JP5761548B2 - 不活性炭化水素の水酸化方法およびダミー分子 - Google Patents

Description

本発明は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとダミー分子とを用いて不活性炭化水素を水酸化する方法、および、この水酸化方法に用いられるダミー分子に関する。

細菌由来の酵素であるシトクロムＰ４５０は、真核生物由来のシトクロムＰ４５０に比べて高い触媒活性を持つことが知られている。細菌由来のシトクロムＰ４５０として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のシトクロムＰ４５０ｃａｍや、バチルス属菌細菌の一種であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０ＢＭ３等の、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが知られている。

例えば、シトクロムＰ４５０ｃａｍは、樟脳（カンファー）の水酸化反応を、毎分１０００回転を超える速さで触媒することができる。この触媒活性は、哺乳類のＰ４５０の触媒活性（毎分数回から数十回転程度）と比較すると非常に高い。シトクロムＰ４５０ＢＭ３は、脂肪酸の末端から数えて１〜３番目（ω−１〜ω−３）のメチレン基の水酸化を触媒する。シトクロムＰ４５０ＢＭ３の触媒活性は毎分数千回転に達し、シトクロムＰ４５０ＢＭ３はシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼとしては最大の活性を有する。

また、真核生物由来のＰ４５０は膜蛋白質であるため、水に対する親和性が著しく低い。これに対して上述したシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、水に対する親和性が高く、酵素蛋白の精製、結晶化ならびに取り扱いが容易である。

また、シトクロムＰ４５０は、ＮＡＤＰＨなどの電子供与体（以下、Ｐ４５０還元系と呼ぶ）と酸素とを用い、基質の水酸化を触媒する。単離したシトクロムＰ４５０の触媒活性を向上させるためには、Ｐ４５０還元系からＰ４５０への電子伝達を効率よく進行させる必要がある。上述したシトクロムＰ４５０ＢＭ３は、通常のシトクロムＰ４５０とは異なり、Ｐ４５０還元系の一部（シトクロムＰ４５０ＢＭ３ではＦＡＤおよびＦＭＮ）とＰ４５０とが融合して、１本のポリペプチドとして存在している。そして、Ｐ４５０還元系の一部とＰ４５０とが融合し非常に近接していることが、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの優れた触媒活性の一つの要因となっている。換言すると、シトクロムＰ４５０ＢＭ３は融合蛋白であるため、非常に優れた触媒活性を示す。Ｐ４５０ｃａｍは融合蛋白ではない。このため、Ｐ４５０ｃａｍの触媒反応には、プチダレドキシン（Ｐｄｘ）とプチダレドキシン還元酵素（ＰｄＲ）とが必須である。しかしＰ４５０ｃａｍもまた、上述したように優れた触媒活性を示す。

これらの理由により、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、バイオ触媒として適していると考えられる。

ところで、野生型のシトクロムＰ４５０の基質とならない物質、または、野生型のシトクロムＰ４５０によって水酸化され難い基質を水酸化するため、野生型のシトクロムＰ４５０を生産する細菌を形質転換して、これらの物質を基質とし得るシトクロムＰ４５０（以下、変異型シトクロムＰ４５０と呼ぶ）を発現させる技術が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。

例えば、野生型のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シクロヘキサン、プロパン、ベンゼン、エタン、メタン等の不活性炭化水素に対する触媒活性が非常に低い。しかし変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであれば、これらの不活性炭化水素の水酸化を触媒できる可能性がある。

しかし、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを安価に量産するのは困難である。このため変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、不活性炭化水素を大量かつ継続的に（すなわち工業的に）水酸化するのには適していない問題があった。

特表２０００−５０８１６３号公報 特表２００３−５１７８１５号公報 特表２００３−５２１８８９号公報

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを用いて不活性炭化水素を工業的に水酸化できる方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決する本発明の不活性炭化水素の水酸化方法は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと、ダミー分子と、不活性炭化水素とを共存させて、該不活性炭化水素を水酸化する工程を含み、
該ダミー分子は、該シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの結合部位に結合可能な末端構造と、アルキル鎖と、を持ち、
該アルキル鎖に含まれる少なくとも一部の水素がフッ素で置換されていることを特徴とする。

本発明の不活性炭化水素の水酸化方法は、以下の（１）〜（５）の何れかを備えるのが好ましく、（１）〜（５）の複数を備えるのがより好ましい。

（１）前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである。

（２）前記ダミー分子のなかで、少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目のアルキル基に含まれる水素は、フッ素で置換されている。

（３）前記末端構造は、水素末端、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基から選ばれる少なくとも一種である。

