン酸塩；リン酸カルシウム及び／又はその二水和物、第二リン酸カルシウム；リン酸三カルシウム；及び、粒子状のハイドロキシアパタイト等も研磨剤として適切である。これらの物質の混合物を使用することもできる。
口腔ケア組成物に応じて、研磨性生成物は、約０重量％乃至約７０重量％、又は、約１重量％乃至約７０重量％存在していてもよい。練り歯磨きに関して、研磨性材料の含有量は、練り歯磨きの最終製品の重量を基準として、一般に１０重量％乃至７０重量％の範囲内である。
保湿剤は、例えば練り歯磨き等から水分が失われるのを防ぐために使用される。口腔ケア組成物中で使用されるのに適した保湿剤には、グリセロール、多価アルコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、及び、水素化されて部分的に加水分解された多糖類等の化合物、並びに、これらの混合物が含まれる。保湿剤は、一般に、練り歯磨き中の重量で０％乃至約８０％、又は、約５％乃至約７０％の量で存在する。
シリカ、デンプン、トラガカントガム、キサンタンガム、アイルランドゴケの抽出物、アルギネート、ペクチン、（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及びヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸及びその塩、並びに、ポリビニルピロリドンは、歯みがき製品を安定化させることを助ける適切な増粘剤及びバインダの例として挙げることができる。最終製品の重量によって、増粘剤は約０．１％乃至約２０％の量で、バインダは約０．０１%乃至約１０％の量で、練り歯磨きのクリーム及びゲル中に存在することができる。
陰イオン性の界面活性剤、陽イオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、双性イオン性の界面活性剤、及び／又は、両性イオン性の界面活性剤は、発泡剤石鹸として使用することができる。これらは、最終生産物の重量によって、０％乃至約１５％、約０．１％乃至約１３％、又は、約０．２５％乃至約１０％の水準で存在することができる。
界面活性剤は、α−アミラーゼに対する不活性化効果を発揮しない程度までの量であれば適切である。界面活性剤には、脂肪族アルコールスルフェート、１０個〜２０個の炭素原子を有するスルホン化されたグリセリド又は脂肪酸の塩、脂肪酸卵白縮合物、脂肪酸アミドとタウリンとの塩、及び／又は、イセチオン酸の脂肪酸エステルの塩が含まれる。
適切な甘味料には、製剤における使用のためのサッカリンが含まれる。スペアミント等の香味料は、通常、重量によって、約０．０１％乃至約５％、特に約０．１％乃至約５％のような少ない量で存在する。白化剤／白色化剤は、Ｈ２Ｏ２を含んでおり、最終生産物の重量で計算して、約５％より少ない量、又は、約０．２５％乃至約４％の量で加えるようにすることができる。白化剤／白色化剤は、酸素還元酵素のような酵素であってもよい。歯の適切な白色化酵素の具体例はWO97/06775に記載されているようなものである。
通常、水分は、例えば、練り歯磨きに流動できる形態を与える量で加えられる。クロルヘキシジンジグルコン酸塩、ヘキセチジン、アレキシジン、トリクロサン（登録商標）等のさらなる水溶性抗細菌剤、第四級アンモニウム抗細菌性化合物、並びに、亜鉛、銅、銀及び錫等の特定の金属イオンの水溶性供給源（例えば、塩化亜鉛、塩化銅、及び、塩化錫、及び、硝酸銀）がさらに含まれていてもよい。
フッ化物供給源、染料／着色剤、保存剤、ビタミン、ｐＨ調節剤、虫歯予防薬、及び、減感色素等として使用することができる化合物の添加も意図されている。
口腔の洗浄に用いられる場合、生物膜分解酵素はいくつかの利点を有している。プロテアーゼは、歯の表面に吸着されてプラークの第１層である薄膜を形成する唾液タンパクを分解する。プロテアーゼは、リパーゼと共に、細菌の細胞壁及び細胞膜の構造部材を形成するタンパク及び脂質を溶解させることによって細菌を破壊する。
デキストラナーゼ、及び、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ等の他のカルボヒドラーゼは、細菌付着のためのマトリクスを形成する細菌によって生産される有機骨格構造を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼは、カルシウムに結合する炭水化物タンパク複合体を分解することによって、プラーク形成を防ぐだけでなく、歯石の成長を防ぎ、石灰化を防止することができる。
一般に、練り歯磨きは、練り歯磨き組成物の最終産物の重量％で、最大の約７０％の研磨材、０％〜約８０％の保湿剤、約０．１％〜約２０％の増粘剤、約０．０１％〜約１０％のバインダ、約０．１％〜約５％の甘味料、０％〜約１５％の発泡剤、０％〜約５％の白色化剤、及び、約０．０００１％〜約２０％の酵素の成分を含むことができる。
特定の実施形態において、練り歯磨きは、約６．０〜約８．０の範囲内のｐＨを有し、以下：ａ）約１０％〜約７０％の研磨材；ｂ）０％〜約８０％の保湿剤；ｃ）０．１％〜約２０％の増粘剤；ｄ）０．０１％〜約１０％のバインダ；ｅ）約０．１％〜約５％の甘味料；ｆ）０％〜約１５％の発泡剤；ｇ）０％〜約５％の白色化剤；ｉ）約０．０００１％〜約２０％の酵素を含む。
以下で言及されている酵素は、ｉ）α−アミラーゼ変異体のみを含むか、又は、２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ等の他の生物膜分解酵素と組み合わせでα−アミラーゼ変異体を含んでおり、また、選択的に、練り歯磨き中で使用されることが知られている上述の他の種類の酵素等を含む。
口内洗浄液は、一般に、（口内洗浄液組成物の最終製品の重量％で）以下の成分：０％〜約２０％の保湿剤；０％〜約２％の界面活性剤；０％〜約５％の酵素；０％〜約２０％のエタノール；０％〜約２％の他の成分（例えば、香味料、フッ化物等の甘味料有効成分）を含んでいてもよい。この組成物は約０％〜約７０％の水分を含んでいてもよい。
この口内洗浄液組成物は、適切な緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウム、ｐＨ約６．０〜約７．５の範囲内）で緩衝されたものであってもよい。この口内洗浄液は、希釈されていない（すなわち、使用前に希釈が必要な）形態で存在することができる。
口腔ケア組成物は、口腔ケア分野の当業者に知られている従来のあらゆる方法を使用して生産することができる。
４．４ デンプン加工組成物及び使用
他の一態様において、本発明のα−アミラーゼを含む組成物は、デンプンの液化又は糖化のために利用することができる。
一実施形態において、上記組成物はデンプンから甘味料を生産するために使用される。デンプンをフルクトースシロップに変換するための「伝統的」プロセスは、通常、３つの連続した酵素によるプロセス、すなわち、液化プロセスと、その後の糖化プロセス及び異性化プロセスとからなる。液化プロセス中に、デンプンは、ｐＨ約５．５〜約６．２及び約９５℃〜約１６０℃の温度で約２時間にわたって、α−アミラーゼによってデキストリンに分解される。これらの条件下において最善の酵素安定性を確保するために、１ｍＭのカルシウム（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）を加える。デンプン加工は、アルコールの生産（例えば、燃料及び飲用アルコールのための穀物液化、アルコール醸造）、甘味料生産のためのデンプン液化、サトウキビ糖の加工、及び、他の食料関連デンプンの加工の目的に有用である。別のα−アミラーゼ又はその変異体には他の条件を用いることができる。
液化プロセスの後に、デキストリンは、グルコアミラーゼ（例えば、ＡＭＧ（商標））、及び、イソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例えば、PROMOZYME（商標））等の脱分枝酵素の添加によってデキストロースに変換される。このステップの前に、ｐＨを約４．５より低い値にし、高温（９５℃超）を維持して、α−アミラーゼを液化する活性を変性させる。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を加えることができる。この糖化プロセスは一般に約２４時間〜約７２時間にわたって続ける。
糖化プロセスの後に、ｐＨを約６．０〜約８．０の範囲内の値（例えば、ｐＨ７．５）に上昇させ、また、イオン交換によってカルシウムを除去する。その後、デキストロースシロップは、例えば、固定化されたグルコースイソメラーゼ（Sweetzyme（登録商標）等）を使用して、高フルクトースシロップに変換される。
いくつかの実施形態において、上記組成物及び方法は、液化を行うα−アミラーゼのカルシウム依存性が低減されている。α−アミラーゼの安定性を充分に確保するために遊離カルシウムの添加が必要とされるが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く抑制するので、高価なユニット作業によって遊離カルシウムの濃度を３乃至５ｐｐｍ未満程度に減らす必要がある。そのような操作を回避することができれば、コストを削減することができ、遊離カルシウムイオンを添加することなく液化プロセスを実行することができる。
低減されたカルシウム依存性を有するα−アミラーゼであって、遊離カルシウムの低濃度条件（＜４０ｐｐｍ）において安定かつ活性であるα−アミラーゼは、上記組成物及び方法において利用することができる。そのようなα−アミラーゼ又はその変異体は、約４．５〜約６．５の範囲内、又は、約４．５〜約５．５の範囲内のｐＨにおいてｐＨ最適条件を有するはずである。
本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上は、様々な目的のためにデンプン又はあらゆるマルトデキストリン含有化合物を加水分解するための研究装置及び工業装置において使用することができる。このα−アミラーゼは、特定の加水分解を提供するために単独で使用されてもよいし、又は、「混合物」に広範囲の活性を与えるために他のアミラーゼと組み合わされてもよい。典型的な用途には、生物学的サンプル、食料サンプル、飼料サンプル、薬剤サンプル、又は、工業サンプルからの、デンプン又はあらゆるマルトデキストリン含有化合物の除去又は部分的な若しくは完全な加水分解が含まれる。
本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上は、酵母菌等の発酵生物による発酵生産物に変換するのに適したグルコース及び／又はマルトースを、デンプン基質を液化及び／又は糖化することによって生産する発酵プロセスにおいて使用することができる。そのような発酵プロセスには、燃料用エタノール又は飲料用エタノール（飲用アルコール）を生産するプロセス、飲料を生産するプロセス、並びに、所望の有機化合物（例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又は、エリトルビン酸ナトリウム等）、ケトン、アミノ酸（グルタミン酸、モノグルタミン酸ナトリウム等）、合成的に生産するのが難しいより複雑な化合物（例えば、ペニシリン、テトラサイクリン等の抗生物質）、酵素、ビタミン（例えば、リボフラビン、ビタミンＢ１２、β−カロテン）、及び、ホルモンを生産するプロセスが含まれる。
加工するデンプンは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９．５％の純度のように高度に精製されたデンプン品質であり得る。あるいは、このデンプンは、より多くの天然デンプンを含む材料であって、胚残留物及び線維等の非デンプン画分を含む粉砕された全穀粒を含む材料であってもよい。全穀粒等の原料は、構造を広げてさらに加工できるようにするために粉砕されたものである。湿式粉砕及び乾式粉砕の２つの粉砕プロセスを使用することができる。粉砕されたコーングリット等のコーングリットを利用することができる。
乾式粉砕した穀物は、デンプンに加えて、かなり多量の非デンプン炭水化物化合物を含むであろう。そのような不均一材料をジェットクッキングによって処理する場合には、デンプンの部分的なゼラチン化のみが達成される。本発明のα−アミラーゼは、ゼラチン化されていないデンプンに対して高い活性を有するので、ジェットクッキングした乾式粉砕デンプンの液化及び／又は糖化を伴うプロセスにおいて有利に利用される。
さらに、本発明のα−アミラーゼの優れた加水分解活性により、非常に低いレベルのグルコアミラーゼ活性において糖化を実行することが可能になるので、糖化ステップにおけるグルコアミラーゼの必要性が大幅に低下する。グルコアミラーゼ活性は、全く存在しないか、又は、デンプン基質の0.5AGU/g DS以下若しくは未満、0.4AGU/g DS以下若しくは未満、0.3AGU/g DS以下若しくは未満、0.1AGU/g DS以下若しくは未満（約0.05AGU/g DS以下若しくは未満等）の量で存在する。「ＤＳ」は、乾燥した固体基質１グラム当たりに加える酵素の単位である。酵素タンパクをｍｇで表せば、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、存在しないか、又は、約０．５mg EP/g DS以下若しくは未満、約０．４mg EP/g DS以下若しくは未満、約０．３mg EP/g DS以下若しくは未満、約０．１mg EP/g DS以下若しくは未満（例えば、約０．０５mg EP/g DS以下若しくは未満、又は、約０．０２mg EP/g DS以下若しくは未満）の量で存在する。グルコアミラーゼは、アスペルギルス(Aspergillus)種、タラロミセス(Talaromyces)種、パチキトスポラ(Pachykytospora)種、又は、トラメテス(Trametes)種に由来するものであってもよく、典型例は、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)、タラロミセスエマーソニイ(Talaromyces emersonii)、トラメテスシングラタ(Trametes cingulata)、及び、パチキトスポラパピラセア(Pachykytospora papyracea)である。
上記プロセスは、ａ）例えば第１態様のポリペプチド等のような、α−アミラーゼ活性を有する触媒単位と炭水化物結合単位とを含む本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上にデンプン基質を接触させるステップと、ｂ）少なくとも９０重量％、少なくとも９１重量％、少なくとも９２重量％、少なくとも９３重量％、少なくとも９４重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、又は、少なくとも９９．５重量％のデンプン基質を発酵性糖に変換することを達成するのに充分な時間及び温度で、前記デンプン基質を前記酵素と共にインキュベート（定温放置）するステップと、ｃ）発酵生成物を生産するために発酵するステップと、ｄ）選択的に発酵生成物を回収するステップとを含んでいてもよい。上記工程ｂ）及び／又はｃ）において、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、存在しないか、又は、０．００１〜２．０AGU/g DS、０．０１〜１．５AGU/g DS、０．０５〜１．０AGU/g DS、若しくは、０．０１〜０．５AGU/g DSの量で存在する。グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、存在しなくてもよいし、又は、０．５AGU/g DS以下若しくは未満、０．４AGU/g DS以下若しくは未満、０．３AGU/g DS以下若しくは未満、又は、０．１AGU/g DS以下若しくは未満（例えば、デンプン基質１ＤＳ当たり０．０５AGU/g以下若しくは未満）の量で存在することもできる。酵素タンパクをｍｇで表せば、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、存在しないか、又は、０．５mg EP/g DS以下若しくは未満、０．４mg EP/g DS以下若しくは未満、０．３mg EP/g DS以下若しくは未満、若しくは、０．１mg EP/g DS以下若しくは未満（例えば、デンプン基質１ＤＳ当たり０．０５mg EP/g以下若しくは未満若しくは０．０２mg EP/g以下若しくは未満）の量で存在する。上記工程ａ）、ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）は別々に又は同時に実行することができる。
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、ａ）デンプン基質を、α−アミラーゼ活性を有する触媒単位と炭水化物結合単位とを含む本発明のα−アミラーゼの１つ又はそれ以上を発現するように形質転換された酵母細胞に接触させるステップと、ｂ）前記デンプン基質を、少なくとも９０重量％のデンプン基質を発酵性糖に変換することを達成するのに充分な時間及び温度で前記酵母と共にインキュベートするステップと、ｃ）エタノールを生産するために発酵させるステップと、ｄ）選択的にエタノールを回収するステップとを含む。上記工程ａ）、ｂ）及びｃ）は別々に又は同時に実行することができる。
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、ゼラチン化された又は粒状のデンプンのスラリーの加水分解、特に、粒状デンプンの初期ゼラチン化温度より低い温度で粒状デンプンを可溶性デンプン加水分解物に加水分解するステップを含む。α−アミラーゼ活性を有する触媒単位と炭水化物結合単位とを含むポリペプチドに接触させステップに加えて、デンプンを、真菌性α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）のいずれか１つ又はそれ以上に、並びに、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）及びグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）の１つ又はそれ以上に接触させることができる。更なる一態様においては、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）又はプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）等の他のデンプン分解酵素又は脱分枝酵素を、本発明のα−アミラーゼと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、初期ゼラチン化温度より低い温度で行う。そのようなプロセスは、多くの場合、少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４３℃、少なくとも４４℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、少なくとも５０℃、少なくとも５１℃、少なくとも５２℃、少なくとも５３℃、少なくとも５４℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、又は、少なくとも６０℃で行う。このプロセスが行われるｐＨは、約３．０〜約７．０、約３．５〜約６．０、又は、約４．０〜約５．０の範囲内である。一態様は、例えばエタノールを生産するための酵母菌を用いて、例えば３０℃乃至３５℃等のように約３２℃の温度における発酵を含むプロセスを意図するものである。
他の一態様において、上記プロセスは、例えば約３２℃のように３０℃乃至３５℃の温度において、例えばエタノールを生産するための酵母又は所望の有機化合物を生産するための他の適切な発酵生物を用いた同時の糖化及び発酵を含む。
上記発酵プロセスにおいて、エタノール含有量は、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約１６％のエタノールに達する。
上記態様のいずれかにおいて使用されるデンプンスラリーは、約２０％〜約５５％の乾燥固体粒状デンプン、約２５％〜約４０％の乾燥固体粒状デンプン、又は、約３０％〜約３５％の乾燥固体粒状デンプンを有していてもよい。α−アミラーゼに接触させた後に、酵素は、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の量で、可溶性デンプンを、粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解産物に変換する。
他の一実施形態において、α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する触媒単位と炭水化物結合単位とを含んでおり、ゼラチン化されたデンプンの液化及び糖化のためのプロセス、例えば、限定されるものではないが、ジェットクッキングによるゼラチン化において使用される。このプロセスには、発酵生産物（例えばエタノール）を生産するための発酵が含まれてもよい。デンプン含有材料から発酵によってエタノールを生産するためのそのようなプロセスは、（ｉ）α−アミラーゼ活性を有する触媒単位と炭水化物結合単位とを含むポリペプチド（例えば第１態様のポリペプチド）を用いてデンプン含有材料を液化するステップと、（ｉｉ）液化して得られたマッシュを糖化するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた材料を発酵生物の存在下で発酵させるステップとを含む。選択的に、上記プロセスは、エタノール回収をさらに含む。上記糖化プロセス及び上記発酵プロセスは、同時の糖化と発酵のプロセス（ＳＳＦプロセス）として実行することもできる。発酵中に、エタノール含有量は、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも１５％、例えば、少なくとも１６％のエタノールに達する。
