JP5765744B2

JP5765744B2 - アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤、および外用剤

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Publication number: JP5765744B2
Application number: JP2012536248A
Authority: JP
Inventors: 量二弘田; ランドゥロジャーガッツ
Original assignee: Kochi University NUC
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Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2015-08-19
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Description

本発明は、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ（ＶＡＭ）葉のアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤；ＶＡＭ葉および／またはその上記抽出物を有効成分として含有する化粧料などの外用剤；並びに、ＶＡＭ葉および／またはその上記抽出物を含有する外用剤素材に関するものである。

アトピー性皮膚炎は強い痒みを伴う皮膚疾患であり、そのためアトピー性皮膚炎の患者は引っ掻き行動を頻繁に行なって炎症部位の慢性化を招いている。アトピー性皮膚炎では血清中のＩｇＥ濃度が上昇するほか、炎症の初期には好中球、中期にはマクロファージ、後期には好酸球の増加が見られるなど、炎症細胞の特徴的な推移が見られる。現在、アトピー性皮膚炎の治療剤として、副腎皮質ホルモンを主体とするステロイド剤が汎用されているが、抗かゆみ作用（抗掻痒作用）は不十分であるという問題を抱えている。

一方、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ（ベルノニアアミグダリナ）は、熱帯アフリカに広く自生するキク科潅木であり、この水溶性葉抽出物はヒト乳癌に対して抗癌活性を有することが知られている。また、特許文献１および２には、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ乾燥葉をクロロホルム抽出、ｎ−ヘキサン−メタノール抽出、シリカゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により精製して得られた水不溶性のベルノダリンまたはそのジヒドロ体が、マウス白血病細胞に対する抗腫瘍効果や、マウスＴ細胞依存性／非依存性の抗体産生能を有することが報告されている。また特許文献３には、極性溶媒またはその混合物により抽出されたＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａの抽出物が体毛喪失予防および／または体毛成長促進の作用を有することが報告されている。

特開平６−１６５５０号公報特開平６−１９２２６５号公報特開２００９−５３２３４２号公報

しかしながら、上記特許文献を含め、これまでにＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉のアルコールおよび／または水の抽出物とアトピー性皮膚炎との関係について具体的に開示されたものはない。

また、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉やその上記抽出物を化粧料や入浴剤に用いたものものこれまで開示されていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、ステロイド剤と同等またはそれ以上の抗掻痒作用および抗炎症作用を有しており、アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として極めて有用な技術を提供することにある。

更に本発明の他の目的は、例えば、抗掻痒作用や抗炎症作用などを発揮し得る新規な外用剤およびその原料となる外用剤素材を提供することにある。

上記課題を解決し得た本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤は、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉のアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有するところに要旨を有するものである。

また、上記課題を解決し得た本発明の外用剤は、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉、および／またはそのアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有するところに要旨を有するものである。

本発明の好ましい実施形態において、上記外溶剤は、化粧料として用いられるものである。

本発明の好ましい実施形態において、上記化粧料は、入浴剤として用いられるものである。

本発明には、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉、および／またはそのアルコールおよび／または水の抽出物を含有する化粧料用または入浴剤用素材も包含される。

本発明の予防剤または治療剤は、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉のアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有するため、汎用のステロイド剤と同等またはそれ以上に高い抗掻痒作用および抗炎症作用が発揮される。

また、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉自体、および／またはその上記抽出物は、外用剤素材として有用であり、これらを含む外用剤は、例えばローション、乳液、石鹸、入浴剤などの化粧料として好適に用いられる。

図１は、実施例１における引っ掻き回数の経時的変化を示すグラフである。図２は、実施例１における耳介腫脹の経時的変化を示すグラフである。図３は、実施例１における臨床症状の経時的変化を示すグラフである。図４は、実施例１におけるマウス耳および炎症細胞の結果を示す写真である。図５は、実施例１における血清中ＩｇＥ抗体の結果を示すグラフである。図６は、実施例２における耳介腫脹の経時的変化を示すグラフである。図７は、実施例２における耳介腫脹（重量）の結果を示すグラフである。図８は、実施例２における臨床症状の結果を示すグラフである。図９は、実施例２におけるマウス耳および炎症細胞の結果を示す写真ある。

