JP5745752B2 - 細胞スクリーニング方法、その方法に用いる制御ソフトウェア、細胞スクリーニング装置、及び画像解析装置、並びに細胞スクリーニングシステム - Google Patents

Description

本発明は、細胞スクリーニング方法、細胞スクリーニング方法、その方法に用いる制御ソフトウェア、細胞スクリーニング装置、及び画像解析装置、並びに細胞スクリーニングシステムに関する。

近年、マルチウェルプレート等の細胞アレイ用プレートに配列された各容器内の細胞を走査して、細胞の表面又は内部から発せられる蛍光等の光を撮像し、撮像した細胞の画像を解析し、解析結果を出力する、細胞スクリーニング装置が利用されるようになってきている。

そして、例えば、特許文献１には、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング：high-throughput screening）モードで、スキャン対象となっているウェルの領域全体をスクリーニングし、そのウェルの特徴をウェル全体から抽出し、その抽出結果を所定の閾値あるいは強度応答と比較して「ヒット」又は「対象外」を判定し、「ヒット」と判定されたウェルの位置を記憶し、次に、ＨＣＳ（ハイコンテントスクリーニング：High Content Screening）モードで、そのウェルを詳細に測定、解析する技術が記載されている。

また、細胞スクリーニングを用いた癌の臨床検査、特に大腸癌の臨床検査分野に関しては、例えば、特許文献２に、糞便試料から大腸癌細胞を回収し、細胞観察容器中に固定し、大腸癌細胞と特異的に結合し得る検出用抗体を用いて免疫染色する方法、及び検査キットを用いたこれらの工程後に顕微鏡細胞画像を取得し、画像解析することで大腸癌細胞を見つけ出す技術が記載されている。近年、この方法及び検査キットの発明により、所望の癌細胞のみを検体から抽出できるようになったことで、顕微鏡細胞画像の取得技術と画像解析技術との組合せが、臨床検査へ応用されようとしている。

特許第３４６６５６８号公報 特願２００８−３３１２７４号明細書

特許文献１に記載の細胞スクリーニング装置は、測定対象のウェルが「ヒット」のウェルであるか否かを、低分解能（低倍）スクリーニングにより得られた「各ウェル内の多くのまたは全ての細胞または多量の物質の全信号出力」を平均し、その平均値を閾値に用いて判定する。

しかし、臨床検体の場合、ウェル内に存在する測定対象の細胞（主に、癌細胞）の数は、１個もしくは数個、場合によっては数千個と、様々である。このため、特許文献１に記載の方法のように、上記平均値を「ヒット」のウェルであるか否かの判定の閾値とすると、ウェル内に存在する細胞数が少ない場合、閾値が正確性に欠けたものとなる。また、測定対象の細胞が非常に微小である場合、特許文献１に記載の方法のように、低倍でスクリーニングすると、細胞自体を発見できなくなる可能性がある。このため、特許文献１に記載の方法を用いたのでは、本来「ヒット」と判定されるべきウェルが「ヒット」と判定されなくなる可能性がある。
また、特許文献１に記載の技術では、「ヒット」と判定されたウェルを、高分解能モードで再度スクリーニングすることになるので、光学系の切り替えやステージ動作の面で二度手間となり、スクリーニングの効率性が悪い。

また、特許文献２には、大腸癌の診断方法において、糞便試料中に、大腸粘膜由来の正常細胞と大腸癌細胞とで共通に発現する細胞表面抗原と特異的に結合する回収用抗体がリンカーを介して結合された、固相担体を混合して、正常細胞と大腸癌細胞を回収し、次いで、該固相担体から分離し、次いで、分離した細胞を大腸癌細胞と特異的に結合し得る検出用抗体を用いて免疫染色し、次いで、免疫染色した細胞の顕微鏡画像を取得し、画像解析を行うことが記載されている。

しかし、特許文献２に記載の方法を用いて回収される癌細胞は、ウェル内に数個、場合によっては１個だけしか存在しない場合がある。ウェル内に癌細胞が１個でも存在すれば、その検体提供者は癌と診断されることになるが、特許文献２の記載には、ウェル内の癌細胞を効率よく探し出すための具体的なウェルの走査方法については、言及されていない。

本発明は、上記従来の問題点を鑑みてなされたものであり、ウェル内における測定対象とする細胞を効率よく検出することが可能な細胞スクリーニング方法、その方法に用いる制御ソフトウェア、細胞スクリーニング装置、及び画像解析装置、並びに細胞スクリーニングシステムを提供することを目的とする。