（４）前記不活性炭化水素は、シクロヘキサン、ブタン、プロパン、ベンゼンから選ばれる少なくとも一種である。

（５）前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持ち、
前記ダミー分子は、パーフルオロカルボン酸である。

上記課題を解決する本発明のダミー分子を含む組成物は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび不活性炭化水素と共存させて、該不活性炭化水素を水酸化するためのダミー分子を含む組成物であって、
該シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの結合部位に結合可能な末端構造と、アルキル鎖と、を持ち、
該アルキル鎖に含まれる少なくとも一部の水素がフッ素で置換されていることを特徴とする。

本発明のダミー分子を含む組成物は以下の（６）〜（８）の何れかを備えるのが好ましく、（６）〜（８）の複数を備えるのがより好ましい。

（６）少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目のアルキル基に含まれる水素がフッ素で置換されている。

（７）前記末端構造は、水素末端、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基から選ばれる少なくとも一種である。

（８）前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持ち、
前記ダミー分子は、パーフルオロカルボン酸である。
以下、本明細書において「ダミー分子を含む組成物」を単にダミー分子と略する。

以下、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをＰ４５０と略する。Ｐ４５０の触媒反応は、以下のように開始すると考えられている。

Ｐ４５０の活性中心には、基質が結合する結合部位が存在する。基質が結合部位に結合すると、活性中心に存在する水分子が活性中心から押し出される。以下、この状態を活性化スイッチが入る、と呼ぶ。活性中心は、その後、電子や酸素分子等の作用を受けた後に、基質の水酸化を触媒する。したがって、活性化スイッチが入らないと、Ｐ４５０の触媒反応は開始しないと考えられている。なお、野生型のＰ４５０の基質としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸が知られている。これらの基質は、結合部位に結合する末端構造（カルボキシル基）と、アルキル鎖とを持つ。

本発明の不活性炭化水素の水酸化方法は、ダミー分子の共存下で、Ｐ４５０によって不活性炭化水素の水酸化を触媒する方法である。ダミー分子は、Ｐ４５０の結合部位に結合可能な部分（末端構造）と、アルキル鎖とを持つ。このためダミー分子とＰ４５０とを共存させると、ダミー分子が基質のかわりにＰ４５０の結合部位に結合し、活性化スイッチが入ると考えられる。

上述したように、不活性炭化水素に対する野生型Ｐ４５０の触媒活性は非常に低い。しかし、活性化スイッチが入ることで、不活性炭化水素に対する野生型Ｐ４５０の触媒活性が向上する。したがって、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法によると、野生型のＰ４５０を用いて不活性炭化水素を水酸化できる。

また、このダミー分子において、アルキル鎖に含まれる少なくとも一部の水素は、フッ素で置換されている。このため、ダミー分子は活性中心の疎水性を高め、水分子を活性中心から排除すると考えられる。このため、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法によると、Ｐ４５０における活性化スイッチが入り易く、触媒反応が進行し易い。

これらの作用によって、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法によると、野生型のＰ４５０によっても不活性炭化水素を水酸化できる。よって、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを用いて不活性炭化水素を工業的に水酸化できる。なお、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法によると、変異型Ｐ４５０を用いて不活性炭化水素を水酸化することも可能である。

プロパンの水酸化確認試験で用いた反応装置を模式的に表す説明図である。 ダミー分子のアルキル鎖長、プロパノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。 反応時間、プロパノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。 パルミチン酸が結合したＰ４５０ＢＭ３の活性中心、および、ＰＦＣ１０が結合したＰ４５０ＢＭ３の活性中心を模式的に表す説明図である。 ダミー分子の鎖長、ヘキサンの有無およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。 シクロヘキサンの水酸化確認試験で得られたガスクロマトグラフィー分析結果を表すグラフである。 ダミー分子の鎖長、シクロヘキサノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。 ベンゼンの水酸化確認試験で得られたガスクロマトグラフィー分析結果を表すグラフである。 ダミー分子のアルキル鎖長、フェノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。 ダミー分子のアルキル鎖長、２−ブタノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフである。

本発明の不活性炭化水素の水酸化方法で用いるＰ４５０としては、シトクロムＰ４５０ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）および／またはシトクロムＰ４５０ｃａｍ（カンファー５−モノオキシゲナーゼ、ＣＹＰ１０１）を特に好ましく選択できる。上述したように、これらのＰ４５０は触媒活性に優れるからである。