上記態様のプロセスにおいて加工されるデンプンは、特に、塊茎、根、茎、豆果、穀物又は全穀粒から得ることができる。より詳細には、粒状デンプンは、コーン、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、マイロ、サゴ、カッサバ、タピオカ、モロコシ、コメ、エンドウ、豆、バナナ又はイモから得ることができる。コーン及び大麦の油性タイプ又は非油性タイプも意図されている。
上記組成物は、ゼラチン化された若しくは粒状のデンプン及び部分的にゼラチン化されたデンプンを液化及び／又は糖化するために使用することができる。部分的にゼラチン化されたデンプンとは、ある程度がゼラチン化されたデンプン、すなわち、デンプンの一部が不可逆的に膨張してゼラチン化し、また、デンプンの一部が粒状のまま存在するデンプンである。
上記組成物は、０．０１〜１０．０AFAU/g DS、０．１〜５．０AFAU/g DS、０．５〜３．０AFAU/g DS、又は、０．３〜２．０AFAU/g DSの量で存在する酸性のα−アミラーゼ変異体を含んでいてもよい。上記組成物は上記デンプン処理のあらゆるものにおいて利用できる。
β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、すなわち、エキソ型マルトース生成アミラーゼ）は、アミロース、アミロペクチン、及び、関連グルコースポリマー中の１，４−αグルコシド結合の加水分解を触媒することによってマルトースを放出させるために加えられてもよい。β−アミラーゼは、様々な植物及び微生物から単離される(W. M. Fogarty and C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979)。これらのβ−アミラーゼは、４０℃〜６５℃の範囲内の最適温度及び約４．５〜約７．０に範囲内の最適ｐＨを有することを特徴とする。以下に限定されるものではないが、意図されているβ−アミラーゼには、大麦SPEZYME（登録商標）BBA1500、SPEZYME（商標）DBA、OPTIMALT（商標）ME、OPTIMALT(商標)BBA(Genencor International社）、及び、NOVOZYM（商標）WBA(Novozymes A/S)に由来するβ−アミラーゼが含まれる。
グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）も組成物中に含まれていてもよい。このグルコアミラーゼは微生物又は植物に由来するものであってもよい。典型的なグルコアミラーゼは真菌又は細菌に由来するものである。典型的な真菌グルコアミラーゼは、アスペルギルス・グルコアミラーゼ、特に、アスペルギルスＧ１又はＧ２グルコアミラーゼ(Boel et al., EMBO J. 3(5):1097-1102(1984)又はその変異体であってWO92/00381及びWO00/04136に開示されているもの等；Ａ．アワモリ・グルコアミラーゼ(WO84/02921)；Ａ．オリゼー(Agric. Biol. Chem., 55(4): 941-949 (1991))又はその変異体若しくは断片である。
他のアスペルギルス・グルコアミラーゼ変異体は、熱安定性を向上するための変異体：G137A及びG139A(Chen et al., Prot. Eng. 9: 499-505 (1996)); D257E及びD293E/Q(Chen et al., Prot. Eng. 8: 575-582(1995)); N182(Chen et al., Biochem. J. 301: 275-281(1994)); ジスルフィド結合、A246C (Fierobe et al., Biochemistry, 35: 8698-8704(1996)); 並びに、位置A435及び位置S436におけるプロリン残基の導入(Li et al., Protein Eng. 10: 1199-1204(1997))を含む。意図されている他のグルコアミラーゼには、タラロミセス・グルコアミラーゼ、特に、タラロミセス・エマーソニイ(Talaromyces emersonii)(WO99/28448)、タラロミセス・レイセタヌス(Talaromyces leycettanus)(米国特許No. RE32153）、タラロミセス・デュポンティ(Talaromyces duponti)、タラロミセス・サーモフィラ（米国特許第4587215号）に由来するものが含まれる。
細菌グルコアミラーゼには、クロストリジウム属に由来するグルコアミラーゼ、特に、Ｃ．サーモアミロリチカム(C. thermoamylolyticum)(EP135138)、及び、Ｃ．サーモヒドロスルフリクム(C. thermohydro sulfuricum)(WO86/01831)が含まれる。さらに意図されている市販のグルコアミラーゼは、AMG200L; AMG300L; SAN(商標)SUPER及びAMG(商標)E (Novozymes社製); OPTIDEX(商標)300 (Genencor International社製); AMIGASE(商標)及びAMIGASE(商標)PLUS (DSM社製); G-ZYME(商標) G900 (Enzyme Bio-Systems社製); G-ZYME(商標)G990ZR (Ａ．ニガーグルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量)である。
いくつかの実施形態において、グルコアミラーゼは、０．０２〜２．０AGU/g DS又は０．１〜１．０AGU/g DS、例えば、０．２AGU/g DS等の量で加えられてもよい。
選択的に加えることができる他の酵素は、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）又はプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）等の脱分枝酵素である。イソアミラーゼは、アミロペクチン及びβリミットデキストリン中のα−１，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解するものであり、イソアミラーゼにプルランを攻撃する能力がないこと及びαリミットデキストリンに対する作用が限定されていることによってプルラナーゼと区別され得る。脱分岐酵素は、当業者に広く知られている有効な量で加えることができる。
上記プロセスの生成物の正確な組成は、利用する酵素の組み合わせ及び加工する粒状デンプンの種類によって左右される。例えば、可溶性の加水分解産物は、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％又は少なくとも約９９．５％の純度を有するマルトースであり得る。あるいは、可溶性のデンプン加水分解産物がグルコースであることもあり得るし、又は、デンプン加水分解物が、少なくとも９４．５％、少なくとも９５．０％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６．０％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７．０％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８．０％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９．０％若しくは少なくとも９９．５％のＤＸ（可溶性された全固形分のグルコース百分率）を有する。上記プロセスは、グルコース、マルトース、ＤＰ３及びＤＰｎの混合物を含む特殊シロップ等のように、アイスクリーム、ケーキ、キャンディ、缶詰め果物の生産において使用するための特殊シロップである生成物を含み得る。
２つの粉砕プロセスは湿式粉砕及び乾式粉砕である。湿式粉砕においては全穀粒を粉砕して使用する。湿式粉砕は、胚と穀粉（デンプン粒子とタンパク）の優れた分離を与えるものであり、若干の例外はあるものの、シロップの生産においてデンプン加水分解物を使用する位置において利用される。乾式粉砕及び湿式粉砕の両方は、デンプン加工の業界において広く知られてており、本明細書に開示されている組成物及び方法と共に使用されるように同等に意図されている。酵素、未加工デンプン及び水の存在下で濃縮水を再循環下に保持し、かつ、浸透液が可溶性デンプン加水分解物である限外濾過システムにおいて上記プロセスを実行することができる。同等に意図されているのは、限外濾過膜を有する連続膜反応装置中で実行されるプロセスであって、酵素、未加工デンプン及び水の存在下で濃縮水を再循環下に保持し、かつ、浸透液が可溶性デンプン加水分解物であるプロセスである。精密ろ過膜を有する連続膜反応装置中で実行されるプロセスであって、酵素、未加工デンプン及び水の存在下で濃縮水を再循環下に保持し、かつ、浸透液が可溶性デンプン水解物であるプロセスも意図されている。
いくつかの実施形態において、上記プロセスの可溶性のデンプン加水分解物は、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）等の高フルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）への変換に供される。この変換は、グルコースイソメラーゼを使用して、固体支持体上に支持された固定されたグルコースイソメラーゼによって達成することができる。典型的なイソメラーゼには、市販製品であるSweetzyme(登録商標）、IT(Novozymes A/S)、G-ZYME（商標）IMGI及びG-ZYME(商標)G993、KETOMAX(商標）、G-ZYME（登録商標）G993(Rhodia)；G-ZYME(商標)G993液、GENSWEET(商標)IGI(Genencor International社）が含まれる。
他の実施形態においては、これらの方法によって生産された可溶性デンプン水解物を、燃料用又は飲料用のエタノールの生産において使用することができる。発酵は、加水分解に対して同時に又は別々に／連続的に実行することができる。発酵を加水分解と同時に実行する場合には、温度は３０℃〜３５℃又は３１℃〜３４℃である。酵素、未加工デンプン、酵母、酵母栄養素及び水の存在下で濃縮水を再循環下で保持し、かつ、浸透液がエタノール含有液である限外濾過システムにおいて上記プロセスを実行することができる。限外濾過膜を有する連続膜反応装置であって、酵素、未加工デンプン、酵母、酵母栄養素及び水の存在下で濃縮水を再循環下に保持し、かつ、浸透液がエタノール含有液である装置中で上記プロセスを実行することもできる。
上記プロセスの可溶性のデンプン加水分解物水解物は、加工されたデンプンを、クエン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又は、エリトルビン酸ナトリウム等の発酵産物に発酵させるステップを含む発酵産物の生産のために使用することができる。
本発明の１つ又はそれ以上のα−アミラーゼのデンプン分解活性は、ジャガイモデンプンを基質として使用して決定することができる。この方法は、酵素によって変性されたジャガイモデンプンの分解に基づくものであり、反応は、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素液と混合した後に生じる。まず、黒みを帯びた青色が形成されるが、デンプンの分解中に、青色が弱くなり、徐々に赤茶色に変わる。これを色ガラス標準と比較する。
５． 方法
５．１ フィルタ選抜分析
以下に検討されている分析は、高い若しくは低いｐＨにおいて及び／又はＣａ２＋枯渇条件下において親α−アミラーゼ又は対照α−アミラーゼと比較して変化した安定性を有する変異体を同定するための本発明のα−アミラーゼの選抜において使用することができる。
５．２ 高ｐＨフィルタ分析
１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴＹ寒天プレート上で、酢酸セルロース(OE 67、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)とニトロセルロースフィルタ(Protran-Ba 85、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)とのサンドイッチの表面に、バチルスライブラリを、３７℃で少なくとも２１時間にわたって被覆させる。酢酸セルロース層をＴＹ寒天プレート上に置く。
フィルタ上で陽性の変異体の場所がわかるようにするために、それぞれのフィルタサンドイッチを、被覆後かつインキュベート前に針で特異的に標識する。また、結合した変異体を有するニトロセルロースフィルタを、ｐＨ８．６−１０．６のグリシン−ＮａＯＨバッファを含む容器内に移し、室温（１０℃乃至６０℃に変化してもよい）で１５分間インキュベートする。コロニーを有する酢酸セルロースフィルタは、使用時までＴＹプレート上で室温で保管する。インキュベート後に、残存活性は、ｐＨ８．６〜１０．６のグリシン−ＮａＯＨバッファ中に１％アガロース、０．２％デンプンを含むプレート上で検出される。ニトロセルロースフィルタを有する分析プレートを、フィルタサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルタを除去した後に、分析プレートを１０％のルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、濃紺色のバックグラウンド上の白いスポットとして検出され、次に、保管プレート上で識別される。第１の選抜と同じ条件下で陽性の変異体を再び選抜する。
５．３ 低カルシウムフィルタ分析
例えばカナマイシン又はネオマイシン等の適切な抗生物質を含むＴＹ寒天プレート上で、酢酸セルロース(OE 67、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)とニトロセルロースフィルタ(Protran-Ba 85、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)のサンドイッチの表面に、バチルスライブラリを、３７℃で少なくとも２１時間にわたって被覆させる。酢酸セルロース層をＴＹ寒天プレート上に置く。
フィルタ上で陽性の変異体の場所がわかるようにするために、それぞれのフィルタサンドイッチを、被覆後かつインキュベート前に針で特異的に標識する。また、結合した変異体を有するニトロセルロースフィルタを、ｐＨ８．５〜１０の炭酸塩／重炭酸ソーダバッファを有し、かつ、様々なＥＤＴＡ濃度（０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ）を有する容器内に移す。このフィルタを室温で１時間インキュベートする。コロニーを有する酢酸セルロースフィルタは、使用時までＴＹプレート上において室温で保管する。インキュベート後に、残存活性は、ｐＨ８．５〜１０の炭酸塩／重炭酸ソーダバッファ中に１％アガロース、０．２％デンプンを含むプレート上で検出される。ニトロセルロースフィルタを有する分析プレートを、フィルタサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルタを除去した後に、分析プレートを１０％のルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、濃紺色のバックグラウンド上の白いスポットとして検出され、次に、保管プレート上で識別される。第１の選抜と同じ条件下で陽性の変異体を再び選抜する。
５．４ 低ｐＨフィルタ分析
１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含むＴＹ寒天プレート上で、酢酸セルロース(OE 67、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)とニトロセルロースフィルタ(Protran-Ba 85、Schleicher & Schuell、Dassel、ドイツ)のサンドイッチの表面に、バチルスライブラリを、３７℃で少なくとも２１時間にわたって被覆させる。酢酸セルロース層をＴＹ寒天プレートに置く。
フィルタ上で陽性の変異体の場所がわかるようにするために、それぞれのフィルタサンドイッチを、被覆後かつインキュベート前に針で特異的に標識する。また、結合した変異体を有するニトロセルロースフィルタを、ｐＨ４．５のシトレートバッファを含む容器内に移し、（野性型骨格中の変異を選別する場合には）８０℃で２０分間又は（親α−アミラーゼの変異を選別する場合には）８５℃で６０分間インキュベートする。コロニーを有する酢酸セルロースフィルタは、使用時までＴＹプレート上において室温で保管する。インキュベートの後、残存活性は、ｐＨ６．０のシトレートバッファ中に１％アガロース、０．２％デンプンを含む分析プレートの上で検出する。ニトロセルロースフィルタを有する分析プレートを、フィルタサンドイッチと同じ方法で標識し、５０℃で２時間インキュベートする。フィルタを除去した後に、分析プレートを１０％のルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、濃紺色のバックグラウンド上の白いスポットとして検出され、次に、保管プレート上で識別される。第１の選抜と同じ条件下で陽性の変異体を再び選抜する。
５．５ 第２の選抜
再選別後の陽性の形質転換体を、保管プレートから採取し、第２のプレート分析において試験する。５ｍｌのＬＢ＋ネオマイシンの中で陽性の形質転換体を３７℃で２２時間にわたってインキュベートする。各陽性形質転換体のバチルスインキュベート液、及び、コントロールとして、対応する骨格を発現するクローンを、ｐＨ４．５のシトレートバッファ中で９０℃インキュベートし、０分、１０分、２０分、３０分、４０分、６０分、及び、８０分にサンプルを得た。３マイクロリットルのサンプルを分析プレート上にスポットする。分析プレートを１０％のルゴール液で染色する。改良された変異体は、その骨格より高い残存活性を有する変異体とみなされる（分析プレート上の輪として検出される）。改良された変異体をヌクレオチド配列決定によって決定する。
５．６ 未精製変異体の安定性分析
変異体の安定性を以下のように分析することができる。分析しようとする変異体を発現するバチルスインキュベート液を、１０ｍｌのＬＢ＋ネオマイシンの中で３７℃で２１時間インキュベートする。８００マイクロリットルのインキュベート液を、２００μＬのｐＨ４．５のシトレートバッファと混ぜる。サンプルの時間点の数に対応する複数の７０μＬ分割量をＰＣＲチューブ中に作成し、その分割量をＰＣＲ装置内で様々な時間（一般に、５分、１０分、１５分、２０分、２５分及び３０分）わたって７０℃又は９０℃でインキュベートする。０分のサンプルは高温でインキュベートしない。サンプル中の活性は、「α−アミラーゼ活性の分析」以下に後述されているように、２０μＬ〜２００μＬのα−アミラーゼＰＮＰ−Ｇ７基質ＭＰＲ３(Boehringer Mannheimカタログ番号1660730)を移すことによって測定される。結果は、時間に対する（０の時点に対する）百分率の活性としてプロットされているか、又は、インキュベート後の特定時間にわたる百分率の残存活性として記載されている。
５．７ α−アミラーゼ変異体の発酵及び精製
適切な発現プラスミドを有するバチルスサチリス株を以下のように発酵及び精製することができる。この株を、−８０℃の貯蔵物から得て、１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートの上に縞状に塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。そのコロニーを、５００ｍｌの振とうフラスコ中の、１０μｇ／ｍｌネオマイシンを加えた１００ｍｌのＰＳ−１インキュベート液の中に移す。
ＰＳ−１インキュベート液の組成：
パール糖 １００ｇ／ｌ
ダイズ粉末 ４０ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ １０ｇ／ｌ
プルロニック(Pluronic)(商標)PE6100 ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣＯ３ ５ｇ／ｌ
このインキュベート液を３７℃、２７０ｒｐｍで５日間にわたって振とうする。４５００ｒｐｍで２０分〜２５分間遠心分離することによって、インキュベート液から細胞及び細胞破片を除去する。その後に、完全に透明な溶液を得るためにその上澄みをろ過する。その濾液を、濃縮し、ＵＦフィルタ（１００００ＭＷ分離膜）で洗浄し、さらに、バッファを２０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）に変更する。そのＵＦ濾液をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に投入し、同一バッファ内で０．２ＭのＮａＣｌを用いた段階溶出によって溶出を実行する。この溶出液をｐＨ９．０の１０ｍＭトリスに対して透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に投入し、０〜０．３ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配を用いて６カラム体積を溶出させた。（フェイドバス分析によって測定される）活性を含む画分を貯めて、ｐＨをｐＨ７．５に調節し、0.5％W/Volの活性炭を用いた５分間の処理によって残存する色を除去した。
５．８ 比活性測定
比活性は、PHADEBAS(商標)分析(Pharmacia)を使用して酵素１ｍｇ当たりの活性として測定する。製造業者の指示書は下記の通りである（「α−アミラーゼ活性のための分析」も参照されたい）。
５．９ 等電点の試験
ｐＩは等電点電気泳動（例えば、Pharmacia、Ampholine、pH3.5-9.3）によって決定する。
５．１０ 加速した安定性分析