本件出願人は、細胞に照明光を照射する照明光学系、細胞から発せられる光を撮像する撮像光学系及び撮像素子、撮像のために細胞に焦点を合わせるオートフォーカス手段、細胞を格納したウェルを載置してスキャン位置に搬送するためのステージ、を備えた細胞スクリーニング装置と、細胞スクリーニング装置に連動して、撮像直後に撮像された画像を解析し、解析結果が所定の条件を満たしていた場合にはその情報を該細胞スクリーニング装置に送信して該当ウェル内のスクリーニングを終了させる画像解析装置及び制御ソフトウェアを有することで、効率よく細胞スクリーニングを行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明による細胞スクリーニング方法は、細胞スクリーニング装置が、細胞が格納されたマルチウェルプレートの各ウェルに対し所定のウェル順で第１のスキャンを行ない、且つ、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルの全領域を複数のショット領域に分け、各ショット領域に対し所定の順で第２のスキャンを行い、各ショット領域を撮像し、画像解析装置が、前記細胞スクリーニング装置により各ショット領域が撮像されるごとに、該細胞スクリーニング装置により撮像された当該ショット領域の画像を解析する細胞スクリーニング方法であって、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始することを特徴としている。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記検出対象とする細胞が、少なくとも１色以上の蛍光標識が施された、ヒト・動物由来の細胞であるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記検出対象とする細胞が、大腸癌細胞であるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記検出対象とする細胞が、子宮癌細胞であるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記検出対象とする細胞の検出目標数として、１個以上の設定が可能であり、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始し、当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象とする細胞の個数が目標数に到達しない場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を行うように、前記細胞スクリーニング装置及び前記画像解析装置を制御する制御ソフトウェアを用いるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記制御ソフトウェアは、ショット領域ごとに、重なりなく、且つ隙間なく前記第２のスキャンを行なうように前記細胞スクリーニング装置を制御するモードと、任意に設定した範囲のショット領域に対して前記第２のスキャンを行なうように前記細胞スクリーニング装置を制御するモードを選択可能に備えているのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記細胞スクリーニング装置が、撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に照明光を照射する照明光学系と、前記ウェル内の細胞から発せられる光を撮像する撮像手段と、前記撮像手段の焦点を前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に合わせるオートフォーカス手段と、前記マルチウェルプレートを載置し、各ウェル内の細胞を撮像位置に搬送するステージ、を有するのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニング方法においては、前記制御ソフトウェアは、解析手段により、前記画像解析装置が、前記細胞スクリーニング装置によって撮像された画像を撮像直後に解析し、解析した結果、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、その情報を送信手段により該細胞スクリーニング装置に送信し、制御手段により、該細胞スクリーニング装置が、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始するように、前記細胞スクリーニング装置及び前記画像解析装置を制御するのが好ましい。

また、本発明の制御ソフトウェアは、上記本発明の細胞スクリーニング方法に用いる制御ソフトウェアである。

また、本発明の細胞スクリーニング装置は、上記本発明の細胞スクリーニング方法に用いる細胞スクリーニング装置である。

また、本発明の画像解析装置は、上記本発明の細胞スクリーニング方法に用いる画像解析装置である。

また、本発明による細胞スクリーニングシステムは、細胞を格納する複数のウェルを備えたマルチウェルプレートを載置するとともに、該マルチウェルプレートの位置を撮像位置に対して調整可能なステージと、前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に照明光を照射する照明部と、前記ウェル内の細胞から発せられる光を撮像する撮像部と、前記撮像部の焦点を前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に合わせるオートフォーカス手段と、前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける全領域を複数ショット領域に分け、各ショット領域が所定のピッチ及び順で撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させるステージ駆動部を有する細胞スクリーニング装置を有する細胞スクリーニングシステムであって、検出対象とする細胞の条件及び検出目標数を設定可能な検出条件設定部と、前記撮像部を介して撮像された画像を解析し、前記検出条件設定部で設定された条件を満たす細胞を検出する解析部と、前記解析部での解析結果に応じて前記ステージ駆動部による前記ステージの駆動及び前記撮像部による撮像を制御するスキャン制御部を有し、前記スキャン制御部は、前記解析部で検出された細胞の個数が前記検出条件設定部を介して設定された目標数に達したとき、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記ステージ駆動部による撮像位置への位置合わせ及び前記撮像部による撮像を終了させて、次のスキャン対象となっているウェルにおける各ショット領域に対する該ステージ駆動部による撮像位置への位置合わせ及び該撮像部による撮像を開始させることを特徴としている。

また、本発明の細胞スクリーニングシステムにおいては、前記検出対象とする細胞は、少なくとも一色以上の蛍光標識が施された、人・動物由来の細胞であるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニングシステムにおいては、前記検出条件設定部は、前記検出対象とする細胞の検出目標数として、１個以上の設定が可能であるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニングシステムにおいては、前記ステージ駆動部は、前記各ウェルにおける各ショット領域が、重なりなく、且つ隙間なく、撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させるのが好ましい。