また、Ｐ４５０としては、シトクロムＰ４５０ＢＭ３、シトクロムＰ４５０ｃａｍのみでなく、これらの酵素のアミノ酸配列とアミノ酸配列が一部異なる酵素を用いても良い。例えば、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ＢＭ３のファミリー酵素）や、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と５５％以上の相同性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ＢＭ３のサブファミリー酵素）を好ましく用いることができる。或いは、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ｃａｍのファミリー酵素）や、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と５５％以上の相同性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ｃａｍのサブファミリー酵素）を好ましく用いることができる。なお、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のファミリー酵素またはサブファミリー酵素は脂肪酸を水酸化可能であるのが好ましく、シトクロムＰ４５０ｃａｍのファミリー酵素またはサブファミリー酵素はカンファー（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｏ）を水酸化可能であるのが好ましい。
なお、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６４（１９），１０９８７−１０９９８（１９８９）や、ＮＣＢＩのベータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐ１４７７９．２）に開示されているように、公知である。また、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸もまた、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＹＰ_７１４０２９）に開示されているように公知である。本発明の不活性炭化水素の水酸化方法で用いるダミー分子は、末端構造とアルキル鎖とを持つ。ダミー分子の一例を下式１に示す。
（式１）

末端構造（式１中Ｒ）は、Ｐ４５０の結合部位に結合可能であれば良く、水素末端、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基等が例示される。ダミー分子の末端構造は１のみであっても良いし、複数であっても良い。１つのダミー分子に含まれる複数の末端構造は、同一の構造であっても良いし、互いに異なる構造であっても良い。

ダミー分子におけるアルキル鎖の鎖長は特に限定されない。また、ダミー分子のアルキル鎖は１のみであっても良いし、複数に分岐していても良いし、環状であっても良い。本発明のダミー分子においては、このアルキル鎖に含まれる一部または全部の水素がフッ素置換されていれば良いが、後述するように、少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目のアルキル基に含まれる水素がフッ素で置換されているのが好ましい。少なくとも、アルキル鎖の末端から数えて１〜７番目のアルキル基に含まれる水素がフッ素で置換されているのがさらに好ましい。

ダミー分子としては、例えば式２に示すようなものを用いることもできる。
（式２）

本発明の不活性炭化水素の水酸化方法において、Ｐ４５０、ダミー分子および不活性炭化水素の反応は、バッチ式でおこなっても良いし、連続的におこなっても良い。反応を連続的におこなう場合には、Ｐ４５０を公知の酵素固定手段（例えば、反応槽の壁面やフィルタ等）に固定化すれば良い。さらに、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法における反応系は、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ）、酸素分子等のＰ４５０の反応に必要な因子を含むのが良い。

Ｐ４５０としては、野生型を用いても良いし、変異型を用いても良いが、上述したように不活性炭化水素を工業的に水酸化するためには、野生型を用いるのが好ましい。

以下、本発明の不活性炭化水素の水酸化方法およびダミー分子を具体的に説明する。

１．Ｐ４５０の調製
〔１〕シトクロムＰ４５０ＢＭ３の調製
以下の方法により、シトクロムＰ４５０ＢＭ３（以下、Ｐ４５０ＢＭ３と略する）を部分精製した。

先ず、大腸菌（ＤＨ５α株）に、Ｐ４５０ＢＭ３全長の塩基配列を挿入したｐＵＣベクターを組み込んで、Ｐ４５０ＢＭ３遺伝子を発現させた。

この大腸菌を培養し、得られた大腸菌を超音波破砕することで、大腸菌が生産したＰ４５０ＢＭ３を大腸菌から抽出した。

得られた破砕液を、硫酸アンモニウム沈殿法により分画（塩析）し、硫酸アンモニウムの飽和度４０〜６０（％飽和）で生じた沈殿を回収した。この沈殿をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液ｐＨ７．４（以下緩衝液Ａと呼ぶ）に分散させた。上述した沈殿の１００倍量（体積比）の緩衝液Ａを用いて、沈殿分散液を２回透析した。この操作によって沈殿分散液中の硫酸アンモニウムを脱塩した。

透析後の沈殿分散液（粗酵素液と呼ぶ）を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ６５０ＳまたはＤＥ−５２）に通し、粗酵素液に含まれるＰ４５０ＢＭ３をカラムに吸着させた。カラムに吸着したＰ４５０ＢＭ３を、ＫＣｌ水溶液（濃度勾配０〜５００ｍｍｏｌ／ｌ）を用いて溶出し、Ｐ４５０ＢＭ３の色である茶色のピーク画分を回収した。

回収した粗酵素液に含まれるＰ４５０ＢＭ３には、基質が結合している可能性がある。この基質をＰ４５０ＢＭ３から除去するために、回収した粗酵素液に５００ｍｍｏｌ／ｌ程度となる量のＮＡＤＰＨを加え、４℃で３０分間反応させた。反応後、残存するＮＡＤＰＨを分離し、かつ、緩衝液を置換するため、粗酵素液をゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００）に通した。ここで用いた緩衝液は、緩衝液Ａに１００ｍｍｏｌ／ｌとなる量のＫＣｌを加えた緩衝液（以下緩衝液Ｂと呼ぶ）である。ゲルろ過カラムを通して得られた茶色のピーク画分を回収し、得られた画分（Ｐ４５０ＢＭ３溶液と呼ぶ）をＰ４５０として以下の試験に用いた。