本発明者らは、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ（ベルノニアアミグダリナ）葉のアルコールおよび／または水の抽出物について種々検討をしてきた。その結果、上記抽出物はアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤のいずれにおいても適用可能であり、驚くべきことに、汎用のステロイド剤と同等またはそれ以上に優れた抗掻痒作用および抗炎症作用を両方有することを見出し、本発明を完成した。上述したようにステロイド剤は、抗掻痒作用が弱く、激しい痒みのために炎症部位が慢性化するといった問題があるのに対し、本発明の抽出物は抗掻痒作用にも優れているため、このような問題を解消することができる。

また、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉自体、および／またはその上記抽出物は、外用剤素材として有用であり、これらを含む外用剤は、例えば化粧水、乳液、石鹸、入浴剤などの化粧料として好適に用いられる。例えば入浴剤などは、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａの抽出物のみならずＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉もそのまま、湯中に浸漬するなどして使用することができる。上記外用剤の使用により、例えば、抗掻痒作用や抗炎症作用などの効能が期待される。

以下、本発明について詳細に説明する。本明細書では、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａをＶＡＭと略記する場合がある。また、ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉のアルコールおよび／または水の抽出物を、単にＶＡＭ葉の抽出物と呼ぶ場合がある。

（１）アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤
まず、本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤について説明する。上記予防剤または治療剤は、ＶＡＭ葉のアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有する。

本発明に用いられる抽出物は、ＶＡＭ葉を用い、アルコールおよび／または水の溶媒で抽出した後の抽出液（ろ過後の溶出部分）である。ただし、これに限定されず、保存安定性などを考慮して、必要に応じて、その後に上記抽出液を濃縮したり上記溶媒に再溶解したり、あるいは乾燥したりするなど通常用いられる精製手段を行っても良く、このような処理を行なったものも、本発明に用いられる抽出物の範囲に包含される。

以下、上記抽出物を得るための好ましい抽出方法を説明する。

まず、原料としてＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ（ＶＡＭ）の葉を用意する。本発明に用いられるＶＡＭの産地や採取時期などは特に限定されないが、アトピー性皮膚炎に対する優れた予防作用または治療作用を得るためには、ＶＡＭの新葉などが好ましく用いられる。

本発明では、ＶＡＭのうち葉を抽出材料として用いる。葉のなかにアトピー性皮膚炎の予防または治療に有用な成分が含まれていると考えられるからである。本発明では、葉のみを用いても良いが、本発明の作用を損なわない範囲で、葉以外の部分（茎や根など）が含まれていても良い。

以下の抽出を行なう前に、必要に応じて、ＶＡＭの葉を洗浄したり乾燥しても良い。乾燥の条件は特に限定されないが、有効成分の細胞内水分による変性や腐敗を考慮すると、収穫後、風通しを良くするために竿に吊るして天日で乾燥を行なうことが好ましい。

また、抽出効率を高めるため、抽出の前にＶＡＭの葉を粉砕することが好ましい。粉砕方法は特に限定されず、例えば、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、エヒスインテグレーター、冷却装置付きブレンダーなどを用い、おおむね１ｍｍ〜１０ｍｍのサイズに粉砕することが好ましい。

次に、粉砕した材料にアルコールおよび／または水の溶媒を加えて浸漬させ、有効成分を抽出する。本発明では、抽出溶媒として、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等のアルコール：または水を単独で用いても良いし、これらの混合溶媒を用いても良い。上記混合溶媒としては、例えばメタノールと水、エタノールと水などが挙げられ、具体的には、例えばメタノール：水＝５０：５０〜８０：２０のものが例示される。後記する実施例に示すように、水よりもアルコール（特にメタノール）抽出物の方が、高い活性が得られる。

上記の浸漬条件は、抽出溶媒の種類や抽出材料の量などに応じ、適宜調節することができる。例えば用いられる抽出溶媒の量は、抽出材料であるＶＡＭ葉が、少なくとも万遍なく浸漬する程度とし、有効成分の抽出量や濃縮する際の効率などを考慮して適宜調節すればよいが、おおむね、乾燥状態の抽出材料１００質量部に対し、抽出溶媒を約１００〜１０００の割合で用いることが好ましい。

