JP5688788B2 - 遺伝子改変による致死性表現型を持つ動物の繁殖用ファウンダー動物作製法 - Google Patents

Description

本発明は、生体内で所望の細胞由来の臓器を作製するために用いられる繁殖用の動物およびその作製方法に関する。

細胞移植あるいは臓器移植といった形での再生医療を論じる上で、多分化能を有する幹細胞への期待は大きい。胚盤胞期受精卵の内部細胞塊より樹立されたＥＳ細胞は、多分化能を持ち、種々の細胞分化の研究に用いられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれを特定の細胞系譜に分化誘導する分化制御法の開発は再生医学研究のトピックである。

胚性幹（ＥＳ）細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化研究では胚発生初期に分化してくる血球、血管、心筋、神経系などの中胚葉、外胚葉系へは分化しやすい。しかしながら、胚発生中期以降に細胞間相互作用を通じて複雑な組織形成へと向かう器官への分化は難しいという一般的な傾向が知られている。

例えば、哺乳類の成体腎臓である後腎は胚発生中期に中間部中胚葉より発生する。具体的には後腎間葉細胞と尿管芽上皮という２つのコンポーネントの相互作用により腎臓発生は始まり、最終的に数十種類という他臓器には見られない程の多種類の機能細胞への分化とそれらによる糸球体・尿細管を中心とした複雑なネフロン構造の構成により、成体腎臓が完成する。腎臓の発生時期とその過程の複雑さから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＳ細胞から腎臓を誘導することが非常に手間のかかる難仕事であることは容易に推察でき、事実上不可能であると考えられている。また、腎臓などの臓器では体性幹細胞の同定はいまだ確定的なものではなく、一時盛んに研究された骨髄細胞の障害腎臓修復過程への寄与もさほど大きいものではないということが判明しつつある。

多分化能を有するＥＳ細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すれば産生個体はキメラマウスを形成する。Ｔ細胞、Ｂ細胞系譜を欠損するＲａｇ−２ノックアウトマウスに対して、この技術を応用した胚盤胞補完作用（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によるＴ細胞、Ｂ細胞系譜のレスキュー実験が過去に報告されている（非特許文献１）。このキメラマウス・アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系の存在しないＴ細胞系譜の分化を確認するｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系として用いられている。

本発明者らは、上記技術に関連して臓器再生方法として、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／ ５１１２９を出願した（特許文献１：ＷＯ／２００８／１０２６０２）。しかし、ここで用いられている方法は、一代限りのものであり、臓器を再生するごとに、煩雑な作業を繰り返す必要がある。

したがって、より効率よい臓器再生を実現するためには、恒常的に臓器再生を可能にする技術を開発する必要がある。
国際出願公開２００８／１０２６０２パンフレット Ｃｈｅｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．４５２８−４５３２，１９９３

本発明は、産業用に適する臓器再生の技術を提供することを課題とする。

本発明は、胚盤胞補完方法において、発生した胚盤胞にＥＳ細胞または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を注入することで、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出し、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出したことによって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることを明らかにし、上記課題を解決するに至った。

本発明においては、例えば、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分の欠損を特徴とするノックアウトマウスおよびトランスジェニック動物（例えば、マウス）中に、多能性幹細胞としてたとえばマウスなどのＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を移植して、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分を補いファウンダーとして効率的に産仔を得ることができることを見出した。

本発明においては、遺伝子型決定（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の結果より膵臓が補われたノックアウトマウスは正常に成体へと育つことがわかった。補われたノックアウト（ＫＯともいう。）マウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられるＫＯとヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであるところ、実際にそのようになったことを見出した。

このことから、例えば、膵臓、腎臓などの臓器または身体部分を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析が顕著に行いやすくなると思われる。

臓器、腎臓などの臓器または身体部分欠損を誘発する導入遺伝子を卵細胞に入れ、この後、移植するのが従来のトランスジェニック（Ｔｇ）動物作製法である。この手法では、臓器を欠損する表現型を持つ動物は、その臓器が生存に必須である場合は出生後死んでしまう。そこで、発生した胚盤胞にＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を注入することで、膵臓の欠損を補うと、次世代が誕生することを見出した。しかも、膵臓が補われたトランスジェニック動物はファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能であることをも見出した。したがって、このようなファウンダーを用いて、臓器再生を行うことができることが明らかになった。

いったんある臓器について、本発明の方法が適用することができることがわかると、その臓器については、成功した事例に基づいて適宜変更を加えて応用することができることが理解される。その理由は以下のとおりである。適切な欠損動物が存在すれば、本明細書に示されるように蛍光などで標識されたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用い、あるいは、標識がなされた欠損動物と標識がされていないまたは別の標識がされた多能性幹細胞を用い、同様の解析方法を適用すれば構築された臓器がホスト由来かＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等由来かは明らかとなり、臓器構築の可否を判定でき、同様の理論で、次世代の動物を再生産させることができることが理解されるからである。

したがって、本発明は、以下を提供する。

１つの局面において、本発明は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物を提供する。

１つの実施形態において、前記補完された臓器または身体部分は標識されたものである。

１つの実施形態において、本発明の動物を生産する方法は、
Ａ）前記欠損原因遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；
Ｃ）該胚盤胞中に、前記欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；
Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器またはその身体部分が補完されたものを選択する工程
を包含する。

１つの実施形態において、前記第一多能性幹細胞は、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚である。

１つの実施形態において、前記遺伝子は外来遺伝子であり、前記Ａ）工程は、前記第一多能性幹細胞に該外来遺伝子を導入することを包含する。

１つの実施形態において、前記第二多能性幹細胞は、卵細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。

１つの実施形態において、前記Ｄ）工程は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて前記個体を生産することを包含する。

１つの実施形態において、前記選択は、前記第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することによって達成される。

１つの実施形態において、前記第二多能性幹細胞は標識されたものであり、前記選択は、該標識を同定することを包含する。

別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
Ａ）請求項１に記載の動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
Ｂ）該動物から卵子を得、該卵子を胚盤胞に成長させる工程；
Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する方法を提供する。

１つの実施形態において、前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を該非ヒト宿主哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する。

１つの実施形態において、前記目的多能性幹細胞はＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。

１つの実施形態において、前記目的多能性幹細胞はマウス由来である。

１つの実施形態において、前記目的の臓器または身体部分は膵臓または腎臓である。

１つの実施形態において、前記動物はマウスである。

１つの実施形態において、前記マウスはＰｄｘ−１ノックアウトマウスまたはＰｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスなどである。

１つの実施形態において、前記目的の臓器または身体部分は、完全に前記目的多能性幹細胞由来のものである。

別の局面において、本発明は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物の、該臓器または身体部分の製造のための使用を提供する。

別の局面において、目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、Ａ）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、動物と、Ｂ）該目的の臓器または身体部と同種の細胞とを備える、セットを提供する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の動物を生産するための、多能性幹細胞と、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子をコードする核酸との組み合わせ、あるいは、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を有する多能性幹細胞と該遺伝子を有しない細胞との組み合わせの、使用を提供する。

本発明により、産業用に適する臓器再生の技術が提供された。

例えば、ファウンダー動物生産技術の確立により、従来の方法では維持が困難であった遺伝子改変（ノックアウトもしくはトランスジェニック）動物の効率的な生産が可能となる。さらに、作製されたファウンダー動物を用いることで、遺伝子改変された胚もしくは新生児を用いた操作（臓器再生等を目的とした研究）がより一層効率的に行えるようになる。あるいは、トランスジェニック動物では作製に煩雑な手間がかかるのにも拘らず、遺伝子導入を行った一世代目において致死性の表現型が現れると同様の遺伝子挿入位置、コピー数をもつ動物の解析は１回しか行えないという欠点があった。しかし、この方法を適用することで、本来致死であるはずの一世代目の生存が可能となり、次世代へ全く同様の表現型を伝搬できるため、致死のメカニズムを明らかにするというような解析を完全にクローナルなコロニーで行うことができる。これにより、作製されたファウンダーマウスを用いた解析を目的とした実験が可能となった。これは、従来技術ではまったく不可能であった技術であるといえる。

Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎにより膵臓が補われたノックアウト（ＫＯ）マウスの誕生のスキームを示す。 Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇの結果より膵臓が補われたノックアウトマウスは正常に成体へと育つことがわかったことを示す。上パネルには、末梢血中のホスト由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を示す。左下にはその結果を示す。この方法により明らかにされたマウスの割合が示されており、このデータでは計２２匹中ファウンダーとなりうるＫＯ個体は４匹いた。右に示したのはそれぞれの個体についてのキメラ率である。末梢血中のＧＦＰ（＋）細胞の割合を示すことによって分析した。 ＥＳ細胞由来膵臓は生体内で膵臓の機能マーカーを発現している（新生児期に解析）ことを示す。上から膵臓の機能マーカー、ＧＦＰ、併合図（Ｍｅｒｇｅｄ）を示す。左から順番に外分泌組織マーカーのαアミラーゼ、内分泌組織マーカーのインスリン、グルカゴン、ソマトスタチンを示し、右には、膵管マーカーのＤＢＡレクチンを示す。 膵臓が補われたマウスは血糖値の調節も正常に行えることを示す。左には、定常状態における血糖値を示す。右には、糖負荷試験後の血糖値の変遷を示す。糖負荷後１５，３０，６０，１２０分後に血糖値測定した。 ＥＳ細胞により膵臓を補われたノックアウトマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。左上に示すように、ｗｔ／Ｐｄｘ１−ＬａｃＺ個体と交配させた。これの産仔の解析を行い、Ｐｄｘ１対立遺伝子の解析を行ったものを右に示す。下には、実際の解剖写真を示す。 Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ による膵臓再生を示す。上パネルには、導入したベクターの構造を示す。パネルの右には、見分け方を記載する。Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。右下には、膵臓が補われたトランスジェニックマウスを示す。Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウスを用いてＥＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能であることが明らかになった（左下の表は結果を示す。）。 トランスジェニック作製技術とＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎを組み合わせたファウンダートランスジェニックマウス作製への戦略スキームを示す。過排卵誘起したメスマウスとの交配をおこなって卵細胞を得、前核期卵への遺伝子導入（ここでは、導入するトランスジーン（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１））を行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養を行う。生存卵子へのＥＳ細胞の注入を行い、仮親子宮への胚移植を行う。出生産仔のＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行い、ファウンダーマウスが生成される。膵臓が補われたトランスジェニックマウスはファウンダーとして次世代に表現型を伝えることが可能である。 ファウンダートランスジェニックマウスの作製への試みを示す。左から、前核注入卵子、生存卵子数、胚盤胞数、ＥＳ細胞注入胚数、移植胚数、生存産仔数、トランスジェニックの個体数および必要に応じて割合を示す。キメラは毛の色で判断した。ドナーのＥＳ細胞は１２９系統マウス（アグーチ）由来、ホストの胚はＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来のため体毛が生えそろえばキメラかどうかは判断可能である。 膵臓を補われたトランスジェニックマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック−キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくるはずであるからである。ここでは、＃３７のマウスがファウンダーとして機能することを示す。右には産仔の解析の導入遺伝子の確認を行い、下パネルには、実際の写真を掲載する。＃３７は作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したと考えられる。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーが作製可能である。 胚盤胞補完によるｉＰＳ細胞由来の膵臓構築を用いた治療モデルを示す。 ａ．はＧＦＰマウス由来ｉＰＳ細胞樹立のストラテジーを示す。ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ ｔｉｐ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立を行った後、３因子（初期化因子）を導入し、２５〜３０日間ＥＳ細胞用培地にて培養し、ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株を樹立した。ｂ．は、樹立されたｉＰＳ細胞の形態をその形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影したものを示す。左は、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２のものを、右には＃３を示す。ｃ．は、アルカリフォスファターゼ活性の測定を示す。ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社 Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。左から明視野像、ＧＦＰ蛍光像およびアルカリフォスファターゼ染色を示す。ｄ．は、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによる導入された３因子（初期化因子）の特定を示す。ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った結果である。上からＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏｇの遺伝子の発現を示す。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ（４因子のもの）、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）のものを示す。一番右には蒸留水での結果を示す。本発明において用いたｉＰＳ細胞における３因子の挿入が確認された。ｅ．は、ＲＴ−ＰＣＲによる本発明で用いた細胞におけるＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンの解析と導入遺伝子の発現確認を示す。上からＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃである。Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｇａｐｄｈの遺伝子の発現を示す。一番下には、ネガティブコントロール（ＲＴ（−））を示す。Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４については、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡとトランスジェニック（Ｔｇ）とを分けて発現を確認した。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）およびさらにコントロールとしてのＴＴＦ（ネガティブコントロール）の発現の様子を示す。一番右には蒸留水での結果を示す。ｆ．は、ｉＰＳ細胞を用いたキメラマウス作製を示す。樹立されたｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ６とＢＤＦ１系統のマウスの交配により得られた胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した結果を示す。上には、胎生１３．５日目の明視野像（左）ＧＦＰ蛍光像（右）を示す。下には、新生児期のものを示す。ＮＣと記載しているのはネガティブコントロールである。 図１１Ａは、胚盤胞補完により構築された膵臓の形態（出生後５日目）を示す。Ｈｏｍｏのマウスでは膵臓の辺縁がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されているが、ｈｅｔｅｒｏマウス膵臓ではドット状のキメラになっている。 図１１Ｂは、ｉＰＳ細胞由来膵臓の組織学的な解析（出生後５日目）を示す。ここでは、ｉＰＳ細胞由来の膵臓の凍結切片標本を作製し、核染色としてＤＡＰＩおよび抗ＧＦＰ抗体、抗インスリン抗体による染色を施し、正立蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡により観察、撮影した。左から明視野像、ＧＦＰ＋ＤＡＰＩの像、および右側には抗インスリン抗体による染色を示す。上パネルは、本発明のＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}にＧＦＰ−ｉＰＳ細胞を導入したものを示し、下パネルにはコントロールであるＰｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}にＧＦＰ−ｉＰＳ細胞を導入したものを示す。 ｉＰＳ細胞により膵臓を補われたノックアウトマウスはファウンダーとして次世代にその表現型を伝えられることを示す。左上に示すように、ｗｔ／Ｐｄｘ１−ＬａｃＺ個体と交配させた。これの産仔の解析を行い、Ｐｄｘ１対立遺伝子の解析を行ったものを右に示す。 Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎによる腎臓再生を示す。Ｓａｌｌ１対立遺伝子の遺伝子型判定結果を上に示す。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。下には、＃３マウスをホストとしてｉＰＳ細胞による胚盤胞補完を行い再生された腎臓の形態（生後１日目）を示す。ホモのＫＯマウスでは、腎臓全体がきれいにＧＦＰ陽性細胞で構成されていることが分かる。Ｓａｌｌ１ノックアウトマウスを用いてｉＰＳ細胞由来の腎臓を作ることが可能であることが明らかになった。

配列番号１ 注入された胚由来の細胞同定用のフォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＡＣ
配列番号２ 注入された胚由来の細胞同定用のリバース１（Ｒｖ１）プライマー：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ
配列番号３ 注入された胚由来の細胞同定用のリバース（Ｒｖ２）プライマー：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ
配列番号４ トランスジーン検出用フォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧ
配列番号５ トランスジーン検出用リバース（Ｒｖ）プライマー：ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
配列番号６ Ｏｃｔ３／４検出用Ｆｗプライマー（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）：ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ
配列番号７ Ｏｃｔ３／４検出用Ｒｖプライマー（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＡ
配列番号８ Ｋｌｆ４検出用Ｆｗプライマー（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）：ＧＣＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ
配列番号９ Ｋｌｆ４・Ｓｏｘ２・ｃ−Ｍｙｃ検出用Ｒｖプライマー（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）：ＴＴＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
配列番号１０ Ｓｏｘ２検出用Ｆｗプライマー（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）：ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＧ
配列番号１１ ｃ−Ｍｙｃ検出用ＦＷプライマー（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）：ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＣ
配列番号１２ 注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）検出用フォワードプライマー：ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＧ
配列番号１３ 注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）検出用フォワードプライマー：ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣ
配列番号１４ 注入された胚由来の細胞（ｍｕｔａｎｔ）リバースプライマー：ＡＴＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＣ
配列番号１５ 注入された胚由来の細胞（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）検出用リバースプライマー：ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＧ

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

本明細書において「ファウンダー」生物または「ファウンダー」動物とは、次世代以降に所望の形質（特に、臓器等の欠損）を維持したまま生存させることができる生物または動物をいう。

本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる」とは、ある要因について、その要因が機能すると、ホストである動物がまったく生存できずに死ぬか、あるいは、生きることはできるが、成長困難であるとか生殖困難であるなどの理由で、その後の生存が実質的に不可能になることをいい、当該分野において通常の知識を用いて理解することができる。

本明細書において、「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分」とは、ある因子について言及するとき、その因子により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となるものをいう。例えば、外来遺伝子の場合、その遺伝子が生物に導入され、その遺伝子が正常に発現すると、ある臓器または身体部分に欠損が生じ、その結果生存し得ないまたは生存困難となることをいう。生存困難とは、次世代に子孫を残せないことを含む。臓器または身体部分としては、例えば、膵臓、腎臓などを挙げることができるがそれらに限定されない。

本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする（欠損原因）遺伝子」または「欠損原因遺伝子」は、交換可能に用いられ、ある遺伝子について言及するとき、その因子が機能（例えば、外来遺伝子の場合、導入され発現されるか、あるいは内因性の場合そのような遺伝子が機能する条件にさらされることなど）により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となる遺伝子をいう。

本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の内臓を構成する器官一般を指す。

本明細書において「身体部分」とは、身体のいずれかの部分を指し、一般に臓器と称されないものをも含む。例えば、腎臓を例に取ると、正常な遺伝子を有するときには完全な腎臓が生成されるが、ある遺伝子が欠損または異常を有すると、腎臓のような器官はできるものの、その一部に異常ないし欠損が生じるようなことがあり、そのような異常ないし欠損が生じる部分がこの「身体部分」の例であるといえる。遺伝子の欠損ないし異常が必ずしも臓器ごとに対応しておらず、その一部に影響があることが頻繁にあることから、遺伝子との対応関係を考える場合は、身体部分での対応を考慮したほうがよいこともあり、本明細書においてもそのような対応関係をも考慮することとする。