２．ダミー分子の調製
ダミー分子として、炭素数８〜１４のパーフルオロ脂肪酸を準備した。

ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４は、アルキル鎖に含まれる水素全てがフッ素で置換されている。各ダミー分子をそれぞれメタノールに溶解させたものを、ダミー分子溶液として以下の試験に用いた。

３．Ｐ４５０およびダミー分子を用いた不活性炭化水素の水酸化試験
〔１〕プロパンの水酸化確認試験
上述したＰ４５０ＢＭ３溶液およびＰＦＣ１０溶液を用いて、不活性炭化水素の一種であるプロパンを水酸化した。

高純度プロパンガスと高純度酸素ガスとを８０：２０（体積比）で混合した混合ガスを準備した。この混合ガスを上述した緩衝液Ｂに吹き込み、混合ガス飽和緩衝液Ｂを調製した。この混合ガス飽和緩衝液Ｂに、Ｐ４５０ＢＭ３溶液、ＰＦＣ１０溶液、およびＮＡＤＰＨを加えて、プロパンの水酸化反応を開始した。混合ガス飽和緩衝液Ｂは、反応開始時の反応液中に９０体積％以上含まれていた。また、反応開始時の反応液中において、Ｐ４５０ＢＭ３の濃度は５００ｎｍｏｌ／ｌであり、ＰＦＣ１０の濃度は１００μｍｏｌ／ｌであり、ＮＡＤＰＨの濃度は５ｍｍｏｌ／ｌであった。さらに、この反応液は０．５体積％のメタノールを含んでいた。

図１に示すように、反応は密閉したバイアルで行った。このバイアルには、上述した混合ガスで満たしたバルーンを接続した。バルーンの加圧下で、反応液を撹拌しながら、反応を進行させた。反応開始３０分後に、反応で生成したアルコール（プロパノール）をガスクロマトグラフィーにより検出・定量した。なお、対照実験として、ＰＦＣ１０に代えて０．５体積％のメタノールのみを添加した系と、プロパンガスを添加していない系とを同様に反応させ、反応液中のプロパノールをガスクロマトグラフィー分析した。

ガスクロマトグラフィー分析は以下のようにおこなった。

先ず、反応液中のアルコールを亜硝酸エステルに誘導体化した。アルコールの誘導体化は、文献（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２００１，１７，６３９−６４３及びＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１３４４２−１３４５０）にならっておこなった。詳しくは、反応液１ｍｌに０．１５ｇの亜硝酸ナトリウムを加え、次いで０．５ｍｌのヘキサンを加えた後に、氷上で反応液に２０％硫酸を１５０ｍｌ滴下し、１５分間反応させることで、反応液中のアルコールを誘導体化した。

誘導体化後、ヘキサン相を回収し、回収したヘキサン相を純水で洗浄した。洗浄後のヘキサン相をガスクロマトグラフィー用の分析試料とした。ガスクロマトグラフは島津社製のＦＩＤ検出器を有するＧＣ−２０１４を用い、カラムはＲｅｓｔｅｋ社製のＲｔｘ−１カラム（内径０．５３ｍｍ、液層の膜厚３ｍｍ、カラム長６０ｍ）を用いた。ガスクロマトグラフにおける試料注入口温度は２５０℃であった。カラムオーブンの温度プログラムは、５０℃で５分維持し、その後６分かけて２００℃まで昇温し、そのまま３分間維持するよう設定した。検出器は２５０℃に設定した。

反応液をガスクロマトクラフィー分析した結果、Ｐ４５０ＢＭ３、ダミー分子およびプロパンガスを含む反応系では、対照試験では見られないピークが一つだけ得られた。このピークが反応生成物のピークだと考えられる。プロパンを水酸化すると、１−プロパノールもしくは２−プロパノールが生成する可能性がある。そこで、２−プロパノールをガスクロマトグラフィー分析したところ、２−プロパノールのピーク（保持時間）は、反応生成物のピークと一致した。この結果から、反応生成物が２−プロパノールであることがわかった。

また、上記のガスクロマトグラフィー分析では、誘導体化したプロパノールに相当するピークは検出されなかった。この結果から、亜硝酸エステルに誘導体化したプロパノールは、本条件下では不安定であり亜硝酸エステルとして検出することはできないこと、および、分解してプロパノールそのものとして検出されることがわかった。