また、本発明の細胞スクリーニングシステムにおいては、前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける各ショット領域のスキャン範囲を設定するスキャン範囲設定部を有し、前記ステージ駆動部は、前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける前記スキャン範囲設定部で設定された範囲内で、各ウェルにおける各ショット領域が所定のピッチ及び順で撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させるのが好ましい。

本発明によれば、ウェル内における目的とする細胞を効率よく検出することが可能な細胞スクリーニング方法、その方法に用いる制御ソフトウェア、細胞スクリーニング装置、及び画像解析装置、並びに細胞スクリーニングシステムが得られる。

本発明の一実施形態にかかる細胞スクリーニング方法に用いる細胞スクリーニングシステムの概略構成を示す説明図である。 図１の細胞スクリーニングシステムを用いた本実施形態の細胞スクリーニング方法の処理手順の一例を示すフローチャートである。 本実施形態の細胞スクリーニング装置による、マルチウェルプレートにおけるウェルに対するスキャン順を示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニング装置における、１ウェルに対する撮像のショット数を概念的に示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニング装置における、１ウェルにおけるショット領域に対するスキャン順の一例を示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニングシステムのモニターに表示する、検出条件パラメータ設定画面の一例を示す説明図である。 図６の検出条件パラメータ設定画面における一設定項目である“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能の一例を示す説明図で、(a)は二つの細胞隣接もしくはくっついて存在する撮像画像に対し、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能を“ＯＦＦ”に設定して画像解析装置で解析したときの細胞の認識状態を示す図、(b)は二つの細胞隣接もしくはくっついて存在する撮像画像に対し、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能を“ＯＮ”に設定して画像解析装置で解析したときの細胞の認識状態を示す図である。 本実施形態の細胞スクリーニングシステムを用いて、ショット領域（ｉ，ｇ）を開始位置として、スクリーニングを開始し、ショット領域（ｉｖ，ｊ）まで進んだ状態を示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニングシステムにおいて、ショット領域（ｉｖ，ｊ）まで進んだとき、ショット領域（ｉｖ，ｊ）の画像から各種パラメータ設定項目で設定した条件を満足する陽性細胞が目標数検出されたときの画像解析装置が認識した画像認識状態の一例を示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニングシステムを用いてマルチウェルプレートの全てのウェルに対するスクリーニングを行った結果、検出対象の細胞が目標数検出されたウェルの一例を示す説明図である。 本実施形態の細胞スクリーニングシステムのモニターに表示する、スクリーニング後における陽性細胞及び各ウェルの任意のショット領域を再確認するためのリコール機能を備えたＧＵＩの一例を示す説明図である。

本発明のように、解析に必要な細胞数をスクリーニングの前に設定するなどして、スキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数（最低１つ）に到達した場合、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの第１のスキャン、第１のスキャンを行なっているウェルにおける各ショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析に切り替えるようにすれば、スクリーニングに費やされる時間を節約することができる。特に、細胞ベースの診断であって、生体サンプルから抽出される細胞数が非常に少なく、１細胞でも検出されたときには陽性として扱うような診断においては、スクリーニング時間の節約効果が非常に大きくなる。

以下、図面を用いて本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかる細胞スクリーニング方法に用いる細胞スクリーニングシステムの概略構成を示す説明図、図２は図１の細胞スクリーニングシステムを用いた本実施形態の細胞スクリーニング方法の処理手順の一例を示すフローチャートである。
本実施形態の細胞スクリーニングシステムは、細胞スクリーニング装置と、画像解析装置と、制御ソフトウェアを有して構成されている。

細胞スクリーニング装置は、電動ステージ１０１と、照明部と、撮像部と、オートフォーカス手段としてのオートフォーカス（ＡＦ）ユニット１０９と、ステージ駆動部としてのステージコントローラ１１５を有している。
電動ステージ１０１は、ステージコントローラ１１５に接続され、マルチウェルプレート１を載置するとともに、撮像位置に対して調整可能に構成されている。
なお、本実施形態では、マルチウェルプレート１として、９６ウェルのマルチウェルプレートを用いている。マルチウェルプレート１には、１ウェルごとに異なる被検者から採取された、例えば、少なくとも１色以上の蛍光標識が施された、ヒト・動物由来の大腸癌細胞や子宮癌細胞などの検出対象とする細胞が含まれている可能性のある検体が格納されている。格納した検体が陰性の被検者のものである場合は、そのウェルには目的とする細胞は存在せず、陽性の被検者のものである場合は、そのウェルには目的とする細胞が１つ以上存在する可能性が高くなる。

照明部は、水銀キセノンランプ１０２と、ランプ電源１０３と、シャッターユニット１０４と、コリメータレンズ１０５を有している。
水銀キセノンランプ１０２はランプ電源１０３に接続され、マルチウェルプレート１の各ウェルに格納されている蛍光染色された細胞を照明する。シャッターユニット１０４は、シャッターブレード１０４ａを内蔵し、細胞の画像を撮像する際の褪色を防ぐために、必要な露光時間以外に照明光を遮断する。コリメータレンズ１０５は、水銀キセノンランプ１０２の光を平行光線にして、蛍光キューブ１０７に導く。

