JP5665264B2 - 安定なｄ−ダイマー液体製剤 - Google Patents

Description

本発明は、血液凝固診断の分野であり、そしてコントロール又は検定の目的のための基準物質として適切である、Ｄ−ダイマー含有緩衝マトリックスで構成される液体製剤に関する

Ｄ−ダイマーは、凝固活性の検出のための重要な臨床検査用パラメータである。凝固の目的は血餅（血栓）の形成であり、それにより外傷の場合に、創傷を閉じることにより血液損失をできるだけ低い状態にする。血液中に遍在するフィブリノゲンの不溶性のフィブリンへの変換は、血餅形成の必須構成要素である。フィブリン前駆体であるフィブリノゲンは大きな分子量の二量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合により連結される三対の鎖（α鎖、β鎖及びγ鎖）から構成される。フィブリン形成は一連の酵素的タンパク質分解プロセスにより起こる。最初に、トロンビンがα鎖のＮ末端領域からフィブリノペプチドＡを切断し、次いでフィブリノペプチドＢをフィブリノゲンのβ鎖から切断し、それによりＤｅｓＡＡＢＢ−フィブリンがモノマー形態で生じる。これらの可溶性フィブリンモノマーは、自発的に重合して長繊維を生じ、そして最終的には密に枝分かれしたネットワークを生じ、この形態のフィブリンはまだ可溶性である。凝固因子ＸＩＩＩａ（Ｆ ＸＩＩＩａ）が最初にフィブリンのγ鎖に架橋して二量体を生じ、最終的にα鎖に架橋してポリマーを生じることによるＦ ＸＩＩＩａの活性により、このまだ比較的不安的なフィブリンが最終的に安定化される。凝固系のアンタゴニストとして作用する系はフィブリン溶解系であり、その目的はフィブリン塊を再溶解することであり、そしてそれにより例えば血管の再疎通を保証する。フィブリン溶解の間、フィブリノゲン及びフィブリンの両方がプラスミンによりタンパク質分解で切断され、今や再び水溶性である種々の切断生成物を生じる。フィブリノゲン及びフィブリンの分解産物は異なる。最も小さいフィブリン特有の分解産物はＤ−ダイマーであり、これはＦ ＸＩＩＩａにより共有結合されたＤドメインから構成される。従ってＤ−ダイマーはフィブリン溶解のマーカーとして適しており、そして凝固活性化の検出のための重要な診断パラメータである。従ってＤ−ダイマーを特異的に認識する抗体は、血管内凝固活性化の診断において使用される。血漿又は血清サンプル中のＤ−ダイマー抗原の定量的測定は、静脈血栓症及び肺塞栓症の排除のための情報を与え、そして播種性血管内凝固症候群の診断に使用される。

従来技術において、ヒトの血漿サンプル又は血清サンプル中のＤ−ダイマーの定量検出のための種々の試験手順が知られている。Ｄ−ダイマー特異的抗体は、ラテックス凝集アッセイのような免疫化学的手順又は酵素免疫測定法の両方の使用を可能にする。種々のＤ−ダイマー試験手順において、コントロール又は標準物質として非常に様々なＤ−ダイマー抗原濃度のＤ−ダイマー含有製剤、通例０.５ｍｇ／ｌ ＦＥＵ未満のＤ−ダイマーを含有する標準的測定範囲のためのコントロール、及び０.５ｍｇ／ｌ ＦＥＵより多いＤ−ダイマーを含有する病的測定範囲のためのコントロールを使用することが慣例である。ＦＥＵはフィブリノゲン当量単位を示し、そしてＤ−ダイマーに関して世界中で使用される最も慣用的な単位である。２ｍｇ／ｌ ＦＥＵのＤ−ダイマーは本明細書では１ｍｇ／ｌのＤ−ダイマーに相当し、この変換は、フィブリン形成及び続くフィブリン溶解後に１つのフィブリノゲン分子から２つのＤ−ダイマー分子が生じるという事実に基づく。

