JP5774595B2

JP5774595B2 - 抗ｇｌｐ−１ｒ抗体及びそれらの使用

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Publication number: JP5774595B2
Application number: JP2012536995A
Authority: JP
Inventors: オニール，カリン; ピチャ，クリステン
Original assignee: ヤンセンバイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date: 2009-10-28
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2030-10-27
Also published as: US8389689B2; ES2617281T3; EP2494062B1; WO2011056644A3; US20110098443A1; EP2494062A4; US20140162316A1; US8883447B2; WO2011056644A2; EP2494062A2; JP2013509182A

Description

本発明は、ＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体、並びにそれらの作製方法及び使用に関する。

糖尿病はまん延しつつあり、２０２５年までに３億人を越える人々が罹患すると見積もられ、その全症例のうち９０〜９５％が２型糖尿病である。持続性の高血漿グルコース値によってもたらされる合併症としては、心臓血管疾患、腎症、神経障害、及び網膜症が挙げられる。加えて、膵臓のβ−細胞が破壊されるため、疾病の後期にはインスリン分泌が止まる。糖尿病の現在の処置は低血糖及び体重増加をもたらす場合があり、また時間が経過するにつれて患者が処置療法に対して耐性を持つようになり得るため、疾病の後期において結果的にインスリン療法が必要になる（Ｎａｒａｙａｎｅｔａｌ．，ＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ及びＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ５０：Ｓ７７〜Ｓ８４，２０００；Ｍｏｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ４１４：８２１〜８２７，２００１）。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、経口グルコース負荷後に腸のＬ−細胞から分泌される３０−アミノ酸ペプチド（配列番号１７）である（Ｍｏｊｓｏｖｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１８８０〜１１８８４，１９８６；Ｏｒｓｋｏｖｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ４３：５３５〜５３９，１９９４；Ｄｒｕｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３１〜３４３８，１９８７；Ｓｕｚｕｋｉｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２５：３１０９〜３１１４，１９８９）。グルコースに応答して、ＧＬＰ−１は膵臓上のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合し、インスリン分泌を誘発する（ヒトＧＬＰ−１Ｒのアミノ酸配列は配列番号１に示され、マウスＧＬＰ−１Ｒのアミノ酸配列は配列番号２に示される）。ＧＬＰ−１は胃内容排出を低減し、これは血行路中に放出されるグルコースの急速投与を減少させ、食物摂取を低減し得ることも示されている（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎｅｔａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３８：６６５〜６７３，１９９３）。ＧＬＰ−１はアポトーシスを阻害し、膵臓内のβ−細胞の増殖を高めることも示されている（Ｄｒｕｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１７：１６１〜１７１，２００３；Ｐｅｒｆｅｔｔｉｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４１：４６００〜４６０５，２０００；Ｈｕｉｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４４：１４４４〜１４５５，２００３；Ｆａｒｉｌｌａｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４３：４３９７〜４４０８，２００２）。それ故、ＧＬＰ−１は、血中グルコースを低下させ、糖尿病患者の膵臓のβ−細胞を保存する治療法において魅力的な性質を有している。

異なるタイプの組織及び細胞内に局在する機能的ＧＬＰ−１受容体は、多面発現性ＧＬＰ−１ペプチドの、観察される全般的な有効性に寄与する可能性がある。例えば、ＧＬＰ−１が中枢又は末梢仲介機構のどちらを介して食物摂取を調節しているのかは明かではない。現在のＧＬＰ−１Ｒ組織分布の研究は、タンパク質レベルではなく殆ど完全にｍＲＮＡレベルに依存している（Ｂｕｌｌｏｃｋｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７：２９６８〜２９７８；Ｖａｌｖｅｒｄｅｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ２３：７７〜８４，２００４）。受容体生体内分布の更なる研究は、種全体で交差反応する特定のＧＬＰ−１Ｒ抗体の入手可能性と、それにより例えば多数の種にわたって、規定された脳領域及び末梢組織内のタンパク質レベルの測定を容易にすることから利益を得るであろう。ＧＬＰ−１Ｒの活性を同定及び中和する抗体は、薬力学研究を促進するであろう。例えば、抗体は、ＧＬＰ−１効果を仲介する役割を担い得る、脳と対比した末梢のＧＬＰ−１受容体の寄与を詳細に分析するツールとして使用することができる。

したがって、ＧＬＰ−１Ｒ及びそのリガンドの生体内分布、薬力学及び作用機構の研究を促進する、ＧＬＰ−１Ｒに対する抗体が必要とされている。

本発明の１つの態様は、配列番号３、４及び５にそれぞれ示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列と、配列番号６、７及び８にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列とを含む、グルカゴン様ペプチド受容体１（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体である。