５０ｍｌのプロピレンチューブ中に、対象の１０ｍｌの洗剤を加えた。洗剤を含む別々のチューブの中にピペットを用いて計測した１８０ｐｐｍの各α−アミラーゼが入るように、適切な希釈物を作成した。各α−アミラーゼを含む洗剤を３０秒間ボルテックスで攪拌し、次に、RotaMix(ATR RKVSモデル)の上に１０分間置いた。変異体酵素を含む洗剤１００μＬをピペットで測り取り、１：６５１に希釈した。変異体の初期活性は、Konelabモデル20XTにおいて、ブロックされたＰ−ニトロ−フェニル−マルトヘプタオース（ブロックされたPBNPG7）基質を使用して分析した。その後、３７℃に設定した定温インキュベータ内で、それらの洗剤サンプルをインキュベートした。１日、２日、４日、７日及び１７日にサンプルを移し、酵素活性を分析した。
５．１１ α−アミラーゼ活性についての分析
５．１１．１ フェイドバス分析
基質としてPHADEBAS（登録商標）錠剤を用いた方法によってα−アミラーゼ活性を決定する。フェイドバス錠剤（Pharmacia Diagnosticによって供給されるPHADEBAS(商標)アミラーゼ試験）は、架橋された青色の不溶性デンプンポリマーを含んでおり、該ポリマーは、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合されて錠剤化されている。
１つずつの測定について、５ｍｌの５０ｍＭブリットン・ロビンソンバッファ５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＮａＯＨで対象の値に調節したｐＨ）を含むチューブに１個の錠剤を懸濁する。この試験は、興味の対象となる温度の水槽中で実行する。試験されるα−アミラーゼは、ｘｍｌの５０ｍＭブリットン・ロビンソンバッファの中で希釈する。このα−アミラーゼ溶液１ｍｌを、５ｍｌの５０ｍＭブリットン・ロビンソンバッファに加える。デンプンはα−アミラーゼによって加水分解されて可溶性の青色の断片が与えられる。６２０ｎｍにおいて分光測光法で測定される得られた青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の作用である。
１０分間又は１５分間のインキュベート（試験時間）の後に６２０ｎｍにおいて測定される吸光度が、６２０ｎｍにおいて０．２〜２．０の吸光度単位の範囲内であることが重要である。この吸光度範囲においては、活性と吸光度との間に直線性がある（ランベルトベール法則）。従って、この基準に適合するように酵素の希釈倍率を調節しなければならない。特定の条件群（温度、ｐＨ、反応時間、バッファ条件）においては、所定のα−アミラーゼ１ｍｇが特定量の基質を加水分解して青色を生じる。色彩強度は６２０ｎｍにおいて測定する。測定される吸光度は、所定の条件群において対象のα−アミラーゼの比活性（純粋なα−アミラーゼタンパク１ｍｇ当たりの活性）に正比例する。
５．１１．２ 代替的方法
α−アミラーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド（ＰＮＰ−Ｇ７）基質を用いた方法によって測定する。この基質は、エンド型アミラーゼによって開裂され得るブロックされたオリゴ糖である。開裂の後に、キットに含まれるα−グルコシダーゼは、基質を消化し、遊離したＰＮＰ分子を解放する。ＰＮＰ分子は、黄色を有し、従って、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）において可視分光光度計によって測定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びα−グルコシダーゼを含むキットは、Boehringer-Mannheim社（カタログ番号１０５４６３５）によって製造されている。
試薬溶液１０ｍｌを作成するために、製造業者によって推奨されているように、５０ｍｌの酵素／バッファ溶液に基質／バッファ溶液を加える。２０μＬのサンプルを９６ウェルの微量定量プレートに移して２５℃でインキュベートすることによって分析を実行する。あらかじめ２５℃に合わせた２００μＬの試薬溶液を加える。この溶液を混ぜて１分間予備インキュベートし、ＥＬＩＳＡリーダで光学密度４０５ｎｍにおいて吸光度を３０秒ごとに４分間測定する。
時間依存的な吸収曲線の傾きは、所定の条件群における対象のα−アミラーゼの活性に正比例する。
５．１２ 洗剤組成物中における酵素性能の試験
５．１２．１ 米国条件
米国における典型的な洗浄条件をシミュレートするために、Terg-o-tometer（米国試験、Hoboken、ニュージャージー州）を使用した。用量効果曲線(DEC)は、蛍光増白剤を含まない液体ＡＡＴＣＣ２００３及び／又は粉末ＡＡＴＣＣ１９９３（American Association of Textile Chemists and Colorists）等の標準洗剤を使用して２０℃において実施した。その後、本発明の変異体酵素の汚れ除去性能を比較するために、比較用のα−アミラーゼの相当するDECを実施した。このプロセスを４０℃において繰り返した。一般的に、１リットルの脱イオン水及び１．５ｇの液体ＡＡＴＣＣで満たされたTerg-o-tometerのスチール容器内に、CS-28コメデンプン汚れ（オランダのCFT）の４個のサンプルを置いた。粉末ＡＡＴＣＣを使用した場合は、化学天秤（モデルPM4800、Mettler Instrument社、Highstown、ニュージャージー州08520）を用いて１．５ｇの洗剤粉末を測り取り、それをTerg-o-tometerに加えた。２回の重複試験を同時に実行した。別段の定めがない限り、この試験を１２分間実行し、３分間すすいだ。洗浄した後に、サンプルを空気乾燥し、サンプルの反射率を、コニカミノルタ社によって製造された色度メーター・モデルＣＲ−４１０を用いて測定した。収集したデータを適切な統計分析によって処理した。
５．１２．２ ヨーロッパ条件
ヨーロッパにおける典型的な洗浄条件をシミュレートするために、ローンダＯメータ(Launder-O-meter)（アトラス社、Atlanta、Georgia）を使用した。対象の変異体酵素の用量効果曲線(DEC)は、標準的なヨーロッパの試験用洗剤であるIEC A、及び、漂白剤（ＴＡＥＤ、テトラアセチルエチレンジアミン酢酸）と過ホウ酸ナトリウムとを含むIEC Aを使用して４０℃において実施した。その後、本発明の変異体酵素の汚れ除去性能を比較するために、比較用の変異体酵素の相当するDEC曲線を実施した。望ましい場合には、より高い洗浄温度でこのプロセスを繰り返した。一般的に、６．８ｇ／LのIEC A洗剤、又は、漂白洗剤を含む８．０ｇ／LのIEC Aを含む２５０ｍｌの脱イオン水を有するスチール容器内に、EMPA 161の４個のサンプル、トウモロコシデンプン(EMPA、スイス)を置いた。２回の重複試験を同時に実行した。別段の定めがない限り、この試験を４５分間実行し、５分間すすいだ。洗浄した後に、サンプルを空気乾燥し、この試験のサンプルの反射率を色度メーター・モデルＣＲ−４１０を用いて測定した。収集したデータを適切な統計分析で処理した。
５．１２．３ 洗剤組成物評価の微量サンプル法(microswatch method)
数多くのα−アミラーゼ洗浄試験が当業界において知られている。典型的な洗浄試験はサンプルを必要とするものであり、サンプルは汚れを塗布することができる布等の材料片である。この材料は、例えば、綿、ポリエステル、又は、天然繊維と合成繊維との混合物から作られた布であってもよい。サンプルは、濾紙若しくはニトロセルロース等の紙であってもよいし、又は、セラミック、金属若しくはガラス等の硬質材料の一片であってもよい。アミラーゼについては、汚れはデンプンをベースとするものであるが、血液、ミルク、インク、草、茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵子、チーズ、粘土、色素、油、又は、これらの化合物の混合物を含んでいてもよい。
いくつかの試験は、より大きいサンプルを１穴の穴開け装置で切断した又は特注の９６穴の穴あけ装置で切断したより小さい部分を使用することができる。その複数穴の穴あけ装置のパターンが標準的な９６ウェルの微量定量プレートに一致するものであるか、又は、そうでなければサンプルから断片を取得する。サンプルは、繊維、紙、金属又は他の適切な材料であってもよい。このより小さいサンプルは、２４ウェル、４８ウェル又は９６ウェルの微量定量プレートのウェルの中に入れる前又は後に付けた汚れを有していてもよい。このより小さいサンプルは、材料の小片に汚れを付けることによって作成することもできる。より小さいサンプルは、例えば、直径が5/8"又は0.25"の染色された一片の布であってもよい。上記の特注穴あけ装置は、９６ウェルプレートのすべてのウェルに９６個のサンプルを同時に届けるように設計されている。この装置は、同じ９６ウェルプレートに単純に複数回装填することによって、１ウェル当たり１個よりも多いサンプルを届けることができる。マルチ穴あけ装置は、限定されるものではないが、２４ウェル、４８ウェル及び９６ウェルのプレートを含むあらゆる型のプレートにサンプルを同時に届けることができると考えることができる。考えられる他の方法において、汚れを付ける試験試料台は、金属、プラスチック、ガラス、セラミック、又は、繊維以外の材料用の洗浄組成物の試験における使用のための汚れ物質で被覆された他の適切な材料で作られたビーズであってもよい。次に、１個以上の被覆されたビーズを、適切なバッファ及び酵素を含む９６ウェル、４８ウェル若しくは２４ウェル又はさらに大きい型のプレートのウェルの中に入れる。この場合、放出された汚れについて、直接的な吸光度測定によって又は二次発色反応の後に上澄みを試験することができる。放出された汚れの分析は、質量スペクトル分析によって得ることもできる。さらなるマイクロスクリーニング試験は、マルチウェルプレートのウェルに、例えば、藍染めしたデニム等のサンプルを届けて固定すること、砂又は例えば粒子６〜８又は９規格を含むようにふるいにかけたガーネットのようなより大きい粒子等の粒子を追加すること、及び、加えた粒子によってサンプルの研磨が生じるようにプレートを撹拌することであってもよい。この分析は、ストーンウォッシュ用途おけるセルラーゼの評価において用途が見いだされた。酵素の有効性は、反応バッファへの色の放出（例えば、放出された藍をジメチルスルホキシドに溶解し、Ａ６００ｎｍの吸光度を測定する）、又は、研磨したサンプルの反射率測定によって判断することができる。
例えば、未処理のＢＭＩ（血液／ミルク／インク）サンプルを、漂白剤を含まない洗剤で洗浄する場合、プロテアーゼの補助がなくても大部分のインクが放出される。プロテアーゼを加えることによって放出されるインクはわずかに増加するので、多量のバックグラウンドに対して定量することが難しいこともある。一態様は、汚れの固着の程度を制御することを可能にする処理プロトコルを提供する。結果として、試験を行う酵素の非存在下において洗浄された場合に、例えば、放出する汚れの量が変化するサンプルを生産することが可能である。固着したサンプルの使用は、洗浄試験におけるシグナル対ノイズ比の劇的に改善することができる。更に、固着の程度を変化させることによって、様々な洗浄条件下において最適の結果を与える汚れを作ることができる。
様々な種類の材料に対して既知の「強度」の汚れを有するサンプルは、購入することもできる(EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; or Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands)し、及び／又は、実行者によって作ることもできる(Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982))。以下に限定されるものではないが、他の試験サンプルには、綿を含む布に付着した血液／ミルク／インク（ＢＭＩ）の汚れ、綿を含む布に付着したホウレンソウの汚れ、若しくは、綿を含む布に付着した草、並びに、綿を含む布に付着したチョコレート／ミルク／すすが含まれる。
０．０００３％〜０．３％の過酸化水素を用いて、ＢＭＩの汚れを綿に固着することができる。他の組み合わせには、０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドを用いて固着させた草若しくはホウレンソウ、０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドを用いて固着させたゼラチンとクーマシーブリリアントブルー染色、又は、０．００１％〜１％のグルタルアルデヒドを用いて固着させたチョコレートとミルクとすすが含まれる。
酵素及び／又は洗剤配合物と共にインキュベートする間にサンプルを攪拌することができる。洗浄性能データは、ウェル中の、特に９６ウェルプレート中のサンプルの方向（水平対垂直）によって左右される。これは、インキュベート中の混合が不十分であったことを示す。インキュベート中に充分な攪拌を確保するための方法は多数存在するが、２枚のアルミニウムプレートの間に微量定量プレートを挟み込むプレートホルダーを構築することができる。これは、例えば、粘着性のプレート密着材をウェルの上に配置し、次に、任意の種類の適切な市販の締め具によって９６ウェルプレートに２枚のアルミプレートを固定する程度の単純なものであってもよい。その後、それを市販のインキュベータ振盪機に乗せることができる。振盪機を約４００ｒｐｍに設定することは、ホルダーによって漏れや相互汚染を効果的に防ぎながら、混合を非常に効率的にする。
洗剤液中のアミノ基の濃度を定量するためにトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を使用することができる。これは、サンプルから取り除かれたタンパクの量の基準としての役割を果たすことができる(例えば、Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200(1997)参照)。しかしながら、（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在に起因して）洗剤又は酵素サンプルが異常に小さいペプチド断片を生成する場合には、より大きいＴＮＢＳシグナル（すなわち、より多くの「ノイズ」）が得られるであろう。
血液／ミルク／インク又は他の染色の洗浄性能を測定する他の手段は、インク放出をベースとするものである。サンプル表面のタンパクの分解によって、洗剤液の吸光度を測定することによって定量することができるインク粒子が放出される。吸光度は、３５０ｎｍ乃至８００ｎｍの間のあらゆる波長において測定することができる。波長は４１０ｎｍ又は６２０ｎｍにおいて測定する。草、ホウレンソウ、ゼラチン、又は、クーマシーブリリアントブルー染色を含む汚れに対する洗剤性能を測定するために洗剤液を試験することもできる。これらの汚れのための典型的な波長には、ホウレンソウ若しくは草のための６７０ｎｍ、並びに、ゼラチン若しくはクーマシーブリリアントブルーのための６２０ｎｍが含まれる。例えば、一定量の洗剤液（一般的には、例えば、９６ウェルマイクロプレートから１００μＬ〜１５０μＬ）を取り出し、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートの中に置く。次に、これを分光光度計の中に置き、吸光度を適切な波長において測定する。
この系は、布地、プラスチック、又は、セラミック等の適切な支持体に対して、例えば、血液／ミルク／インキ染色を使用して、改良された酵素及び／又は食器洗浄用洗剤組成物を測定するために使用することができる。
一態様において、０．３％の過酸化水素をＢＭＩ／綿サンプルに２５℃において３０分間適用することによって、又は、０．０３％の過酸化水素をＢＭＩ／綿サンプルに６０℃において３０分間適用することによって、ＢＭＩ染色を綿に固着させる。そのＢＭＩ／綿サンプルから約０．２５インチの小さいサンプルを切り出し、それを９６ウェル微量定量プレートのウェルの中に入れる。各ウェルの中に、洗剤組成物と変異体タンパク等の酵素との既知の混合物を入れる。微量定量プレートの上面に粘着性プレートシーラーを配置した後に、その微量定量プレートをアルミプレートに固定し、オービタルシェイカーの上で約２５０ｒｐｍで約１０分〜約６０分間攪拌する。この時間の終わりに、上澄みを新しい微量定量プレートの中のウェルに移し、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは、ホウレンソウ／綿サンプル又は草／綿サンプルに対して０．０１％のグルタルアルデヒドを２５℃で３０分間適用することによって綿に固着させたホウレンソウ汚れ又は草汚れを用いて同様に試験することができる。チョコレート、ミルク及び／又はすす汚れを用いて同様に実行することができる。血液／ミルク／インクによるさらなる試験及び条件は、米国特許第7122334号（Genencor International社）において提供されている。
５．１３ ＬＡＳ感度の試験
様々な濃度のＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルフォネート、Ｎａｎｓａ １１６９／Ｐ）と共に、変異体を４０℃において１０分間インキュベートする。フェイドバス（商標）アッセイ法又はＰＮＰ−Ｇ７基質を使用した別法を使用して残存活性を測定する。０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）の中でＬＡＳを希釈する。５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、及び、１０ｐｐｍの濃度を使用するか、又は、ＬＡＳが全く含まれない。
異なるＬＡＳバッファの中に１０ｍｌの全体積中に０．０１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌの濃度となるように変異体を希釈し、それを温度管理水槽中で１０分間インキュベートする。少ない分量を冷却した試験バッファの中に移すことによってインキュベートを停止させる。活性測定に影響しないようにするためには、活性測定中にＬＡＳ濃度が１ｐｐｍ未満であることが重要である。
次に、上述されているＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標）分析又は別法を使用して、残存活性を二回反復して測定する。ブランクの減算の後に活性が測定される。ＬＡＳを全く含まない活性は１００％である。
本出願は、読みやすくするためにいくつかのセクションに整理されているが、読者は、あるセクションに記載されている陳述を他のセクションに当てはめることができることを認識するであろう。このように、本開示の様々なセクションにおいて使用されている見出しは、限定するものとして解釈してはならない。
本発明の組成物及び方法並びにそれらの長所をさらに説明するために以下の特定の実施例を与える。以下の実施例は、本発明の組成物及び方法を説明するために提供されており、あらゆる態様において本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
実験
本開示は以下の実施例においてさらに詳細に説明されている。以下の実施例は、特許請求の範囲に記載されているような開示の範囲をいかなる態様においても限定するように意図したものではない。
本開示の全体にわたって以下の略語：ＡＥ（アルコールエトキシレート）；ＡＥＯ（アルコールエトキシレート）；ＡＥＯＳ（アルコールエトキシスルフェート）；ＡＥＳ（アルコールエトキシスルフェート）；ＡＦＡＵ（真菌性酸性α−アミラーゼ単位、acid fungal alphaamylase units）；ＡＧＵ（グルコアミラーゼ活性単位）；ＡＯＳ（α−オレフィンスルフォネート）；ＡＳ（アルコールスルフェート）；ＢＡＡ（バチルス・アミロリケファシエンス・α−アミラーゼ）；ＢＬＡ（バチルスリケニフォルミス又はＬＡＴ）；ＢＰＮＰＧ７（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）；ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＤＰ３（３個のサブユニットを有する重合度）；ＤＰｎ（ｎ個のサブユニットを有する重合度）；ＤＴＭＰＡ（ジエチルトリアミンペンタ酢酸）；ＥＣ（酵素分類のための酵素委員会）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＥＯ（エチレンオキシド）；Ｆ＆ＨＣ（布用及び家庭用ケア）；ＦＡＵ（真菌性アミラーゼ単位）；ＧＡ（グルコアミラーゼ）；ｇｐｇ（１ガロン当たりのグレイン、grains per gallon）；ＨＦＣＳ（高フルクトースコーンシロップ）；ＨＦＳＳ（高フルクトースデンプンをベースとするシロップ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルフォネート）；ＬＯＭ（ラウンダ−Ｏ−メータ、LAUNDER-O-METER)；ＬＵ（リキホン単位）；ＭＴＰ（微量定量プレート）；ＭＷ（分子量）；ＭＷＵ（修飾されたウォルゲムス単位）；ＮＯＢＳ（ノナノイルオキシベンゼンスルフォネート）；ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＩ（性能指数）；ＰＶＡ（ポリ（ビニルアルコール））；ＰＶＰ（ポリ（ビニルピロリドン））；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＳＡＳ（第２級アルカンスルフォネート）；ＳＥＬ（部位評価ライブラリ）；ＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンジアミン）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＴＳＢ（トリプシン大豆培養液）；ＵＦＣ（限外濾過濃縮物）；℃（摂氏温度）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ又はＤＩ（脱イオン水）；ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱ濾過）