商業用Ｄ−ダイマー試験の品質コントロールのためのＤ−ダイマーコントロール又は標準物質は、通例は血漿マトリックスから構成され、そして大部分は安定化されたヒト血漿から製造されており、これに規定量のＤ−ダイマーが添加される。公知のように、Ｄ−ダイマーは、例えばヒト血漿を凝集活性化剤で処理し、続いてプラスミンで処理し、それにより最初にフィブリンが形成し、続いてフィブリン分解が誘導されることにより得ることができる。フィブリン分解によるこのいわゆる「血餅溶解」血漿において形成されるＤ−ダイマーを富化及び精製することができる。あるいは、Ｄ−ダイマーの獲得のために、純粋なフィブリノゲンを塩化カルシウム、Ｆ ＸＩＩＩａ及びトロンビンの添加により重合させてフィブリンを得ることもでき、続いてこれをプラスミンとのインキュベーションにより分解できる。

これらの既知のコントロール又は標準物質の大部分は、現在は充填後に安定性の理由から凍結乾燥される。しかし原理上は、適切な貯蔵寿命を有する液体の凍結乾燥していないＤ−ダイマーコントロール又は標準物質を製造することも可能である。Bio-Rad Laboratoriesは、例えばヒト血漿に基づく液体Ｄ−ダイマーコントロール（Liquichek^TM Ｄ−ダイマーコントロール、レベル１、２及び３）を供給し、その寿命は３年と表示される。Ｄ−ダイマーが安定化緩衝マトリクス中に存在している別の液体Ｄ−ダイマー含有製品は１８ヶ月の寿命を有していた。ここでは安定化は、ウシアルブミンのような一般的な非特異的安定化剤、及び、トロンビン又はプラスミンのようなセリンプロテアーゼの阻害剤としてのアプロチニンを用いて行われた。しかしながら、液体マトリクス中の検体の安定化に適したＤ−ダイマー特異的安定化剤又は手順は知られていない。

従って本発明が基づく目的はまた、Ｄ−ダイマーを含有し、かつ液体状態で適切な貯蔵寿命を有し、すなわち検体Ｄ−ダイマーの一定の回収を保証する製剤を提供することにある。

この目的は、請求項１に記載される製剤の供給により達成される。

本発明は、Ｄ−ダイマー、そしてさらにフィブリノゲンを含有する緩衝マトリクスで構成される製剤に関する。フィブリノゲンの添加により、３７℃の貯蔵温度で２４週まで適切に一定のＤ−ダイマーの回収を保証するＤ−ダイマー製剤が得られる一方、フィブリノゲンを全く添加していないＤ−ダイマー製剤では３７℃の貯蔵温度で１０週間後でさえももはや許容しうるＤ−ダイマーの回収ができないということが見いだされた。

本発明の製剤は緩衝マトリクスで構成されており、従って本質的に血漿マトリクスからなる製剤とは区別されるべきである。標準物質又はコントロールとして使用される血漿マトリクスに基づく製剤は、通例、正常又は欠損した血漿で構成され、従って内因性フィブリノゲンを含有する。緩衝マトリクスに基づく本発明の製剤は、内因性フィブリノゲンを全く含有せず、検体Ｄ−ダイマー及びフィブリノゲンが精製した形態又は部分的に精製した形態で添加される緩衝化溶液から本質的になる。緩衝マトリクスの製造には、５〜１０のｐＨ範囲において緩衝化作用を有する物質が特に適している。適切な物質は、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギニン緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びＴＲＩＳ緩衝液である。特に好ましい緩衝マトリクスは、約６〜９のｐＨを有するものである。

