JP5776684B2 - 促進された共培養樹状細胞を使用して抗原特異的ｔ細胞応答を刺激するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。

発明の背景
抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答の研究は、厄介な技術的課題をもたらす[Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005]。これはＡｇ特異的画分が一般的に、末梢血中に非常に低い頻度で示されるという事実に主に起因し、この特徴がその検出を困難なものとしている[Mallone, Clin.Immunol. 110:232, 2004]。この検出はＣＤ４＋Ｔ細胞を考える場合にはさらにより問題のあるものとなる。なぜなら、これらの画分は、しばしば、そのＣＤ８＋の同等物よりもさらにより低い頻度でしか存在しないからである[Homann, Nat.Med. 7:913, 2001; Seder, Nat.Immunol. 4:835, 2003]。

多種多様な構造的または機能的な解読値を使用してこのようなＡｇ特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を検出することを可能とするいくつかの検出戦略が現在利用可能である[Kern, Trends Immunol. 26:477, 2005]。しかしながら、全ての技術によって共有される１つの欠点は、Ａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ex-vivoでは、およそ直接的に検出することができないことである。最も一般的には、これらの細胞を、５〜１４日間のin vitroにおける培養工程を通して予め増殖させて、検出閾値に到達させる必要がある[Mallone, Clin.Immunol. 110:232, 2004]。このin vitroにおける増殖のために多くのアプローチを使用することができる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、適切な数のＣＤ４＋Ｔ細胞並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ；単球、Ｂ細胞、および僅かな循環樹状細胞の画分（ＤＣ））を含むので、それらを、対象のペプチドエピトープまたはタンパク質Ａｇでパルスし、そしてインターロイキン（ＩＬ）−２およびＩＬ−７などの共刺激サイトカインを添加してまたは添加せずに増殖させることができる。

あるいは、単球をまず単離し、そして５〜７日間かけて顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ−４を用いて未成熟ＤＣへと分化させ、続いてさらに２４〜４８時間かけて異なる炎症誘発刺激を用いて成熟させることができる[Zhou et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2588, 1996]。この戦略はＤＣのより高い刺激能力を活用することにより、より多くのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を達成する。魅力的であるが、しかしながらそれはより多くの出発血液容量を必要とする。なぜなら単球はＰＢＭＣの僅かに約５〜１５％を占め、そしてアロ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の選択を避けるために自己単球を理想的には使用するべきであるからである。それ故、単球由来ＤＣが生成される間、Ｔ細胞は、培養液中にまたは凍結して保持される必要がある。より多くのＰＢＭＣが必要とされることの他に、この手順はまた、血液の天然のＡＰＣに専ら依拠する手順よりも長い。

さらに、Ｔ細胞刺激のためのペプチドエピトープの使用は、免疫応答によってターゲティングされるそのようなエピトープの事前の同定を必要とする。この同定手順は非常に大きな労力を要し、そして１つのＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対して特異的である。従って、研究したいと思うヒト被験者に応じて、異なるＨＬＡアレルに対して異なるエピトープを同定しなければならない。

さらに特筆すべきことに、しばしば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するだけではなく、さらなる機能的プロファイリングのためにそれらを単離および増殖することに関心がある。

それ故、Ｔ細胞応答を測定し、そしてＴ細胞クローン、特にＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するための感度が高く、多用途で、そして使い易い方法を提供するための充足されていない必要性が依然として当技術分野において存在する。

発明の要約
本発明者らは、適切なサイトカイン混液および培養条件を使用して、未分画全血または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料からの直接的な成熟樹状細胞と共にＡｇ特異的Ｔ細胞を共培養することによって、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激することが可能であることを発見した。

従って、本発明は、以下の工程：
ａ）樹状細胞（ＤＣ）の分化を誘導する培地中において血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
（Ａｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、被験体から単離した前記血液試料またはＰＢＭＣ試料中において抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法を提供する。