；ＥＴＯＨ（エタノール）；ｅｑ（均等物）；Ｎ（通常）；ＤＳ（固形分）；ｇ又はｇｍ（グラム）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μＬ及びμｌ（マイクロリットル）；ｍＬ及びｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；Ｕ（ユニット）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈｒ（ｓ）（時間）；ＤＯ（溶解酸素）；ＷＴ％（重量パーセント）；Ｗ／Ｖ（体積に対する重量）；Ｗ／Ｗ（重量に対する重量）；Ｖ／Ｖ（体積に対する体積）；ＧＥＮＥＡＲＴ（GENEART GmbH、Regensburg、ドイツ）；及び、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Danisco US社、Genencor部門、パロアルト、カリフォルニア州）を適用する。
実施例１
分析
以下の実施例においては、読みやすさのために以下に記載されていように、様々な分析を使用した。以下に提供されているプロトコルから得たすべての偏差を示す。これらの試験においては、反応の完了後に生じた生成物の吸光度を測定するために分光光度計を使用した。
Ａ．タンパク含有量分析
この分析は、８０％の湿度において３００ｒｐｍで振動させて３７℃において３日間培養した微量定量プレート（ＭＴＰ）から得た培養上清を濾過したものを使用して実行した。高速液体クロマトグラフィ法によるタンパク分析のために、１ウェル当たり５０μｌの上澄みを含む底部が平坦な９６ウェルの未使用のＭＴＰを使用した。５％のアセトニトリルと１０％の塩化ナトリウムとを含む１０ｍＭのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．２５）によって上澄液を３倍に希釈し、その希釈した各１０μｌのサンプルを分析した。SwiftTM RP-all PN 68-1030-041(Teledyne Isco社)カラムを装着したAgilent 1100(Hewlet Packard社)HPLCを使用した。溶剤系は、水相中の０．１％のトリフルオロ酢酸と、アセトニトリル中の０．０７％のトリフルオロ酢酸とからなるものであった。２２２ｎｍにおいて吸光度を測定し、精製したＢＡＳＥ(AmyTS23t)タンパクの標準曲線に基づいてサンプルのタンパク濃度を決定した。
Ｂ．セラルファアミラーゼ分析(Ceralpha Amylase Assay)
このα−アミラーゼ分析の原理は、グルコース及び遊離ｐ−ニトロフェノールに対して過剰なレベルの耐熱性α−グルコシダーゼの存在下における所定のオリゴ糖（ＢＰＮＰＧ７）の加水分解に基づいている。４００ｎｍにおける吸光度を測定する。これは分析したサンプル中の活性アミラーゼのレベルに直接的に比例する。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTPリーダ（タイプ340−Molecular Devices）、及び、iEMSインキュベータ／振盪機(Thermo/Labsystems)である。この分析系において、使用した試薬及び溶液は、１）ｐ−ニトロフェニル・マルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質(Megazyme HR kit)、２）５０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファ、ｐＨ７．１５、及び、３）ｐＨ１０．２の２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファ（ＳＴＯＰバッファ）である。
１０ｍｌのミリＱ水中に５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７基質を含むバイアルを溶解させた。アミラーゼサンプル（発酵上澄液）をＭＯＰＳバッファ中に希釈した。この希釈したアミラーゼ溶液２５μｌをＭＴＰのウェルの中に加え、次に、５．４５ｍｇ／ｍｌのＢＰＮＰＧ７基質溶液２５μｌを加えることによって分析を実行した。この溶液を混合し、微量定量プレートをプレートシールで密閉して、２５℃及び９００ｒｐｍのインキュベータ／振盪機(iEMS- Thermo/Labsystems)の中に３０分間置いた。５０μｌのＳＴＯＰバッファを加えることによってこの反応を停止させ、波長４００ｎｍにおける吸光度をＭＴＰリーダで測定した。バックグラウンド吸光度の値を補正するために非酵素の対照を使用した。
Ｃ．ＣＳ−２８コメデンプン微量サンプル分析(Microswatch Assay)
このα−アミラーゼ分析の原理は、微量サンプルの中に組み入んだコメデンプンの加水分解に起因するオレンジ色素の遊離に基づいている。４８８ｎｍにおける吸光度を測定する。これは、所望の条件（ｐＨ、温度及びバッファ）における分析したサンプル中のアミラーゼ活性のレベルと比例する。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTPリーダ（タイプ３４０−Molecular Devices）、及び、ｉＥＭＳインキュベータ／振盪機(Thermo/Labsystems)であった。この分析系において、使用した試薬及び溶液は、１）ＣＳ−２８微量サンプル（コメデンプン、有色）、２）２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ８０バッファ（ｐＨ８．０）、３）２５ｍＭのＣＡＰＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ８０バッファ（ｐＨ１０．０）、及び、４）１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ８０（希釈バッファ）である。
円の直径が１／４インチのＣＳ−２８微量サンプルは、センター・フォー・テストマテリアル(Center for Testmaterials、CFT、フラールディンゲン、オランダ)から得た。全表面積を暴露させるために、９６ウェル微量定量プレートの各ウェルの中で２個の微量サンプルを直立に（例えば、ウェルの底に対して水平でないように）配置した。１０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０溶液によってあらかじめ希釈したいくつかの条件における適切な濃度：１）ｐＨ８（２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ）及び１６℃；分析における最終アミラーゼ濃度＜０．０２５μｇ／ｍｌ；２）ｐＨ８（２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ）及び３２℃；分析における最終アミラーゼ濃度＜０．０１２μｇ／ｍｌ；３）ｐＨ１０（２５ｍＭのＣＡＰＳバッファ）及び３２℃；分析における最終アミラーゼ濃度＜０．０２５μｇ／ｍｌ；並びに、４）ｐＨ１０（２５ｍＭのＣＡＰＳバッファ）及び５０℃；分析における最終アミラーゼ濃度＜０．０１２μｇ／ｍｌにおいて、アミラーゼサンプル（発酵上澄液）を試験した。
インキュベータ／振盪機は、望ましい温度、１６℃（冷蔵貯蔵室又は冷蔵庫）、３２℃、又は、５０℃に設定した。微量サンプルを９６ウェルＭＴＰのウェルの中に入れた。その培養上澄液のサンプルを、１０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０によって所望の最終濃度になるように２０倍に希釈した。微量サンプル−ＭＴＰの各ウェルにＨＥＰＥＳバッファ又はＣＡＰＳバッファのいずれかを１９０μｌ加え、続いて、各ウェルに１０μｌの酵素溶液を加えて、１ウェル当たりの全体積を２００μｌとした。ＭＴＰをプレートシールで密閉し、インキュベータ／振盪機の中に置き、求められる温度（１６℃、３２℃又は５０℃）において１１５０ｒｐｍで６０分間インキュベートした。適切な条件下でのインキュベートの後に、各ウェルから１００μｌの溶液を未使用のＭＴＰに移し、ＭＴＰ分光光度計を使用して４８８ｎｍにおける吸光度を測定した。バックグラウンドを除去するために、２個の微量サンプルとバッファとを含むが、酵素を含まない対照を含めた。
得られた吸光度をブランク値（酵素の非存在下における微量サンプルのインキュベートの後に得られた値）に対して補正した。その得られた吸光度が加水分解活性の尺度である。各サンプル（変異体）について性能指数（ＰＩ）を算出した。この性能指数は、同じタンパク濃度において変異体の性能（実際の値）と対照酵素の性能（理論値）とを比較するものである。理論値は、対照酵素のラングミュア式のパラメータを使用して算出することができる。１を超えるＰＩ（ＰＩ＞１）は、（対照酵素又は標準酵素［例えば、野生型］と比べて）より優れた変異体を特定する。一方で、ＰＩが１である（ＰＩ＝１）ことは、標準のものと性能が同じ変異体を特定する。また、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、標準のものより性能が劣る変異体を特定する。したがって、ＰＩは、特定の状況下で使用するための、優れたものだけでなく、それほど望ましくない変異体も特定する。
Ｄ．耐熱性分析−初期活性及び残存活性の測定
対照アミラーゼと比較したアミラーゼ変異体の耐熱性は、定められた条件下においてＭＯＰＳバッファ（ｐＨ７．１５）の中でアミラーゼサンプルをインキュベートすることによって決定した。対照アミラーゼの初期活性が約７０％失われるように、インキュベートの温度を選択した。セラルファ(Ceralpha)法を使用してアミラーゼの初期活性及び残存活性を測定した。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTPリーダ（タイプ３４０−Molecular Devices）、及び、ｉＥＭＳインキュベータ／振盪機(Thermo/Labsystems)であった。この分析系において、使用した試薬溶液は：１）ｐ−ニトロフェニル・マルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質(Megazyme HR kit)；２）１０ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＣａＣｌ２，０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファ（希釈バッファ）；３）５０ｍＭのＭＯＰＳ，５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファ（ｐＨ７．１５）；４）２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファ（ｐＨ１０．２）（ＳＴＯＰバッファ）；及び、５）５０〜１５０μｇ／ｍｌのタンパクを含むアミラーゼインキュベート上澄液であった。
「マスター希釈」プレートは、インキュベート上澄液を、１０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファによって２０倍に希釈し、次に、ＭＯＰＳバッファによって４２倍に希釈するステップによって調製する。アミラーゼの初期活性を決定するために２５μｌのマスター希釈液を使用し、ヒートインキュベートのために１００μｌを使用した。１００μｌのサンプルをＭＴＰ(Greiner 655.101)の中に入れ、それをアルミニウムテープで密閉し、ｉＥＭＳインキュベータの中で９００ｒｐｍで攪拌しながら６５．５℃で６０分間インキュベートした。インキュベートの後に、アミラーゼの残存活性を測定する前にＭＴＰを氷水の上で冷ました。初期活性（ｔ００）及び残存活性（ｔ６０）を測定するために、１ウェル当たり２５μｌのＢＰＮＰＧ７溶液を含む未使用のＭＴＰの中に２５μｌのサンプルを移し、２５℃で３０分間インキュベートした。セクションＢにおいて上述されているようにセラルファアミラーゼ分析を実行した。
耐熱性＝［ｔ−６０値］／［ｔ−００値］のように耐熱性を算出するために、アミラーゼの残存活性と初期活性との比を使用した。また、各変異体について、変異体の耐熱性を対照（標準）酵素と比較した性能指数を算出した。１を超える（ＰＩ＞１）性能指数（ＰＩ）は、（対照又は標準［例えば、野生型又は骨格］と比較して）より優れた変異体を特定する。一方で、ＰＩが１である（ＰＩ＝１）ことは、標準と同じくらい安定な変異体を特定する。また、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、標準よりも安定性が劣る変異体を特定する。したがって、ＰＩは、特定の状況下で使用するための、優れたものだけでなく、それほど望ましくない変異体も特定する。
Ｅ．耐熱性分析−Ｔ５０値の測定
セクションＤに上述されている耐熱性分析は、所定の条件下において活性を失う変異体をランク付けすることしかできない。所定の条件下において１００％安定な変異体は、互いに違いを見分けられることができない。従って、Ｔ５０値の測定、すなわち、初期活性の５０％を失わせるインキュベート温度は、著しく向上した耐熱性を有する変異体をランクづけるためにより適切な分析である。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTPリーダ（タイプ３４０−Molecular Devices）、及び、エッペンドルフマスターサイクラ(Eppendorf Mastercycler)であった。アミラーゼ変異体を含む培養上澄液をＭＯＰＳバッファで１０００倍に希釈し、セクションＢに上述されているセラルファアミラーゼ分析を使用してアミラーゼの初期活性を決定した。希釈したアミラーゼサンプルを使用して、１００μｌ／ウェルを含むＰＣＲプレートを調製した。このプレートを、６０℃〜８０℃（単一部位の変異体）又は６０℃〜１００℃（コンビナトリアル変異体）に及ぶ温度勾配によってエッペンドルフマスターサイクラの上で６０分間インキュベートした。インキュベートの後、残存アミラーゼ活性を測定する前にＭＴＰを４℃に冷却した。
アミラーゼの残存活性と初期活性との比をインキュベート温度に対してプロットし、方程式：ｙ＝ａ０＋ａ１／（１＋（ｘ／ａ２）ａ３）を使用してデータに合わせた。次に、各アミラーゼ変異体についてＴ５０値を算出した（例えば、残存活性が５０％である温度）。したがって、Ｔ５０値は、変異体の耐熱性に関する尺度であり、対照アミラーゼ及びその他の変異体との関連で変異体をランク付けすることができる。
Ｆ．１０％洗剤安定性分析
１０％洗剤（業務用洗剤、熱不活性化されたもの）の存在下における定められた条件下でのインキュベート後に、対照アミラーゼ及びその変異体の安定性を測定し、セラルファアミラーゼ分析を使用してアミラーゼの初期活性及び残存活性を決定した。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTPリーダ（タイプ３４０−Molecular Devices）、及び、ｉＥＭＳインキュベータ／振盪機(Thermo/Labsystems)であった。この分析系において、使用した試薬溶液は：１）ｐ−ニトロフェニル・マルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Megazyme HR kit）；２）液体洗剤（ＨＤＬ商品、不活性化酵素、９５℃で２時間）；３）２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８．０）中の１０．５％洗剤；４）５０ｍＭのＭＯＰＳ，５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２，０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファ，ｐＨ７．１５；５）２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファ，ｐＨ１０．２（ＳＴＯＰバッファ）；及び、６）５０〜１５０μｇ／ｍｌのタンパクを含むアミラーゼ培養上澄液であった。
簡潔に説明すると、９５μｌの１０．５％洗剤液を微量定量プレート（ＭＴＰ）に移し、５μｌの培養上澄液と混合した。アミラーゼの初期活性を測定するために３μｌの分割量を取得した。ｉＥＭＳインキュベータの中で、ＭＴＰを９００ｒｐｍで攪拌しながら４０℃（又は、より高い安定性を有するＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の場合には５０℃）で３０分間インキュベートした。インキュベートの後に、洗剤と酵素との混合物３μｌを使用して、アミラーゼの残存活性を測定した。アミラーゼの初期活性（ｔ０）及び残存活性（ｔ３０）：３μｌの「洗剤及び酵素」の混合物を１２２μｌのＭＯＰＳバッファで希釈し、次に、上述されているセラルファアミラーゼ分析を使用してアミラーゼ活性を測定するために、そのうちの２５μｌを使用した。
「１０％洗剤」の安定性を算出するために、安定性＝［ｔ３０値］／［ｔ０値］のようにしてアミラーゼの残存活性と初期活性との比を使用した。また、各変異体について性能指数を算出した。この性能指数は、アミラーゼ変異体の１０％洗剤の安定性をＢＡＳＥアミラーゼと比較するものである。１を超える（ＰＩ＞１）性能指数（ＰＩ）は、（対照又は標準［例えば、野生型］と比較して）より優れた安定性の変異体を特定する。一方で、ＰＩが１である（ＰＩ＝１）ことは、標準と同程度に安定な変異体を特定する。また、１未満（ＰＩ＜１）のＰＩは、標準より安定性が劣る変異体を特定する。したがって、ＰＩは、特定の状況下で使用するための、優れたものだけでなく、それほど望ましくない変異体も特定する。
Ｇ．１００％洗剤安定性分析−温度勾配曲線
１００％の洗剤（業務用洗剤、酵素不活性化されたもの）の存在下における定められた条件下でのインキュベートの後にＢＡＳＥ骨格及びＢＡＳＥ変異体のＨＤＬ洗剤安定性を測定した。また、セラルファアミラーゼ分析を使用してアミラーゼの初期活性及び残存活性を測定した。
使用した装置は、Biomek FXロボット(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTPリーダ（タイプ３４０−Molecular Devices）；エッペンドルフマスターサイクラ、及び、ｉＥＭＳインキュベータ／振盪機(Thermo/Labsystems)であった。この分析系において、使用した試薬溶液は：１）ｐ−ニトロフェニル・マルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Megazyme HR kit）；２）液体洗剤（ＨＤＬ商品−９５℃で２時間加熱することによって不活性化されたもの）；３）５０ｍＭのＭＯＰＳ，５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０バッファ，ｐＨ７．１５；４）２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファ，ｐＨ１０．２（ＳＴＯＰバッファ）；及び、５）５０−１５０μｇ／ｍｌのタンパクを含むアミラーゼ培養上澄液であった。
アミラーゼ培養上澄液をＨＤＬ洗剤の中に２０倍に希釈して完全に混合した。セクションＢに記載されているセラルファアミラーゼ分析を使用してアミラーゼの初期活性を決定した。希釈したアミラーゼＨＤＬサンプルを使用して、１００μｌ／ウェルを含むＰＣＲプレートを調製した。このプレートを、エッペンドルフ・マスター・サイクラの上で、３０℃〜７０℃に及ぶ温度勾配によって３０分間インキュベートした。インキュベートの後に、上述されているようにアミラーゼの残存活性を測定する前に、ＭＴＰを４℃に冷却した。
ＨＤＬ Ｔ５０値を算出するために、アミラーゼの残存活性と初期活性との比をインキュベート温度に対してプロットし、ｙ＝ａ０＋ａ１／（１＋（ｘ／ａ２）ａ３）の方程式を使用してそのデータに合わせた。次に、各ＢＡＳＥ変異体についてＴ５０値を算出した（例えば、残存活性が５０％である温度）。したがって、Ｔ５０値は、変異体の耐熱性の尺度であり、対照アミラーゼ及びその他の変異体との関連で変異体をランクづけることができる。
Ｈ．ＡＡＰＦプロテアーゼ
本明細書に開示されているサブチリシンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ＡＡＰＦ）の加水分解を測定した。使用した試薬溶液は：
１）０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．６（トリス希釈バッファ）；
２）１０ｍＭのＣａＣｌ２と０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０とを含む１００ｍＭのトリス緩衝液，ｐＨ８．６（トリス／Ｃａバッファ）；
３）１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを含むＤＭＳＯ溶液（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液）（シグマ：Ｓ−７３８８）であった。
ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍｌのＡＡＰＦストックを１００ｍｌのトリス／Ｃａバッファに加え、少なくとも１０秒間充分に混合した。希釈したプロテアーゼ溶液１０μｌを各ウェルに加え、直後に１ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦ希釈標準溶液１９０μｌを加えることによってこの分析を実行した。この溶液を５秒間混合し、２５℃においてＭＴＰリーダの中で４１０ｎｍにおいて吸光度変化を動的モード（５分間に２０回測定）で測定した。プロテアーゼ活性は、ＡＵ（活性＝ＯＤ・ｍｉｎ−１ ｍｌ−１）として表されている。
実施例２
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）及びその変異体を発現するバチルスサチリス株の生成