緩衝マトリクスで構成される本発明の製剤は、所望の純度及び濃度のＤ−ダイマーを含有する。優先的に、製剤中に含有されるＤ−ダイマーは、ヒト血餅溶解血漿由来、又は例えば塩化カルシウム、Ｆ ＸＩＩＩａ及びトロンビンの添加により重合されてフィブリンを生じ、続いてプラスミン、ウロキナーゼ若しくはエラスターゼ若しくはこれらの組み合わせとのインキュベーションにより分解された、純粋な、好ましくはヒトのフィブリノゲンの分解産物由来のＤ−ダイマーである。Ｄ−ダイマーの精製又は富化は、当業者に適切であると思われるあらゆる望ましい手順により行うことができる。Ｄ−ダイマーの所望の純度によって、炭水化物、脂質、核酸、タンパク質及び／又は他の生体分子のような不純物の分離を可能にする精製手順を使用することができる。公知のように、タンパク質の精製に使用される手順の例は、クロマトグラフィー分離手順、例えばイオン交換、ゲルろ過、疎水性相互作用、又はアフィニティクロマトグラフィーである。さらに、分取ゲル電気泳動、分取等電点電気泳動、クロマト分画、沈降及び超遠心分離法も、タンパク質混合物からのタンパク質の分離に使用することができる。優先的に、本発明の製剤は、約０.１〜約１００ｍｇ／ｌ ＦＥＵのＤ−ダイマーの最終濃度でＤ−ダイマーを含有する。

緩衝マトリクスへのＤ−ダイマーの添加は、Ｄ−ダイマーのさらなる精製又は富化をすることなく、例えばＤ−ダイマー含有血餅溶解血漿を、緩衝化水溶液と混合することにより行うこともできる。出発血漿を過剰の凝固活性化剤で処理し、それによりフィブリン形成が達成されるため、血餅溶解血漿はもはや内因性フィブリノゲンを全く含有していないはずである。しかし実際には、微量の内因性フィブリノゲン（仮にそれらが検出可能な場合に、本発明の製剤の安定性に対して決定的な影響を全く及ぼさない）が血餅溶解血漿中に存在し得るということは排除されない。優先的に、血餅溶解血漿のＤ−ダイマー濃度は、混合する前に決定され、そして血餅溶解血漿は、結果として生じる緩衝マトリクスにおいて所望のＤ−ダイマー濃度が達成されるように緩衝化水溶液で希釈される。しかし結果として生じる緩衝マトリクスは、１０体積パーセント以下の血餅溶解血漿を含有するにちがいない。従って本発明は、０から最大１０体積パーセントの血餅溶解血漿を含有する緩衝マトリクスで構成される製剤に関する。本発明の製剤は、最大で５体積パーセント、特に好ましくは最大で１体積パーセント、特に好ましくは最大で０.５体積パーセント含有する緩衝マトリクスで構成されるものが好ましい。

さらに、本発明の製剤を構成する緩衝マトリクスは、ヒト、動物（例えば、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ由来）又は組み換え起源のフィブリノゲンを含有する。優先的に、緩衝マトリクスに含有されるフィブリノゲンは、精製されたフィブリノゲンであり、市販でも入手可能である。純粋なフィブリノゲンの入手は、フィブリノゲンが天然に存在するか又は組み換えＤＮＡ技術により製造された有機原材料からのフィブリノゲンの精製を可能にする、当業者に適切と思われるあらゆる望ましい手順により行うことができる。フィブリノゲンの所望の純度により、炭水化物、脂質、核酸、タンパク質及び／又は他の生体分子のような不純物の分離を可能にする精製手順を使用することができる。フィブリノゲンの入手のための原材料は、例えば動物又はヒトの組織又は体液（例えば血液、血漿）、動物又はヒトの細胞培養物、又は真核細胞若しくは組み換えフィブリノゲンを発現している微生物（例えば細菌又は真菌）の培養物の、上清又は溶解産物であり得る。公知のように、タンパク質の精製に使用される手順の例は、クロマトグラフィー分離手順、例えばイオン交換、ゲルろ過、疎水性相互作用又はアフィニティクロマトグラフィーである。さらに、分取ゲル電気泳動、分取等電点電気泳動、クロマト分画、沈降及び超遠心分離法も、タンパク質混合物からのタンパク質の精製に使用することができる。優先的に、本発明の製剤を構成する緩衝マトリクスは、０.０２５ｇ／ｌより多くかつ最大で２.５ｇ／ｌの最終濃度、好ましくは０.１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ、特に好ましくは０.２ｇ／ｌ〜０.５ｇ／ｌの最終濃度のフィブリノゲンを含有する。