本発明の別の態様は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、グルカゴン様ペプチド受容体１（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体である。

本発明の別の態様は、配列番号３、４及び５に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含む抗体軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の別の態様は、配列番号６、７及び８に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含む抗体重鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の別の態様は、配列番号９、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の態様は、配列番号１０、１３及び１４に示されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の別の態様は、配列番号１５及び１６に示される配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の別の態様は、配列番号９、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体軽鎖である。

本発明の別の態様は、配列番号１０、１３及び１４に示されるＣＤＲアミノ酸配列を含む、単離された抗体重鎖である。
本発明の別の態様は、本発明の抗体重鎖及び軽鎖をコードするベクターである。
本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体を発現することが可能な宿主細胞である。

本発明の別の態様は、ＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体の作製方法である。
本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体を発現するハイブリドーマ細胞株である。

ＰＨＤ１９１は、可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒに対するＧＬＰ−１ペプチドの結合を阻害したことを示す。ＰＨＤ１９１は、ヒト受容体に対する^１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合を阻害したことを示す。

表１は、配列リストの説明を示す。

本明細書に引用する、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない刊行物はすべて、それらがあたかも本明細書に完全に記載されているのとまったく同様に本願に援用するものである。
本明細書で使用される用語「アンタゴニスト」は、何らかの機構によって、受容体又はリガンドなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子を意味する。アンタゴニストは、ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性を直接又は間接的に、実質的に相殺し、又は低減し、又は阻害することが可能である。アンタゴニストは、抗体、タンパク質、ペプチドなどであってもよい。例えば、抗体アンタゴニストは、ＧＬＰ−１Ｒに直接結合し、ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性を阻害することができる。

用語「と反応する」は、抗体が所定の抗原と、他の抗原又はタンパク質に対して有する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、反応する抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１０^−７Ｍ以下で結合し、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又はその他任意の特定ポリペプチド）に関するＫ_Ｄに比べ、少なくとも１０分の１のＫ_Ｄで、所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、用語「抗原と反応する抗体」、例えばＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体、と同義的に使用される。解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。

用語「抗体」は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体と、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体と、抗体フラグメントとを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。完全な抗体とは、２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）を一端に有し、これに多数の定常領域が続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）という２つの明確に異なるタイプのうちの１つに帰属させることができる。

免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに帰属させることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアイソタイプに更に分類される。
用語「抗体フラグメント」は、損なわれていない抗体の部分、通常は、損なわれていない抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、３つの「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワーク領域」からなっている。抗原結合部位は、以下の様々な表現を使用して定義されている。（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（ＷｕａｎｄＫａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は、ＶＨ内の３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）とＶＬ内の３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）との６つのＣＤＲを有している（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）により定義されているように、構造において超可変性を有する抗体可変ドメイン領域を指す。一般に抗原結合部位は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を有している。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されたＨＶを「正準構造（canonical structure）」と称している。ＣＤＲ及びＨＶの付番体系及び注釈は、最近、Ａｂｈｉｎ及びＭａｒｔｉｎにより改訂された（ＡｂｈｉｎａｎｄａｎａｎｄＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２〜３２３９，２００８）。（ｉｉｉ）Ｖドメインと、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体との比較に基づいた、抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）により提案されている。ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらの領域の標準的な付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの記述間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は、Ａｌｍａｇｒｏ（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）による特異性決定残基の使用（Specificity Determining Residue Usage）（ＳＤＲＵ）に基づいて記述されてもよく、特異性決定残基（ＳＤＲ）とは、抗原接触に直接関与する、免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。Ａｌｍａｇｒｏにより定義されるＳＤＲＵは、抗原抗体複合体の結晶構造の解析により定義される、異なるタイプの抗原に関するＳＤＲの数及び分布の正確な測定である。

本明細書で使用される用語「コンセンサンス領域」とは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴによって個別に記述されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域の記述を含むものとして定義される抗原結合部位を意味する。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、可変領域から抗原結合部位を除いた残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は、上述したような様々な記述により決定され得るため、フレームワーク配列の意味は、それに対応して異なる解釈が為される。本明細書で使用されるフレームワーク配列とは、抗原結合部位配列により定義されるもの以外の、抗体の可変領域内のそれらの配列を意味する。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対して作製される。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。
本明細書で使用される用語「ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性」とは、リガンド結合、例えばＧＬＰ−１（７−３７）のＧＬＰ−１Ｒに対する結合の結果生じる任意の活性を指す。ＧＬＰ−１Ｒ活性の例は、環状ＡＭＰの細胞内蓄積、カルシウム放出、インスリン分泌、又は標的タンパク質のキナーゼ仲介リン酸化である。ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性を測定するアッセイは、当技術分野にて周知である。