この実施例においては、ＢＡＳＥ（バチルス株ＴＳ−２３ α−アミラーゼ又はＡｍｙＴＳ２３ｔの短縮された形態）及びその変異体を発現するバチルスサチリス株の構築を記載する。ＢＡＳＥ、すなわち、切断されたアミラーゼの成熟形態は、好アルカリ性及び好熱性のバチルス株ＴＳ−２３のＴＳ−２３ α−アミラーゼ（ＡｍｙＴＳ２３）に由来するものであった(Lin et al., J Appl Microbiol, 82:325-334, 1997)。
ＡｍｙＴＳ２３の成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号１：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ
SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN
HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
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WKATIALPQGKAIEFKFIKKDQAGNVIWESTSNRTYTVPFSSTGSYTASWNVP
として記載されている。
ＡｍｙＴＳ２３の成熟形態をコードする核酸配列であって、コドンを変更した核酸配列は、配列番号３：
aatacggcgccgatcaacgaaacgatgatgcagtattttgaatgggatctgccgaatg
atggaacgctgtggacgaaagtcaaaaacgaagcggcgaatcttagcagcctgggaat
cacagcactttggcttccgccggcatataaaggaacgagccaaagcgatgtcggctat
ggcgtctatgatctgtatgacctgggcgaatttaaccaaaaaggcacgatccggacga
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gctgctgatcgccagacgggattatgcctatggcacacagcgggattatatcgaccat
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gagcaatagaacgtatacggtcccgtttagcagcacaggaagctatacagcgagctgg
aatgttccgtga
として記載されている。
ＢＡＳＥは、シグナルペプチドをコードする５’配列領域の最初の９０ｂｐ、及び、酵素のカルボキシル末端をコードする３’配列の２９７ｂｐの両方を除去することによって生成されるものであり、それによって短縮されたα−アミラーゼが生成される。ＢＡＳＥの成熟形態（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）のアミノ酸配列は、配列番号２：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ
SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN
HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV
VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE
FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK
DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY
GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG
LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS
VSIWVAK
として記載されている。
ＧＥＮＥＡＲＴによって生産され、かつ、バチルスサチリスにおける発現のためにコドンを変更したＢＡＳＥ遺伝子を含む合成ＤＮＡ断片（０７２３０１３）は、ＢＡＳＥ及びその変異体を発現するバチルスサチリス株の構築のためのテンプレートＤＮＡ（配列番号４）としての役割を果たした。ＢＡＳＥを発現させるために、ユニークなＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴによってｐＨＰＬＴベクターの中にＢＡＳＥ ＤＮＡ断片をクローンした(Solingen et al., Extremophiles 5:333-341, 2001)。ｐＨＰＬＴ発現ベクターは、バチルスリケニフォルミスＬＡＴプロモータ（Ｐｌａｔ）と、レプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン抵抗性マーカ(ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０(McKenzie et al., Plasmid, 15: 93-103, 1986)に由来するさらなる因子とを含む。
ＬＡＴシグナルペプチドのためのコード領域は配列番号１５：atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagcaとして記載されている。
ＬＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号１６：MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASAとして記載されている。
ｐＨＰＬＴ発現ベクターのマップを図２に示し、ＢＡＳＥ遺伝子を含むｐＨＰＬＴベクターのマップを図３に示す。ＧＥＮＥＡＲＴによって生産されたコドン変更核酸配列であって、ＢＡＳＥの成熟形態（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）をコードする核酸配列は、配列番号４：
1 tctgcagct tcagcaaac accgcgccg attaacgaa accatgatg cagtatttc gaatgggat ctgccgaac
73 gatggcacc ctgtggacc aaagtgaaa aacgaagcg gcgaacctg agcagcctg ggcattacc gcgctgtgg
145 ctgccgccg gcatataaa ggcaccagc cagagcgat gtgggctat ggcgtgtat gatctgtac gatctgggc
217 gaatttaac cagaaaggc accattcgt accaaatat ggcaccaaa acccagtat attcaggcg atccaggcg
289 gcgaaagcg gcgggtatg caggtgtat gcggatgtg gtgtttaac cataaagcg ggtgcggat ggcaccgaa
361 tttgtggat gcggtggaa gtggatccg agcaaccgt aaccaggaa accagcggc acctatcag attcaggcg
433 tggaccaaa tttgatttt cccggccgt ggcaacacc tatagcagc tttaaatgg cgctggtat cattttgat
505 ggcaccgat tgggatgaa agccgtaaa ctgaaccgc atctataaa tttcgtagc accggcaaa gcgtgggat
577 tgggaagtg gataccgaa aacggcaac tatgattac ctgatgttc gcagacctg gatatggat catccggaa
649 gtggtgacc gaactgaaa aactggggc acctggtat gtgaacacc accaacatt gatggcttt cgtctggat
721 gcggtgaaa cacatcaaa tacagcttt tttccggat tggctgacc tatgtgcgt aaccagacc ggcaaaaac
793 ctgtttgcg gtgggcgaa ttttggagc tatgatgtg aacaaactg cacaactac atcaccaaa accaacggc
865 agcatgagc ctgtttgat gcgccgctg cataacaac ttttatacc gcgagcaaa agcagcggc tattttgat
937 atgcgttat ctgctgaac aacaccctg atgaaagat cagccgagc ctggccgtg accctggtg gataaccat
1009 gatacccag ccgggccag agcctgcaa agctgggtg gaaccgtgg tttaaaccg ctggcctac gcgtttatt
1081 ctgacccgt caagagggc tatccgtgc gttttttat ggcgattat tacggcatc ccgaaatat aacattccg
1153 ggcctgaaa agcaaaatt gatccgctg ctgattgcg cgtcgtgat tatgcgtat ggcacccag cgtgattat
1225 attgatcac caggatatt attggctgg acccgtgaa ggcattgat accaaaccg aacagcggc ctggccgcg
1297 ctgattacc gatggcccg ggtggcagc aaatggatg tatgtgggc aaaaaacat gcgggcaaa gtgttttat
1369 gatctgacc ggcaaccgt agcgatacc gtgaccatt aacgcggat ggctggggt gagtttaaa gtgaacggc
1441 ggcagcgtg agcatttgg gtggcgaaa taagttaac aga
として記載されている。Ｎ００１・Ｎ末端コドン及びＫ４８４・Ｃ末端コドンは下線で示されている。
ＧＥＮＥＡＲＴは、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥベクターＤＮＡを使用して、バチルスサチリス株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）及び（ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ）を形質転換した。当業界で知られているように(WO02/14490)バチルスサチリスの形質転換を実行した。ハートインフュージョン寒天培地(Difco、カタログ番号244400）と、１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン（Sigma、カタログ番号Ｎ−１８７６、１ｍｇ当たり７３２μｇのネオマイシンを含むもの）と含む寒天プレートの上で、バチルスサチリス形質転換体を選択した。pHPLT-BASE GENEARTベクターを有するバチルスサチリス形質転換体の選択的増殖は、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳをベースとした特定の培地）、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含む振盪フラスコの中で実行した。ＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４及びＣａＣｌ２を基礎培地から省略し、３ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を使用し、６０ｍＭの尿素、７５ｇ／ｌのグルコース及び１％のソイトン(Soytone)を基礎培地に追加した以外は、当業界で知られているように(Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747, 1974)、基本的にＭＢＤ培地を作成した。１リットル中に、４００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２、及び、１０ｍｌの０．５Ｍ クエン酸ナトリウムを含む１００倍原液として微量栄養素を作成した。増殖によって、デンプン加水分解活性を有する分泌されたＢＡＳＥアミラーゼが生じた。
実施例３
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）部位評価ライブラリの生成
部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）の生産は、特許プロセス（ＷＯ２００４／０５９５５６Ａ３）を使用してＧＥＮＥＡＲＴ社が実行した。ＰＣＲによるタンパクの発現の目的のためにヌクレオチド配列を最適化するための方法及び装置、並びに、ＤＮＡ分子の生産は、ＧＥＮＥＡＲＴ社が所有する又は同社にライセンスされた技術（欧州特許第０２００３６２及び第０２０１１８４号、並びに、米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号及び第６４７２１８４号）を利用した。この実施例に記載されているＢＡＳＥ ＳＥＬの構築は、独占的なＧＥＮＥＡＲＴ社のノウハウ及び／又は知的財産に従って、遺伝子最適化、遺伝子合成及びライブラリ生成のための同社の技術土台を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴ社によって実行された。ＧＥＮＥＡＲＴの連続する置換アプローチはＳＥＬを生産するために、会社のウェブサイトに全般的に記載されている。
ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドＤＮＡは、ＳＥＬを生産するためのテンプレートとしての役割を果たした。発明者らがあらかじめ選択した位置（表３−１）において、ＢＡＳＥ ＳＥＬをＧＥＮＥＡＲＴ社が生産した。（あり得る１９個の中から）少なくとも１６個の異なるアミノ酸に対するコドンによって、対応するＤＮＡコドンのそれぞれを置換した。ＢＡＳＥ ＳＥＬを作成するために、当業界で知られている（ＷＯ２００２／０１４４９０）ように、形質転換受容性を有するバチルスサチリス細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を形質転換するために、コドンを変異させたｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ混合液を使用した。１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシンを含むＨＩ寒天プレート（ハートインフュージョン寒天培地）の表面に形質転換混合液を被覆させた。各ライブラリについて１個のコロニーを採取し、その後のＤＮＡ抽出及び遺伝子配列分析のために、それらをＴＳＢ（トリプトン及び大豆ベース培養液）液体培地において１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン選抜を行いながら増殖させた。配列分析データによって、１個のライブラリにつき最高１９個のＢＡＳＥ成熟変異体が明らかになった。ＢＡＳＥ ＳＥＬにおいて特定されたＢＡＳＥ変異体を表３−２に一覧する。生化学的特性評価のためのＢＡＳＥ及びＢＡＳＥ変異体酵素サンプルを生成するために、９６ウェルＭＴＰにおいてＭＢＤ培地中でＢＡＳＥ ＳＥＬ変異体の選択的増殖を３７℃で６８時間実行した。
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実施例４
ＢＡＳＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）コンビナトリアルライブラリの生成
合成ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリは、成熟配列の選択した２個以上のコドンを特定のＤＮＡ配列で置換した合成ＢＡＳＥ遺伝子混合物を含む。独占的なＧＥＮＥＡＲＴ社のノウハウ又は知的財産に従って、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社との契約により、遺伝子最適化、遺伝子合成及びライブラリ生成のためのＧＥＮＥＡＲＴ社の技術土台を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴ社が４個の合成ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリを作成した。コンビナトリアルライブラリを作成するためのＧＥＮＥＡＲＴ社の先進的な変異生成アプローチは、同社のウェブサイトに全般的に記載されている。
表４−１〜表４−４は、合成ＢＡＳＥのコンビナトリアルライブラリのいくつかに存在し得る置換を一覧する（配列番号２のＢＡＳＥ成熟アミノ酸配列に従って番号付けた）。各ライブラリにおいて、対象とされているＢＡＳＥの複数の位置は、野性型（wt）のままである可能性、又は、表４−１〜表４−４に一覧されている特定のアミノ酸で置換される可能性が等しい。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドＤＮＡの変異体を作成するために、変異させたＢＡＳＥ遺伝子をｐＨＰＬＴベクターの中にクローンし、次に、バチルスサチリス細胞を形質転換することによって、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリを作成した。１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン及び０．５％のＲＢＢデンプン（Sigma-Aldrich商品番号S7629、レマゾールブリリアントブルーＲと共有結合したジャガイモデンプン）を含むＨＩ寒天プレート（ハートインフュージョン寒天培地）の上に形質転換混合液を被覆させた。各ライブラリについて、透明帯を生成する１個のコロニーを採取し、それを１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを含むＴＳＢ（トリプトン及び大豆ベース培養液）液体培地において増殖させた。生化学的特性評価のためのＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ変異体酵素サンプルを生成するために、９６ウェルＭＴＰにおいてＭＢＤ培地中で、ＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリのいくつかの選択的増殖を３７℃で６８時間実行した。
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実施例５
ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の生成
この実施例において、ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体を発現するバチルスサチリス株の構築を記載する。ＢＡＳＥ組み合わせ変異体を発現させるために、ユニークなＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用することによって、ＢＡＳＥ変異体のＤＮＡ断片をｐＨＰＬＴベクターの中にクローンし、次に、バチルスサチリス株の中に導入した。ＢＡＳＥ ＤＮＡ変異体の断片を以下に説明するように構築した。表５−１（Ｓ１〜Ｓ３２）に一覧されている各ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体について、表５−２及び表５−３に一覧されているプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
以下に記載されているＰＣＲ反応のために、最終濃度０．２μＭのＤＮＡプライマー及び０．１〜１０ナノグラムのプラスミドＤＮＡテンプレートを使用した。表５−２は、各変異体を構築するために使用した特定のｐＤＮＡテンプレート及びプライマーペアを一覧する。さらに、すべてのＰＣＲ反応は、Finnzymes社(Finnzymes OY、エスポー、フィンランド)のPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ（カタログ番号Ｆ−５３０Ｌ）を使用して、５０μＬの体積中で完結させた。すべてのＰＣＲ反応混合液は、５０μＬの全容積に対して、１０μＬの5X Phusion HFバッファ、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ混合液、０．７５μＬのPhusion DNAポリメラーゼ（２単位／μＬ）、１μＬの１００％ＤＭＳＯ、及び、オートクレーブ滅菌した脱イオン化水を含んでいた。MJ Research PTC-200 Peltierサーマルサイクラ(MJ Research社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用して、９８℃で３０秒間、２５サイクル（９８℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で２５秒間）、最後に７２℃で５分間として、ＰＣＲプログラムを実行した。
ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｓ１〜Ｓ１６について、ＰＣＲ１によって生成された増幅ＤＮＡ断片とＰＣＲ２によって生成された増幅ＤＮＡ断片とを、３回目のＰＣＲによって融合させた。プライマーＰｓｔＩ−ＦＷ及びプライマーＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＶを含む第３の反応混合液に、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の両方の増幅ＤＮＡ断片を０．５μＬ加えた。増幅させた１．５ｋｂの線状ＤＮＡ断片を精製し（Qiagen(商標)Qiaquick PCR精製キット、カタログ番号２８１０６）、ＰｓｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて消化した。次に、ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体ＤＮＡ断片Ｓ１〜Ｓ１６及びｐＨＰＬＴ ｐＤＮＡ（ＰｓｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した５０ｎｇ／μＬ）を精製し(Qiagen(商標)Qiaquick PCR精製キット カタログ番号２８１０６）、これらを連結した。その反応条件は、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩによって消化して精製したＢＡＳＥ変異体断片４μＬ、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化して精製したｐＨＰＬＴ ＤＮＡ断片２μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファ８μＬ（Invitrogen社（商標）カタログ番号46300-018）、脱イオン化してオートクレーブ滅菌した水２５μＬ、及び、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬ（１単位／μＬ（Invitrogen社（商標）カタログ番号15224-017）であった。連結反応を２０℃で１６〜２０時間実行した。
バチルスサチリス細胞中に連結反応混合液をそのまま導入して形質転換するために、連結したｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ変異体ＤＮＡを、TempliPhiキット（Amershamカタログ番号２５−６４００）を使用して増幅した。この目的のために、連結反応混合液１μＬを、TempliPhiキットによって提供されるサンプルバッファ５μＬと混ぜて、それを、ＤＮＡを変性させるために９５℃で３分間加熱した。その反応混合液を２分間氷上に置いて冷却し、簡単に遠心分離した。次に、TempliPhiキットによって提供される反応バッファ５μＬ及びｐｈｉ２９ポリメラーゼ０．２μＬを加え、この反応を、MJ Research ＰＣＲ機器中で３０℃で４時間にわたってインキュベートした。６５℃で１０分間インキュベートすることによってｐｈｉ２９酵素を熱不活性化した。
バチルスサチリスの中にＢＡＳＥ変異体を導入するために、０．１μＬのTempliPhi増幅反応生成物を、５００μＬの形質転換受容性バチルスサチリス細胞［（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ）］と混ぜて、次に、及び３７℃で１時間にわたって強く攪拌し、１０ｍｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン及び０．５％のＲＢＢデンプンを含むハートインフュージョン寒天培地(Difco、カタログ番号２４４４００)プレートの上に１００μＬ及び５００μＬを被覆させた。各変異体について、透明帯を生成する１個のコロニーを採取し、その後のプラスミドＤＮＡ単離及び遺伝子配列分析のために、それらをＴＳＢ（トリプトン及び大豆ベース培養液）液体培地において１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン選抜を行いながら増殖させた。配列分析によってＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の同一性を測定した。本明細書に記載されているように、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ Ｓ１〜Ｓ１６プラスミドＤＮＡは、ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｓ１７〜Ｓ３２を構築するためのテンプレートＤＮＡとしての役割を果たした。生化学的特性評価のためのＢＡＳＥコンビナトリアル変異体酵素サンプルを生成するために、９６ＭＴＰにおいてＭＢＤ培地中でＢＡＳＥコンビナトリアル変異体を３７℃で６８時間にわたって増殖させた。
表５−１
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表５−２
Figure 0005651682
表５−３
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ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｗ１〜Ｗ１３を使用してＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｐ１〜Ｐ１２を構築した。実施例４に記載されているＢＡＳＥコンビナトリアルライブラリ１−４から表５−４のＰ１−Ｐ１２変異体を選択した。表５−５に一覧されている各ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体（Ｗ１〜Ｗ３２）について、表５−６に一覧されているプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応条件のすべては、ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｓ１〜Ｓ３２を作成するために使用した上記プロトコルと類似したものであった。
表５−４
Figure 0005651682
表５−５
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表５−６
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ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体Ｗ１〜Ｗ１３を構築するためのＰＣＲの構成を表５−７及び表５−８に示す。変異体生産は、５つのＰＣＲ反応（シリーズＡ〜Ｅ）から始まり、２つの融合ＰＣＲ反応（シリーズＦ及びＧ）を続ける。Qiagen(商標)Qiaquick PCR精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用してすべてのＰＣＲ断片を精製した。変異体Ｓ１〜Ｓ３２の構築について記載されているように、ＰＣＲ Ｇ１〜Ｇ１３の融合ＤＮＡ断片をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、それを、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＰＬＴベクターＤＮＡと連結した。次に、ｐｈｉ２９ポリメラーゼで増幅させた連結反応混合物をバチルスサチリスの中に導入した。各変異体について、透明帯を生成する１個のコロニーを採取し、その後のプラスミドＤＮＡ単離及び遺伝子配列分析のために、１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含むＴＳＢ液体培地（トリプトン及び大豆ベース培養液）において増殖させた。配列分析によってＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の同一性を確認した。生化学的特性評価のためのコンビナトリアル変異体Ｗ１〜Ｗ１３の酵素サンプルを生成するために、９６ウェルＭＴＰにおいてＭＢＤ培地中でＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の選択的増殖を３７℃で６８時間実行した。
表５−７
Figure 0005651682
表５−８
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実施例６
ＡＣＥ（ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ）部位評価ライブラリの生成
この実施例には、ＢＡＳＥ変異体：ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１（ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ又はＡＣＥとしても知られている）；及び、ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１Ｓ２４３Ｑ（ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ又はＡＣＥ−Ｑと命名されたＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳＳ２４３Ｑとしても知られている）を発現するバチルスサチリス株の構築が記載されている。さらに、ＡＣＥ−Ｑ部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）の生成が記載されている。
ＤＮＡコドンを変更したＢＡＳＥ遺伝子を含む合成ＤＮＡ断片０５６４２６（ドイツ、レーゲンスブルクのＧｅｎｅａｒｔ社によって生産されたもの）がテンプレートＤＮＡとしての役割を果たした。ユニークなＰｓｔＩ制限部位及びＨｐａＩ制限部位を使用して、このＢＡＳＥ ＤＮＡ断片をｐＨＰＬＴベクター(Solingen et al., Extremophiles, 5:333-341, 2001)の中にクローンした。ｐＨＰＬＴ発現ベクターは、ＢＡＳＥをクローンするためのＰｓｔＩ制限部位及びＨｐａＩ制限部位を後に伴うバチルス・リケニフォルミスＬＡＴプロモータ（Ｐｌａｔ）、及び、レプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン抵抗性マーカ（ｂｌｅｏ）を含むｐＵＢ１１０由来因子(McKenzie et al., Plasmid, 15: 93-103, 1986)を含む。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥプラスミドのマップを図３に示す。テンプレートＤＮＡとしてｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥを使用し、かつ、表６−１に一覧されているＤＮＡプライマーを使用して、コドン１８０（ＣＧＧ）及びコドン１８１（ＡＧＣ）を削除したＢＡＳＥ ＤＮＡ（ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１、ＡＣＥとも称する）を生成した。シグマ社(Sigma-Aldrich Chemie B.V、Zwijndrecht、オランダ)がＤＮＡプライマーを合成及び脱塩した。
プライマーペアTS-delRS-FW/pHPLT-HpaI-RV及びTS-delRS-RV/pHPLT-PstI-FWを使用して、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥテンプレートＤＮＡを使用して２つのＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲによって生じた２つの断片を融合させるために、プライマーpHPLT-PstI-FW及びプライマーpHPLT-HpaI-RVを加える第３のＰＣＲ反応に、両方の反応から未精製のＰＣＲ混合液１μｌを加えた。増幅した１．５ｋｂの線状ＤＮＡ断片を精製し(Qiagen(商標）Qiaquick PCR精製キット、カタログ番号28106）、ＰｓｔＩ制限酵素及びＨｐａＩ制限酵素で消化した。
記載されているすべてのＰＣＲ反応について、最終濃度が０．２μＭのＤＮＡプライマーを使用し、０．１〜１０ナノグラムのＤＮＡテンプレートを使用した。さらに、Finnzymes社(Finnzymes OY、エスポー、フィンランド)のPhusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ(カタログ番号F-530L)を使用して、すべてのＰＣＲ反応を５０μｌの体積中で完結させた。また、すべてのＰＣＲ反応混合液は、１０μＬの５×Phusion HFバッファ、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．７５μＬのPhusion DNAポリメラーゼ（２単位／μＬ）、１μＬの１００％ＤＭＳＯ、及び、最終体積を５０μＬとするための、脱イオン化してオートクレーブ滅菌した水を含む。MJ Research PTC-200 Peltierサーマルサイクラー(MJ Research、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用して、Finnzymes社によって説明されているように（９８℃で３０秒間、３０サイクル［９８℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で２２秒／ｋｂ］、及び、７２℃で５分間の最終ステップ）、ＰＣＲプログラムを実行した。
次に、ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１ ＤＮＡ断片及びｐＨＰＬＴプラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ、ＰｓｔＩ制限酵素及びＨｐａＩ制限酵素で消化したもの）の両方を(Qiagen(商標)Qiaquick PCR精製キット、カタログ番号28106を使用して)精製した。次に、それらを、以下の反応条件：ＰｓｔＩ及びＨｐａＩで消化して精製したＢＡＳＥ−ΔＲ１８０−ΔＳ１８１ ＤＮＡ断片４μＬ、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩで消化して精製したｐＨＰＬＴ ＤＮＡ断片２μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファ８μＬ(Invitrogen社(商標)カタログ番号46300-018)、脱イオン化してオートクレーブ滅菌した水２５μｌ、及び、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬ(１単位／μＬ(Invitrogen社(商標)カタログ番号15224-017)を使用して、ＰｓｔＩ末端及びＨｐａＩ末端で連結した。連結反応を２０℃で１６〜２０時間実行した。
この連結反応混合物をＷＯ０２／１４４９０に記載されているようにバチルスサチリス株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）及び（ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ（Δｖｐｒ、ΔｗｐｒＡ、ΔｍｐｒｙｂｆＪ、ΔｎｐｒＢ））に導入して形質転換した。ＷＯ０２／１４４９０は、細菌形質転換の教示として本明細書に組み込まれている。ハートインフュージョン寒天培地(Difco、カタログ番号244400)と１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンとを含む寒天プレート上でバチルスサチリス形質転換体を選択した。２５ｍｌのＭＢＤ培地（ＭＯＰＳをベースとした特定の培地）と１０ｍｇ／Ｌのネオマイシンとを含む振盪フラスコの中で、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１プラスミドを有するバチルスサチリス形質転換体の選択的増殖を実行した。これによって、デンプン加水分解活性を有するＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１アミラーゼの分泌型が生産される。本明細書においてｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１プラスミドをｐＨＰＬＴ−ＡＣＥと称することもある。
ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０−ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑアミラーゼを発現するバチルスサチリス株を生成するために同様のプロトコルを使用した。最初の２つのＰＣＲ反応は、プライマーACE-S243Q-FW及びプライマーpHPLT-HpaI-RV、プライマーACE-S243Q-RV及びプライマーpHPLT-PstI-FW、並びに、ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥテンプレートＤＮＡを使用して実行した。プライマー配列を表６−１に一覧する。ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑを有するバチルスサチリス形質転換体は、デンプン加水分解活性を有するＢＡＳＥ−ΔＲ１８０−ΔＳ１８１−Ｓ２３４Ｑアミラーゼを生産及び分泌した。ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑとも称される、ｐＨＰＬＴ−ＢＡＳＥ−ΔＲ１８０―ΔＳ１８１−Ｓ２４３Ｑプラスミドのマップは、図４に示されている。
表６−１
Figure 0005651682
ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３ＱプラスミドＤＮＡは、部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を生産するためのテンプレートとしての役割を果たした。ＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬのために選択したアミノ酸位置は、成熟ＢＡＳＥアミノ酸配列（配列番号２）に従って番号付けたものであり、その位置には、以下のもの：Ｒ１２７、Ｙ３０５、Ｑ３２０、Ｐ３７９、Ｔ４１９、Ｌ４５３及びＧ４７５が含まれる。対応する各ＤＮＡコドンは、最大２０個の異なるアミノ酸をコードする変更したコドンで置換した。このｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３ＱプラスミドはユニークなＢｇｌＩＩ制限部位を含んでいた。これをＳＥＬ構築時に利用した。ライブラリを作成するために使用したプライマー（商用に合成及び脱塩したもの）の配列は、表６−２に一覧されている。
ＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬを構築するために、３つの反応：変更した対象コドンをＡＣＥ−Ｑ ＤＮＡ配列中に導入するための２つの変異生成反応、及び、２つのＰＣＲ断片を融合させる第３の反応を実行した。この変異生成の方法はコドン特異的変異アプローチに基づくものである。この方法においては、変異させるコドンの配列に対応し、かつ、対象コドンにおけるヌクレオチドのランダムな組み込みを保証する特別に設計されたトリプレットＤＮＡ配列ＮＮＳ（（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ｃ又はＧ））をコードする順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定のＤＮＡトリプレットにおいて可能なすべての変異の生成を実行した。表６−２のプライマー名に一覧されている数字は、特定のＡＣＥ−Ｑコドン位置（成熟ＢＡＳＥアミノ酸配列の番号付けに基づいたもの）に一致する。ＳＥＬを構築するために使用した２つのさらなるオリゴヌクレオチドプライマーは、ユニークなＢｇｌＩＩ制限部位、及び、そのＢｇｌＩＩ制限部位に隣接するｐＨＰＬＴ ＤＮＡ配列をコードする。
表６−２
Figure 0005651682
各ＳＥＬの構築は、２つの一次増幅反応：ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマーと、特定のＡＣＥ−Ｑ逆方向変異生成プライマーとを使用した第１のＰＣＲ；及び、ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマーと、特定のＡＣＥ−Ｑ順方向変異生成プライマーとを使用した第２のＰＣＲから開始した。成熟ＡＣＥ−Ｑ配列における変異の導入は、Finnzymes Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ(Finnzymes OY社、エスポー、フィンランド)(カタログ番号F-530L)を使用して実行した。すべての反応を製造業者によって供給されているプロトコルに従って実行した。主要な反応に関するＰＣＲ条件は以下のとおりであった。
一次ＰＣＲ１：ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマーと特定のＡＣＥ−Ｑ逆方向変異生成プライマー、両者とも１μＬ（１０μＭ）、０．１〜１０ナノグラムのＤＮＡテンプレート（ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）、５×Phusion HFバッファ１０μＬ、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合液１μＬ、Phusion DNAポリメラーゼ０．７５μＬ（２単位／μＬ）、１００％ＤＭＳＯ１μＬ、及び、最終体積が５０μＬとなる量の脱イオン化及びオートクレーブ滅菌した水。
一次ＰＣＲ２：ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマーと特定のＡＣＥ−Ｑ順方向変異生成プライマー、両者とも１μＬ（１０μＭ）、０．１〜１０ナノグラムのＤＮＡテンプレート（ｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）、５×Phusion HFバッファ１０μＬ、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合液１μＬ、Phusion DNAポリメラーゼ（２単位／μＬ）０．７５μＬ、１００％ＤＭＳＯ１μＬ、及び、最終体積が５０μＬとなる量の脱イオン化及びオートクレーブ滅菌した水。