本明細書において「胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは、多分化能を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すると産生個体はキメラマウスを形成する現象を利用して、欠損している臓器または身体部分を補完させる技術をいう。このような技術の基本的手法については、特許文献１などを参照することができる。

本明細書において「標識」とは、補完された臓器を宿主から識別するために使用される因子をいう。したがって、臓器のみ、宿主のみを標識してもよく、両方を別の峻別可能なもので標識してもよい。

本明細書において「第一多能性幹細胞」とは、ファウンダー動物の宿主（本明細書中ホストともいう。）となるべき起源として使用される多能性幹細胞またはそれに由来する細胞塊をいい、好ましくは、受精卵・胚が使用される。

本明細書において「第二多能性幹細胞」とは、生産すべき臓器を目的として使用される多能性幹細胞をいう。

本明細書において「欠損を補完する能力を有する」とは、因子または遺伝子等について言及するとき、臓器または身体部分を補うことができる能力をいう。

本明細書において「キメラ胚盤胞」とは、第一多能性幹細胞由来の細胞と、第二多能性幹細胞由来の細胞とがキメラ状態となって形成される胚盤胞をいう。

（分子生物学）
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。

本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン塩基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。

本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子（例えば、Ｓａｌｌ１、Ｐｄｘ−１など）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

本明細書において、特定の遺伝子配列にハイブリダイズする核酸配列も、機能を有する限り使用することができる。ここで、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔ_ｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメータによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。

代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ^＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ^＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。

本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。

本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。

本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、Ｓａｌｌ１、Ｐｄｘ−１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、腎臓欠損、膵臓欠損など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、腎臓欠損、膵臓欠損など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。

本発明の実施の形態を具体的に説明することを目的として、以下に例示的な実施形態を記載する。

（繁殖用のファウンダー動物の生産方法）
本発明の一つの局面は、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物に関する。

この動物（本明細書において「ファウンダー動物」ともいう。）を用いて、次世代動物を生産することによって、目的の臓器を欠損させて、その臓器について、所望のゲノム型を有する臓器を生産することができる。しかも、この方法で生産すると、次世代においても臓器生産をすることができることが判明していることから、本発明の産業用の応用への道が大きく開けることになった。

本発明のファウンダー動物において使用される「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分」とは、ある因子について言及するとき、その因子により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となるものであれば任意のものを使用することができる。例えば、外来遺伝子の場合、その遺伝子が生物に導入され、その遺伝子が正常に発現すると、ある臓器または身体部分に欠損が生じ、その結果生存し得ないまたは生存困難となることをいう。生存困難とは、次世代に子孫を残せないことを含む。臓器または身体部分としては、例えば、膵臓、腎臓などを挙げることができるがそれらに限定されない。

そのような事象に関連する遺伝子としては、例えば、Ｐｄｘ−１（これに対する膵臓）、Ｓａｌｌ１（これに対する腎臓）、などを挙げることができる。

なお、臓器生産用とするには、臓器を補完し、かつ、それ以外の要因（母親マウスからミルクが摂取できない等）により出生後死んだりするようなことのない遺伝子を選択すべきである。そのような遺伝子としては、Ｐｄｘ−１を挙げることができる。このような性質を有する遺伝子を用いて、本願発明を実施することができる。そして、例えば、表現型が膵臓の欠損と同様であっても意味合いは大きく異なり、具体的にはノックアウトでは生産効率の向上、トランスジェニックではそれに加えて、致死表現型のクローナルな解析を可能にするという特徴がある。

本明細書において「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる」とは、ある要因について、その要因が機能すると、ホストである動物がまったく生存できずに死ぬか、あるいは、生きることはできるが、成長困難であるとか生殖困難であるなどの理由で、その後の生存が実質的に不可能になることをいい、当該分野において通常の知識を用いて理解することができる。このような例は、もともとそのような遺伝的特徴を有する臓器等を有するもののほか、そのような特徴を有する遺伝子を導入することによって、生産することができる。

本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の内臓を構成する器官一般を指す。ファウンダー動物としては、特に、存在しないと次世代が通常は生存しないような臓器、たとえば、腎臓、膵臓などが想定されるが、これら以外も本発明の範囲に入ることが理解される。

本明細書において「身体部分」とは、身体のいずれかの部分を指し、一般に臓器と称されないものをも含む。例えば、腎臓を例に取ると、正常な遺伝子を有するときには完全な腎臓が生成されるが、ある遺伝子が欠損または異常を有すると、腎臓のような器官はできるものの、その一部に異常ないし欠損が生じるようなことがあり、そのような異常ないし欠損が生じる部分がこの「身体部分」の例であるといえる。遺伝子の欠損ないし異常が必ずしも臓器ごとに対応しておらず、その一部に影響があることが頻繁にあることから、遺伝子との対応関係を考える場合は、身体部分での対応を考慮したほうがよいこともあり、本明細書においてもそのような対応関係をも考慮することとする。たとえば、身体部分とは、膵臓の一部であるランゲルハンス島、腎臓の一部である糸球体などを挙げることができるがそれらに限定されない。

本明細書において「胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは、多分化能を有するＥＳ細胞などの多能性幹細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すると産生個体はキメラマウスを形成する現象を利用して、欠損している臓器または身体部分を補完させる技術をいう。本発明者らは、困難と考えられていた胚盤胞補完について、腎臓、膵臓、毛および胸腺などの複数種の細胞からなる複雑な細胞構成を有する哺乳動物の臓器を、動物、特に非ヒト動物の生体中で作製することができることを見出しており（特許文献１）、この技術は、本発明において全面的に利用することができる。

本明細書において「標識」とは、補完された臓器を宿主から識別するために使用される限りどのような因子でもよい。したがって、臓器のみ、宿主のみを標識してもよく、両方を別の峻別可能なもので標識してもよく、例えば、補完されるべき臓器にのみ特定の遺伝子（例えば、蛍光タンパク質を発現する遺伝子など）を発現するようにすることにより、その特定の遺伝子に起因する性質（例えば、蛍光）によって補完されるべき臓器を、補完の宿主から識別することができる。あるいは、宿主のみを同様に標識し、補完された臓器に対応する細胞については別の標識または標識なしで識別することもできる。このようにして、外部の細胞由来の細胞が補完によって完全な動物となったのか、内部の細胞由来の細胞が補完されて完全な動物になったのかを区別することができ、これにより、より簡単に本発明のファウンダー動物を選択することができる。この細胞は、移植する前に、特異的に検出するための蛍光タンパク質を発現可能な状態で組み込んでもよい。例えば、その様な検出用の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの遺伝子変異体、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４（Ｂｅｖｉｓ Ｂ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｌｉｃｋ Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）を、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御によりほぼ全身臓器に発現するように配列設計し、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）によりＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に組み込むことができる。この様な移植用の細胞に対する蛍光による標識を行うことにより、製造された臓器が移植された細胞のみから構成されているか否かを容易に検出することができる。

そのような標識の例としては、上記の他、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、その他蛍光タンパク質およびＬａｃＺなどを挙げることができる。

別の局面では、本発明は、本発明のファウンダー動物を生産する方法であって、Ａ）前記遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器またはその一部が補完されたものを選択する工程を包含する方法を提供する。

本発明のファウンダー動物の生産方法において使用される「機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする（欠損原因）遺伝子」（または「欠損原因遺伝子」）は、その因子が機能すること（例えば、外来遺伝子の場合、導入され発現されるか、あるいは内因性の場合そのような遺伝子が機能する条件に晒されることなど）により、臓器または身体部分が欠損または機能不全（例えば、正常でない）となると、生存することができないか、生存が困難となる遺伝子であれば、任意のものを使用することができる。そのようなものの代表例としては、例えば、Ｐｄｘ−１（これに対する膵臓）、Ｓａｌｌ１（これに対する腎臓）などを挙げることができる。

本発明において使用される「多能性幹細胞」とは、卵細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｍＧＳ細胞）などを挙げることができる。ファウンダー動物の生産の原理は、いったんＥＳ細胞において証明されたならば、他の多能性幹細胞においても応用可能であるからである。それが証拠に、本発明においては、同様の手法を用いてｉＰＳ細胞を用いてファウンダー動物生産およびそれを用いた臓器生産の方法に成功したことが証明されている。

本発明のファウンダー動物細胞において使用される「第一多能性幹細胞」は、ファウンダー動物のホストとなるべき起源として使用される多能性幹細胞またはそれに由来する細胞塊であれば、どのような細胞等を使用してもよく、好ましくは、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚などが使用される。

本発明において使用される「第二多能性幹細胞」とは、生産すべき臓器を目的として使用される多能性幹細胞であって、第一多能性幹細胞とキメラ胚盤胞を形成して成長することができる細胞である限りどのような細胞であってもよく、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用いることができる。

本発明において使用される「欠損を補完する能力を有する」「因子」または「遺伝子」等は、臓器または身体部分を補うことができる因子または遺伝子等であれば、いかなる公知のものを使用してもよいことが理解される。