本明細書で使用される用語「ＧＬＰ−１Ｒ」とは、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿００２０５３（配列番号１）に示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＬＰ−１Ｒタンパク質を指す。マウスＧＬＰ−１Ｒは、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０６７３０７（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有する。
本明細書では以下のようにアミノ酸の慣習的な１文字及び３文字の略号を用いる。

物質の組成
本発明は、ヒトＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体、及びそのような抗体の使用に関する。そのようなＧＬＰ−１Ｒの抗体は、ＧＬＰ−１Ｒ受容体に結合し、ＧＬＰ−１Ｒ受容体仲介シグナル伝達を阻害する特性を有することができる。そのようなアンタゴニストにより阻害される、ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達が阻害される機構の例は、リガンド結合の阻害、又は下流のシグナル伝達経路の阻害を含む。ヒトＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体はまた、生物学的サンプル、例えば血清、組織、細胞、又は固定組織若しくは固定細胞内のＧＬＰ−１Ｒタンパク質の検出に使用され得る非中和抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば研究試薬、診断試薬として、ＧＬＰ−１Ｒの生体内分布の評価、及び薬力学研究において有用である。例えば、ＧＬＰ−１Ｒ抗体は、血液脳関門を交差する可能性が低い。したがって、アンタゴニストのＧＬＰ−１Ｒ抗体は、動物に投与された際、例えば食物摂取に関する、中枢ＧＬＰ−１活性ではなく末梢ＧＬＰ−１活性を選択的に遮断する効果を測定するのに使用されることができる。更に、ＧＬＰ−１Ｒに特異的な抗体は、脳の様々な区分内及び迷走神経内の受容体レベルを測定するのに役立ち、これは、それらのいずれか内のＧＬＰ１−Ｒの発現が、ＧＬＰ−１の食物摂取上の効果に寄与し得るためである。

本発明の１つの実施形態は、配列番号３、４及び５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列（ＬＣＤＲ１）、（ＬＣＤＲ２）及び（ＬＣＤＲ３）と、配列番号６、７及び８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列（ＨＣＤＲ１）、（ＨＣＤＲ２）及び（ＨＣＤＲ３）とを有する、ＧＬＰ−１Ｒと反応する単離された抗体である。
別の態様において、本発明は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む、ＧＬＰ−１Ｒと反応する単離された抗体を提供する。

別の態様において、本発明は、配列番号１１及び１２に示されるアミノ酸配列を有する単離された軽鎖と、配列番号１３及び１４に示されるアミノ酸配列を有する単離された重鎖とを提供する。
本発明の別の実施形態は、単離されたアンタゴニストのＧＬＰ−１Ｒ抗体である。ＧＬＰ−１Ｒに対するアンタゴニストの抗体を生成するには、受容体内のＧＬＰ−１結合ドメインを標的とする必要がある。ＧＬＰ−１Ｒは、７回膜貫通Ｇ−タンパク質共役受容体のサブクラスに属し、過去、このタイプの受容体に対する抗体を開発することは困難であった（Ｍｉｃｈｅｌａｔａｌ．，Ｎａｕｎｙｎ−ＳｃｈｍｉｅｄＡｒｃｈＰｈａｒｍａｃｏｌ．３７９：３８５〜３８８，２００９；Ｓａｎｇａｗａｅｔ．ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２７：３３１〜３３５，２００８；Ｈｕａｎｇｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．１８：３２７〜３３３，２００５）。ＧＬＰ−１Ｒは、比較的大きい細胞外Ｎ−末端ドメインを含み、そのドメインは、ＧＬＰ−１結合親和性の主要な決定基であることが明かになっている（Ｗｉｌｍｅｎｅｔａｌ．，Ｆｅｄｅｒ．Ｅｕｒｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３９８：４３〜４７，１９９６）。したがって、Ｎ−末端ドメインに対して産生された抗体は、結合に関してＧＬＰ−１Ｒアゴニストと競合し、その結果下流効果を阻害する可能性がある。

抗体の例は、アイソタイプがＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧＡ又はＩｇＭである抗体である。加えて、こうした抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの自然界には存在しない共有結合修飾などの処置によって翻訳後修飾されることができる。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行ってよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと結合（ペギレート）させることによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。結合は当業者には周知の方法によって行うことができる。治療抗体のＰＥＧとの結合は、機能を妨害することなく薬力学を向上させることが示されている（Ｄｅｃｋｅｒｔｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８７：３８２〜３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔｅｔａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ１５：４０９〜４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６：１０６〜１１９，２００１；及びＹａｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１６：７６１〜７７０，２００３）。