抽出温度も特に制限されず、抽出効率を高めるために３０〜５０℃程度に加温してもよいが、有効成分が分解される恐れがあるので、室温で抽出することが好ましい。抽出時間も適宜調節すればよいが、おおむね、室温で５〜１０日間程度であることが好ましい。

抽出効率を更に高めるために、抽出材料に抽出溶媒を加えた後、攪拌することが好ましい。あるいは、抽出材料に抽出溶媒を加えた後、上記の粉砕機などを用いて磨り潰すことも好ましい態様である。

本発明では、上記の抽出処理を行なった後、濾過等によって抽出残渣を除去し、得られた抽出液を、そのままアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いることができる。

あるいは本発明では、上記のようにして得られた抽出液を濃縮したものや、さらに前述したアルコールおよび／または水の抽出溶媒に再溶解したものを、アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いることもできる。これにより、保存安全性などが向上する。濃縮処理では、濃縮温度の抑制や作業効率の観点からエバポレーターを用いて蒸留することが好ましい。具体的な蒸留条件は、有効成分の抽出量や濃縮する際の効率などを考慮して適宜調節すればよいが、おおむね、温度：約２０〜５５℃、圧力：約４００〜６００ｈＰａにて蒸留を行なうことが好ましい。

本発明では、上記のように濃縮や再溶解を行なったものを、そのままアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いても良いが、一旦乾燥し、使用直前に抽出溶媒に適宜溶かして用いることもできる。

本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤は、上記のようにして得られた抽出物を有効成分として含むものである。上記の抽出物には、医薬的に通常用いられる公知の製剤成分を添加し、様々な製剤とすることができる。例えば、基材、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などを添加することができる。また、これら添加剤の配合量は、本発明の作用効果を妨げない様な量である限り、必要に応じて適宜設定することができる。

上記予防剤又は治療剤の適用方法は特に限定されず、外用剤（軟膏剤、貼付剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤など）、粘膜適用剤（トローチ剤、坐剤など)、注射剤、経口投与剤（散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エキス剤、流エキス剤、エリキシル剤、懸濁剤・乳剤、チンキ剤、シロップ剤など）などの形態で適用することができる。

例えば上記ＶＡＭ葉抽出物を用いる場合、いったん濃縮して粉末とした抽出物を、水等の溶媒に再溶解または再分散する。このときの抽出物の濃度は特に制限されず、被験者の状態等により適宜調節すればよいが、例えば、乾燥状態の抽出物の濃度に換算して、約５０〜２００ｇ／Ｌ程度とすることが好ましい。

上記抽出物の溶媒としては、ヒトや動物が飲用するに適した水が好ましい。例えば、蒸留水、精製水、純水、水道水などを用いればよい。また、微量のエタノールなどを添加してもよい。

本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤の投与量は、投与すべき被験者の症状や年齢や性別；抽出物の構成などに応じ、所望の作用効果が得られるように適宜適切に調製すれば良い。例えばラットには、おおむね、２００ｍｇ／ｋｇ／日程度投与することが好ましいが、ヒトに対しては、より少ない量であることが好ましい。何れにせよ、被験者の状態等を充分考慮し、投与量は適宜調節すればよい。

（２）外用剤
上記ＶＡＭ葉および／またはその抽出物（アルコールおよび／または水の抽出物）は、外用剤の原料として用いることができる。外用剤は、更に皮膚外用剤と化粧料に大別される。上記皮膚外溶剤としては、例えば軟膏剤、貼付剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤などが挙げられる。

上記化粧料の種類は特に限定されず、例えば乳液、化粧水（ローション）、クリーム、洗顔料、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク、ひげそり用化粧料などの基礎化粧品；ファンデーション類、口紅類。白粉・打粉類、頬紅類、眉目類、美爪類などのメーキャップ化粧品；洗髪用化粧品（シャンプーやリンスなど）、育毛剤、毛髪仕上げ用化粧品（ヘアスタイリング剤、ヘアトリートメント剤など）；パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、ヘアブリーチなどの毛髪化粧品；香水やコロンなどの芳香化粧品；石鹸、液体ボディ洗浄料、サンケア製品、ハンドケア製品、防臭化粧品、脱色剤・除毛剤、入浴剤（浴用剤）などのボディ化粧品；歯磨類、口中清涼剤などの口腔用化粧品などが挙げられる。