本発明において使用される「キメラ胚盤胞」は、第一多能性幹細胞由来の細胞と、第二多能性幹細胞由来の細胞とがキメラ状態となって形成される胚盤胞をいい、例えば、注入法のほか、いわゆる「凝集法」といった胚＋胚、もしくは胚+細胞をシャーレ内で密着させキメラ胚盤胞を作製する方法などを利用することによって生産することができる。また、本発明においてはレシピエントとなる胚と移植される細胞との関係は、同種の関係であっても異種の関係であってもよい。このような異種間でのキメラ動物作成は、従来より当該技術分野において多数の報告がなされており、例えばラット−マウス間のキメラ作出（Ｍｕｌｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ．２７６，３７９−３８１（１９７３）；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２４３，４７２−４７３（１９７３）；Ｔａｃｈｉ，Ｓ．＆Ｔａｃｈｉ，Ｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０，１８−２７（１９８０）；Ｚｅｉｌｍａｒｋｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１１５−１１６（１９７３））、ヒツジ−ヤギ間のキメラ作出（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４））など、近縁の動物種間での胚胞キメラ動物が実際に報告されている。したがって、本発明において、例えばヒト以外の哺乳動物細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合には、これらの従来から知られているキメラ作出方法（例えば、移植する細胞を、レシピエントとなる胚盤胞中に挿入する方法（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４）））に基づいて、異種のある臓器をレシピエントとなる胚中で作成することができる。

本発明のファウンダー動物の生産方法において、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子（または、欠損原因遺伝子）を有する第一多能性幹細胞を提供する工程は、例えば、その遺伝子を持っている多能性幹細胞を調達するか、あるいは、多能性幹細胞中に、その遺伝子を導入してその遺伝子を有する多能性幹細胞を生産することによって実施することができる。このような遺伝子の導入方法は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜選択してこのような遺伝子導入を実施することができる。好ましくは、エレクトロポレーションを用いるとよい。それは、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、ＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換すなわち目的遺伝子の導入を起こすことから、その後のダメージが少ないなどということが理由として挙げられるが、それに限定されない。

本発明のファウンダー動物の生産方法において、第一多能性幹細胞（例えば、受精卵、胚など）を胚盤胞に成長させる工程は、多能性幹細胞を胚盤胞にするための任意の公知の成長方法により実施することができる。そのような条件は当該分野において周知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（本明細書において参考として援用される）に記載される。

本発明のファウンダー動物の生産方法において、胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程は、第二多能性幹細胞を胚盤胞に導入することができる限り、当該分野において公知のどのような方法を用いてもよい。そのような手法としては、例えば、注入法もしくは凝集法が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のファウンダー動物の生産方法において、キメラ胚盤胞から個体を生産する方法は、当該分野において公知の手法を用いることができる。通常は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて仮親の胎内で成長させるがこの手法に限定されない。

本発明のファウンダー動物の生産方法において、臓器またはその身体部分が補完されたものを選択することは、その臓器または身体部分の補完を確認しうる任意の手法を用いて実施することができる。

そのような手法の例としては、第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することを挙げることができる。本明細書において「識別子」とは、ある個体または種などを特定し、由来を同定することができる任意の因子をいい、略称として「ＩＤ」とも称される。そのような識別子は、例えば、第二多能性幹細胞に特有のゲノムの配列であり得る。あるいは、このような選択は、第二多能性幹細胞として、標識されたものまたは標識されうるもの（遺伝子発現によって標識となるものも含む）を用い、本発明のファウンダーマウスの生産方法における選択を、該標識を同定することによって実施することができる。このほかにも、適宜当業者は、この手法を改善して実施することができることが理解される。

（ファウンダー動物を用いた臓器再生方法）
別の局面において、本発明は、目的の臓器または身体部分を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）ファウンダー動物を提供する工程であって、ファウンダー動物における欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；Ｂ）該動物から卵子を得、胚盤胞に成長させる工程；Ｃ）該胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；およびＤ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程を包含する。

ここで、このＤ）工程は、前記キメラ胚盤胞を該動物（倫理上好ましくは、非ヒト宿主哺乳動物）の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することによって実施することができる。

（膵臓の形成）
膵臓の形成については、肉眼的所見、染色後の顕微鏡観察、あるいは蛍光を利用した観察などの方法を用いた、マクロまたはミクロの形態学的解析、遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。

例えば、肉眼的所見を行うことにより、実際に臓器が存在するか否か、臓器の外観などの特徴を調べることができる。この様なマクロの形態学的解析とあわせて、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的組織染色後の組織を顕微鏡によりミクロ的に観察することもできる。このようなミクロ的な観察により、具体的な膵臓内部の様々な細胞の構成まで含めて調べることができる。

さらに、条件に応じて蛍光を発する様に蛍光を使用した遺伝子発現解析を行うことも可能である。例えば、本明細書中の実施例において記載されるＰｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞の場合、野生型（＋／＋）あるいはヘテロ（＋／−）の個体では蛍光標識されたＥＳ細胞を使用した場合その寄与が見られたとしてもまだらのキメラ状態の蛍光を示すが、ホモ（−／−）個体では膵臓が完全にＥＳ細胞由来の細胞により構築されるため、まんべんなく一様の蛍光を呈するという特徴を有する。このような特質を利用して、目的とする臓器または臓器を構成する細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子に関してどのような遺伝子型であるかを簡便に調べることができる。ｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞を使用することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を作製するには、Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８（７１５１）３１３−７（２００７）等を参照することができる。この文献に基づいて作製されたＮａｎｏｇ−ｉＰＳと呼ばれるｉＰＳ細胞株の場合は、マーキングがなされていないことから、キメラ作製に用いた場合ホストの胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、このＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記ＥＳ細胞の場合と同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ＥＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。

本発明で得られる目的臓器は、完全に前記異個体宿主哺乳動物由来のものであることが特徴である。従来の方法では、キメラのものが再生されていた。理論に束縛されることは望まないが、欠損する遺伝子の発生過程における機能、特に臓器形成過程における各臓器の幹／前駆細胞の分化・維持に必須な転写因子であったことが原因であると考えられる。本発明では、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞等を使用することができ、上記のように標識を付すことができる。

本発明はまた、本発明の方法によって生産された哺乳動物を提供する。このような目的臓器を有する動物は、従来生産することができなかったことから、動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、それらを救済する方法が存在しなかったことが原因であると考えられる。

本発明はさらに、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト宿主哺乳動物の、目的臓器の製造のための使用も提供する。このような用途で宿主細胞を使用することは従来十分に想定されていなかった。したがって、このような宿主動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、遺伝子欠損により示される欠損臓器が生存に必須であり、性成熟に達する週齢まで目的個体の維持が不可能であったことが原因であると考えられる。

（他の幹細胞の場合）
ＥＳ細胞以外の幹細胞として、例えばｉＰＳ細胞およびｍＧＳ細胞などを使用することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を作製するには、Ｏｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄを参照することができる。ｍＧＳ細胞についても同様に、当該分野において公知の手法（Ｍｉｔｏ Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．１１９，１００１−１０１２（２００４））を用いることができる。マーキングがなされていない場合は、キメラ作製に用いた場合ホストの胚側と区別する術がなく、臓器の補充がなされたか識別できない。したがって、これを解決するために、このＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞株に蛍光色素の導入をすることにより、上記ＥＳ細胞の場合と同様のプロトコールで実験をすることができる。そして、以上のような細胞を用いれば、ＥＳ細胞を用いた場合と同様のプロトコールで臓器を作り、その由来を明らかにすることが可能となる。

（ｉＰＳ細胞）
ｉＰＳ細胞はＯｋｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ以外の他の方法によっても作製することができる。すなわち、ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子（単数または複数の因子の組み合わせでありうる）を接触させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４；これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Ｙａｍａｎａｋａ因子とも呼ばれるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４因子を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。ｃ−Ｍｙｃの代わりにｎ−Ｍｙｃを用い、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてもｉＰＳ細胞の樹立は可能である（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：２４５−２４７）。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功しており（Ｙｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０）、これらも本発明において利用することができる。

マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃを用いて線維芽様滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞を生産することもできる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２．）。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子にｈＴＥＲＴ・ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔを加えた６遺伝子を用いてヒトｉＰＳ細胞の樹立することもできる（Ｐａｒｋ ＩＨ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ ４５１：１４１−１４６．）。また、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の３因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることが示されており、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えるのに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：１０１−１０６．；Ｗｅｒｉｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１０−１２）。また、遺伝子産物のみならず、低分子化合物でもｉＰＳ細胞を生産することができ、これらも本発明において利用することができる（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００８ Ｊｕｎ ５；２（６）：５２５−５２８を参照）。

（種々の動物を使用する場合の留意点）
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。例えば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｃｈｉｍｅｒａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｉｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２）））が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、例えば、上記細胞をいずれも胚盤胞までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の８細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。

ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞の代わりに内部細胞塊を注入したキメラを用いた場合、本明細書に記載した実施例において、以下の点を変更ないし修正して使用する必要があることに留意すべきであるが、これらは当該分野における周知技術の範囲内の技術であることが理解される。

ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞の代わりに内部細胞塊を注入したキメラを用いる場合は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞と異なり細胞株ではないので別途胚を作製する過程（自然交配後の採卵、あるいは人工授精）が必要となる。そのようなプロトコールは、上記各文献（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｃｈｉｍｅｒａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｉｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２））に記載されており、必要に応じてこれらの文献を参考として援用する。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１）
本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、欠損させるべき臓器として膵臓を選択した。さらに、膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにＰｄｘ１遺伝子を用いた。