なお、内部標準として１ｍｍｏｌ／ｌのエタノールを用い、反応液中の２−プロパノールを定量した結果、上記条件で３０分間反応させると６００μｍｏｌ／ｌを超える２−プロパノールが生じた。

〔２〕プロパンを基質とする場合のダミー分子の評価
アルキル鎖長１０〜１３のダミー分子（ＰＦＣ１０〜ＰＦＣ１３）を用い、ダミー分子のアルキル鎖長とプロパンの水酸化との相関を調べた。Ｐ４５０としてはＰ４５０ＢＭ３溶液を用いた。また、反応条件は上述した反応条件と同じである。なお、１ｍｏｌのプロパノールを生成する際には、１ｍｏｌのＮＡＤＰＨが消費される。このため、カップリング率は、プロパノール生成量 （μｍｏｌ/分）÷ＮＡＤＰＨ消費量（μｍｏｌ/分）×１００で算出できる。ＮＡＤＰＨ量は、ＵＶスペクトル（３４０ｎｍ）における吸光度の減少と、ＮＡＤＰＨのモル吸光係数ε３４０ｎｍ＝６２００Ｍ^−１ｃｍ^−１とを用いて算出した。ダミー分子のアルキル鎖長、プロパノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフを図２に示す。また、ダミー分子のアルキル鎖長、プロパノール生成量、ＮＡＤＰＨ消費量およびカップリング率の関係を表１に示す。

表１および図２に示すように、ダミー分子としてＰＦＣ９〜ＰＦＣ１３の何れを用いた場合にも、ＮＡＤＰＨが消費された。このため、ダミー分子（ＰＦＣ９〜ＰＦＣ１３）によってＰ４５０ＢＭ３の活性化スイッチが入ったと考えられる。

また、ダミー分子としてＰＦＣ９〜ＰＦＣ１３の何れを用いた場合にも、プロパンからプロパノールが生成した。この結果から、これらのダミー分子を用いることでＰ４５０ＢＭ３のプロパン水酸化活性を高めることができ、プロパンを水酸化できることがわかる。また、Ｐ４５０ＢＭ３によるプロパノール生成量は、ＰＦＣ１０＞ＰＦＣ１１＞ＰＦＣ１２≧ＰＦＣ９＞ＰＦＣ１３の順に高い値を示した。この結果から、Ｐ４５０ＢＭ３のプロパン水酸化活性を高めるためには、ダミー分子のアルキル鎖長が９〜１２であるのが好ましく、アルキル鎖長が１０〜１１であるのがより好ましく、アルキル鎖長が１０であるのが特に好ましいことがわかる。

〔３〕Ｐ４５０ＢＭ３およびＰＦＣ１０によるプロパン水酸化の経時変化
Ｐ４５０ＢＭ３とＰＦＣ１０とを用い、反応開始１０分後、３０分後、６０分後および１８０分後におけるプロパノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量を測定することで、プロパンの水酸化反応の経時変化を調べた。反応条件は上述した反応条件と同じである。反応時間、プロパノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフを図３に示す。また、反応時間、プロパノール生成量、ＮＡＤＰＨ消費量およびカップリング率の関係を表２に示す。

表２および図３に示すように、Ｐ４５０ＢＭ３およびＰＦＣ１０によるプロパンの水酸化反応は、ＮＡＤＰＨを消費するまで進行した。

〔４〕Ｐ４５０ＢＭ３の活性中心における基質およびダミー分子の配位
野生型Ｐ４５０ＢＭ３の基質であるパルミチン酸が結合したＰ４５０ＢＭ３の活性中心を模式的に表す説明図を図４（ａ）に示し、ＰＦＣ１０が結合したＰ４５０ＢＭ３の活性中心を模式的に表す説明図を図４（ｂ）に示す。図４（ａ）、（ｂ）は、基質結合型のＰ４５０ＢＭ３の結晶構造の基質をＰＦＣ１０に置き換えたものである。なお、この結晶構造は、ＰＤＢ（蛋白質構造データバンク Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）のデータベースに格納されている構造データであり、そのエントリーＩＤ（ＰＤＢ ＩＤ）は１ＦＡＧである。

Ｐ４５０は活性部位にヘムを持つ。ヘムは水酸化反応の反応場であり、図４（ａ）、（ｂ）に示すように、ヘムの上方には基質やダミー分子が結合する結合部位が存在する。

上述したように、プロパンを水酸化する場合、Ｐ４５０ＢＭ３の水酸化活性は、アルキル鎖長１０のＰＦＣ１０をダミー分子として用いたとき非常に高くなる。これは、野生型Ｐ４５０ＢＭ３の基質であるパルミチン酸（アルキル鎖長１６）に対し、ＰＦＣ１０（アルキル鎖長１０）のアルキル鎖長は６短いため、反応場であるヘム上方に、プロパンが取り込まれる空間が確保されるためと考えられる。