上記化粧料として用いる場合、ＶＡＭ葉抽出物などの有効成分のほかに、化粧料原料として通常用いられる成分を適宜配合することができる。上記成分としては、例えば、油脂、ロウ類、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類、シリコーン油などの油性原料；アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤などの界面活性剤；グリセリン、プロピレングリコールなどの保湿剤；増粘剤高分子（キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、皮膜剤高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど）などの高分子化合物；紫外線吸収剤；酸化防止剤；金属イオン封鎖剤などが挙げられる。

以下、本発明に用いられるが外用剤の代表例として、入浴剤および化粧料を代表的に取り上げて、より詳細に説明する。

（入浴剤）
入浴剤として用いる場合、前述したＶＡＭ葉の抽出物を用いても良いし、ＶＡＭ葉そのものを用いても良い。ＶＡＭ葉そのものを用いる場合、ＶＡＭ葉の乾燥品を用いても良いし、ＶＡＭ葉の粉砕物（粉末）を用いても良い。なお、入浴剤以外の化粧料として用いるときは、ＶＡＭ葉の抽出物を用いることが好ましい。

上記ＶＡＭ葉（粉末などを含む）および／またはその抽出物は、そのまま湯中に入れて使用しても良いし、或いは、これらを不織布などの多孔質袋体に入れて湯中に浸漬して揉み出しながら使用することもできる。あるいは、スプレードライ処理などにより乾燥したＶＡＭ葉などを、血行促進効果のある無機塩類（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど）、皮膚を清浄にする無機塩類（例えば炭酸水素ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）に加えて使用しても良い。

（化粧水）
化粧水の種類は、柔軟化粧水、収れん化粧水、洗浄用化粧水などに大別され、化粧水の種類に応じて通常用いられる方法によって製造することができる。例えば、例えば透明化粧水（弱酸性）を構成する基材の一般的な処方例は、以下のとおりであり、有効成分としてＶＡＭ葉の抽出物を適宜添加すれば良い。ただし、本発明は下記処方例に限定する趣旨ではない。

保湿剤（１，３−ブチレングリコールグリセリン）６．０質量部
（グリセリン）４．０質量部
エモリエント剤（オレイルアルコール）０．１質量部
界面活性剤（ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル)
０．５質量部
（ＰＯＥ（１５）ラウリルアルコールエーテル)０．５質量部
アルコール（エタノール）１０．０質量部
香料、色剤、防腐剤、褪色防止剤、緩衝剤夫々、適量
精製水７８．９質量部

精製水に保湿剤、緩衝剤、褪色防止剤を室温にて溶解して水相を得る。エタノールに防腐剤、香料、エモリエント剤、可溶化剤（界面活性剤）を入れて溶解した後、上記の水相に加えて混合し、可溶化する。その後、色剤を加えて調色後、濾過し、充填を行なう。

（乳液）
乳液の種類としては、例えば、Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ型、多層エマルションが挙げられ、乳液の種類に応じて通常用いられる方法によって製造することができる。例えば保湿・柔軟乳液を構成する基材の一般的な処方例は、以下のとおりであり、有効成分としてＶＡＭ葉の抽出物を適宜添加すれば良い。ただし、本発明は下記処方例に限定する趣旨ではない。

油分（ステアリン酸）２．０質量部
（セチルアルコール）１．５質量部
（ワセリン）４．０質量部
（スクワラン）５．０質量部
（グリセロールトリ−２−エチルヘキサン酸エステル）
２．０質量部
界面活性剤（ソルビタンモノオレイン酸エステル) ２．０質量部
保湿剤（ジプロピレングリコール) ５．０質量部
（ＰＥＧ１５００) ３．０質量部
アルカリ（トリエタノールアミン）１．０質量部
防腐剤、香料夫々、適量
精製水７４．５質量部