優先的に、本発明の製剤を構成する緩衝マトリクスは、安定化のための追加物質、例えば、酸化的分解の防止のための抗酸化剤若しくは還元剤、タンパク質分解過程の予防のためのプロテイナーゼ阻害剤、特に好ましくはアプロチニン、重金属イオンの排除のためのキレート剤又は微生物増殖を回避するための静菌剤及び殺真菌剤、特に好ましくはアジ化ナトリウムを含有することができる。吸着、表面による変性、熱変性、乾燥、反復凍結解凍のような物理的作用に起因する活性損失は、例えばグリセロール、炭水化物、アミノ酸、親水性ポリマー又は不活性タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオボアルブミンの添加により低減することができる。さらに、本発明の製剤は、いわゆる容積負荷剤（volume replacements）、例えばポリゲリン（polygeline）（Haemaccel（登録商標））を含有することもできる。

たとえ本発明の製剤の特定の利点が液体形態で特に安定であることであっても、貯蔵目的のために製剤を凍結乾燥することも可能である。

本発明のさらなる主題は、試験手順、特にヒト血清又は血漿サンプル中のＤ−ダイマーの定量的測定のための免疫化学的試験手順におけるコントロール又は標準物質としての本発明の製剤の使用である。特に好ましくは、本発明の製剤は、Ｄ−ダイマー抗原がモノクローナル抗体８Ｄ３により検出されるＤ−ダイマー試験手順のコントロール又は標準物質に使用される［抗体８Ｄ３については：Holvoet,P.et al.(1989) Binding properties of monoclonal antibodies against human fragment D-dimer of cross-linked fibrin to human plasma clots in an in vivo model in rabbits.Thrombosis and Haemostasis 61 (2):307-313を参照のこと］。優先的に、このためには多数の異なるＤ−ダイマー濃度の製剤が、正常（＜０.５ｍｇ／ｌ ＦＥＵ）及び病的に高い（＞０.５ｍｇ／ｌ ＦＥＵ）Ｄ−ダイマーレベルを区別するために調製される。

本発明はさらに、Ｄ−ダイマーを含有する本発明の製剤の製造のための方法に関する。本発明の方法において、Ｄ−ダイマー製剤は、液体緩衝マトリクス中のフィブリノゲン溶液と混合される（例えば、緩衝マトリクス中に溶解された、ヒト血餅溶解血漿由来の精製Ｄ−ダイマー）。特に好ましい実施態様において、製剤は、混合の後、限定された期間の間＋３０〜＋５０℃にてインキュベートされる。特に好ましくは、このインキュベーションは＋３７℃で行われる。このインキュベーション工程は、Ｄ−ダイマー液体製剤の安定化をもたらす。優先的に、このインキュベーションは４時間から７日間までの期間、特に好ましくは１２時間から３日間までの間行われ、その後この製剤を望ましい貯蔵温度（通例、冷蔵庫で＋２〜＋８℃）でさらなる使用まで何ヶ月も貯蔵することができる。