蛍光キューブ１０７は、ダイクロイックミラー１０７Ａ、励起フィルター１０７Ｂ、吸収フィルター１０７Ｃを備えている。また、本実施形態の細胞スクリーニング装置では、複数の蛍光色素に対応できるようにするために、蛍光キューブ１０７を複数内蔵することができるターレット（図示省略）を備えている。そして、不図示の回転機構を介してターレットを回転することにより蛍光キューブ１０７の切り替えができるようになっている。

撮像部は、結像レンズ１０８と、ＣＣＤカメラ１１０を有している。
結像レンズ１０８は、ウェル内の細胞から発せられる光をＣＣＤカメラ１１０内部のＣＣＤ素子に細胞画像として結像させる。ＣＣＤカメラ１１０は、カメラコントローラ１１１に接続され、カメラコントローラ１１１により制御されている。本実施形態では、ＣＣＤカメラ１１０には、１２ビットのＣＣＤカメラを用いている。

カメラコントローラ１１１は、ＣＣＤカメラ１１０を介して撮像された画像をパーソナルコンピュータｌ１２に送信する。

オートフォーカス（ＡＦ）ユニット１０９は、一般的によく知られている瞳分割方式のＡＦユニットであり、ＡＦコントローラ１０９Ａと、半導体レーザー素子１０９Ｂと、偏光ビームスプリッタ１０９Ｃと、２分割フォトディテクター１０９Ｄとで構成されている。そして、オートフォーカスユニット１０９は、半導体レーザー素子１０９Ｂから発し、偏光ビームスプリッタ１０９Ｃを経由したＡＦ用レーザー光線を、プリズム１１７、対物レンズ１１８を経由してマルチウェルプレート１に照射し、マルチウェルプレート１から反射され、対物レンズ１１８、プリズム１１７を経由した光を、偏光ビームスプリッタ１０９Ｃを経由して、２分割フォトディテクター１０９Ｄで受光し、ＡＦコントローラ１０９Ａが受光結果に応じて不図示の対物レンズ駆動ユニットを介して対物レンズ１１８を上下に動作させて、フォーカスを合わせる。

ステージコントローラ１１５は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１１２に接続されている。そして、ＰＣ１２に備わる後述の制御ソフトウェアによる制御により、マルチウェルプレート１の各ウェルにおける各ショットでの撮像領域が、所定のピッチ及び順で撮像位置に位置合わせされるように、電動ステージ１０１を駆動させる。

画像解析装置は、カメラコントローラ１１１とパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１１２を有して構成されている。そして、ＰＣ１２に備わる後述の制御ソフトウェアによる制御により、撮像部を介して撮像された画像を解析し、スキャン対象のウェルごとに、後述の検出条件設定部で設定された検出対象の細胞を検出する。

ＰＣ１１２は、カメラコントローラ１１１と、ステージコントローラ１１５と、不図示の顕微鏡コントローラと接続されている。また、ＰＣ１１２は、これらのコントローラを介して上述のＡＦ制御や蛍光キューブの切り替え制御、ＣＣＤカメラ１１０からの画像の取り込み制御、画像解析装置での解析結果に応じた電動ステージ１０１の駆動制御等を行う制御手段として機能するようにプログラミングされた、制御ソフトウェアを備えている。
図１中、１１３はキーボード、１１４はモニター、１１６はマウスである。本実施形態の細胞スクリーニング装置は、モニター１１４、キーボード１１３、及びマウス１１６が検出条件設定部として機能し、検出対象とする細胞の条件及び検出目標数を設定可能に構成されている。

また、制御ソフトウェアは、検出対象とする細胞の検出目標数として、１個以上の設定が可能となるように検出条件設定部を制御するようにプログラミングされている。
また、制御ソフトウェアは、ショット領域ごとに、重なりなく、且つ隙間なく第２のスキャンを行なうように細胞スクリーニング装置を制御するモードと、任意に設定した範囲のショット領域に対して第２のスキャンを行なうように細胞スクリーニング装置を制御するモードを選択可能にプログラミングされている。

また、制御ソフトウェアは、第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの第１のスキャン、第１のスキャンを行なっているウェルにおける各ショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始し、当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達しない場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次のショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を行うように、細胞スクリーニング装置及び画像解析装置を制御するようにプログラミングされている。
詳しくは、制御ソフトウェアは、解析手段により、画像解析装置が、細胞スクリーニング装置によって撮像された画像を撮像直後に解析し、解析した結果、第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、その情報を送信手段により細胞スクリーニング装置に送信し、制御手段により、細胞スクリーニング装置が、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対するステージ駆動部による撮像位置への位置合わせ及び撮像部による撮像を終了して、次のスキャン対象となっているウェルにおける各ショット領域に対するステージ駆動部による撮像位置の位置合わせ及び撮像部での撮像を開始するように、スクリーニング装置及び画像解析装置を制御するようにプログラミングされている。