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

実施例１
本実施例では、以下のようにして調製したＶＡＭ葉の抽出物を用い、マウスを用いたアトピー性皮膚炎に対する予防効果を調べた。

（抽出物の調製）
コンゴ産のＶＡＭの葉を日干しにより十分に乾燥し、乾燥した葉０．１ｋｇを乳鉢・乳棒を用いて約２ｍｍのサイズに粉砕した。得られた粉砕物１ｇを抽出溶媒（水５ｍＬまたはメタノール５ｍＬ）に浸漬し、液体窒素を用いて充分すり潰した。ろ過後、得られた抽出液４ｍＬに水１５ｍＬまたはメタノール１５ｍＬを加え、エバポレーターにより、温度：４５℃、圧力：５００ｈＰａの条件で蒸留した後、３７℃で２時間乾燥させることにより、ＶＡＭの水抽出物またはＶＡＭのメタノール抽出物を得た。以下の実験では、各抽出物０．５ｇを５ｍＬの蒸留水に溶解したものを実験に供した（濃度は２００ｇ／Ｌ）。

（供試動物）
７週齢の雄性ＮＣ／Ｎｇａマウス１６匹を日本エスエルシーより購入し、飼料および飲料水を自由に摂取させて７日間馴化させたものを実験に用いた。マウス１６匹を、４匹ずつ以下の４群に分けた。試験の前日には、小動物用バリカンを用いてマウスの腹部を剃毛した（Ｄａｙ０）。
・第１群（本発明例投与群）：
ＶＡＭの水抽出物（以下、「ＷＡＴ−ＶＡＭ」と略記する）投与群
・第２群（本発明例投与群）：
ＶＡＭのメタノール抽出物（以下、「ＭＥＴ−ＶＡＭ」と略記する）投与群
・第３群（溶媒対照群）：メタノール（以下、「ＶＥＨ」と略記する）投与群
・第４群（溶媒対照群）：水（以下、「ＮＯＲＭ」と略記する）投与群

（試験方法）
第１群および第２群（いずれも本発明例投与群）について、以下の処置を行なった。

まず、剃毛した各群のマウスの腹部に、感作源として５％塩化ピクリルのアセトン溶液を５００μＬ塗布して感作を行なった（Ｄａｙ１）。感作後７日目（Ｄａｙ８）に、上記の各抽出物（「ＷＡＴ−ＶＡＭ」または「ＭＥＴ−ＶＡＭ」）７ｍｇ／ｍＬをマウスの右耳に５０μＬ塗布（予防処置）し、その３０分後に、０．５％塩化ピクリルのアセトン・オリーブオイル溶液を５０μＬ、マウスの両耳に塗布して追加感作を行なった（Ｄａｙ８）。上記Ｄａｙ８と同様の操作を、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ１６、Ｄａｙ１８、およびＤａｙ２０に行い、アトピー性皮膚炎を惹起（チャレンジ）させた。

比較のため、第３群（「ＶＥＨ」投与群）については、上記の抽出物を塗布する代わりにメタノールを塗布したこと以外は、前述した第１群と同様にして感作および惹起を行なった。

一方、第４群（「ＮＯＲＭ」投与群）については、５％塩化ピクリルの感作を行なわないこと、および上記の抽出物を塗布する代わりに水を塗布したこと以外は、前述した第１群と同様にして処置した。

（評価）
（１）引っ掻き行動の経時的変化
Ｄａｙ８、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２０のそれぞれにおいて、各群のマウスについて、３０秒以内に観察される引っ掻き行動の回数を測定し、各群（４匹）の平均値および標準偏差を算出した。この回数が少ない程、抗掻痒効果に優れることを示している。これらの結果を図１に示す。図１には、各実験群について、左から順にＤａｙ８、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２０の結果を示している。

（２）耳介厚さ（腫脹）の経時的変化
Ｄａｙ８、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２０のそれぞれにおいて、各群のマウスの右耳の厚さ（μｍ）をデジタルノギスを用いて測定し、Ｄａｙ０のマウスの右耳の厚さとの差（μｍ）を算出し、各群（４匹）の平均値を算出した。厚さの差が少ない程、耳腫脹抑制効果に優れることを示している。これらの結果を図２に示す。図２には、各実験群について、左から順にＤａｙ８、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２０の結果を示している。