本発明はまた、被験体における疾病を診断するための、および／または免疫療法の効果をモニタリングするためのこのような方法の使用に関する。

本発明の別の局面は、Ａｇ特異的Ｔ細胞クローンを産生するためのこのような方法の使用に関する。

本発明のさらに別の局面は、治療タンパク質の免疫原性を評価するための並びにＡｇ発見およびエピトープマッピング分析のための、このような方法の使用に関する。

本発明のさらに別の局面は、Ａｇ特異的制御性Ｔ細胞を生成するためのこのような方法の使用に関する。

発明の詳細な説明
本発明は、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
（Ａｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、被験体から単離した前記の血液試料またはＰＢＭＣ試料中においてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に関する。

１つの態様において、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答はＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。別の態様において、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。

本発明者らは、本発明の方法を実施するために適切な生物学的試料は、血液試料、または慣用的な密度勾配分離プロトコールを使用して全血から精製したＰＢＭＣ試料である。

好ましい態様において、本発明の生物学的試料はＰＢＭＣ試料である。本明細書において使用する「ＰＢＭＣ」または「末梢血単核球」または「未分画ＰＢＭＣ」という用語は、全ＰＢＭＣ、すなわち所与の亜集団群へと濃縮されていない、丸い核を有する白血球の１集団群を指す。典型的には、本発明によるＰＢＭＣ試料は、接着性ＰＢＭＣ（実質的に９０％超の単球からなる）または非接着性ＰＢＭＣ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞およびＤＣ前駆体を含む）のみを含むための選択工程にかけられていない。

それ故、本発明によるＰＢＭＣ試料は、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）、単球およびその前駆体を含む。

典型的には、これらの細胞を、血液の層を分離する親水性多糖であるフィコールを使用して全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは血漿の層の下に細胞輪を形成する。さらに、ＰＢＭＣを、赤血球を優先的に溶解する低浸透圧性溶解を使用して全血から抽出することができる。このような手順は、当業者には公知である。

あるいは、本発明による生物学的試料は血液試料でもよい。

本明細書において使用する「血液試料」または「未分画血液試料」という用語は、被験体から単離され、そして適切な抗凝固剤（例えばヘパリンリチウムまたはクエン酸ナトリウム）を含むチューブまたは他の容器中に回収された粗血液標本を指す。血液試料は未分画の全血であり、そして血漿および血球（赤血球、白血球）を含む。それは新たに単離された血液試料（４８時間未満）であっても、または以前に入手しそして使用まで凍結して保存されていた血液試料でもよい。

本明細書において使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウスまたはラット）、ネコ、イヌまたは霊長類を指す。好ましい態様において、前記被験体はヒト被験者である。

本発明による被験体は、健康な被験体であっても、または所与の疾病を患う被験体であってもよい。

本明細書において使用する「抗原」（「Ａｇ」）という用語は、Ｔ細胞応答を誘起することのできるタンパク質、ペプチド、組織または細胞の調製物を指す。好ましい態様において、前記Ａｇは、組換えＤＮＡ技術によって、または異なる組織もしくは細胞源からの精製によって得ることができるタンパク質である。このようなタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、例えば選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、または異なるタンパク質の部分を融合することによって得られる改変タンパク質またはキメラ構築物も含む。本発明の別の態様において、前記Ａｇは、Ｆｍｏｃ生化学的手順、大規模多重ピンペプチド合成、組換えＤＮＡ技術または他の適切な手順によって得られる合成ペプチドである。

本発明の別の態様において、Ａｇは、当業者には公知の種々の生化学的手順（例えば固定、溶解、細胞下分画、密度勾配分離）によって得られる粗または部分精製された組織または細胞の調製物である。

工程ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中における血液試料またはＰＢＭＣ試料の培養
本発明の方法は、ＤＣの分化を誘導する培地中における血液試料またはＰＢＭＣ試料の培養工程を含む。