また、ＰＦＣ１０、すなわちフッ素置換されたダミー分子が活性中心の結合部位に結合することで、反応場の疎水性が高められると考えられる。このため、同じく疎水性のプロパンが活性中心の反応場に入り込み易くなり、かつ、水分子が反応場から排除されると考えられる。このため、活性化スイッチが入り、プロパンの水酸化反応が進行すると考えられる。

また、ＰＦＣ９（アルキル鎖長９）をダミー分子として用いた場合には、ダミー分子のアルキル鎖長が短いために、活性化スイッチが十分に入らないと考えられる。このため、ダミー分子としてＰＦＣ９を用いる場合には、ダミー分子としてＰＦＣ１０を用いる場合に比べて、プロパノール生成量（すなわちＰ４５０の水酸化活性）とＮＡＤＰＨ消費量の双方が低下したと解釈できる。

また、ＰＦＣ１３（アルキル鎖長１３）をダミー分子として用いた場合には、ダミー分子のアルキル鎖長が長いために、プロパノール生成量（Ｐ４５０の水酸化活性）が低下する。これは、ダミー分子のアルキル鎖長が過剰に長いと、反応場上方の空間（基質が取り込まれる空間）が狭くなり、プロパンが取り込まれ難くなるためと考えられる。なお、この場合にも活性化スイッチは入るために、ＮＡＤＰＨの消費は十分に早く進行する。

活性化スイッチを入れ、かつ、Ｐ４５０ＢＭ３の水酸化活性を充分に高めることを考慮すると、Ｐ４５０ＢＭ３によってプロパンを水酸化するためのダミー分子としては、ＰＦＣ１０（パーフルオロデカン酸）を用いるのが特に好ましいと考えられる。

〔５〕シクロヘキサンの水酸化確認試験
上述したＰ４５０ＢＭ３溶液およびダミー分子（ＰＦＣ８〜１４）溶液を用いて、不活性炭化水素の一種であるシクロヘキサンを水酸化した。

上述した緩衝液Ｂに、Ｐ４５０ＢＭ３溶液、ダミー分子溶液、ＮＡＤＰＨおよびシクロヘキサンを加えて、シクロヘキサンの水酸化反応を開始した。シクロヘキサンは、エタノールに溶解したものを用いた。反応開始時の反応液中において、Ｐ４５０ＢＭ３の濃度は１００ｎｍｏｌ／ｌであり、ダミー分子の濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌであり、ＮＡＤＰＨの濃度は１ｍｍｏｌ／ｌであり、シクロヘキサンの濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌであった。さらに、この反応液は１体積％のエタノールを含んでいた。

反応液を攪拌しつつ室温で一晩放置し、シクロヘキサンの水酸化反応を進行させた。その後、反応で生成したアルコール（シクロヘキサノール）をガスクロマトグラフィーにより検出・定量した。なお、対照実験として、ダミー分子溶液に代えて０．５体積％のエタノールのみを添加した系（ダミー分子なし）を同様に反応させ、反応液中のシクロヘキサノールをガスクロマトグラフィー分析した。

反応液をガスクロマトクラフィー分析した結果、図６に示すように、ダミー分子、Ｐ４５０ＢＭ３、およびシクロヘキサンを含む反応液からはシクロヘキサノールが検出された。ダミー分子を含まない反応液からは、有意な量のシクロヘキサノールは検出されなかった。この結果から、ダミー分子（ＰＦＣ８〜１４）を共存させることで、Ｐ４５０ＢＭ３のシクロヘキサン水酸化活性を向上させ得ることがわかる。

〔６〕シクロヘキサンを基質とする場合のダミー分子の評価
アルキル鎖長８〜１４のダミー分子（ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４）を用い、ダミー分子のアルキル鎖長とシクロヘキサンの水酸化との相関を調べた。Ｐ４５０としてはＰ４５０ＢＭ３溶液を用いた。反応条件は、反応時間が１０分間であったこと以外は、上述した反応条件と同じであった。反応で生成したシクロヘキサノール量（μｍｏｌ/分）と、反応で消費したＮＡＤＰＨ量（μｍｏｌ/分）とを、使用したダミー分子毎に比較した。また、シクロヘキサノール生成に利用されたＮＡＤＰＨ量のＮＡＤＰＨ消費量（全量）に対する割合（カップリング率（％））を算出した。

ダミー分子の鎖長、シクロヘキサノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフを図７に示す。また、ダミー分子のアルキル鎖長、シクロヘキサノール生成量、ＮＡＤＰＨ消費量およびカップリング率の関係を表３に示す。