下記プログラム：９８℃で３０秒間、３０サイクル（９８℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）、及び、７２℃で５分間を用いて、ＰＴＣ−２００Peltierサーマルサイクラー(MJ Research社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用した。各ＳＥＬ一次増幅反応について、対象のＡＣＥ−Ｑコドンの周囲に約３０個のヌクレオチド重複を有する約２〜３ｋｂの２つのＤＮＡ断片を生産した。２つのＤＮＡ断片を融合させるために、プライマーｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷとプライマーｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶとを加える第３の増幅反応に対して、両方の反応から未精製のＰＣＲ反応混合液１μＬを加えた。増幅した５．２ｋｂの線状ＤＮＡ断片を精製し(Qiagen(商標)Qiaquick PCR精製キット、カタログ番号28106)、それを、融合断片の両側に付着末端を作成するために、ＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて消化した。この制限酵素消化液は、３０℃で１時間インキュベートしたときに、３５μＬの精製された線状ＤＮＡ断片、４μＬのＲＥＡＣＴ(商標）３バッファ(Invitrogen社、Paisley PA4 9RF、英国)、及び、１μＬのＢｇｌＩＩ、１０単位／ｍｌ(Invitrogen社、Paisley PA4 9RF、英国)を含んでいた。
ＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬを作成するために、ＷＯ２００２／０１４４９０に記載されているように、形質転換受容性を有するバチルスサチリス細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）を形質転換するために、コドンを変異させたｐＨＰＬＴ−ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ連結反応混合液を使用した。１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ネオマイシン(Sigma社、カタログ番号N-1876、１ｍｇ当たり７３２μｇのネオマイシンを含む)を含むＨＩ寒天プレート（ハートインフュージョン寒天培地）の表面に、この形質転換混合液を被覆させた。各ライブラリについて１個のコロニーを採取し、それを、その後のプラスミドＤＮＡ単離及びＡＣＥ−Ｑ遺伝子変異体のＤＮＡ配列分析のために、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン選択下においてトリプトン及び大豆ベース培養液体培地中で培養した。ＢａｓｅＣｌｅａｒ Ｂ．Ｖ．(Leiden社、オランダ)によってＤＮＡ配列分析を実行した。配列分析データによって、１個のライブラリ当たり最大１８個のＡＣＥ−Ｑ変異体が明らかになった。７個のＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬにおいて特定されたすべてのＡＣＥ−Ｑ変異体が表６−３に一覧されている。生化学的特性評価のためのＡＣＥ−Ｑ変異体酵素サンプルを作成するために、９６ウェルのＭＴＰにおいてＭＢＤ培地（ＭＯＰＳをベースとした特定の培地）中で、ＡＣＥ−Ｑ ＳＥＬのいくつかの選択的増殖を３７℃で６８時間にわたって実行した。
表６−３
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実施例７
ＢＡＳＥ変異体についての性能指数値
この実施例には、ＢＡＳＥ及びその変異体の洗浄性能（ｐＨ１０／３２℃、ｐＨ１０／５０℃、ｐＨ８／１６℃、及び、ｐＨ８／３２℃におけるＣＳ−２８微量サンプル分析）、洗剤安定性、耐熱性、ＢＰＮＰＧ７アミラーゼ活性、及び、ＨＰＬＣタンパク濃度（対象特性の試験）を測定するために実行した試験の結果が記載されている。実施例１の方法を使用してこれらの結果を得た。終始記載されているように、ＢＡＳＥ変異体の機能性を性能指数（ＰＩ）として定量した。この性能指数は親タンパクに対する変異体の性能の比である。表１０−１は、試験した特性についての多数のＢＡＳＥ変異体のＰＩ値を示している。多様なアミノ酸位置に導入した変異が示されている。０．０５以下の性能指数を０．０５とした。０．０５以下のＨＰＬＣタンパクＰＩを有するすべての変異体について、すべての値を０．０５とした。また、２つの安定性測定値について、安定性分析における初期活性のＰＩが０．０５以下である場合には、それに関連する安定性ＰＩを０．０５とした。表７−１は、組み込み可能な変異を有するＢＡＳＥ変異体の性能指数を与える。本明細書において、この組み込み可能な変異は、少なくとも１つの特性についてＰＩ値≧０．５であり、かつ、すべての特性について０．０５＞ＰＩ値を有する変異体中の変異として定義される。
表７−１
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表３−２には存在するが、表７−１には存在しないＢＡＳＥ ＳＥＬのその他の８２１個の変異は、親α−アミラーゼのコンビナトリアル変異体に含ませるのにあまり適していないものである。同様に、配列番号２に対応する位置の天然由来α−アミラーゼの残基であって、８２１個の組み込み不可能な変異と同一である残基は、性能が低い天然由来α−アミラーゼ中に存在すると考えられ、したがって、変異生成のための候補である。そのため、本明細書の開示は、特性の所望の組み合わせを有する変異体α−アミラーゼを生産するための詳細な製法を提供する。
実施例８
α−アミラーゼ中の制限的位置及び非制限的位置
ＢＡＳＥ及びその変異体の洗浄性能（ｐＨ１０／３２℃、ｐＨ１０／５０℃、ｐＨ８／１６℃、及び、ｐＨ８／３２℃におけるＣＳ−２８微量サンプル分析）、洗剤安定性、耐熱性、ＢＰＮＰＧ７アミラーゼ活性、及び、ＨＰＬＣタンパク濃度（対象特性の試験）を測定するために実行した試験の結果を記載する。実施例１に記載されている方法を使用してこれらの結果を得た。終始記載されているように、ＢＡＳＥ変異体の機能性を性能指数（ＰＩ）として定量した。性能指数は、親アミラーゼ又は対照アミラーゼに対する変異体の性能の比である。下記様々な用語は、変異を説明するために使用されている。上昇変異はＰＩ＞１を有し、中間的変異はＰＩ＞０．５を有し、非有害変異はＰＩ＞０．０５を有し、有害変異はＰＩ≦０．０５を有し、組み込み可能な変異は、変異体が少なくとも１つの特性についてＰＩ≧０．５を有し、かつ、すべての特性についてＰＩ＞０．０５を有するようになる変異である。組み込み可能な変異は、１つ又はそれ以上の所望の特性について適切なＰＩを有するタンパクを届けるために組み込むことができる変異である。
変異が生じる位置を以下のように分類する。非制限的位置は、少なくとも１つの特性について中間的変異を２０％以上にし、制限的位置は、活性及び安定性について中間的変異を２０％未満にする。表８−１は、活性及び安定性について２０％未満の中間的変異（ＰＩ＞０．５）が検出された制限的位置を示す。表８−２は、試験した少なくとも１つの特性について２０％の中間的変異（ＰＩ＞０．５）が検知された非制限的位置を示す。上記％は、中間的変異の定義を満たすと評価される変異体のパーセントである。
表８−１
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表８−２
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制限的位置は、これらの制限的位置にはあらゆる特性について中間的である置換がほとんど存在しないので、一般に変異させるべきではない。これらの位置を変更しなければならない場合、これらの位置はアミノ酸置換が保存的置換であることを必要とする。例えば、位置５８における２つの変異、すなわち、Ａ５８Ｇ及びＡ５８Ｔは、組み込み可能であり、また、位置２３６における２つの変異、すなわち、Ｙ２３６Ｆ及びＹ２３６Ｗは、組み込み可能である。多数の組み込み可能な変異が存在するので、非制限的位置は、コンビナトリアルライブラリを構築する際の使用に最も適した位置である。相同タンパクは同じ構造を共有しており、制限的位置はそのタンパクの構造及び／又は機能にとって重要であるので、制限的位置はすべての相同アミラーゼにおいて制限的である。本明細書の開示において実証されているように、あり得るアミノ酸変異を試験し、それらのタンパク（例えば、α−アミラーゼ）の１個の特性を測定することによってのみ、制限的位置を特定することができる。図１の配列比較表において２つの制限的位置が保存されているが、保存それ自体が、ある位置が制限的であるという指標ではないことに留意されたい。例えば、Ｑ７１、Ｋ７２及びＧ７３は、配列比較表のすべてにおいて保存されているが、３つの位置のすべては、活性、安定性、又は、両方について親より優れたいくつかの変異が存在する。各特性について中間的変異が２０％超になる非限定的位置は、一般に、コンビナトリアル変異のための非常によい選択である。α−アミラーゼ中の試験した１９８個の位置のうち、この条件を満たす１１５個の位置が存在する。
実施例９
ＡＣＥ−Ｑアミラーゼ変異体の洗剤安定性
１０％洗剤（業務用洗剤、不活性化されたもの）の存在下における７０℃での定められ条件下でのインキュベートの後にＡＣＥ−Ｑ（ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）アミラーゼ変異体の洗剤安定性を測定し、実施例１に記載されているセラルファ法（ＢＰＮＰＧ７）を使用してアミラーゼの初期活性及び残存活性を測定した。アミノ酸残基の番号付けは、ＢＡＳＥα−アミラーゼの番号付けに対応する。下記表９−１中の結果は、ＡＣＥ α−アミラーゼと比較した各変異体の性能指数（ＰＩ）として示されている。
表９−１
ＰＩが０．５以上であるＡＣＥ−Ｑ変異体の洗剤安定性
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示されている変異体は、ＳＥＬデータにおいて特定された組み込み可能な変異である。ＰＩ≧０．５を有する変異体だけが示されている。安定性と活性との所望の組み合わせを与えるためにこれらの変異を組み込むことができる。
実施例１０
ＡＣＥ−Ｑ変異体の洗浄性能
実施例１に記載されているように、４つの異なる条件、ｐＨ８／１６℃、ｐＨ８／３２℃、ｐＨ１０／３２℃及びｐＨ１０／５０℃の下で、ＣＳ２８微量サンプルを使用して、ＡＣＥ−Ｑ（ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ）アミラーゼ変異体の洗剤性能を測定した。アミノ酸残基の番号付けは、ＢＡＳＥ α−アミラーゼの番号付けに対応する。下記の表１０−１〜表１０−４の結果は、ＡＣＥα−アミラーゼと比較した各変異体の性能指数（ＰＩ）として示されている。
表１０−１
ＣＳ−２８、ｐＨ８、１６℃における洗浄性能についてのＰＩが０．５以上であるＡＣＥ−Ｑ変異体（１１８個）
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表１０−２
ＣＳ−２８、ｐＨ８、３２℃における洗浄性能についてのＰＩが０．５であるＡＣＥ−Ｑ変異体（１１８個）
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表１０−３
ＣＳ−２８、ｐＨ１０、３２℃における洗浄性能についてのＰＩが０．５であるＡＣＥ−Ｑ変異体（８７個）
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表１０−４
ＣＳ−２８、ｐＨ１０、５０℃における洗浄性能についてのＰＩが０．５であるＡＣＥ−Ｑ変異体（７３個）
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実施例１１
ＢＡＳＥ単一変異変異体の耐熱性
熱不活性化した１００％Persil(Henkel)HDL中での精密なＴ５０％試験のために、ＳＥＬスクリーンから１個の変異を有する２３個のＢＡＳＥの変異体を選択した。業務用洗剤の熱不活性化は、非酵素成分の特性を保持しながら、あらゆる酵素成分の活性を破壊する役目を果たす。ＳＥＬスクリーンにおいて行われるように、選択は、耐熱性及び１０％Persil HDL安定性における向上した性能指数に基づいている。１００％Persil HDLにおいてそれぞれのＴ５０％値を有する選択された変異体が表１１−１に一覧されている。
表１１−１
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実施例１２
ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の耐熱性
実施例５に記載されているコンビナトリアルライブラリを構築するために、ＢＡＳＥ対照アミラーゼの５つの位置（Ｎ１２８Ｃ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、Ａ１８５Ｄ及びＳ２４３Ｑ）を選択した。このコンビナトリアルライブラリの可能な３２個の変異体（ＢＡＳＥ−Ｓ１〜ＢＡＳＥ−Ｓ３２）のうち、３０個の変異体を、熱不活性化したPersil HDL中における安定性について分析した。それらの変異体、それらの変異体のそれぞれの変異、及び、Persil HDL中で測定したＴ５０％は、野生型(ＷＴ)ＢＡＳＥ（対照アミラーゼ）、ＡＣＥ及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑアミラーゼ変異体と比較して、表１２−１に一覧されている。
表１２−１
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この結果は、ＡＣＥ及びＡＣＥ−Ｓ２４３ＱがＷＴ ＢＡＳＥと比較して著しく向上した耐熱性を有していることを示している。さらに、いくつかコンビナトリアル変異体も著しく向上した増加した耐熱性を示した。６個の変異体（ＢＡＳＥ−Ｓ２６、ＢＡＳＥ−Ｓ２０、ＢＡＳＥ−Ｓ３１、ＢＡＳＥ−Ｓ１２、ＢＡＳＥ−Ｓ２７、ＢＡＳＥ−Ｓ２８）は、安定性の上昇が５０％を超えた。
実施例１３
ＢＡＳＥコンビナトリアル変異体の洗浄性能及び耐熱性
性能を向上させる変異と安定性を向上させる変異とを組み込んで、実施例５に記載されているように１３個のコンビナトリアルＢＡＳＥ変異体を構築した。表１３−１に示されているように、２つの異なる条件（ｐＨ８、１６℃及びｐＨ８、３２℃）下におけるＣＳ２８微量サンプルに対する洗浄性能（ＰＩ又は性能指数）、並びに、ＭＯＰＳバッファ中における耐熱性及び１００％Persil HDL中における耐熱性（Ｔ５０％）について、α−アミラーゼ変異体ＢＡＳＥ−Ｗ１〜ＢＡＳＥ−Ｗ１３を分析した。
表１３−１
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＊ＢＡＳＥ−Ｗ１０変異体はＦ２０２Ｙ置換をさらに含む。
これらの結果は、いくつかコンビナトリアル変異体がＷＴ ＢＡＳＥと比較して著しく向上した洗浄性能及び洗剤安定性を示すことを示している。３個の変異体、ＢＡＳＥ−Ｗ９、ＢＡＳＥ−Ｗ１０及びＢＡＳＥ−Ｗ１１は、低温洗浄において３倍超の向上を示し、同時に１．７５倍超の向上した洗剤安定性を示す。
実施例１４
ＢＡＳＥ変異体Ｗ９、Ｗ１０、Ｗ１１及びＡＣＥ−ＱＫの洗浄性能
ＢＡＳＥ変異体Ｗ９、Ｗ１０及びＷ１１及びＡＣＥ−ＱＫの洗剤性能を洗濯用洗剤用途において試験した。地元のスーパーマーケットから購入して熱不活性化したアリエール(Ariel)洗剤(Proctor and Gamble社)を使用して、ラウンダ−ｏ−メータ試験において、綿表面のCFT CS-28コメデンプン(Center for Testmaterials BV社、Vlaardingen、オランダ)、及び、綿表面のＥＭＰＡ１６１デンプン(Test materials AG社、St. Gallen、スイス)に対する汚れ除去を測定した。アリエール洗剤をBrother社の高速電子レンジにおいて９０℃〜１００℃で８分間不活性化した。この洗剤を５０℃未満に冷まし、次に、電子レンジにおいて７分間再び加熱した。このステップを１回繰り返した。
処理の前後に、三刺激値ミノルタメータCR-400を使用した光反射率によってＥＭＰＡサンプルを測定した。CIE-LAB色空間によって定義されているように、Ｌ値、ａ値、ｂ値の差を全色差(dE)に変換した。汚れの洗浄は、洗浄の前と後の色差の比を取得し、それを、汚していない布に対する未洗浄汚染（洗浄前）の差と比較することによって得られるパーセントによる汚れ除去指数（％ＳＲＩ）として表される。
ラウンダ−ｏ−メータにおいて３０℃で洗浄処理を実施した。洗浄時間は、４５分間（３０℃に到達するまでの１５分間、及び、３０℃で３０分間）と、冷たい水道水による５分間のすすぎ時間であった。水の硬度を８．５°ＧＨに調節し、熱不活性化したアリエールを４．５ｍｌ／Ｌで使用した。汚れの投入は、１個のビーカー当たり各２個のＥＭＰＡ１６１及び２個のＣＦＴ ＣＳ−２８サンプルと、６個のスチールボールとからなるものであった。洗浄処理の後に、すべてのサンプルを遠心力で脱水し、空気乾燥し、上記光反射率を測定した。対照は、ベンチマーク商用酵素からなるものであった。これらの結果を図５に示す。
約０．０５ｐｐｍ〜約０．５ｐｐｍの量でのＢＡＳＥ変異体の存在は、一般に、コントロールと比較して性能を向上させた。ＢＡＳＥ変異体の相対的性能は、Ｗ１０＞Ｗ１１＞Ｗ９＞ＡＣＥ−Ｑであった。
実施例１５
ＢＡＳＥ変異体Ｘ８Ｃ、Ｗ１０ＥＫ及びＡＣＥ−ＱＫの洗浄性能
洗濯用洗剤の用途において、Ｔｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒを使用して、さらなるＢＡＳＥ変異体ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（すなわち、Ｗ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ）、ＢＡＳＥ−Ｗ１０ＥＫ（すなわち、ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）、及び、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（すなわち、ＡＣＥ−ＱＫ）の洗浄性能を試験した。１６℃において性能評価を実施した。汚れの投入量は、１Ｌの脱イオン水で満たしたＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒのビーカー当たり、各２個のCS-28コメデンプン(Center for Testmaterials BV、Vlaardingen、オランダ)、各２個のＡＳ−１０色素オイルミルク(オランダのCFT)、各２個のＥＭＰＡ１６１トウモロコシデンプン、各２個のＥＭＰＡ１６０チョコレートクリーム、及び、各２個のＥＭＰＡ１６３ポリッジ(EMPA Testmaterials AG社、St. Gallen、スイス)サンプルからなっていた。水の硬度を１ガロン当たり６グレインに調節し、熱不活性化したグレインバリュー(Great Value)(Walmart社)洗剤を１．０ｍｌ／Ｌで使用した。洗浄時間は１５分であった。洗浄処理の後にすべてのサンプルを遠心脱水して空気乾燥した。
Ｄ６５（６５００°Ｋ）標準光源にセットしたミノルタ反射測定色度メータモデルCR-410(コニカミノルタ社)を使用し、処理の前後におけるそれぞれの汚れを光反射率によって測定した。CIE-LAB色空間によって定義されているように、Ｌ値、ａ値、ｂ値の差を全色差（ｄＥ）に変換した。汚れの洗浄は、洗浄前後の色差の比を取得することによって、汚れ除去指数（ＳＲＩ）として表されている。ＥＭＰＡ１６０サンプルの洗浄についての結果は図６に示されている。試験したすべてのＢＡＳＥ変異体は、対照と比較して効果的な洗浄を示した。
実施例１６
ＢＡＳＥ変異体とサブチリシンプロテアーゼとの間の洗濯利用における相乗作用
原寸大の洗濯用途において、チョコレートクリームで汚したＥＭＰＡ１６０サンプル、及び、ポリッジで汚したＥＭＰＡ１６３サンプルを用いて、汚れ除去に関するＢＡＳＥとサブチリシンプロテアーゼ(バチルスアミロイケファシエンスサブチリシンBPN'-Y217L; BPNのSwissprot Accession Number P00782)との間の相乗作用を測定した。ｐＨ８．０の５ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Sigma、H4034)、及び、熱不活性化したＴＩＤＥ(商標)２×冷水洗剤(Proctor & Gamble社、Cincinnati、オハイオ州)の中で、ＥＭＰＡ１６０サンプル及びＥＭＰＡ１６３サンプルからの汚れ除去を試験した。業務用洗剤の熱不活性化は、非酵素成分の特性を保持しながら、酵素成分の活性を破壊する役目を果たす。予め重さを測った（ガラスボトル中の）液体洗剤を９５℃の水槽中に２時間にわたって置くことによって熱不活性化を実行した。地元のスーパーマーケットから洗剤を購入した。不活性化されたパーセンテージを正確に測定するために、洗剤の溶解から５分以内に、加熱していない洗剤及び加熱した洗剤の両方を分析した。ＡＡＰＦ分析及びセラルファ分析によって酵素活性を測定した。