図３は本実施形態の細胞スクリーニング装置による、第１のスキャンである、マルチウェルプレートにおけるウェルに対するスキャン順を示す説明図である。
本実施形態の細胞スクリーニング装置では、制御ソフトウェアが、同じ行位置に並ぶウェルごとに、行方向の向きを変えてスキャン制御（ステージコントローラ１１５を介した電動ステージ１０１の駆動、及び撮像部による撮像）をするようにプログラミングされている。例えば、図３に示すように、Ａ行に並ぶ各ウェルを１列目のウェルから１２列目のウェルへと順にスキャンし、次いで、Ｂ行に並ぶ各ウェルを１２列目のウェルから１列目のウェルへと順にスキャンする。以後、同様のスキャン動作を最後のウェル（図３の例ではＨ行における１列目のウェル）まで繰り返す。全てのこのような順序でスキャンすると、電動ステージ１０１のウェルの搬送動作が最小限に抑えられて、プレートに配列された全てのウェルを効率よくスキャンすることができ時間の短縮を図ることができる。

図４は本実施形態の細胞スクリーニング装置における、１ウェルに対する撮像のショット数を概念的に示す説明図である。図４中、円形で表わされているものがウェルで、小さい四角で表されているものが夫々１ショットで撮像される領域を示している。各ショット領域は、ウェルの少なくとも一部の領域を含んでいる。
本実施形態のスクリーニング装置では、制御ソフトウェアは、これらの各ショットで撮像される領域が隙間なく並ぶように、ステージコントローラ１１５による電動ステージ１０１の駆動を制御するようにプログラミングされており、撮像部でウェルの全領域を撮像することができるようになっている。

図５は本実施形態の細胞スクリーニング装置における、第２のスキャンである、１ウェルにおけるショット領域に対するスキャン順の一例を示す説明図である。
本実施形態の細胞スクリーニング装置では、制御ソフトウェアは、ウェルにおける中心から水平方向に最も離れた一方の領域から他方の領域に向けて、同じ列位置に並ぶショット領域ごとに、列方向の向きを変えてスキャンするように、プログラミングされている。例えば、図５に示すように、ｉ列に並ぶ各ショット領域をｇ行目のショット領域からｊ行目のショット領域へと順に、撮像位置に搬送して撮像し、次いで、ｉｉ列に並ぶ各ショット領域をｍ行目のショット領域からｅ行目のショット領域へと順に、撮像位置に搬送して撮像する。以後、同様のスキャン動作を最後のショット領域（図５の例ではＸＶｉｉ列におけるｍ行目のウェル）まで繰り返す。

図６は本実施形態の細胞スクリーニングシステムのモニター１１４に表示する、検出条件パラメータ設定画面の一例を示す説明図である。
本実施形態の細胞スクリーニングシステムでは、制御ソフトウェアは、モニター１１４に検出条件パラメータを表示し、キーボード１１３、マウス１１６を介して、検出対象とする細胞の条件及び検出目標数を設定することができるようにプログラミングされている。
図６中、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ”は、撮像されるショット中のピクセルのうち、検出対象とするピクセルの輝度の最小値の設定項目、“Ｍａｘｉｍｕｍ Ｃｅｌｌ Ｓｉｚｅ”は、検出対象とする物体における、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ”で設定した輝度の最小値以上の輝度値を有する面積の最大値の設定項目、“Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｃｅｌｌ Ｓｉｚｅ”は、検出対象とする物体における、“Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ”で設定した輝度の最小値以上の輝度値を有する面積の最小値の設定項目である。“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”は、ウェル内の細胞密度が高く、細胞が混み合っている場合において、複数の細胞が一つの細胞として誤認識されることを防ぐ機能についてのＯＮ／ＯＦＦの設定項目である。

図７に“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能の一例を示す。例えば、複数の細胞が隣接もしくはくっついて存在している場合、モニター１１４に表示された検出条件パラメータ設定画面において、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能設定項目を“ＯＦＦ”に設定した場合には、図７(a)に示すように、二つの細胞が一つの細胞として誤認識されてしまう。しかし、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能設定項目を“ＯＮ”に設定すると、図７(ｂ)に示すように、細胞画像のくびれやエッジを認識することによって正しく細胞を分割することができる。通常、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能設定項目は“ＯＮ”に設定しておくのが好ましい。なお、明らかに細胞密度が低い場合には、“Ｗａｔｅｒ Ｓｈｅｄ”機能を用いることなく個々の細胞を正しく認識することができるので、この機能を“ＯＦＦ”に設定すれば、その分、画像処理速度を高めることができる。