本発明の抗体の薬物動態的性質は、当業者には周知の技法により、Ｆｃ修飾によって向上させることも可能である。例えばＩｇＧ４アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）というモチーフを含んでいる。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が他の重鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合する（重鎖間）か、あるいは特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合し得る（重鎖内）。生体内のイソメラーゼ酵素は、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、またその逆反応を行うことが可能であると考えられている（Ａａｌｂｅｒｓｅ及びＳｃｈｕｕｒｍａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０５：９〜１９、２００２）。したがって、ヒンジ領域に重鎖内結合を有するこうしたＩｇＧ４分子内の重鎖：軽鎖の各ペアは互いに共有結合していないことからＨＬモノマーに解離し、更に他のＩｇＧ４分子に由来するＨＬモノマーと再結合して、２重特異性のヘテロダイマーのＩｇＧ４分子を形成する。２重特異的なＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂの結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＣＰＳＣモチーフのＳｅｒ残基をＰｒｏで置換することによって「ＩｇＧ１様挙動」が生じる。すなわち、これらの分子は重鎖同士の間に安定したジスルフィド結合を形成するために他のＩｇＧ４分子とのＨＬ交換が起きない。１つの実施形態では、本発明の抗体はＣＰＳＣモチーフ内にＳ→Ｐの突然変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。ＣＰＳＣモチーフの位置付けは通常、成熟した重鎖の残基２２８に見いだされるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。

更に、本発明の抗体において、アミノ酸配列は、ＦｃＲｎサルベージ受容体以外のＦｃ受容体に対する結合に影響を与えるＦｃドメイン内で変更又は除去されてもよい。例えば、本発明の抗体において、ＡＤＣＣ活性に関与する抗体Ｆｃ領域を除去することができる。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異、又はＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３５／Ｌｅｕ２３６のＰ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａへの突然変異によって、ＦｃＲへの結合が最小となり、補体依存性細胞傷害活性及びＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリンの能力が低減する。１つの実施形態では、本発明の抗体は、Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ突然変異を有するＩｇＧ４Ｆｃドメインを含むであろう。上記で特定したこれらの残基の位置付けは成熟した重鎖においては典型的なものであるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。

本発明の抗体アンタゴニストは、約１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１又は１０^−１２Ｍ以下のＫ_ｄでＧＬＰ−１Ｒと結合することができる。ＧＬＰ−１Ｒに対する所定の分子の親和力は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。こうした方法では、当業者には周知であるバイアコア（Biacore）機器又はＫｉｎＥｘａ機器、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを使用することができる。
ＧＬＰ−１Ｒと所望の親和性で結合するアンタゴニスト抗体分子は、抗体親和性成熟を含む方法によって変異体又はフラグメントのライブラリから選択することができる。アンタゴニスト抗体は、任意の適当な方法を用いて、ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性の阻害に基づいて同定することができる。そのような方法は、レポーター遺伝子検査、又は当業者に既知の、細胞内環状ＡＭＰ生成を測定する検査を使用することができる。分布及び薬力学試験のための好適な抗体は、免疫組織化学的検査又はＥＬＩＳＡアッセイなどの通常の方法論を用いて試験することができる。

本発明の抗体は、多様な方法により、例えばＫｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法により産生することができる。受容体抗体（通常、別の哺乳動物種、例えばヒト）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域と関連してドナー抗体（通常はマウス）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法によって調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（通常はマウス）に由来するＣＤＲ、及び１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の部分を抽出した免疫グロブリンの残部を有するＣＤＲグラフト化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知の方法によって作製することができる。グラフト化に有用なヒトフレームワーク配列は、当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。場合により、ＣＤＲグラフト化ｍＡｂは、更に、Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，１９９１に開示されている技術により、変更されたフレームワーク支持残基を組み込んで結合親和性を保存することによりヒト化されてもよい。ヒト以外のいかなる配列も持たない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５〜８５１，１９９６、及びＭｅｎｄｅｚら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６〜１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスから作製することができる。ヒトｍＡｂはまた、ファージディスプレイライブラリを元に、例えばＫｎａｐｐｉｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００；及びＫｒｅｂｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４２００１に参照された技法によって調製及び最適化することができる。

免疫原性抗原の調製、及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、又は全細胞若しくは細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、又は抗原は、動物の身体内で、前記抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてもよい。