（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｐｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}およびＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}（ファウンダー）を使用した。Ｐｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞を使用した。

（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）
コンストラクト作製に関しては詳しくは既報の論文（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，９８３−９９５（１９９６））に基づいて作製することができる。簡単には、以下のとおりである。相同領域のアームはＰｄｘ１領域を含むλクローンよりクローニングしたものを使用することができる。本実施例では、京都大学大学院医学研究科腫瘍外科学研究室川口義弥先生より供与されたものを使用した。

（トランスジェニック・ノックインの手法：Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）
上記のコンストラクトをＥＳ細胞にエレクトロポレーションで導入しポジティブ／ネガティブ選択後、サザンブロティングによりスクリーニングし、得られたクローンを胚盤胞注入しキメラマウスを作製した。その後生殖系列にのったラインを確立し、遺伝的な背景をＣ５７ＢＬ／６系統にバッククロスさせて作製することができる。

（交配）
次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した（図１）。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない（出生後１週間程度で死んでしまう）ため、ヘテロマウス同士を交配し胚を回収することとした。

（マウスの維持手順および確認）
胚盤胞にＥＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した。この際のＥＳ細胞にはＥＧＦＰでマーキングされたＧ４．２という株を使用した（ＲＩＫＥＮＣＤＢ，丹羽仁史先生より供与）。これと同等のマーキングされたＥＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。

産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため目的の“膵臓欠損＋ＥＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、両者とも血液および組織の細胞を採取し、フローサイトメーターによりＥＧＦＰ陰性を示す細胞（ＥＳ細胞由来ではなく、注入された胚由来の細胞）を分取し、ゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した（図２）。用いたプライマーは以下の通りである。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＡＣ（配列番号１）
リバース１（Ｒｖ１）：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ（配列番号２）
リバース（Ｒｖ２）：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ（配列番号３）。

この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるためその仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように末梢血中のホスト由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を行いその遺伝子型を特定する。

補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する最初のステップとして膵臓の形態観察が容易な新生児期において機能マーカーの発現解析を行った。

図３に、新生児期で解剖したマウス膵臓より作製した凍結切片に免疫染色を施した像を示す。抗体は外分泌組織の指標として抗α−アミラーゼ抗体（ＳＩＧＭＡ社より購入ｃａｔ．＃Ａ８２７３）、内分泌組織の指標として抗インスリン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２４２１）、抗グルカゴン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２２７１）、抗ソマトスタチン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２６５１）、膵管の指標としてＤＢＡ−Ｌｅｃｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社より購入ｃａｔ．＃ＲＬ−１０３２）をそれぞれ染め分けた。こられがすべて陽性であることから、補われた膵臓は正常に機能していることが示唆される。

この結果からほぼすべての機能マーカーの発現が認められ、生存に事足りる正常な機能を持っていると考えられる。

次に、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する次のステップとして成体マウスにて血糖値の測定を行う(図４）。

図４には、血糖値を指標とした膵臓補完マウスにおける膵機能評価の結果を示す。（１）は定常状態における血糖値で、成熟した膵臓補完マウスの血糖値をメディセーフミニＧＲ−１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）により測定した値の平均および標準偏差を示す。コントロールとしてＰｄｘ１アレルをヘテロにもつキメラマウスおよび、膵臓機能の低下したＳＴＺ−ＤＭモデルの値を示す。また（２）は糖負荷後の血糖値の変遷を同メディセーフミニにより測定した結果を示す。これらの結果は血糖調節能の正常性を示し、作製された膵臓補完マウスがファウンダーとして用いる際にも長期に生存可能であることを示唆している。

すなわち、糖負荷後、一度上昇した血糖値もコントロールとして用いたヘテロ（＋／−）キメラと同様に正常値に戻ることから、作製されたＫＯキメラ（ファウンダー）は糖尿病などの症状を示さず、長期生存の可能性が示された。

次に、ファウンダーマウスとして次世代にその表現型を伝搬することが可能かどうかを、ヘテロ個体との交配により得られた産仔より明らかにしようと試みた。図５はその工程および結果を示す。得られた産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、（マウスの維持手順および確認）の項で用いたプライマーを使ったＰＣＲを行った。その結果ヘテロもしくはノックアウト個体しか得られないことが明らかとなり、このことはファウンダーがノックアウト個体で、次世代にその表現型を伝えることができるということを強く示唆している。

すなわち、ノックアウト（ＫＯ）とヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであり、そのとおりの結果が示された。

このことから例えば膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。

（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Ｐｄｘ１プロモーター領域下にＨｅｓ１遺伝子を繋げたコンストラクトをマウス前核期卵に注入し作製したマウス（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１マウス）を用いた。コンストラクト作製に関して既報の論文（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３，３３２−３３９（２０００））で使用されたＰｄｘ１プロモーター領域を含むコンストラクトのＰａｘ６遺伝子部にＨｅｓ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）を挿入し作製することができる。

（トランスジェニックの手法）
上記のコンストラクトをＣ５７ＢＬ６マウスおよびＢＤＦ１マウス（日本ＳＬＣ株式会社より購入）を交配して得られた前核期卵にマイクロインジェクターを用いて注入し、仮親へ移植してトランスジェニックマウスを作製する。図６に胚盤胞補完作用によって生産した膵臓が補われたマウスの例を示す。

Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックのＢｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎによる膵臓再生を示す。同マウスを用いてＥＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能である。

このことからＰｄｘ１ノックアウトマウス同様にこのようにして作製されたトランスジェニックマウスも膵臓を補うことが可能であることが実証された。

（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製するため図７に示したストラテジーを適用した。

簡単に説明すると、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でＥＳ細胞等を注入することで、膵臓の欠損を補った。この際のＥＳ細胞にはノックアウトの項と同様にＥＧＦＰでマーキングされたＧ４．２というＥＳ細胞株（ＲＩＫＥＮ ＣＤＢ，丹羽仁史先生より供与）。これと同等のマーキングされたＥＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。このようにトランスジーンを導入した胚にＥＳ細胞を注入するという二重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから膵臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ膵臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。

従来の方法では、前核期卵に遺伝子を導入した後、移植するのが従来のトランスジェニックマウス作製法であるが、それだと膵臓を欠損する表現型を持つマウスは出生後死んでしまう。したがって、本発明は、従来の方法では達成し得なかった技術を提供することになる。

図８にはその生産過程における結果を表にまとめたものを示す。

この生産過程では、キメラは毛の色で判断した。ドナーのＥＳ細胞は１２９系統マウス（アグーチ）由来、ホストの胚はＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来のため体毛が生えそろえばキメラかどうかは判断可能である。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲによりトランスジーンを検出することによって行った。

産仔はトランスジェニックであればトランスジーンが次世代に伝わる確率は１／２となるため目的の“膵臓欠損＋ＥＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため図９に示すように野生型マウスと交配させ、トランスジーンの伝搬を産仔の尻尾から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで確認するとともに、それら産仔の膵臓の形態を観察した。ＰＣＲには以下のプライマーセットを用いた。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧ（配列番号４）
リバース（Ｒｖ）：ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ（配列番号５）。

使用したフォワードプライマーはＰｄｘ１プロモーター領域に対応するヌクレオチド配列に対してはハイブリダイズするように作製されており、リバースプライマーはＨｅｓ１ ｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．がＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなＰｄｘ１プロモーターとＨｅｓ１ ｃＤＮＡが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたＰＣＲにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。

以上の実験より、図８中の＃３７が次世代で膵臓欠損を起こすことが可能であるファウンダーマウスであることが示唆される結果が得られた。

このような方法をマウスに限らずその他大型動物等に適用することで、致死性の表現型を持つトランスジェニック動物およびノックアウト動物をより効率的に生産可能となると思われる。

図９には、本実施例の工程および結果を示す。

作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック−キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくることになる。図８に示したファウンダー候補のうち＃３７が次世代で膵臓を欠損させることに成功した。このことから＃３７は作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したことが示される。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーが作製可能であることになる。

以上から、ＨＥＳ−１の強制発現により膵臓ができなくなるようにしたものを含むマウスであっても、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウスであっても、臓器不全動物の死を胚盤法補完によりレスキューしてファウンダーとして使用することができることが示されたことになる。

（実施例２：ｉＰＳ細胞を用いる例）
本実施例では、ＥＳ細胞に代えてｉＰＳ細胞を用いて、実施例１と同様の実験を行った。なお、ｉＰＳ細胞は基本的に多能性幹細胞株であり、ＥＳ細胞に非常に酷似した特徴をもつため、実施例１において行ったプロトコールをそのまま実施することができる。すなわち、培養方法、胚への導入方法に相違はなく、実施例１に記載のものを用いて実施することができることが理解される。

（ｉＰＳ細胞の調製例）
本発明者らは、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図１０および詳細には図１１ａに示した。

（ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ ｔｉｐ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立）
ＧＦＰトランスジェニックマウスより尻尾を約１ｃｍ採取し、皮を剥ぎ２〜３片に刻んだ。それをＭＦ−ｓｔａｒｔ ｍｅｄｉｕｍ（ＴＯＹＯＢＯ，日本）中に置き、５日間培養した。そこで出現してきた繊維芽細胞を新たな培養皿に撒きなおし数継代し、これを尻尾由来繊維芽細胞（ＴＴＦ）とした。