“Ｃｅ１１ Ｃｏｕｎｔ”は、１ウェルにおける検出対象とする細胞の検出目標数の設定項目である。図６の例では、１個に設定している。
本実施形態の細胞スクリーニングシステムでは、制御ソフトウェアは、ＰＣ１１２がスキャン制御部として機能し、画像解析装置を介して検出された１ウェル中における検出対象とする細胞の個数が“Ｃｅ１１ Ｃｏｕｎｔ”で設定した目標の個数に達したときに、当該ウェルに対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの第１のスキャン、第１のスキャンを行なっているウェルにおける各ショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始するように、プログラミングされている。

このように構成された本実施形態の細胞スクリーニングシステムを用いた細胞スクリーニングは次のようにして行う。
使用者は、システムを起動するとともに、各ウェルに検体を格納したマルチプレートウェル１を電動ステージ１０１に載置し、ＰＣｌ１２、キーボード１１３、モニター１１４、及びマウス１１６を操作して、第１のスキャンを行なうウェルを選択する（ステップＳ１）。
次いで、操作者は、図６に示すように、モニター１１４に表示された検出条件パラメータ設定画面において、各種のパラメータ（検出対象とする細胞の条件及び検出目標数）を設定する。また、その他モニター１１４、ＰＣｌ１２、キーボード１１３、モニター１１４、及びマウス１１６を操作して、撮像条件、照明条件、オートフォーカス条件、１プレート内での撮像対象とするウェル数を設定する（ステップＳ２）。
次いで、使用者は、スクリーニングをスタートさせる（ステップＳ３）。

使用者が、スクリーニングをスタートさせると、第一ウェル（本実施の形態の場合はＡ１ウェル）から、図８に示すように、ショット領域（ｉ，ｇ）を開始位置として、第２のスキャン（電動ステージ１０１による撮像位置への搬送、撮像部による撮像）を開始する（ステップＳ４〜Ｓ６）。また、撮像部による撮像と同時に、画像解析装置がショット領域毎の画像を解析し、ショット領域ごとの画像中に、検出条件パラメータ設定画面で設定した条件を満足する陽性細胞が存在するかどうかを認識する（ステップＳ７）。なお、本実施形態の細胞スクリーニングシステムでは、その際、バックグランド除去などの処理を行うように、制御ソフトウェアを構成してもよい。なお、細胞認識のための検出条件パラメータは、図６に示した他に、サーキュラリティーファクター、円周ペリメータ、エロンゲーションファクターなどを含めるとともに、そのパラメータに応じた解析を行うように制御ソフトウェアを構成すると、なお良い。

次いで、画像解析装置による最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、上述の各種パラメータ設定項目で設定した条件を満足する陽性細胞を検出した個数が目標数に到達したか否かをチェックする（ステップＳ８）。陽性細胞を検出した個数が目標数に到達していないときは、画像解析装置で解析した当該ショット領域がウェル内の最後のショット領域であるか否かをチェックする（ステップＳ９）。ウェル内の最後のショット領域でない場合は、同一ウェル内の次のショット領域が撮像位置に位置するように電動ステージ１０１を駆動し（ステップＳ１０）、同一ウェル内の次のショット領域のスクリーニングへと処理を切り替える（ステップＳ５以降の処理）。ウェル内の最後のショット領域である場合は、この最後のショット領域がマルチウェルプレート１における最後のウェルにおけるものであるかをチェックする（ステップＳ１１）。このウェルが、最後のウェルにおけるものでない場合、次のウェルが撮像位置に位置するように、電動ステージ１０１を駆動し（ステップＳ１２）、次のウェルのスクリーニングへと処理を切り替える（ステップＳ５以降の処理）。このウェルが、最後のウェルにおけるものである場合、モニター１１４を介して後述の結果表示を行う（ステップＳ１３）。

ここで、本実施形態の細胞スクリーニングシステムにおいて、ショット領域（ｉ，ｇ）より開始したショットが、図８に示すように、ショット領域（ｉｖ，ｊ）まで進んだとき、ショット領域（ｉｖ，ｊ）の画像から上述の各種パラメータ設定項目で設定した条件を満足する陽性細胞が目標数検出されるものとする。
図９にそのときの画像解析装置が認識した画像認識状態の一例を示す。図９の例では、陽性細胞は３つ検出されており、認識されたことを示す四角い粋が３つ細胞を囲んで表示されている。本実施形態の細胞スクリーニングシステムでは、この段階で、このウェルに対するスクリーニングを終了し、この最後のショット領域がマルチウェルプレート１における最後のウェルにおけるものであるかをチェックする（ステップＳ１４）。このウェルが、最後のウェルにおけるものでない場合、次のウェルが撮像位置に位置するように、電動ステージ１０１を駆動し（ステップＳ１２）、次のウェルのスクリーニングへと処理を切り替える（ステップＳ５以降の処理）。このウェルが、最後のウェルにおけるものである場合、モニター１１４を介して図１０に一例として示すような結果表示を行う（ステップＳ１５）。