本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド、又はそれらの相補体である。特定のポリヌクレオチドの例を本明細書に開示するが、遺伝子コードの縮重及び特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。単離されたポリヌクレオチドの例は、配列番号１５又は１６に示される配列を有するポリヌクレオチドを含む。本発明の単離された核酸は、当技術分野にて周知のように、（ａ）組み換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はそれらの組み合わせを使用して形成することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、当技術分野にて既知である方法を用いて配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。ハイブリドーマを産生する場合、かかる細胞は、かかるＤＮＡ源として機能し得る。あるいは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリなどのコード配列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージ選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を生成するために用い、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。かかるベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってもよい。本発明のポリペプチドを発現させるためのベクターの例は、ＣＭＶプロモーター、Ｔ７結合部位、ＶＨリーダー配列、ＢＧＨポリＡ部位、ｆ１複製開始点、ＣｏｌＥ１開始点、ＣＭＶプロモーター及びβ−ラクタマーゼからなり、抗体定常領域、例えばマウスγ２ａ定常領域をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。

本発明の別の実施形態は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、本発明の任意のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。かかる宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞（archeal cells）であってもよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものであり得る。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣＮｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマ細胞株などの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例には、Ｕ２６６（ＡＴＴＣＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）がある。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）のようなチャイニーズハムスターに由来する卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＤＧ４４が挙げられる。

本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養する工程と、その宿主細胞によって産生された抗体を回収する工程とを含む、ＧＬＰ−１Ｒと反応する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は当技術分野では周知のものである。
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

（実施例１）
可溶性ＧＬＰ−１Ｒタンパク質の生成
ヒトＧＬＰ−１受容体のアミノ酸２４〜１４５（配列番号１）及びマウスＧＬＰ−１受容体のアミノ酸２１〜１４３（配列番号２）に対応する可溶性ヒト及びマウスＧＬＰ−１受容体をコードするｃＤＮＡを、遺伝子合成技術（米国特許第６，６７０，１２７号、同第６，５２１，４２７号）を用いて調製した。合成可溶性受容体の発現のためのプラスミドを、標準的な分子生物学技術を用いて調製した。各プラスミドは、Ｋｏｚａｋ配列、ヒト成長ホルモンシグナル配列、ヒト又はマウスＧＬＰ−１Ｒの可溶性領域、及び精製を容易にするためのＣ−末端６ｘＨｉｓタグをコードしていた。標準的な方法を用いてベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に一過的にトランスフェクトし、分泌されたタンパク質を、Ｔａｌｏｎ樹脂を使用してＩＭＡＣにより精製した。

ＥＺｌｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用して、製造業者の指示書に従って可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒ抗原（＃３５２７）をビオチンで標識した（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。ＣＮＴＯ７３６、ＧＬＰ−１ミメティボディ（商標）構築物（Ｐｉｃｈａｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ５７：１９２６〜３４，２００８）を使用して、ビオチン標識３５２７の活性を確認した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、５μｇ／ｍＬのビオチン標識又は非標識３５２７のいずれかで被覆し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、３００μｌ／ウェルの１ＸＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを用いて室温で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＣＮＴＯ７３６又はＣＮＴＯ１９９６のいずれかの連続希釈物（１：３）（ＧＬＰ−１ペプチドを欠いた負の対照）を１０μｇ／ｍｌから開始して作製し、プレート内の適切なウェルに加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間結合させた。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。プレートを、ＴＢＳＴで１：５０００に希釈した、１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰ検出抗体を用いて、室温で１時間処理した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（１：５）は、ＡＰ活性を検出した。ビオチン標識３５２７は非標識３５２７に対して類似の結合プロファイルを維持した（データは示さず）。

（実施例２）
抗ヒトＧＬＰ−１Ｒ抗体の同定
（Ｒｏｔｈｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２〜１２００，２００８；Ｓｔｅｉｄｌｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１３５〜１４４，２００８）に記載されているビオチン標識抗原−ストレプトアビジン磁気ビーズ捕集方法を用いて、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリＧＯＬＤ（ＨｕＣＡＬＧＯＬＤ）の溶液パニング（solution panning）を３回連続で行った。選択の最後の回から回収したＦａｂを、Ｍｙｃ及びＨｉｓ６タグを含むｐＭＯＲＰＨｘ９＿Ｍｘ＿ＭＨＦａｂ発現ベクター内にサブクローニングした（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３８１９４〜３８２０５，２００３）。電気穿孔を介して大腸菌ＴＧ１細胞（＃２００１２３，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換し、細菌によりＦａｂが産生された。