（＋３因子（初期化因子）の導入）
目的遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質を導入し作製したウイルス産生細胞株（２９３ｇｐもしくは２９３ＧＰＧ細胞株）より上清を回収し、遠心濃縮後凍結保存しておいたウイルス液を前日に１×１０^５細胞／６ウェルプレートになるよう継代したＴＴＦ細胞の培養液中に加え、これを３因子（初期化因子）の導入とした。

（２５〜３０日間のＥＳ細胞用培地での培養）
３因子（初期化因子）導入後、翌日ＥＳ培養用の培養液に置換し２５〜３０日間培養した。この際、毎日培養液の置換を行った。

（ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株の樹立）
培養後出現してきたｉＰＳ細胞様コロニーをイエローチップ（たとえば、Ｗａｔｓｏｎから入手可能）にてピックアップし、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上に撒いた。

（結果）
上記方法により樹立されたｉＰＳ細胞株は図１１ｂ−ｆに示したようなｉＰＳ細胞としての特徴すなわち未分化性と全能性とを有していることが証明された。

図１１に上記実験の結果を示す。図１１ｂに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞株２株について、その形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影した。その条件は以下のとおりである。

ピックアップ後のｉＰＳ細胞を継代後、ディッシュ上でセミコンフルエントになった段階で観察および撮影を行った。

形態的にＥＳ細胞様の未分化コロニーを形成することがわかった。

図１１ｃに示すように、ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社 Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。その条件は以下のとおりである。

明視野像、ＧＦＰ蛍光像をカメラを付属した顕微鏡にて観察・撮影後、培養液を除きリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したｉＰＳ細胞の培養ディッシュに１０％ホルマリン・９０％メタノールからなる固定液を、添加し、１〜２分固定処理を施した。これを洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））で一度洗浄した後、上記キットの染色液を添加し、暗所にて１５分間静置した。その後、再び洗浄液で洗浄後、観察・撮影した。

図１１ｃに示されるように、本実施例で作製したｉＰＳ細胞は、ＧＦＰマウス由来であるため、ＧＦＰを恒常的に発現し、未分化細胞に特徴的である高いアルカリフォスファターゼ活性を示すことがわかった。

図１１ｄに示すように、ｉＰＳ細胞樹立の際にゲノムＤＮＡ上に挿入された３因子の同定のため、ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。その条件は以下のとおりである。

ゲノムＤＮＡはＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い製造業者のプロトコールに従い、１ｘ１０^６個の細胞からＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲを行った。
Ｏｃｔ３／４
Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）： ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ（配列番号６）
Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）： ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＡ（配列番号７）

Ｋｌｆ４
Ｆｗ（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）： ＧＣＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＣＣ（配列番号８）
Ｒｖ（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）： ＴＴＡ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ（配列番号９）

Ｓｏｘ２
Ｆｗ（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）： ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＧ（配列番号１０）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）： 上記と同じ（配列番号９）

ｃ−Ｍｙｃ
ＦＷ（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）： ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＣ（配列番号１１）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）： 上記と同じ（配列番号９）
その結果図１１ｄに示されるように、３因子の挿入が確認された。

図１１ｅに示すように、ＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンおよび導入された遺伝子の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により確認した。その条件は以下のとおりである。

１ｘ１０^５個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーターを用いＴｒｉｚｏｌ−ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に分取し、そこから抽出したｍＲＮＡよりＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い付属のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成をおこなった。合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーはトランスジーンの発現（図中Ｔｇと表記）は上記図１１ｄと同様のプライマー、それ以外の遺伝子発現についてはＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋ ＆ Ｙａｍａｎａｋａ Ｓの報告（Ｃｅｌｌ ２００６ Ａｕｇ ２５；１２６（４）：６５２−５．）等に基づきプライマーを合成したものを用いた。

図１１ｅに示すように、いずれの株もＥＳ細胞とほぼ同様の発現パターンを示し、また導入された遺伝子（Ｔｇ）はｉＰＳ細胞の高い遺伝子サイレンシング活性によりその発現が抑えられていることがわかった。

図１１ｆに示すように、樹立されたｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した。その条件は以下のとおりである。

ＰＭＳＧおよびｈＣＧホルモンの投与により過排卵誘起処理を施したＢＤＦ１系統のマウス（♀，８週齢）より採取した卵子とＣ５７ＢＬ／６由来の精子を用いインビトロ受精（ＩＶＦ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｉｔｏｎ）を行い、受精卵を得た。それを８細胞期／桑実胚まで培養した後、凍結保存し、胚盤胞注入を行う前日に起こした。ｉＰＳ細胞はセミコンフルエントになったものを０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより剥がし、注入用にＥＳ細胞培養液に縣濁した。胚盤胞注入は胚盤胞補完での手法同様に顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて行い、注入後の培養を経て、ＩＣＲ系統の仮親子宮に子宮移植を施した。解析では、胎生１３日目および出生後１日目に蛍光実体顕微鏡下で観察および撮影した。

図１１ｆに示されるように、胎児期および新生児期でｉＰＳ細胞由来の細胞（ＧＦＰ陽性）が確認でき、樹立されたｉＰＳ細胞株が高い多分化能を有していることが示唆される。

（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｐｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}およびＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}（ファウンダー）を使用した。Ｐｄｘ１遺伝子ローカスにＬａｃＺ遺伝子をノックイン（ノックアウトでもある）したマウス（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）由来胚盤胞を使用した。

（Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウス）
ＥＳ細胞の代わりにｉＰＳ細胞を用いた以外は、実施例１に記載されるプロトコールに従って、Ｐｄｘ１−ＬａｃＺノックインマウスを作製した。

（ファウンダーマウス）
（使用したマウス）
膵臓欠損を特徴とするトランスジェニックマウスとして、Ｐｄｘ１プロモーター領域下にＨｅｓ１遺伝子を繋げたコンストラクト（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１コンストラクト）をマウス前核期卵に注入し作製したマウス（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１マウス）を用いた（Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、コンストラクトの作製については実施例１を参照のこと）。

上記のように作製したトランスジェニックマウスは、Ｐｄｘ１（特に胎生期の膵臓で発現）のプロモーター下で発現するＨｅｓ１の発現量に依存して膵臓の形成度合が異なる。発現が高い（＝コピー数が多い）と膵臓の欠損を示す。Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックの胚盤胞補完による膵臓再生を示す。同マウスを用いてｉＰＳ細胞由来の膵臓を作ることが可能である。

このことからＰｄｘ１ノックアウトマウス同様にこのようにして作製されたトランスジェニックマウスも膵臓を補うことが可能であることが実証される。

（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製した。

簡単に説明すると、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でｉＰＳ細胞を注入することで、膵臓の欠損を補った。この際のｉＰＳ細胞には上記のように調製したＧＦＰでマーキングされたものを使用した。これと同等のマーキングされたｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。このようにトランスジーンを導入した胚にｉＰＳ細胞を注入するという２重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから膵臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ膵臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。

（交配）
次に、本実施例では、こうして樹立されたマウスのヘテロマウス同士を交配し、使用した。上記ノックインマウスに関してはホモでの維持ができない（出生後１週間程度で死んでしまう）ため、Ｐｄｘ１^{ｗｔ／ＬａｃＺ}およびＰｄｘ１^{ＬａｃＺ／ＬａｃＺ}（ファウンダー）同士を交配し胚を回収することとした。

（マウスの維持手順および確認）
胚盤胞に上記ｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入した（図１０ ｉＰＳ細胞の胚盤胞注入）。従来の方法では、ＧＦＰでのマーキングすることが必要であったが、今回はあらかじめＧＦＰマウスの体細胞からｉＰＳ細胞を樹立したのであとからマーキングする必要はなく、そのまま使用した。もちろん、これと同等のマーキングされた他のｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。

産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、両者とも血液および組織の細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ陰性を示す細胞（ｉＰＳ細胞由来ではなく、注入された胚由来の細胞）を分取し、ゲノムＤＮＡを抽出、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した。用いたプライマーは以下の通りである。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＡＣ（配列番号１）
リバース１（Ｒｖ１）：ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ（配列番号２）
リバース（Ｒｖ２）：ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＡ ＡＣＡ ＡＣＣ（配列番号３）。

この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるためその仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように末梢血中の宿主由来の細胞を用いた遺伝子型の解析を行いその遺伝子型を特定する。

このようにして作製したファウンダーマウスに由来する再生した臓器（膵臓）が機能的であることは、上記のように、ファウンダーマウス（♂）とpdx-1＋/−ヘテロタイプ（♀）をかけあわせて、生まれたpdx-1-/−仔マウスの由来のもので確認した。すなわち、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する最初のステップとして膵臓の形態観察が容易な新生児期において機能マーカーの発現解析を行った。その結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａは、出生後５日目の新生児を顕微鏡下で解剖し、露出した膵臓を蛍光顕微鏡下で撮影したものを示す。