（３）臨床症状の経時的変化
Ｄａｙ８、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２０のそれぞれにおいて、各群のマウスの背部に生じた炎症の程度を肉眼で観察し、スコアリングした。詳細には、（ａ）表皮剥脱／腐食の程度、（ｂ）紅班／出血の程度、（ｃ）purpuras（血管より漏れ出た血液により紫色の斑点状の内出血）および毛細血管拡張症の程度を肉眼で観察し、下記基準でスコアリングして各群（４匹）の平均値を算出した。スコアリング値が低い程、炎症抑制効果に優れることを示している。

（ａ）表皮剥脱／腐食の評価
０以上、１以下：ほとんど変化なし
１超、２以下：軽度の症状
２超、３以下：高度の症状

（ｂ）紅班／出血の評価
０以上、１０以下：ほとんど変化なし
１０超、２０以下：軽度の症状
２０超、３０以下：高度の症状

（ｃ）purpurasおよび毛細血管拡張症の評価
０以上、１以下：ほとんど変化なし
１超、２以下：軽度の症状
２超、３以下：高度の症状

これらの結果をそれぞれ、図３Ａ〜図３Ｃに示す。

（４）炎症細胞の浸潤
Ｄａｙ１４に、第１群〜第３群のそれぞれにつき１例ずつ無作為に抽出したマウス左耳の一部を生検し、ヘマトキシリン・エオジン(ＨＥ)染色による炎症細胞の同定（好中球、好酸球）を行なって病理組織標本を作製した。参考のため、上記第１群において、本発明抽出物を投与する前（Ｄａｙ２１）のマウス（アトピー性皮膚炎マウス）左耳の一部を生検し、上記と同様にして病理組織標本を作製した。図４Ａ〜図４Ｃに、アトピー性皮膚炎マウス（図４Ａ）、第１群の「ＶＡＭ−ＷＡＴ」投与群（図４Ｂ）、第２群の「ＶＡＭ−ＭＥＴ」投与群（図４Ｃ）におけるマウスの写真（上段）、病理組織標本の１０倍拡大写真（中段）、４０倍拡大写真（下段）の結果をそれぞれ示す。

（５）血清中ＩｇＥの測定
Ｄａｙ１４に、第１群〜第４群のそれぞれにおいて、各群のマウスの血清中ＩｇＥを測定した。詳細には、キットに添付されている、段階希釈したＩｇＥ標準物質のシグナルから作製した検量線とサンプルのシグナルを比較して血清中ＩｇＥ濃度を決定し、各群（４匹）の平均値および標準偏差を算出した。これらの結果を図５に示す。

図１〜図５より以下のように考察することができる。

まず、抗掻痒作用について考察する。図１より、本発明抽出物を含まずメタノールのみを投与した「ＶＥＨ」（溶媒対照群）では引っ掻き回数が多く、感作回数が進むにつれ（Ｄａｙ８→Ｄａｙ１４→Ｄａｙ２０）、その回数が顕著に増加したのに対し、本発明に係るＶＡＭの水抽出物を投与した「ＷＡＴ−ＶＡＭ」（本発明例）およびＶＡＭのメタノール抽出物を投与した「ＭＥＴ−ＶＡＭ」（本発明例）は、引っ掻き回数の顕著な抑制効果が認められ、水投与群（「ＮＯＲＭ」）とほぼ同程度にまで抑えることができた。本発明例のなかでも特に、ＶＡＭのメタノール抽出物を投与した「ＭＥＴ−ＶＡＭ」では非常に著しい抑制効果が認められ、感作回数が増えても引っ掻き回数の上昇は殆ど見られなかった。よって、本発明抽出物は、極めて優れた抗掻痒作用を有していることが確認された。

なお、図１には示していないが、本発明抽出物ではなく市販のステロイド剤（和光純薬製ハイドロコルチゾン）を用いて同様の実験を行なった場合は、メタノールのみを投与した「ＶＥＨ」（溶媒対照群）の結果と殆ど変わらなかったことを確認している。