図１０の例では、モニター１１４において陽性細胞を含むウェルを色づけして示している。このとき、本実施形態の細胞スクリーニング装置では、色づけして表示されているウェルをマウス１１６でクリックすると、図９に示したような解析画面を表示するように構成されている。

なお、本実施形態の細胞スクリーニングシステムにおいては、制御ソフトウェアに、スクリーニング後に、陽性細胞及び各ウェルの任意のショット領域を再確認するためのリコール機能を備えるとさらによい。例えば、図１１に示すようなＧＵＩ（グラフィカルユーザインタフェース：Graphical User Interface）をＰＣｌ１２のモニター１１４に表示し、陽性細胞を目視で再確認することができるようにしてもよい。図１１において、２０１は撮像画面、２０２はスクリーニング対象のウェルを模式的に表した画面で、中心部分にウェル番号（例：Ａ１）が表示されるようになっている。２０３は画面２０２に表示されたウェルにおいて陽性細胞が見つかったショット領域を示す。２０４は現在、撮像画面２０１が表示しているウェル内のショット領域を示している。２０５は撮像画面の表示領域を移動させる場合に用いるスキャンボタンで、上下左右のボタンで電動ステージ１０１を所定方向に所定量駆動し、ウェル内における撮像領域を移動させることができる。２０６は照明設定項目であり、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（明るさ）や、Ｆｉｌｔｅｒ（蛍光フィルター）の選択ができるようになっている。２０７は対物レンズ切り替え設定項目であり、陽性細胞の画像をさらに大きく拡大して詳細に調査する場合など、スクリーニング時の倍率よりも大きい倍率（例えば６０×等）にする等所定の対物レンズを設定することができるようになっている。

本実施形態の細胞スクリーニングシステム、細胞スクリーニング方法及び細胞スクリーニング装置によれば、スキャン中に検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、次のウェルへの第１のスキャン、第１のスキャンを行なっているウェルにおける各ショット領域に対する第２のスキャン、撮像及び画像解析に切り替えるようにしたので、効率のよいスクリーニングをすることができ、スクリーニングに費やされる時間を節約することができる。特に、細胞ベースの診断であって、生体サンプルから抽出される細胞数が非常に少なく、１細胞でも検出されたときには陽性として扱うような診断においては、スクリーニング時間の節約効果が非常に大きくなる。

マルチウェルプレート等の細胞アレイ用プレートに配列された各容器内の細胞を走査して、細胞の表面又は内部から発せられる蛍光等の光を撮像し、撮像した細胞の画像を解析し、解析結果を出力することが求められる臨床検査の分野において特に有用である。

１ マルチウェルプレート
１０１ 電動ステージ
１０２ 水銀キセノンランプ
１０３ ランプ電源
１０４ シャッターユニット
１０４ａ シャッターブレード
１０５ コリメータレンズ
１０７ 蛍光キューブ
１０７Ａ ダイクロイックミラー
１０７Ｂ 励起フィルター
１０７Ｃ 吸収フィルター
１０８ 結像レンズ
１０９ オートフォーカス（ＡＦ）ユニット
１０９Ａ ＡＦコントローラ
１０９Ｂ 半導体レーザー素子
１０９Ｃ 偏光ビームスプリッタ
１０９Ｄ ２分割フォトディテクター
１１０ ＣＣＤカメラ
１１１ カメラコントローラ
１１２ パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
１１３ キーボード
１１４ モニター
１１５ ステージコントローラ
１１６ マウス
１１７ プリズム
１１８ 対物レンズ

Claims (16)