図１１Ｂは、新生児期で解剖したマウス膵臓より作製した凍結切片に免疫染色を施した像を示す。抗体として内分泌組織の指標として抗インスリン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２４２１）を用いて染めたものを示す。このほかに、外分泌組織の指標として抗α−アミラーゼ抗体（ＳＩＧＭＡ社より購入ｃａｔ．＃Ａ８２７３）、抗グルカゴン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２２７１）、抗ソマトスタチン抗体（株式会社ニチレイバイオサイエンスより購入ｃａｔ．＃４２２６５１）、膵管の指標としてＤＢＡ−Ｌｅｃｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社より購入ｃａｔ．＃ＲＬ−１０３２）をそれぞれ染め分けることもできる。インスリンが陽性であることから、他の抗体での染色をしなくても補われた膵臓は正常に機能していることが理解される。

この結果からほぼすべての機能マーカーの発現が認められ、生存に事足りる正常な機能を持っていると考えられる。

次に、補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認する次のステップとして成体マウスにて血糖値の測定を行う。

血糖値を指標とした膵臓補完マウスにおける膵機能評価の結果を参酌することができる。定常状態における血糖値で、成熟した膵臓補完マウスの血糖値をメディセーフミニＧＲ−１０２（ＴＥＲＵＭＯ社より購入）により測定した値の平均および標準偏差を参酌することができる。コントロールとしてＰｄｘ１アレルをヘテロにもつキメラマウスおよび、膵臓機能の低下したＳＴＺ−ＤＭモデルの値を使用しうる。また糖負荷後の血糖値の変遷を同メディセーフミニにより測定した結果を参酌することができる。これらの結果は血糖調節能の正常性を示し、作製された膵臓補完マウスがファウンダーとして用いる際にも長期に生存可能であることを示唆している。

すなわち、糖負荷後、一度上昇した血糖値もコントロールとして用いたヘテロ（＋／−）キメラと同様に正常値に戻ることから、作製されたＫＯキメラ（ファウンダー）は糖尿病などの症状を示さず、長期生存の可能性が示すことができる。

次に、ファウンダーマウスとして次世代にその表現型を伝搬することが可能かどうかを、ヘテロ個体との交配により得られた産仔より明らかにしようと試みた。図１２はその結果を示す。得られた産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、（マウスの維持手順および確認）の項で用いたプライマーを使ったＰＣＲを行った。その結果ヘテロもしくはノックアウト個体しか得られないことが明らかとなり、このことはファウンダーがノックアウト個体で、次世代にその表現型を伝えることができるということを強く示唆している。

すなわち、ノックアウト（ＫＯ）とヘテロマウスの交配のため理論上メンデル遺伝の法則に従い１／２の確率でＫＯもしくはヘテロ個体になるはずであり、そのとおりの結果が示された。

このことから例えば膵臓を補ったＫＯ同士の交配であれば１００％次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。

（キメラの確認）
キメラは毛の色で判断することができる。ドナーのｉＰＳ細胞はＧＦＰトランスジェニックマウス由来、宿主の胚は野生型であるＣ５７ＢＬ６ｘＢＤＦ１（黒）由来であるので、ＧＦＰの蛍光により判断することができる。トランスジェニックの判定は、尻尾から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲによりトランスジーンを検出することによって行う。

産仔はトランスジェニックであればトランスジーンが次世代に伝わる確率は１／２となるため目的の“膵臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため野生型マウスと交配させ、トランスジーンの伝搬を産仔の尻尾から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により遺伝子型を検出することで確認するとともに、それら産仔の膵臓の形態を観察した。ＰＣＲには以下のプライマーセットを用いる。
フォワード（Ｆｗ）：ＴＧＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＧ（配列番号４）
リバース（Ｒｖ）：ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ（配列番号５）
使用したフォワードプライマーはＰｄｘ１プロモーター領域に対応するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されており、リバースプライマーはＨｅｓ１ｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．がＮＭ＿００８２３５のｍＲＮＡ）ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするように作製されている。このようなＰｄｘ１プロモーターとＨｅｓ１ｃＤＮＡが近傍に存在することは野生型マウスでは起こり得ないため、これらのプライマー用いたＰＣＲにより、トランスジーンを効率的に検出することが可能である。
以上の実験より、次世代で膵臓欠損を起こすことが可能であるファウンダーマウスであることが示唆される結果が得られる。

このような方法をマウスに限らずその他大型動物等に適用することで、致死性の表現型を持つトランスジェニック動物およびノックアウト動物をより効率的に生産可能となるはずである。

作製したトランスジェニックかつキメラであった個体を野生型と交配する。産仔の膵臓の形態解析、あるいはゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、膵欠損という表現型が次世代に伝わるかを明らかにする。もしトランスジェニック−キメラがファウンダーになりうるなら次世代で膵臓を欠損したマウスが産まれてくることになる。次世代で膵臓を欠損させることに成功したものを選択することができる。このようなマウスは作製段階で膵臓を補われたため出生後の正常性を示したことが示される。このようにトランスジェニックを用いても臓器欠損マウスのような胎生期および出生直後に死んでしまうようなマウスを効率的に生産できるファウンダーを用いてｉＰＳ細胞とともに臓器再生を実現することができる。

以上から、ｉＰＳ細胞を用いてＨＥＳ−１の強制発現により膵臓ができなくなるようにした物を含むマウスであっても、Ｐｄｘ−１ノックアウトマウスであっても、臓器不全動物の死を胚盤法補完によりレスキューしてファウンダーとして使用することができることが示されたことになる。

（実施例３：ｍＧＳ細胞を用いる例）
本実施例では、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に代えてｍＧＳ細胞を用いて、実施例１または２と同様の実験を行う（Ｍｉｔｏ Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．１１９，１００１−１０１２（２００４）を参照）。なお、ｍＧＳ細胞は基本的に多能性幹細胞株であり、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に非常に酷似した特徴をもつため、実施例１または２において行ったプロトコールをそのまままたは適宜改変して実施することができる。すなわち、培養方法、胚への導入方法に相違はなく、実施例１または２に記載のものを適宜改変して用いて実施することができることが理解される。

（実施例４：受精卵細胞を用いる例）
本実施例では、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に代えて受精卵細胞（Ｍｉｎｔｚ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｇｇ：ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３８，５９４−５９５（１９６２）を参照）を用いて、実施例１または２と同様の実験を行う。

受精卵細胞を用いる場合は目的の遺伝子改変胚に合わせ、受精卵細胞を人工授精あるいは自然交配後の採卵により回収し、それら胚の透明帯を酸性タイロード溶液中に晒すことで除去し、同一シャーレ内で密接して培養することで凝集させ、キメラ胚盤胞を作製する方法を利用することができる。

同様に処理した受精卵細胞の一部（割球）あるいは発生させ胚盤胞にまで達した胚の内部細胞塊を機械的に剥離し、遺伝子改変胚盤胞内へ注入する方法も利用可能である。

（実施例５：腎臓の場合のファウンダー動物の生産）
次に、この実施例では、腎臓欠損の場合もファウンダー動物を生産することができることを実証した。

本実施例では、ファウンダー動物としてマウスを選び、さらに、腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウスを作製するためにＳａｌｌ１遺伝子を用いる。

（使用したマウス）
腎臓欠損を特徴とするノックアウトマウスとして、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（熊本大学発生医学研究センター、西中村隆一先生より供与）を使用した。Ｓａｌｌ１遺伝子は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の前後方部位特異的ホメオティック遺伝子ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）のマウスホモローグであり、アフリカツメガエルの前腎管誘導実験から、腎発生に重要であることが示唆された、１３２３アミノ酸残基のタンパク質をコードする３９６９ ｂｐの遺伝子である（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１、東大浅島研究室）。このＳａｌｌ１遺伝子は、マウスにおいて、腎臓のほか、中枢神経、耳胞、心臓、肢芽、肛門において発現局在していることが報告された（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）。

このＳａｌｌ１遺伝子のノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統にバッククロス（戻し交配）し解析）は、Ｓａｌｌ１遺伝子のエキソン２以降を欠損することにより、分子内に存在していた１０個全てのｚｉｎｃ−フィンガードメインを欠損しており、その欠損の結果、後腎間葉への尿管芽の陥入が起こらず、腎臓形成初期の異常が生じていると考えられている。

（ファウンダートランスジェニックマウスの作製）
上記トランスジェニックマウスは出生後に死んでしまうことが知られているため、このようなマウスのファウンダーを作製する。

簡単に説明すると、Ｓａｌｌ１ノックアウトトランスジーンを注入した胚を胚盤胞まで培養し、そこにマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下でｉＰＳ細胞を注入することで、腎臓の欠損を補う。この際のｉＰＳ細胞には上記のようにして調製されるＧＦＰ等でマーキングしたものを使用する。これと同等のマーキングされたｉＰＳ細胞等を用いてもよい。注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得ることができる。このようにトランスジーンを導入した胚にｉＰＳ細胞を注入するという２重の胚操作を適用することで、１世代目のトランスジェニックから腎臓を補うことが可能となり、それらが次世代へ腎臓欠損という表現型を伝搬できるファウンダー動物となり得る。

（交配）
次に、Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合体個体（Ｓａｌｌ１（＋／−））のオスとメスとを交配し、胚盤胞期受精卵を子宮還流法により採取した。

（マウスの維持手順および確認）
採取した胚盤胞期受精卵にＧＦＰマーキングされたｉＰＳ細胞をマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡下で注入し、注入後の胚は仮親の子宮へ移植し、産仔を得た。