３５２７に対する結合に関してＦａｂをスクリーニングした（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３８１９４〜３８２０５，２００３）。バックグラウンドの５倍を上回って３５２７に結合したＦａｂを配列決定して、ユニークＦａｂクローンの数を決定した。３９個のＦａｂが、配列決定のために選択された。配列決定した３９個のクローンから、ＰＨＤ１９１が３回、又は全ヒットの８％と同定された。ＰＨＤ１９１のＣＤＲ並びに軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号３〜１０に示す。

（実施例３）
ＰＨＤ１９１Ｆａｂは、可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒに対するＧＬＰ−１の結合を阻害する。
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒ（ｓｈＧＬＰ１−Ｒ）で被覆し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、３００μｌ／ウェルの１ＸＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを用いて室温で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。混合物は、ＰＨＤ１９１Ｆａｂの２５μｇ／ｍｌから出発した連続希釈物（１：２）と、７５ｎｇ／ｍｌで一定に保ったビオチン標識ヒトＧＬＰ−１ペプチドとからなっていた。この混合物をプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＴＢＳＴで１：２０００に希釈した、１００μｌ／ウェルのＳｔｒｅｐ−ＡＰ検出抗体によりプレートを室温で１時間処理した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（１：５）は、ＡＰ活性を検出した。ＰＨＤ１９１は、可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒに対するヒトＧＬＰ−１ペプチドの結合を阻害した（図１）。

（実施例４）
ヒトＩｇＧ１／ヒトＩｇκ及びマウスＩｇＧ２ａ／マウスＩｇκ形式へのＰＨＤ１９１の移動
ＰＨＤ１９１を完全長免疫グロブリン発現ベクター内にサブクローニングした（Ｋｒｅｂｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４，２００１）。ＰＨＤ１９１マウスＩｇκ、ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇκ構築物に関して、同様の構築物を形成した。

完全長重鎖及び軽鎖ベクターを、製造業者の指示書に従って、ＤＨ１０Ｂ細胞内へ形質転換した。個々のコロニーを、正確な可変領域の挿入に関して、ＰＣＲ及び配列分析によりスクリーニングした。正確なクローンのそれぞれについてＤＮＡを単離し、標準的な手順を用いたトランスフェクションに使用し、挿入断片を配列決定した。得られた軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を、配列番号１１〜１４に示す。
適切な重鎖及び軽鎖パートナーをコードするベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞内にコトランスフェクトした。分泌された抗体を含有する上清を、タンパク質Ａ樹脂を使用して、標準的なプロトコルに従って親和性精製した。

（実施例５）
ＰＨＤ１９１の特徴付け
マウスＧＬＰ−１Ｒとの交差反応性
２つの異なるＥＬＩＳＡアッセイ形式を用いて、ＰＨＤ１９１の結合特異性を特徴付けた。両方のアッセイ形式は、ＰＨＤ１９１がヒトＧＬＰ−１Ｒに結合し、マウスＧＬＰ−１Ｒとも交差反応することを示した。最初の特徴付けアッセイは、ニュートラアビジン捕捉アッセイであった。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのニュートラアビジンで被覆し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。被覆したプレートを、ＴＢＳＴで洗浄した。２μｇ／ｍｌのビオチン標識可溶性マウスＧＬＰ−１Ｒ（３４４５）、又はビオチン標識可溶性ヒトＧＬＰ−１Ｒ（３５２７）、又は他のビオチン標識対照タンパク質（マウスＩＬ−２３、マウスＩＬ−１２、マウスＩＬ−１８、ラットトランスフェリン）を加え（１００μｌ／ウェル）、ニュートラアビジンに対して室温で１時間結合させた。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、３００μｌ／ウェルの１ＸＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを用いて室温で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＰＨＤ１９１ｍＡｂの連続希釈物（１：２）を、５μｇ／ｍｌから出発して作製し、プレートに加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間結合させた。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＴＢＳＴで１：５０００に希釈した１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰ検出抗体により、プレートを室温で１時間処理した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（１：５）は、ＡＰ活性を検出した。ヒト可溶性ＧＬＰ−１Ｒに特異的に結合したＰＨＤ１９１は、マウス可溶性ＧＬＰ−１Ｒと交差反応し、非関連ビオチン標識タンパク質には結合しなかった（ヒト及びマウス可溶性ＧＬＰ−１Ｒのそれぞれについて０．４ｎＭ及び２．５ｎＭ）。