本発明を実施するのに適した培地は、ＰＢＭＣの増殖、生存および分化に適した任意の培養培地である。典型的には、それは、ヒトまたは他の起源の血清および／または増殖因子および／または抗生物質を補充することのできる、栄養分（炭素源、アミノ酸）、ｐＨ緩衝液および塩を含む基礎培地からなり、これにＤＣの分化を誘導する物質を加える。

典型的には、基礎培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−ＶＩＶＯまたはＡＩＭ−Ｖ培地であり得、その全てが市販されている標準培地である。

本発明の態様において、ＰＢＭＣ試料よりもむしろ血液試料を培養する場合には、このような基礎培地の使用は不必要であり、培養培地としての役目を果たす血液中に直接、分化剤を加えることができる。

細胞培養は、この目的に適した組織培養インキュベーターを使用して５％ＣＯ_２雰囲気中３７℃で実施し得る。

好ましい態様において、前記培地は、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。典型的には、１〜１０，０００Ｕ/ml、好ましくは１０〜５，０００Ｕ/ml、さらにより好ましくは約１，０００Ｕ/mlの量のＧＭ−ＣＳＦを使用する。

ＧＭ−ＣＳＦを多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＧＭ−ＣＳＦであっても、または組換えＧＭ−ＣＳＦであってもよい。ＧＭ−ＣＳＦは、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

好ましい態様において、前記培地はさらに、インターロイキン４（ＩＬ−４）を含む。典型的には、０〜１０，０００Ｕ/ml、好ましくは１０〜１，０００Ｕ/ml、さらにより好ましくは約５００Ｕ/mlの量のＩＬ−４を使用する。ＩＬ−４を多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＩＬ−４であっても、または組換えＩＬ−４であってもよい。ＩＬ−４は、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

別の好ましい態様において、前記培地は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）リガンドを含み、Ｆｌｔ−３リガンドは単独でまたはＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４と組み合わせて使用され得る。典型的には、１〜１，０００ng/ml、好ましくは１０〜１００ng/mlの量のＦｌｔ−３リガンドを使用する。

Ｆｌｔ−３リガンドを多種多様な起源から得ることができる。それは精製Ｆｌｔ−３リガンドであっても、または組換えＦｌｔ−３リガンドであってもよい。Ｆｌｔ−３リガンドは、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

本発明によると、ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料またはＰＢＭＣ試料をインキュベーションする工程は、前記血液試料またはＰＢＭＣ試料のＤＣを濃縮するのに十分な時間をかけて行なわれる。当業者にとっては、これは、ＤＣによって発現されるか、または発現されないことが知られるマーカーの相対的発現を調べることによって容易に試験することができる。例えば、血液試料またはＰＢＭＣ試料の濃縮は、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６などのマーカーの増加および／またはＣＤ１４などのマーカーの減少によって反映され得る。多種多様なゲーティング戦略を使用して、分析中の細胞を、選択されたＰＢＭＣまたは全血サブセットに制限することによって、ＤＣ集団群上におけるこれらのマーカーの発現の特異性を評価することができる。例えば、ＤＣは、他の亜集団群（例えばＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４；いわゆる系統陰性細胞）に典型的なマーカーを発現せず、そしてＨＬＡ−ＤＲを発現している細胞として同定され得る。

好ましい態様において、前記工程を、ｔ（ａ）ｍｉｎからｔ（ａ）ｍａｘまでの時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

典型的には、工程ａ）の最小インキュベーションのｔ（ａ）ｍｉｎは、約１２時間、好ましくは約１６時間、さらにより好ましくは約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、さらにより好ましくは約２４時間であり得る。

典型的には、工程ａ）の最大インキュベーションのｔ（ａ）ｍａｘは、約１０日間、好ましくは約７日間、さらにより好ましくは約６日間、約５日間、約４日間、約３日間、約２日間、さらにより好ましくは約１日間であり得る。

上に開示した最小および最大インキュベーション時間ｔ（ａ）ｍｉｎおよびｔ（ａ）ｍａｘを組み合わせることができる。

好ましい態様において、工程ａ）を、約１６時間〜約７日間、好ましくは約２０時間〜約４日間の時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