以下に記載される実施例は、本発明の個々の局面の典型的な解明に役立ち、制限と理解されるべきではない：

実施例１：小スケールでの本発明のＤ−ダイマー製剤の製造
Ｄ−ダイマーを得るために、血餅溶解血漿を正常ヒト血漿から、トロンビンを添加し、続いてウロキナーゼを添加することにより調製した。このようにして調製した血餅溶解血漿は1193mg／ｌ FEUのＤ−ダイマーを含有しており、そしてこれを緩衝マトリクスに基づく以下の製剤の製造のためのＤ−ダイマー製剤として使用した：
処方１：３mg／ｌ FEU Ｄ−ダイマー
50mM NaH₂PO₄
10ｇ／ｌのウシ血清アルブミン
0.1％(v／v) Tween（登録商標）20
80000KIU／ｌのアプロチニン
0.04％(w／v)アジ化ナトリウム
pH 6.9
処方２：３mg／ｌ FEU Ｄ−ダイマー
50mM NaH₂PO₄
10ｇ／ｌのウシ血清アルブミン
0.1％(v／v) Tween（登録商標）20
80000KIU／ｌのアプロチニン
0.04％(w／v)アジ化ナトリウム
0.25ｇ／ｌのヒト凝固性フィブリノゲン
（Sigma-Aldrich、カタログ番号：F4883）
pH6.9

それぞれ0.15Ｌの総体積を有する２つの処方は、本発明の処方２がさらに0.25ｇ／ｌのヒトフィブリノゲンを含有するということにおいてのみ異なる。

両方の製剤を室温で成分を混合した後ガラス容器に入れ、３日間＋３７℃でインキュベートした。続いて、製剤を＋２〜＋８℃(望ましい貯蔵温度)又は＋３７度(加速された貯蔵寿命データの生成のため)で貯蔵した。適切な貯蔵期間の後、Ｄ−ダイマー濃度を、Ｄ−ダイマー特異的抗体8D3によるラテックス凝集法の原理に基づくラテックス粒子促進免疫比濁試験(Innovance(登録商標）Ｄ−ダイマー試験、Dade Behring Marburg GmbH，Marburg，Germany)を使用する凝集分析機(BCS(登録商標）システム、Dade Behring Marburg GmbH，Marburg，Germany)で決定した。結果を図１及び２に示す(図１：フィブリノゲンを含まない液体緩衝マトリクス中のＤ−ダイマー(処方１)；図２：フィブリノゲンを含む液体緩衝マトリクス中のＤ−ダイマー(処方２)。

貯蔵寿命研究は、許容限度(最大、最小)間で出された許容範囲を容認基準と定義する場合に、フィブリノゲン含有Ｄ−ダイマー製剤が＋３７℃で２４週の貯蔵期間の間にそのＤ−ダイマー濃度の一定の回収を示すことを明白に示す。それぞれの許容範囲(＋／−２０％)を、時間０でプレインキュベーション後に回収されるＤ−ダイマー濃度により規定した。これと対照的に、フィブリノゲンを含まないＤ−ダイマー製剤(図１)は、＋３７℃で１０週の貯蔵時間後に容認できる貯蔵寿命許容範囲に達しない。このことは、フィブリノゲンが緩衝マトリクス中のＤ−ダイマーの貯蔵寿命を長くしているということを示す。

実施例２：＋３７℃でのプレインキュベーション有り及び無しでのＤ−ダイマー製剤の大スケール製造
本発明の製剤の＋３７℃でのプレインキュベーションの効果を調べるために、１０Ｌの処方２に従うフィブリノゲン含有Ｄ−ダイマー製剤(実施例１を参照のこと)を調製した。この製剤の一部を室温にて成分を混合した後１週間＋２〜＋８℃で貯蔵した。これと並行して、この製剤のさらに一部を＋３７℃で１週間貯蔵（プレインキュベート）した。続いて、各場合で、２つのバッチの一部を＋２〜＋８℃(望ましい貯蔵温度)又は＋３７℃(加速された貯蔵寿命データの生成のため)で貯蔵した。適切な貯蔵期間の後、Ｄ−ダイマー濃度を決定した(実施例１を参照のこと)。結果を図３及び図４に示す。

これらの結果は、緩衝マトリクス中のフィブリノゲン含有Ｄ−ダイマー製剤の＋３７℃でのプレインキュベーションの後、Ｄ−ダイマー濃度は調製時より確かに低いが、Ｄ−ダイマー濃度はプレインキュベーション後に開始時の値(０週)と比較して１６週の期間後に＋３７℃で３０％、そして４℃では２％しか減少しないことを示した(図４）。しかしプレインキュベーションしなかった同じ製剤では、Ｄ−ダイマー濃度は＋３７℃で１６週の期間の後５４％、そして４℃で１６週の期間の後１４％減少した(図３)。従って＋３７℃でのプレインキュベーション工程は、フィブリノゲン含有Ｄ−ダイマー製剤の貯蔵寿命を明確に測定可能なように長くする。