1. 細胞スクリーニング装置が、細胞が格納されたマルチウェルプレートの各ウェルに対し所定のウェル順で第１のスキャンを行ない、且つ、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルの全領域を複数のショット領域に分け、各ショット領域に対し所定の順で第２のスキャンを行い、各ショット領域を撮像し、画像解析装置が、前記細胞スクリーニング装置により各ショット領域が撮像されるごとに、該細胞スクリーニング装置により撮像された当該ショット領域の画像を解析する細胞スクリーニング方法であって、
   前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始することを特徴とする細胞スクリーニング方法。
2. 前記検出対象とする細胞が、少なくとも１色以上の蛍光標識が施された、ヒト・動物由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の細胞スクリーニング方法。
3. 前記検出対象とする細胞が、大腸癌細胞であることを特徴とする請求項２に記載の細胞スクリーニング方法。
4. 前記検出対象とする細胞が、子宮癌細胞であることを特徴とする請求項２に記載の細胞スクリーニング方法。
5. 前記検出対象とする細胞の検出目標数として、１個以上の設定が可能であり、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始し、当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達しない場合は、当該ウェルにおける当該ショット領域の次のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を行うように、前記細胞スクリーニング装置及び前記画像解析装置を制御する制御ソフトウェアを用いることを特徴とする、請求項１に記載の細胞スクリーニング方法。
6. 前記制御ソフトウェアは、ショット領域ごとに、重なりなく、且つ隙間なく前記第２のスキャンを行なうように前記細胞スクリーニング装置を制御するモードと、任意に設定した範囲のショット領域に対して前記第２のスキャンを行なうように前記細胞スクリーニング装置を制御するモードを選択可能に備えていることを特徴とする請求項５に記載の細胞スクリーニング方法。
7. 前記細胞スクリーニング装置が、
   撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に照明光を照射する照明光学系と、
   前記ウェル内の細胞から発せられる光を撮像する撮像手段と、
   前記撮像手段の焦点を前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に合わせるオートフォーカス手段と、
   前記マルチウェルプレートを載置し、各ウェル内の細胞を撮像位置に搬送するステージ、を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞スクリーニング方法。
8. 前記制御ソフトウェアは、解析手段により、前記画像解析装置が、前記細胞スクリーニング装置によって撮像された画像を撮像直後に解析し、解析した結果、前記第１のスキャンを行っている当該ウェルにおける最初のショット領域の画像解析から当該ショット領域の画像解析までを通じて、検出対象として検出する細胞の個数が目標数に到達した場合、その情報を送信手段により該細胞スクリーニング装置に送信し、制御手段により、該細胞スクリーニング装置が、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像を終了して、次のウェルへの前記第１のスキャン、前記第１のスキャンを行なっている前記次のウェルにおける各ショット領域に対する前記第２のスキャン、撮像及び画像解析を開始するように、前記細胞スクリーニング装置及び前記画像解析装置を制御することを特徴とする請求項５又は６、請求項５又は６に従属する請求項７のいずれかに記載の細胞スクリーニング方法。
9. 請求項８に記載の細胞スクリーニング方法に用いる制御ソフトウェア。
10. 請求項８に記載の細胞スクリーニング方法に用いる細胞スクリーニング装置。
11. 請求項８に記載の細胞スクリーニング方法に用いる画像解析装置。
12. 細胞を格納する複数のウェルを備えたマルチウェルプレートを載置するとともに、該マルチウェルプレートの位置を撮像位置に対して調整可能なステージと、前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に照明光を照射する照明部と、前記ウェル内の細胞から発せられる光を撮像する撮像部と、前記撮像部の焦点を前記撮像位置に位置する前記ウェル内の細胞に合わせるオートフォーカス手段と、前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける全領域を複数ショット領域に分け、各ショット領域が所定のピッチ及び順で撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させるステージ駆動部を有する細胞スクリーニング装置を有する細胞スクリーニングシステムであって、
    検出対象とする細胞の条件及び検出目標数を設定可能な検出条件設定部と、
    前記撮像部を介して撮像された画像を解析し、前記検出条件設定部で設定された条件を満たす細胞を検出する解析部と、
    前記解析部での解析結果に応じて前記ステージ駆動部による前記ステージの駆動及び前記撮像部による撮像を制御するスキャン制御部を有し、
    前記スキャン制御部は、前記解析部で検出された細胞の個数が前記検出条件設定部を介して設定された目標数に達したとき、当該ウェルにおける当該ショット領域の次以降のショット領域に対する前記ステージ駆動部による撮像位置への位置合わせ及び前記撮像部による撮像を終了させて、次のスキャン対象となっているウェルにおける各ショット領域に対する該ステージ駆動部による撮像位置への位置合わせ及び該撮像部による撮像を開始させることを特徴とする細胞スクリーニングシステム。
13. 前記検出対象とする細胞は、少なくとも一色以上の蛍光標識が施された、人・動物由来の細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞スクリーニングシステム。
14. 前記検出条件設定部は、前記検出対象とする細胞の検出目標数として、１個以上の設定が可能であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞スクリーニングシステム。
15. 前記ステージ駆動部は、前記各ウェルにおける各ショット領域が、重なりなく、且つ隙間なく、撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させることを特徴とする請求項１２に記載の細胞スクリーニングシステム。
16. 前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける各ショット領域のスキャン範囲を設定するスキャン範囲設定部を有し、
    前記ステージ駆動部は、前記マルチウェルプレートの各ウェルにおける前記スキャン範囲設定部で設定された範囲内で、各ウェルにおける各ショット領域が所定のピッチ及び順で撮像位置に位置合わせされるように、前記ステージを駆動させることを特徴とする請求項１２に記載の細胞スクリーニングシステム。