次に図２〜図５に基づき、抗炎症作用について考察する。抗炎症作用についても前述した抗掻痒作用と同様の傾向が見られ、本発明抽出物を投与した「ＷＡＴ−ＶＡＭ」および「ＭＥＴ−ＶＡＭ」は、溶媒投与群の「ＶＥＨ」に比べ、耳介腫脹抑制効果（図２）、臨床症状の緩和（図３）、炎症細胞（好酸球および好中球）の減少（図４）、血清中ＩｇＥの減少（図５）が見られ、特にＶＡＭのメタノール抽出物を投与した「ＭＥＴ−ＶＡＭ」では非常に著しい抗炎症効果が確認された。

このうち図４を参照すると、アトピー性皮膚炎マウスでは症状が進行して皮膚のバリア層が破壊し（図４Ａの中段の写真をご参照）、好酸球および好中球の浸潤が多く見られた（図４Ａの下段の写真をご参照）のに対し、本発明抽出物を投与したものは図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、バリア層の破壊も殆ど見られず（図４Ｂおよび図４Ｃの中段の写真をご参照）、好酸球および好中球の数も減少した（図４Ｂおよび図４Ｃの下段の写真をご参照）。よって、本発明抽出物は、極めて優れた抗炎症作用を有していることが確認された。

なお、図２〜図５には示していないが、本発明抽出物ではなく市販のステロイド剤（和光純薬製ハイドロコルチゾン）を用いて同様の実験を行なった場合は、メタノールのみを投与した「ＶＥＨ」（溶媒対照群）の結果と殆ど変わらなかったことを確認している。

以上の実験結果より、本発明抽出物は、アトピー性皮膚炎の予防剤として極めて有用であることが確認された。

実施例２
本実施例では、実施例１と同様にして調製したＶＡＭ葉の抽出物を用い、マウスを用いたアトピー性皮膚炎に対する治療効果を調べた。

（供試動物）
７週齢の雄性ＮＣ／Ｎｇａマウス３０匹を日本エスエルシーより購入し、飼料および飲料水を自由に摂取させて７日間馴化させたものを実験に用いた。マウス３０匹を、６匹ずつ以下の５群に分けた。試験の前日には、小動物用バリカンを用いてマウスの腹部を剃毛した（Ｄａｙ０）。
・第１群（本発明例投与群）：ＶＡＭの水抽出物（「ＷＡＴ−ＶＡＭ」）投与群
・第２群（本発明例投与群）：ＶＡＭのメタノール抽出物（「ＭＥＴ−ＶＡＭ」）投与群
・第３群（溶媒対照群）：メタノール（「ＶＥＨ」）投与群
・第４群（溶媒対照群）：水（「ＮＯＲＭ」）投与群
・第５群（比較群）：ステロイド（「ＨＣＴ」）投与群

まず、剃毛した各群のマウスの腹部に、感作源として５％塩化ピクリルのアセトン溶液を５００μＬ塗布して感作を行なった（Ｄａｙ１）。感作後７日目（Ｄａｙ８）、９日目（Ｄａｙ１０）、１１日目（Ｄａｙ１２）、１３日目（Ｄａｙ１４）に、０．５％塩化ピクリルのアセトン・オリーブオイル溶液を５０μＬ、マウスの両耳に塗布してアトピー性皮膚炎を惹起（チャレンジ）させた。その後、Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２３、Ｄａｙ２５、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ２９にそれぞれ、上記の各抽出物（「ＷＡＴ−ＶＡＭ」または「ＭＥＴ−ＶＡＭ」）７ｍｇ／ｍＬをマウスの右耳に５０μＬ塗布（治療処置）した。

更にステロイド剤との対比を行なうため、第５群（「ＨＣＴ」投与群）については、上記の抽出物を塗布する代わりに１０ｍｇ／ｍＬのハイドロコルチゾンを塗布したこと以外は、前述した第１群と同様にして処置した。

（評価）
（１）耳介厚さ（腫脹）の経時的変化
Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２３、Ｄａｙ２５、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ２９における各群の耳介厚さ（Ｄａｙ０との差）の平均値を、前述した実施例１の（２）と同様にして算出した。これらの結果を図６に示す。図６には、各実験群について、左から順にＤａｙ２１、Ｄａｙ２３、Ｄａｙ２５、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ２９の結果を示している。