産仔はノックインマウスであればホモになる確率が１／４となるため、目的の“腎臓欠損＋ｉＰＳ細胞由来の膵臓”というマウスがどれかを判定することが必要となる。そのため、産仔から骨髄細胞を採取し、フローサイトメーターによりＧＦＰ−の造血幹／前駆細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋，Ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎａｇｅ ｍａｒｋｅｒ−：ＫＳＬ細胞）を分取し、１細胞ずつ９６ウェルプレートに落とした。これをサイトカイン添加条件下で１２日間培養しコロニーを形成させ、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により単一細胞から遺伝子型を検出することで当たりのマウスを判定した。用いたプライマーは以下の通りである。
注入された胚由来（すなわちホスト）同定用のフォワードプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＧ（配列番号１２）
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ検出用：ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣ（配列番号１３）
注入された胚由来（すなわちホスト）同定用のリバースプライマー：
ｍｕｔａｎｔ検出用：ＡＴＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＣ（配列番号１４）
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ検出用：ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＧ（配列番号１５）。

この方法で作製した場合、ヘテロ同士の交配であるため、その仔はメンデル遺伝の法則に従い、野生型：ヘテロ：ＫＯ＝１：２：１であると予想される。したがって、そのうちのＫＯ個体を特定するため、このように骨髄細胞を用いた遺伝子型の解析を行い、その遺伝子型を特定した（図１３）。＃３のマウスがＳａｌｌ１ホモＫＯマウスであったことが分かる。

補われた臓器が正常に機能しているかどうかを確認するために、腎臓の形態観察を行った。上記遺伝子型決定にてホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））であることが確認できた新生仔のキメラ個体には、腎臓が後腹膜領域に存在していた。これらの形成された腎臓は、蛍光実体顕微鏡下で観察すると、ＧＦＰ強陽性であった（図１３）。これは、ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））では、腎臓が胚盤胞期受精卵の内腔に移植したマウスｉＰＳ細胞のみに由来していることを示す。一方、ヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））の個体では、腎臓がヘテロ接合体（Ｓａｌｌ１（＋／−））の個体由来の細胞と移植したｉＰＳ細胞由来の細胞のキメラにより構成されているため、ＧＦＰの蛍光並びに抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学由来の蛍光の両方ともに陽性の細胞像が得ることによって確認することができた。

ホモ接合体（Ｓａｌｌ１（−／−））胚盤胞期受精卵にｉＰＳ細胞を移植した結果得られた腎臓の組織学的解析では、係蹄腔内に赤血球を含む成熟機能糸球体、成熟尿細管構造が観察でき、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫組織化学解析でそれら成熟細胞のほとんどがＧＦＰ陽性であることを確認することができる。

これらの結果から、上述した方法により作出されたキメラＳａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（−／−））において、産仔個体中で形成された腎臓が、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｓａｌｌ１（−／−））胚盤胞期受精卵の内腔に移植されたｉＰＳ細胞から形成されたものであることを確認することができる。

このような腎臓を補ったＫＯ同士を交配させると１００％の確率で次世代でＫＯ個体を得ることが可能となり、ＫＯ個体を使った解析がとても行いやすくなると考えられる。

（実施例６：マウス以外の動物を使用する例）
本実施例では、マウス以外の動物を使用する場合でも、ファウンダー動物を生産することができ、臓器を製造することができることを実証する。マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりも、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告が多く、この情報を用いて、臓器製造を行うことができる。ラットの場合は、Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。ウシについては、Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｃｈｉｍｅｒａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。ブタについては、Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｉｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２）に記載される情報を用いて、同様の実験を行うことができる。

例えば、本実施例では、マウス以外の例として遺伝子改変動物の作製が可能とされる動物種（ラット（トランスジェニック）、ブタ（トランスジェニック、ノックアウト）、ウシ（トランスジェニック、ノックアウト）、でも同様の実験を行うことができると想定される。これらの種では、実施例４において記載した受精卵細胞の利用が想定される。

これにより、致死性遺伝子改変ファウンダーラット、ブタ、ウシ等の製造をすることができる。

このように、ラット、ブタ、ウシを用いた場合でも、実施例１〜３に準じて同様の実験を行うことができる。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
（１）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、胚盤胞補完（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物。
（２）補完される前記臓器または身体部分が標識される、上記（１）に記載の動物。
（３）上記（１）に記載の動物を生産する方法であって、
Ａ）前記欠損原因遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；
Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；
Ｃ）該胚盤胞中に、前記欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；
Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器または前記身体部分が補完されたものを選択する工程
を包含する、方法。
（４）前記第一多能性幹細胞は、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚である、上記（３）に記載の方法。
（５）前記遺伝子は外来遺伝子であり、前記Ａ）工程は、前記第一多能性幹細胞に該外来遺伝子を導入することを包含する、上記（３）に記載の方法。
（６）前記第二多能性幹細胞は、卵細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、上記（３）に記載の方法。
（７）前記Ｄ）工程は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて前記個体を生産することを包含する、上記（３）に記載の方法。
（８）前記選択は、前記第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することによって達成される、上記（３）に記載の方法。
（９）前記第二多能性幹細胞は標識されたものであり、前記選択は、該標識を同定することを包含する、上記（３）に記載の方法。
（１０）目的の臓器または身体部分を生産する方法であって、
Ａ）請求項１に記載の動物を提供する工程であって、前記欠損原因遺伝子は、該目的の臓器または身体部分の欠損原因をコードするものである、工程；
Ｂ）該動物から卵子を得、該卵子を胚盤胞に成長させる工程；
Ｃ）該胚盤胞中に、該欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する所望のゲノムを有する目的多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該個体から該目的の臓器または身体部分を取得する工程
を包含する方法。
（１１）前記Ｄ）工程は、前記キメラ胚盤胞を前記動物の母胎中で発生させて、産仔を得、該産仔個体から、該目的臓器を取得することを包含する、上記（１０）に記載の方法。
（１２）前記目的多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、上記（１０）に記載の方法。
（１３）前記目的多能性幹細胞がマウス由来である、上記（１０）に記載の方法。
（１４）前記目的の臓器または身体部分が膵臓または腎臓である、上記（１０）に記載の方法。
（１５）前記動物がマウスである、上記（１０）に記載の方法。
（１６）前記マウスがＰｄｘ−１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、またはＳａｌｌ１ノックアウトマウスである、上記（１５）に記載の方法。
（１７）前記目的の臓器または身体部分が、完全に前記目的多能性幹細胞由来のものである、上記（１０）に記載の方法。
（１８）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により補完される、動物の、該臓器または身体部分の製造のための使用。（１９）目的の臓器または身体部分を製造するためのセットであって、該セットは、
Ａ）機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を含み、かつ、該臓器または身体部分が、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）により補完される、動物と、
Ｂ）該目的の臓器または身体部分と同種の細胞とを備える、セット。
（２０）上記（１）に記載の動物を生産するための、多能性幹細胞と、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子をコードする核酸との組み合わせ、あるいは、機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする遺伝子を有する多能性幹細胞と該遺伝子を有しない細胞との組み合わせの、使用。

Claims (7)

1. 機能すると生存し得ないかまたは生存困難となる、臓器または身体部分の欠損原因をコードする欠損原因遺伝子を含む非ヒト動物の交配可能な成体を生産し、その後、成体を用いて欠損原因遺伝子を含む個体および個体の体内に臓器または身体部分を製造する方法であって、
   Ａ）前記欠損原因遺伝子を有する第一多能性幹細胞を提供する工程；
   Ｂ）該第一多能性幹細胞を胚盤胞に成長させる工程；
   Ｃ）該胚盤胞中に、前記欠損原因遺伝子による欠損を補完する能力を有する第二多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；
   Ｄ）該キメラ胚盤胞から個体を生産し、該第二多能性幹細胞により、前記臓器または前記身体部分が補完されたものを選択する工程；
   Ｅ）補完された個体を成体に成長させて前記非ヒト動物の交配可能な成体を得て、その後、該個体同士を交配して、あるいは該個体と該遺伝子のヘテロの個体とを交配して、胚盤胞を得る工程；
   Ｆ）工程Ｅ）で得られた胚盤胞中に、該遺伝子による欠損を補完する能力を有する多能性幹細胞を導入して、キメラ胚盤胞を生産する工程；および
   Ｇ）工程Ｆ）で得られた胚盤胞から個体および個体の体内に臓器または身体部分を得る工程
   を含んでなり、
   該第一多能性幹細胞と該第二多能性幹細胞とは同種の関係である、
   方法。
2. 前記第一多能性幹細胞は、内部細胞塊(ICM)、受精卵または胚である、請求項１に記載の方法。
3. 前記遺伝子は外来遺伝子であり、前記Ａ）工程は、前記第一多能性幹細胞に該外来遺伝子を導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
4. 前記第二多能性幹細胞は、卵細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｄ）工程は、仮親に前記キメラ胚盤胞を戻し、仮妊娠させて前記個体を生産することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
6. 前記選択は、前記第二多能性幹細胞に由来する識別子を識別することによって達成される、請求項１に記載の方法。
7. 前記第二多能性幹細胞は標識されたものであり、前記選択は、該標識を同定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。