表３および図７に示すように、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、ＮＡＤＰＨが消費された。上述したように、活性化スイッチがはいるとＮＡＤＰＨが消費されるため、ダミー分子の存在によって活性化スイッチが入ると考えられる。なお、ダミー分子を添加せず、同様に１０分間反応させた場合、シクロヘキサノールは検出されなかった。

また、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、シクロヘキサンからシクロヘキサノールが生成した。この結果から、アルキル鎖長（ここでは炭素数）８〜１４程度のダミー分子を用いることでＰ４５０ＢＭ３のシクロヘキサン水酸化活性を高めることができ、シクロヘキサンを反応性高く水酸化できることがわかる。また、シクロヘキサノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量はダミー分子のアルキル鎖長に応じて異なっていた。Ｐ４５０ＢＭ３によるシクロヘキサノール生成量は、ＰＦＣ９＞ＰＦＣ１０＞ＰＦＣ８＞ＰＦＣ１１＞ＰＦＣ１２＞ＰＦＣ１３＞ＰＦＣ１４の順に高い値を示した。この結果から、Ｐ４５０ＢＭ３のシクロヘキサン水酸化活性を高めるためには、ダミー分子のアルキル鎖長が８〜１２であるのが好ましく、アルキル鎖長が８〜１１であるのがより好ましく、アルキル鎖長が９であるのが特に好ましいことがわかる。

〔７〕ベンゼンの水酸化確認試験
上述したＰ４５０ＢＭ３溶液およびダミー分子（ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４）溶液を用いて、不活性炭化水素の一種であるベンゼンを水酸化した。ベンゼンはエタノールに溶解したものを用いた。それ以外は、上述したシクロヘキサンの水酸化と同じである。検出は、ＨＰＬＣで行った。

反応開始時の反応液中において、Ｐ４５０ＢＭ３の濃度は５００ｎｍｏｌ／ｌであり、ダミー分子の濃度は１００μｍｏｌ／ｌであり、ＮＡＤＰＨの濃度は５ｍｍｏｌ／ｌであった。さらに、この反応液は１体積％のエタノールを含んでいた。反応開始１０分後に、反応で生成したアルコール（フェノール）をＨＰＬＣにより検出・定量した。なお、対照実験として、ダミー分子にかえて緩衝液Ｂを添加した系を同様に反応させ、反応液中のフェノールを分析した。

反応液をガスクロマトクラフィー分析した結果、図８に示すように、Ｐ４５０ＢＭ３、ダミー分子およびベンゼンを含む反応系では、ベンゼンのピークおよびフェノールのピークが確認された。図示していないが、対照実験の反応系では、ベンゼンのピークのみが確認され、フェノールのピークは確認されなかった。この結果から、Ｐ４５０ＢＭ３およびダミー分子によって反応液中のベンゼンが水酸化され、フェノールが生じることが確認された。そしてこの結果から、ダミー分子（ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４）を用いることで、Ｐ４５０ＢＭ３のベンゼン水酸化活性を向上させ得ることがわかる。

〔８〕ベンゼンを基質とする場合のダミー分子の評価
アルキル鎖長８〜１４のダミー分子（ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４）を用い、ダミー分子のアルキル鎖長とベンゼンの水酸化との相関を調べた。Ｐ４５０としてはＰ４５０ＢＭ３溶液を用いた。また、反応条件は上述した反応条件と同じである。ダミー分子のアルキル鎖長、フェノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフを図９に示す。また、ダミー分子のアルキル鎖長、フェノール生成量、ＮＡＤＰＨ消費量およびカップリング率の関係を表４に示す。

表４および図９に示すように、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、ＮＡＤＰＨが消費された。このため、ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４によりＰ４５０ＢＭ３の活性化スイッチが入ったと考えられる。

また、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、ベンゼンからフェノールが生成した。この結果から、これらのダミー分子を用いることでＰ４５０ＢＭ３のベンゼン水酸化活性を高めることができ、ベンゼンを水酸化できることがわかる。また、Ｐ４５０ＢＭ３によるフェノール生成量は、ＰＦＣ９＞ＰＦＣ１０＞ＰＦＣ１１＞ＰＦＣ１２＞ＰＦＣ８＞ＰＦＣ１３＞ＰＦＣ１４の順に高い値を示した。この結果から、Ｐ４５０ＢＭ３のベンゼン水酸化活性を高めるためには、ダミー分子のアルキル鎖長が９〜１２であるのが好ましく、アルキル鎖長が９〜１１であるのがより好ましく、アルキル鎖長が９であるのが特に好ましいことがわかる。