（２）耳介重量の変化
Ｄａｙ３０の解剖時にマウスから摘出した耳の重量を、デジタル天秤にて秤量した（０．１μｇまで）。実験群ごとに重量の平均値±標準誤差を算出し、群間の重量有意差を計算した。これらの結果を図７に示す。

（３）臨床症状の経時的変化
Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２３、Ｄａｙ２５、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ２９のそれぞれにおいて、各群のマウスの背部に生じた扁平皮膚領域の分布を肉眼で観察し、下記基準でスコアリングして各群（６匹）の平均値を算出した。これらの結果を図８に示す。
０以上、１以下：ほとんど変化なし
１超、２以下：軽度の症状
２超、３以下：高度の症状

（４）炎症細胞の浸潤
Ｄａｙ３０に、第１群、第２群（以上、本発明例）、第５群（ステロイド投与群）のそれぞれにつき１例ずつ無作為に抽出したマウス左耳の一部（７ｍｍ）を生検し、ヘマトキシリン・エオジン(ＨＥ)染色による炎症細胞の同定（好中球、好酸球）を行なって病理組織標本を作製した。参考のため、上記第１群において、本発明抽出物を投与する前（Ｄａｙ３０）のマウス（アトピー性皮膚炎マウス）左耳の一部を生検し、上記と同様にして病理組織標本を作製した。図９Ａ〜図９Ｄに、アトピー性皮膚炎マウス（図９Ａ）、第１群の「ＶＡＭ−ＷＡＴ」投与群（図９Ｂ）、第２群の「ＶＡＭ−ＭＥＴ」投与群（図９Ｃ）、第５群の「ＨＣＴ」投与群（図９Ｄ）におけるマウスの写真（上段）と病理組織標本の２０倍拡大写真（下段）の結果をそれぞれ示す。

図６〜図９より以下のように考察することができる。

図６より、本発明抽出物を投与した「ＷＡＴ−ＶＡＭ」および「ＭＥＴ−ＶＡＭ」は、溶媒投与群の「ＶＥＨ」およびステロイド投与群の「ＨＣＴ」に比べ、耳介腫脹抑制効果が有意差をもって顕著に見られ（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）、特にＶＡＭのメタノール抽出物を投与した「ＭＥＴ−ＶＡＭ」では非常に著しい抑制効果が確認された。図６とほぼ同様の傾向は図７でも見られ、本発明抽出物を投与した群はいずれも、溶媒投与群およびステロイド投与群に比べ、有意差はないが耳重量の減少が大きく見られた。このことは、本発明抽出物を投与したマウスには、浮腫や炎症の症状が減少していることを意味する。

また図８より、本発明抽出物を用いれば、溶媒投与群に比べて炎症症状を有意に改善でき、ステロイド投与群とほぼ同程度の改善効果が確認された。

更に図９より、アトピー性皮膚炎マウスでは症状が進行して皮膚のバリア層が破壊し、好酸球および好中球の著しい浸潤が見られた（図９の下段の写真をご参照）のに対し、本発明抽出物を投与すると図９Ｂおよび図９Ｃに示すように、バリア層の破壊も殆ど見られず、好酸球および好中球の数も減少した。本発明抽出物による改善作用は、ステロイド投与群（図９Ｄ）とほぼ同程度であった。

以上の実験結果より、本発明抽出物は、極めて優れた抗炎症作用を有していることが確認された。

なお、上記図には示していないが、本発明抽出物を投与すると、顕著な抗掻痒効果が見られたことを実験により確認している。

以上の実験結果より、本発明抽出物は、アトピー性皮膚炎の治療剤としても極めて有用であることが確認された。

Claims

ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉のアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤。
ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉、および／またはそのアルコールおよび／または水の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防用または治療用の外用剤。
化粧料として用いられるものである請求項２に記載の外用剤。
入浴剤として用いられるものである請求項３に記載の外用剤。
ＶｅｒｎｏｎｉａＡｍｙｇｄａｌｉｎａ葉、および／またはそのアルコールおよび／または水の抽出物を含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防用または治療用の化粧料用素材。