好ましい態様において、工程ａ）を約２４時間の時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

実際に、本発明者らは、単離Ｔ細胞に加えられた場合にＡｇ特異的Ｔ細胞応答をその後に刺激することができるＤＣを、出発物質として精製された単球を使用して産生するための慣用的なプロトコールを、共培養液中におけるＤＣの産生に適用することができ、従って、本発明の抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法に適用することができることを実証した。このような方法は、例えば、Caux et al. Nature 360:258, 1992; Romani et al., J Exp Med. 180: 83, 1994 and Sallusto et al., J Exp Med. 179 : 1109, 1994に記載されている。

さらに、本発明者らは、意外なことに、Dauer et al., [Dauer et al., J Immunol, 170:4069, 2003]によって記載された促進されたプロトコールを本発明の方法のためにも使用して、出発物質として未分画血液試料またはＰＢＭＣ試料を使用して、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激することができることを実証した。

工程ｂ）：ＤＣの成熟化
本発明の方法によると、工程ａ）の最中に血液試料またはＰＢＭＣ試料のＤＣを濃縮した後、前記ＤＣを工程ｂ）の最中に成熟させることができる。

好ましい態様において、炎症誘発刺激および／またはウイルスもしくは細菌の攻撃を模倣する物質を、工程ａ）の培地に加える。

本発明の方法に適した炎症誘発刺激の例は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）組換えキメラタンパク質、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）であるがそれらに限定されない。このような物質を、単独でまたは他の炎症誘発刺激またはウイルス／細菌模倣物質との種々の組合せで使用することができる。本発明の方法に適したウイルスまたは細菌の攻撃を模倣する物質の例は、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ポリイノシン酸・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）、Pam3CysSerLys4 (Pam3CSK4)、イミキモドであるがそれらに限定されない。このような物質を、単独でまたは他の炎症誘発刺激またはウイルス／細菌模倣物質との種々の組合せで使用することができる。

１つの態様において、工程ｂ）を、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２、抗ＣＤ４０抗体、ＩＦＮ−α ２ａ、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７およびその混合物からなる群より選択される少なくとも１つの物質の存在下において行なう。

前記物質（群）は、免疫応答を刺激することが知られる物質であり、そして当業者は、非特異的Ｔ細胞活性化を制限しつつＤＣ成熟を得るために適切な各物質の濃度を選択することができるだろう。

また、当業者は、ＤＣ成熟を刺激することが知られる他の物質もまた本発明の方法に従って使用することができることを容易に解釈するだろう。

好ましい態様において、工程ｂ）を、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＰＧＥ２の存在下において行なう。

典型的には、１〜１０，０００Ｕ/ml、好ましくは１０〜５，０００Ｕ/ml、さらにより好ましくは約１，０００Ｕ/mlの量のＴＮＦ−αを使用する。ＴＮＦ−αを多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＴＮＦ−αであっても、または組換えＴＮＦ−αであってもよい。ＴＮＦ−αは、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

典型的には、０．１〜１，０００ng/ml、好ましくは１〜１００ng/ml、さらにより好ましくは約１０ng/mlの量のＩＬ−１βを使用する。ＩＬ−１βを多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＩＬ−１βであっても、または組換えＩＬ−１βであってもよい。ＩＬ−１βは、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

典型的には、０．０１〜１００μM、好ましくは０．１〜１０μM、さらにより好ましくは１μMの量のＰＧＥ２を使用する。ＰＧＥ２を多種多様な起源から得ることができる。ＰＧＥ２は、例えばCalbiochem/MerckまたはSigmaなどの種々の会社から合成品として市販されている。