種々の貯蔵温度でのフィブリノゲンを含まない液体緩衝マトリクス中のＤ−ダイマーの貯蔵寿命(最大、最小：許容限度)。 種々の貯蔵温度での0.25ｇ／ｌのフィブリノゲンを含む液体緩衝マトリクス中の本発明の製剤におけるＤ−ダイマーの貯蔵寿命(最大、最小：許容限度)。 ＋３７℃で１週間(−１から０まで)プレインキュベーションを行わないが、＋２℃〜＋８℃でのインキュベーションを行い、続いて種々の貯蔵温度での0.25ｇ／ｌのフィブリノゲンを含む液体緩衝マトリクス中の本発明の製剤におけるＤ−ダイマーの貯蔵寿命。「−１週」の時点は、調製及び望ましい値の決定の時点に対応する（望ましい値＝破線)。 ＋３７℃で１週間(−１から０まで)プレインキュベーションを行い、続いて種々の貯蔵温度での0.25ｇ／ｌのフィブリノゲンを含む液体緩衝マトリクス中の本発明の製剤におけるＤ−ダイマーの貯蔵寿命。「−１週」の時点は、調製及び望ましい値の決定の時点に対応する（望ましい値＝破線)。

Claims (17)

1. Ｄ−ダイマーを含有する緩衝マトリクスで構成される組成物であって、該緩衝マトリクスがさらに０.１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの最終濃度でフィブリノゲンを含有する組成物。
2. フィブリノゲンがヒト又は動物のフィブリノゲンである、請求項１に記載の組成物。
3. 緩衝マトリクスが、０.２ｇ／ｌ〜０.５ｇ／ｌの最終濃度でフィブリノゲンを含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 組成物が液体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 緩衝マトリクスが、０.１〜１００mg／ｌ FEUのＤ−ダイマーを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. ウシ血清アルブミン、及び／又はプロテアーゼ阻害剤及び／又は界面活性剤及び／又は殺菌性作用及び／又は殺真菌性作用を有する添加剤をさらに含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 殺菌性作用及び殺真菌性作用を有する添加剤がアジ化ナトリウムである、請求項６に記載の組成物。
8. 緩衝マトリクスが、０から最大１０体積パーセントの血餅溶解血漿を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 緩衝マトリクスが、最大５体積パーセントの血餅溶解血漿を含有する、請求項８に記載の組成物。
10. Ｄ−ダイマーの測定のための試験手順のコントロール又は検定のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤ−ダイマー含有組成物の使用。
11. モノクローナル抗Ｄ−ダイマー抗体8D3を使用する、Ｄ−ダイマーの測定のための抗体を基にした試験手順のコントロール又は検定のための、請求項１０に記載の使用。
12. Ｄ−ダイマーを含有する請求項１に記載の組成物の製造のための方法であって、Ｄ−ダイマー溶液が緩衝化フィブリノゲン水溶液と混合される方法。
13. 混合の後、組成物が限定期間の間３０〜５０℃でインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
14. 混合の後、組成物が限定期間の間３７℃でインキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
15. 混合の後に組成物が３０〜５０℃で４時間〜７日間インキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
16. 混合の後に組成物が３０〜５０℃で１２時間〜３日間インキュベートされる、請求項１２に記載の方法。
17. Ｄ−ダイマーを含有する緩衝マトリクスで構成される組成物の安定化のための、ヒト又は動物起源のフィブリノゲンの使用であって、組成物をフィブリノゲンと混合する工程、および混合の後、組成物を限定期間の間３０〜５０℃でインキュベートする工程を含む、使用。

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