Ｄ６５（６５００°Ｋ）標準光源にセットしたミノルタ反射率計ＣＲ−４１０を使用して、処理の前と後にＥＭＰＡサンプルを光反射率によって測定した。CIE-LAB色空間によって定義されているように、Ｌ値、ａ値、ｂ値の差を全色差(dE)に変換した。汚れの洗浄は、洗浄前後の色差の比を取得し、それを、汚していない生地に対する未洗浄の汚れ（洗浄前）の差と比較することによって、汚れ除去指数（ＳＲＩ）として表される。Kenmore洗濯機において４４Ｌで洗浄処理を実施した。「コールド・オート・テンパラチャ(Cold Auto Temperature)」設定を使用して洗濯機に水を満たし、１５０００ｇｐｇの水硬度原液（Ｃａ：Ｍｇ＝３：１）を使用して水の硬度を６ｇｐｇに調節した。不活性化したTIDE(商標)冷水用洗剤（４３．１２ｇ）を加え、温度を３２℃に調節した。０．６ｐｐｍの最終濃度でサブチリシンプロテアーゼを加え、０．１ｐｐｍ．の最終濃度でＡＣＥアミラーゼを加えた。洗浄条件当たり４個のサンプルを使用し、漂白した綿両面編みニット生地をバラストとして加えることによって全生地投入量を４０ｇ／Ｌとした。洗剤条件は、通常サイクル（１５．５分）及びその後のすすぎ（３分）、８９．６°Ｆ／３２℃の洗浄／すすぎ温度、速いかき混ぜ(fast agitation)及び速い回転(fast spin)であった。洗浄の後に、サンプルを低熱で機械乾燥し、さらに、上述されているように光反射率によって測定した。
図７Ａに示されているように、ＡＣＥ α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとは、洗濯に利用したときに相乗的な洗浄効果を発揮した。ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）α−アミラーゼとサブチリシンプロテアーゼ（バチルス・アミロリケファシエンス・サブチリシンＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ変異体）とを用いて洗濯利用における同様の相乗効果試験を実施した。図７Ｂに示されているように、ＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（ＡＣＥ−ＱＫ）α−アミラーゼとＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとは、洗濯用途において相乗的な洗浄効果を発揮した。このことは、洗濯用途におけるより優れた洗浄のためにＢＡＳＥ変異体とプロテアーゼとを併用することができることを示唆している。
実施例１７
ＢＡＳＥ変異体及びサブチリシンプロテアーゼの用量効果
Ｔｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒを使用して、選択した濃度のＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ及びサブチリシンプロテアーゼ（バチルス・アミロリケファシエンス・サブチリシンＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ；BPN' Swissprot Accession Number P00782)の用量効果曲線を作成した。２０℃及び４０℃の両方において性能評価を実施した。１Ｌの脱イオン水と、１．０ｇの市販品ＷＩＳＫ(商標)(Sun Products社、米国で購入)洗濯用洗剤又は４．５ｇのＯＭＯＴＭ（Unilever社、デンマークで購入）洗濯用洗剤とで満たしたＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒのスチール容器中に、通常、ＣＳ−２８コメデンプン(Center for Testmaterials BV、Vlaardingen、オランダ)、ＡＳ−１０色素オイルミルク（オランダのＣＦＴ）、ＥＭＰＡ１６１トウモロコシデンプン、ＥＭＰＡ１６０チョコレートクリーム、及び、ＥＭＰＡポリッジ(EMPA Testmaterials AG、St. Gallen、スイス)のサンプル各２個を入れた。２回の重複測定を同時に実行した。別段の定めがない限り、試験を１２分間行い、サンプルを３分間すすいだ。洗浄の後にサンプルを空気乾燥した。
Ｄ６５（６５００°Ｋ）標準光源にセットしたミノルタ反射率計色度メータ・モデルＣＲ−４１０（コニカミノルタ社）を使用して、処理の前後にそれぞれの汚れを光反射率によって測定した。CIE-LAB色空間によって定義されているように、Ｌ値、ａ値、ｂ値の差を全色差（ｄＥ）に変換した。汚れの洗浄は、洗浄前後の色差の比を取得することによって、汚れ除去指数（ＳＲＩ）として表されている。
表１７−１に示されている結果は、ＢＡＳＥ変異体とプロテアーゼとの組み合わせが、いくつかの工業用洗浄汚れに対して著しい洗浄的効用を生じることを実証している。これらのデータは、ＢＡＳＥ変異体をプロテアーゼと組み合わせて使用することによって、固有の洗浄的効用が得られることを実証している。
表１７−１
プロテアーゼと併用したＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑの洗浄性能
Figure 0005651682
Figure 0005651682
Figure 0005651682
さらなるＢＡＳＥ変異体［すなわち、ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ（すなわち、Ｗ１１−Ｔ１３１Ｉ−Ｔ１６５Ｉ）、ＢＡＳＥ Ｗ１０ＥＫ（すなわち、ＢＡＳＥ−Ｎ１２８Ｃ−Ｋ１７８Ｌ−Ｔ１８２Ｇ−Ｓ２４３Ｅ−Ｙ３０５Ｒ−Ｄ３１９Ｔ−Ｇ４７５Ｋ）及びＡＣＥ−Ｓ２４３Ｑ−Ｇ４７５Ｋ（すなわち、ＡＣＥ−ＱＫ）と、ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンプロテアーゼとの組み合わせにおける洗濯用途における相乗効果を、上述されているように、ＥＭＰＡ１６０及びＥＭＰＡ１６３サンプルを用いてさらに試験した。それらの結果を図８（ＢＡＳＥ−Ｘ８Ｃ）、図９（ＢＡＳＥ Ｗ１０ＥＫ）及び図１０（ＡＣＥ−ＱＫ）に示す。これらのデータは、ＢＡＳＥ変異体をプロテアーゼと組み合わせて使用することによって、固有の洗浄的効用が得られることを実証している。
明細書で言及されている特許及び刊行物のすべては、その開示が属する分野の当業者のレベルを示している。当業者は、対象を実行し、言及されている結果と長所及び固有のものとを得るために、本開示が適切に適合されることを容易に認識する。本明細書に記載されている組成物及び方法は、好ましい実施形態の代表であって、典型的なものであり、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではない。本明細書に開示されている内容にその開示の範囲及び精神から外れることなく様々な置換及び修正を加えてもよいことは、当業者に明らかである。
本明細書において説明的に適切に記載されている開示は、本明細書に明示的に開示されていないあらゆる要素又は限定の１つ又は複数が存在しない状態で実施されてもよい。使用されている用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語ではなく、また、そのような用語及び表現の使用においては、示されている特徴及び記載されている特徴又はそれらの一部分のあらゆる均等物を除外する意図は存在しないが、特許請求の範囲の開示の範囲内で様々な修正があり得ることが認識されている。従って、本明細書の開示は好ましい実施形態及び選択的特徴によって具体的に開示されているものの、修正及び変形が本明細書に定義されている開示の範囲内であると考えられるように、当業者が本明細書に開示されている概念の修正及び変形を用いることができることは理解されるに違いない。
本明細書の開示は広くかつ一般的に記載されている。総称的開示に含まれるより狭い属種及び亜属種のグループのそれぞれも本明細書の開示の一部を形成する。これには、除外される材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かに関わらず、属から任意の主題を除外する条件又は否定的限定を伴う開示の総括的記載が含まれる。

Claims (28)

  1. 単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記変異体は、アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼの成熟形態であり、かつ、１、２、３、４、５、７、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２５、２６、２８、２９、３０、３２、３５、３６、３７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６０、７０、７１、７２、７３、７５、７８、８３、８７、９０、９１、９３、９４、９５、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１２、１１３、１１６、１１８、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３８、１４２、１４４、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、１７７、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、１９２、１９５、１９７、２０１、２０２、２０３、２０７、２１０、２１４、２１７、２２１、２２８、２３４、２３６、２３７、２４６、２５０、２５４、２５５、２５７、２６４、２６７、２６９、２７０、２７２、２７５、２７９、２８３、２８４、２９８、３０１、３０３、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２２、３２３、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４４、３５９、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８１、３８２、３９３、３９４、３９９、４０１、４０７、４０８、４１９、４３３、４３６、４３８、４４４、４４７、４４８、４５１、４５３、４５９、４６５、４７０、４７５、４７６、４８３、及び、４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、
    前記単離されたα−アミラーゼ変異体は、位置２４３に置換をさらに含み、
    前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応するものであり、
    前記α−アミラーゼ変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    異なるアミノ酸残基による１つ又はそれ以上の位置における天然由来アミノ酸残基の前記置換は、安定性の尺度について１．４以上の性能指数を有し、かつ、活性の尺度について１．０を超える性能指数を有するα−アミラーゼ変異体を生じさせることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  2. 請求項１に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記変異体は、２、７、２２、２５、２８、３０、３７、７０、７５、８３、８７、９１、９３、１０８、１２８、１６０、１６５、１７８、１８２、１８３、２１７、２６９、２７０、２７９、２８３、２９８、３０５、３０６、３１０、３２０、３７４、３７５、３７６、４０７、４１９、４７５、及び、４７６からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、
    異なるアミノ酸残基による天然由来アミノ酸残基の前記置換は、安定性の尺度について１．５を超える性能指数を有し、かつ、活性の尺度について１．０を超える性能指数を有するα−アミラーゼ変異体を生じさせることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  3. 請求項１に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    ８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び、４８３からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含むことを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  4. 請求項１に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記変異体は、８３、１２５、１２８、１３１、１６０、１７８、１８２、１８３、１８５、１８９、２７９、３０５、３１９、３２０、３７９、４０７、４３３、４５３、４７５、４７６、及び、４８３からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、
    前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応するものであり、
    前記置換は、向上した洗浄性能、向上した洗剤安定性、向上した耐熱性、及び、向上したタンパク発現からなる群より選択される少なくとも１つの有益な効果を与えることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  5. 請求項１に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記変異体は、アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼの成熟形態であり、かつ、５、３２、８３、９５、１５４、２１４、２２１、２２８、３２２、４０１、４０７、４１９、４４４、４４７、４５９、４７０、４８３、及び、４８４からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、
    前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対応するものであり、
    異なるアミノ酸残基による天然由来アミノ酸残基の前記置換は、ｐＨ８における活性、ｐＨ１０における活性、１６℃における活性、及び、３２℃における活性について０．５以上の性能指数値と、洗剤中の安定性及び耐熱性について０．５以上の性能指数値とを有するα−アミラーゼ変異体を生じさせることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記異なるアミノ酸残基は、前記異なるアミノ酸残基が天然由来アミノ酸残基とは異なるという条件で、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及び、Ｙからなる群より選択されることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する位置１８０及び／又は位置１８１に欠失を含むことを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたα−アミラーゼ変異体であって、
    前記変異体は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応する位置１２８、１７８、１８２、１８５及び１８９からなる群より選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含み、
    前記置換によって向上した洗浄性能又は向上した洗剤安定性が与えられたものであることを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  9. 請求項１に記載のα−アミラーゼ変異体であって、
    前記α−アミラーゼ変異体は、
    （ａ）位置１２５のアラニン、位置１２８のシステイン、位置１３１のイソロイシン、位置１６５のイソロイシン、位置１７８のロイシン、位置１８２のグリシン、位置２０２のチロシン、位置３０５のアルギニン、位置３１９のトレオニン、若しくは、位置４７５のアルギニン、
    （ｂ）置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋと、Ｓ１２５Ａ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｆ２０２Ｙ、及び、Ｄ３１９Ｔからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる置換、又は、
    （ｃ）置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、置換Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は、置換Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋを含み、
    前記変異体は、位置１８０及び／若しくは位置１８１の欠失を選択的にさらに含み、
    前記位置は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対応することを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  10. 請求項１に記載のα−アミラーゼ変異体であって、
    位置４７５の置換を含むことを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  11. 請求項１０に記載のα−アミラーゼ変異体であって、
    前記α−アミラーゼ変異体は位置４７５のアルギニンを含むことを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  12. 請求項１０又は１１に記載のα−アミラーゼ変異体であって、
    位置１８０及び／又は位置１８１の欠失をさらに含むことを特徴とする単離されたα−アミラーゼ変異体。
  13. 請求項１〜１２のいずれかのα−アミラーゼ変異体をコードすることを特徴とする単離された核酸。
  14. プロモータとの作用可能な組み合わせで請求項１３に記載の単離された核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
  15. 請求項１４に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
  16. 請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体を含むことを特徴とする洗浄組成物。
  17. 請求項１６に記載の洗浄組成物であって、
    プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及び、ペルオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる酵素をさらに含むことを特徴とする洗浄組成物。
  18. 請求項１７に記載の洗浄組成物であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がプロテアーゼであることを特徴とする洗浄組成物。
  19. 請求項１８に記載の洗浄組成物であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がサブチリシンであることを特徴とする洗浄組成物。
  20. 請求項１９に記載の洗浄組成物であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がサブチリシンＢＰＮ′又はその変異体であることを特徴とする洗浄組成物。
  21. 請求項２０に記載の洗浄組成物であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がサブチリシンＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ又はその変異体であることを特徴とする洗浄組成物。
  22. 布又は硬表面を洗浄する方法であって、
    布又は硬表面を請求項１６に記載の洗浄組成物に接触させることを含むことを特徴とする方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、
    前記洗浄組成物が少なくとも１つの界面活性剤をさらに含むことを特徴とする方法。
  24. 請求項２２又は２３に記載の方法であって、
    前記洗浄組成物が、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及び、ペルオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる酵素をさらに含むことを特徴とする方法。
  25. 請求項２４に記載の方法であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がプロテアーゼであることを特徴とする方法。
  26. 請求項２５に記載の方法であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がサブチリシンであることを特徴とする方法。
  27. 請求項２６に記載の方法であって、
    前記少なくとも１つのさらなる酵素がＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌサブチリシンであることを特徴とする方法。
  28. 請求項２７に記載の方法であって、
    前記α−アミラーゼ変異体が、
    置換Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、
    置換Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は、
    置換Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋを含むことを特徴とする方法。
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