〔９〕ブタンを基質とする場合のダミー分子の評価
アルキル鎖長８〜１４のダミー分子（ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４）、および、部分的にフッ素化された脂肪酸からなるダミー分子（ＰａｒｔｉａｌＦＣ１０と呼ぶ）を用い、ダミー分子のアルキル鎖長とブタンの水酸化との相関を調べた。Ｐ４５０としてはＰ４５０ＢＭ３溶液を用いた。また、反応条件は上述した反応条件と同じである。ダミー分子のアルキル鎖長、２−ブタノール生成量およびＮＡＤＰＨ消費量の関係を表すグラフを図１０に示す。また、ダミー分子のアルキル鎖長、２−ブタノール生成量、ＮＡＤＰＨ消費量およびカップリング率の関係を表５に示す。なお、ＰａｒｔｉａｌＦＣ１０は、ＰＦＣ１０の２，２，３，３位がフッ素化されず水素のままのダミー分子である。ＰａｒｔｉａｌＦＣ１０については、２−ブタノール生成量のみを測定した。

表５および図１０に示すように、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、ＮＡＤＰＨが消費された。このため、ＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４によりＰ４５０ＢＭ３の活性化スイッチが入ったと考えられる。

また、ダミー分子としてＰＦＣ８〜ＰＦＣ１４の何れを用いた場合にも、ブタンから２−ブタノールが生成した。この結果から、これらのダミー分子を用いることでＰ４５０ＢＭ３のブタン水酸化活性を高めることができ、ブタンを水酸化できることがわかる。また、Ｐ４５０ＢＭ３による２−ブタノール生成量は、ＰＦＣ９＞ＰＦＣ１０＞ＰＦＣ１１＞ＰＦＣ１２＞ＰＦＣ１３＞ＰＦＣ１４＞ＰＦＣ１８の順に高い値を示した。この結果から、Ｐ４５０ＢＭ３のブタン水酸化活性を高めるためには、ダミー分子のアルキル鎖長が９〜１２であるのが好ましく、アルキル鎖長が９〜１０であるのがより好ましく、アルキル鎖長が９であるのが特に好ましいことがわかる。なお、ＰａｒｔｉａｌＦＣ１０をダミー分子として用いた場合にも、２−ブタノール生成量は非常に高い値を示した。この結果から、ダミー分子は、アルキル鎖に含まれる全ての水素がフッ素で置換されてなくても良く、一部の水素がフッ素で置換されていれば良いことがわかる。

本発明の不活性炭化水素の水酸化方法およびダミー分子は、不活性炭化水素を水酸化して、シクロヘキサノール、ブタノール、プロパノール、フェノール等のアルコールを製造するための方法として用いることができる。

Claims (10)

1. シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと、ダミー分子と、不活性炭化水素とを共存させて、該不活性炭化水素を水酸化する工程を含み、
   該ダミー分子は、該シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの結合部位に結合可能な末端構造と、アルキル鎖と、を持ち、
   該アルキル鎖に含まれる少なくとも一部の水素がフッ素で置換されていることを特徴とする不活性炭化水素の水酸化方法。
2. 前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび／またはシトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持つシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである請求項１に記載の不活性炭化水素の水酸化方法。
3. 前記ダミー分子のなかで、少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目のアルキル基に含まれる水素は、フッ素で置換されている請求項１または請求項２に記載の不活性炭化水素の水酸化方法。
4. 前記末端構造は、水素末端、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜請求項３の何れか一つに記載の不活性炭化水素の水酸化方法。
5. 前記不活性炭化水素は、シクロヘキサン、ブタン、プロパン、ベンゼンから選ばれる少なくとも一種である請求項１〜請求項４の何れか一つに記載の不活性炭化水素の水酸化方法。
6. 前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持ち、
   前記ダミー分子は、パーフルオロカルボン酸である請求項１〜請求項５の何れか一つに記載の不活性炭化水素の水酸化方法。
7. シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび不活性炭化水素と共存させて、該不活性炭化水素を水酸化するためのダミー分子を含む組成物であって、
   該シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの結合部位に結合可能な末端構造と、アルキル鎖と、を持ち、
   該アルキル鎖に含まれる少なくとも一部の水素がフッ素で置換されていることを特徴とするダミー分子を含む組成物。
8. 少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目のアルキル基に含まれる水素がフッ素で置換されている請求項７に記載のダミー分子を含む組成物。
9. 前記末端構造は、水素末端、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基から選ばれる少なくとも一種である請求項７または請求項８に記載のダミー分子を含む組成物。
10. 前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を持ち、
    前記ダミー分子は、パーフルオロカルボン酸である請求項７〜請求項９の何れか一つに記載のダミー分子を含む組成物。