別の態様において、工程ｂ）を、抗ＣＤ４０（例えばｍＡｂクローンＧ２８−５）およびＩＦＮ−αの存在下において行なう。

典型的には、０．１〜５０μg/ml、好ましくは１〜２５μg/ml、さらにより好ましくは約１０μg/mlの量の抗ＣＤ４０ｍＡｂを使用する。好ましい態様において、抗ＣＤ４０ｍＡｂはクローンＧ２８−５である。精製Ｇ２８−５もしくは他の抗ＣＤ４０ｍＡｂは、社内でハイブリドーマ培養上清から当業者に公知の手順に従って産生しても、またはBioLegendもしくはeBioscienceなどの種々の業者から購入してもよい。

代替的な態様において、抗ＣＤ４０ｍＡｂを、単量体形または多量体形のいずれかで合成された組換えＣＤ４０リガンド分子を用いて置換してもよい。組換えＣＤ４０リガンド分子は、社内で当業者に公知の組換えＤＮＡ法を使用して産生しても、またはR&D Systemsなどの種々の業者から購入してもよい。

典型的には、１〜１０，０００Ｕ/ml、好ましくは１０〜５，０００Ｕ/ml、さらにより好ましくは約１，０００Ｕ/mlの量のＩＦＮ−αを使用する。好ましい態様において、ＩＦＮ−αはＩＦＮ−α２ａである。ＩＦＮ−αを多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＩＦＮ−αであっても、または組換えＩＦＮ−αであってもよい。ＩＦＮ−αは、例えばRoche (Roferon-A)、R&D SystemsまたはPeproTechなどの種々の会社から市販されている。

別の態様において、工程ｂ）をＬＰＳの存在下において行なう。

典型的には、１〜１０，０００ng/ml、好ましくは１０〜１，０００ng/ml、さらにより好ましくは約１００ng/mlの量のＬＰＳを使用する。ＬＰＳを多種多様な起源から得ることができる。それは種々の細菌株から精製されてもよい。適切な株は、E. coli、K. pneumoniae、P. aeruginosa、S. enterica、S. typhosa、S. marcescensであるがそれらに限定されない。ＬＰＳは、例えばSigmaなどの種々の会社から市販されている。

別の態様において、工程ｂ）をポリＩ：Ｃの存在下において行なう。

典型的には、０．１〜１，０００μg/ml、好ましくは１〜１００μg/ml、さらにより好ましくは約２０μg/mlの量のポリＩ：Ｃを使用する。ポリＩ：Ｃを多種多様な起源から得ることができる。それを当業者に公知の方法を使用して合成してもよい。ポリＩ：Ｃは、例えばSigmaなどの種々の会社から市販されている。

好ましい態様において、低用量のＩＬ−７を工程ｂ）の物質に加える。

典型的には、０．０１〜１０ng/ml、好ましくは０．１〜１ng/ml、さらにより好ましくは約０．５ng/mlの量のＩＬ−７を使用する。ＩＬ−７を多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＩＬ−７であっても、または組換えＩＬ−７であってもよい。ＩＬ−７は、例えばR&D SystemsまたはPeproTechなどの種々の会社から市販されている。

本発明の方法の好ましい態様によると、工程ｂ）を、ＤＣを成熟させるのに十分な時間ｔ（ｂ）をかけて行なう。典型的には、この時間ｔ（ｂ）は、約１２〜約７２時間、好ましくは約１６〜約４８時間、さらにより好ましくは約２４時間である。

代替的な態様において、工程ｂ）を、０〜１２時間というより短い時間ｔ（ｂ）をかけて行なう。

抗原
理論によって練ることなく、本発明の方法にかけられた血液試料またはＰＢＭＣ試料は、種々の成熟段階のＤＣ（単球、未成熟ＤＣ、成熟ＤＣ）と、他の細胞の中でもとりわけＴ細胞との共培養液を含むと考えられる。