ＰＨＤ１９１のマウスＧＬＰ−１Ｒに対する交差反応性を確認するために、プレート上に直接被覆した非標識受容体を使用して、第２の特徴付けアッセイを行った。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの非標識マウス又はヒトＧＬＰ−１Ｒで被覆し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。被覆プレートをＴＢＳＴで洗浄し、３００μｌ／ウェルの１ＸＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを用いて室温で１時間ブロックした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＰＨＤ１９１Ｍａｂの連続希釈物（１：３）を３０μｇ／ｍｌから出発して作製し、プレートに加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間結合させた。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。ＴＢＳＴで１：５０００に希釈した１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰ検出抗体により、プレートを室温で１時間処理した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（１：５）は、ＡＰ活性を検出した。直接被覆アッセイは、ＰＨＤ１９１が可溶性マウスＧＬＰ−１Ｒと交差反応することを確認した（ヒト及びマウス可溶性ＧＬＰ−１Ｒのそれぞれについて０．８ｎＭ及び１１．９ｎＭ）。

ヒトＧＬＰ−１Ｒに対するＧＬＰ−１の結合の阻害
^１２５ＩＧＬＰ−１結合アッセイを用いて、ＰＨＤ１９１が細胞上に発現されたヒト受容体に対するＧＬＰ−１の結合を阻害できるか否かを決定した。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ＰＨＤ１９１の投与量調整試験（dose titration）と共に、３ｎＭ ^１２５ＩＧＬＰ−１の存在下４℃で一晩インキュベートした。未結合^１２５ＩＧＬＰ−１を洗浄除去し、細胞に関連した数を測定した。データを双曲線にフィッティングさせて、４８．５ｎＭのＩＣ_５０を得た（図２）。ヒトＧＬＰ−１Ｒに結合するＧＬＰ−１の３ｎＭのＫｄ（以前に測定）と、競合的阻害とを仮定すると、このデータは、ＰＨＤ１９１のＫｉがおよそ２０ｎＭであることを示す。

ＧＬＰ−１による環状ＡＭＰ刺激の阻害
２つのアッセイ形式を使用して、ＰＨＤ１９１がＧＬＰ−１仲介によるｃＡＭＰ蓄積を阻害することを示した。第１の表示形式では、ヒトＧＬＰ−１Ｒ受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、０．３ｎＭＧＬＰ−１ペプチドの存在下でＰＨＤ１９１の投与量調整試験を加えた。第２の表示形式では、ＧＬＰ−１Ｒ過剰発現細胞に、１μＭＰＨＤ１９１の存在下でＧＬＰ−１ペプチドの用量反応試験（dose response）を加えた。両方のケースにおいて、刺激から７分後の総ｃＡＭＰ蓄積を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬＡＮＣＥｃＡＭＰアッセイキットを使用して定量化した。ＰＨＤ１９１の投与量調整試験は、ＧＬＰ−１依存性ｃＡＭＰ蓄積を用量依存的に低下させ、抗体の存在下でＧＬＰ−１ペプチドのシグナル伝達が低減することを示した。単一結合事象を記述する等式にデータをフィッティングさせ、３．３ｎＭのＩＣ_５０が得られた。ＰＨＤ１９１はまた、ＧＬＰ−１ペプチドがｃＡＭＰアッセイで試験された際、ＥＣ_５０を０．３から１．５ｎＭに変更した。

（実施例６）
ヒトＧＬＰ−１Ｒの組織内分布
正常な組織内でのヒトＧＬＰ−１Ｒのタンパク質発現を、免疫組織化学的検査により評価した。ＧＬＰ−１Ｒタンパク質を、膵島、ＣＮＳニューロン、及び消化管の上皮細胞内に検出した。
正常なドナーからの脳試料をＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。脳解体を行い、神経生物学者（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）により品質評価された。他の正常なヒト組織の試料はＱｕａｌＴｅｋ組織バンクから獲得し、病理学者により品質評価された。以下の方法で、ヒト組織の免疫組織化学的検査を行った。ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから４マイクロメートルの組織切片を切り取り、スライドガラス上に配置し、６０℃で乾燥した。これらを５分間のキシレン交換４回と、それに続く段階的な一連のアルコール〜蒸留水により脱ろう（dewax）した。以下のプロトコルを用いて、ＰＨＤ１９１に対する免疫組織化学的反応性に関して全組織試料を試験した。手短に言えば、ｓＨＩＥＲ２を用いて組織を２０分間前処理した後、ＰｒｏＫにより１：１５希釈にて１０分間消化した。続いて、組織試料を一次抗体、ＰＨＤ１９１と共に、５μｇ／ｍｌ又は７．５μｇ／ｍｌのいずれかにて、４℃で６３時間インキュベートした。ブロッキング実験のために、２０モル過剰のＧＬＰ−１Ｒ細胞外ドメインの存在下で、組織をＰＨＤ１９１と共にインキュベートした。マウス非特異性アイソタイプ対照抗体を使用して、染色の特異性を確認した。Ｔｅｃｈｍａｔｅ上でのＭＩＰＥプロトコルを用いたＡＢＣ検出システムを使用して、結合した一次抗体を標識した。染色後、スライドを一連のアルコール〜絶対エタノールと、それに続くキシレンによる濯ぎにより脱水した。スライドをガラスカバースリップ及びパーマウントにより恒久的にカバースリップ被覆した。スライドを顕微鏡下で調べて、染色を評価した。ポジティブ染色は、茶色色原体（ＤＡＢ−ＨＲＰ）反応生成物の存在により示された。ヘマトキシリン対比染色は、細胞及び組織形態を評価するための青色核染色を提供した。ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６０顕微鏡に取り付けたＯｌｙｍｐｕｓＭｉｃｒｏｆｉｒｅデジタルカメラ（Ｍ／ＮＳ９７８０９）を用いて代表的な画像を獲得し、Ｄｅｌｌフラットパネルモニター上に、ＤＰＩを９６に設定し、画面の解像度を１１５２×８６４画素に設定して表示した。Ｋｏｅｈｌｅｒ照明を使用して、画像の焦点をはっきり合わせた。４０ｘ以上の対物レンズにより作られたいくつかの画像を、視野の集束範囲にわたる連続として撮影し、Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ５．１（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）拡張焦点深度（extended depth of field）機能と組み合わせて、画像の視野全体でしっかりと合った焦点を有する複合画像を得た。

ヘマトキシリン対比染色後、組織学的評価に基づいて、膵島をヒト膵臓区分内で同定した。ヒト膵臓のＩＨＣ解析は、島細胞内のヒトＧＬＰ−１Ｒの存在を示した。染色の特異性は、ＰＨＤ１９１のＧＬＰ−１Ｒの細胞外ドメインとの前インキュベーションが染色を完全に阻害したブロッキング実験にて確認された。ＧＬＰ−１Ｒは扁桃体、視床下部、弓状核及び最後野内のニューロンにおいても検出された。ＧＬＰ−１Ｒは、脳皮質の２つの試料中には検出されなかった。染色は、マウス非特異性アイソタイプ対照抗体で染色した脳切片のいずれにおいても検出されなかった。

上皮を含む組織試料において、染色は上皮細胞中に時折見られた。１４個の肺試料中の４つにおいて、気管支気道のいくつかは、管腔表面に染色を有する上皮細胞と、基底細胞内に核周囲染色を有した。４つの結腸試料中の２つにおいて、管腔表面は強力な染色を有した。３つの乳房試料中の１つにおいて、管を裏打ちする細胞内に核周囲染色が見られた。これらの試料において、負の対照内では反応性が見られなかった。
３つの小腸試料中の１つと、４つの結腸試料中の２つにおいて、単離された陰窩細胞内で反応性が見られた。結腸及び小腸内のこれらの染色陰窩細胞の位置付け及び頻度は、腸管内分泌細胞と一致している。

組織の大部分において、反応する免疫細胞が観察された。これらは一般に、血管内の多形核顆粒球、又はマクロファージ若しくは肥満細胞の形態を有する細胞であった。染色の特異性を確認するために、試料のサブセットを用いて、過剰の抗原（ＧＬＰ−１ＲのＮ−末端ドメイン）の存在下でＩＨＣを繰り返した。これらの条件下で、ニューロン、上皮、及び膵島細胞内でのＰＨＤ１９１反応性は有意に阻害された。免疫細胞内ではＰＨＤ１９１反応性の部分的な阻害のみが観察され、したがって免疫細胞内でのＰＨＤ１９１染色の特異性は、未だ決定されていない。

本明細書に記載したデータは、ＰＨＤ１９１の発見及び特徴付けを詳述している。ＰＨＤ１９１はマウスＧＬＰ−１Ｒと交差反応し、細胞上に発現されたヒトＧＬＰ−１Ｒに結合した。ＰＨＤ１９１はヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ形式のいずれかにクローニングされた。ＰＨＤ１９１は、ヒトＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の結合を阻害し、ＧＬＰ−１仲介によるｃＡＭＰ蓄積を阻害した。これらの性質を有する抗体は、商業的な供給源からは入手できない。
以上、本発明の全容を述べたが、付属の「特許請求の範囲」の趣旨又は範囲を逸脱することなく本発明に多くの変更及び改変をなし得ることは、当業者にとって明白であろう。

Claims

配列番号３、４及び５にそれぞれ示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列と、配列番号６、７及び８にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列とを含む、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体。
配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体。
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）とを含む、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体。
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）とを含む、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）と反応する単離された抗体。
前記抗体がＧＬＰ−１Ｒのアンタゴニストである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
前記抗体がＦａｂ断片を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体。