この異種細胞集団群の中で、ＤＣはＡｇを取り上げ、その表面上でそれをＴ細胞に提示し、これによってＴ細胞はＡｇ特異的様式で刺激されると考えられている。

好ましい態様において、前記Ａｇは、組換えＤＮＡ技術によって、または異なる組織もしくは細胞源からの精製によって得ることのできるタンパク質である。典型的には、前記タンパク質は、１０アミノ酸より長い、好ましくは１５アミノ酸より長い、さらにより好ましくは２０アミノ酸より長い長さを有し、理論的上限はない。このようなタンパク質は天然タンパク質に限定されないが、例えば選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、または異なるタンパク質の部分を融合することによって得られる改変タンパク質またはキメラ構築物も含む。

本発明の別の態様において、前記Ａｇは合成ペプチドである。典型的には、前記合成ペプチドは、３〜４０アミノ酸長、好ましくは５〜３０アミノ酸長、さらにより好ましくは８〜２０アミノ酸長である。合成ペプチドを、Ｆｍｏｃ生化学手順、大規模多重ピンペプチド合成、組換えＤＮＡ技術または他の適切な手順によって得ることができる。このようなペプチドは、天然ペプチドに限定されないが、例えば選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、または異なるタンパク質の部分を融合することによって得られる改変ペプチドまたはキメラペプチドも含む。

本発明の別の態様において、Ａｇは、当業者に公知である種々の生化学的手順（例えば固定、溶解、細胞下分画、密度勾配分離）によって得られる粗または部分精製された組織または細胞の調製物である。

当業者は、所望のＴ細胞刺激に依存して、適切なＡｇを選択することができる。

当業者はまた、どの工程で前記Ａｇを導入すべきかも知っているだろう。

典型的には、Ａｇがタンパク質または組織もしくは細胞の調製物である場合、それは一般的には工程ａ）の最中に加えられる。典型的には、Ａｇがペプチドである場合、それを工程ａ）よりもむしろ工程ｂ）で加えることができる。所与のペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に直接的に結合するか、またはＭＨＣクラスＩＩ分子上への提示の前に樹状細胞によって取り込まれて処理されるかどうかを予測するための明確なアミノ酸長のカットオフ値はないが、各場合についての中間長ペプチドの添加時刻を最適化することは当業者の能力の範囲内である。

刺激されたＴ細胞の検出
刺激されたＴ細胞の検出のための方法は、当業者には公知である。以下に記載した手順は、適切な方法のいくつかの例を提供する。しかしながら、当業者はＡｇに応答するＴ細胞の刺激を評価するのに適した任意の方法を使用することができることを容易に解釈することができる。

酵素免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）：
この手順を、以下の実施例１に詳述する。

プレ培養ウェルからの非接着性細胞を、所望の抗サイトカイン捕捉抗体（Ａｂｓ；例えば抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−４）でコーティングされたプレートに移す。ビオチニル化二次Ａｂｓおよび標準的な比色定量または蛍光定量検出法（例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ−ＢＣＩＰ）を用いて顕色し、そしてスポットを計測する。その後、ＥＬＩＳｐｏｔ解読値をスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６個のＰＢＭＣとして表現する。

上清サイトカインアッセイ：
培養上清中に放出されたサイトカインを、種々の技術、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＤサイトメトリックビーズアッセイ、Biorad Bio-Plexアッセイおよびその他の技術によって測定する。

ＨＬＡクラスＩＩテトラマー：
この手順を用いて、特異的なペプチドエピトープを認識するＡｇ反応性Ｔ細胞を、市販されている試薬（例えばProImmune MHCクラスＩＩ Ultimers）または社内で作成した試薬（例えば、Dr. G.T. Nepom, Benaroya Research Institute, Seattle, USAからの) [Novak et al., J.Clin.Invest. 104:R63, 1999]のいずれかを使用して検出する。

活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７）のアップレギュレーション：
この手順を用いて、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を、Ａｇ認識後に膜上に露出する活性化マーカーのその異なる発現によって検出する。

サイトカイン捕捉アッセイ：
Miltenyi Biotechによって開発されたこのシステムは、そのサイトカイン応答に従ってＡｇ特異的Ｔ細胞を可視化するためのＥＬＩＳｐｏｔに代わる有効なものである。さらに、それは、対象のＴ細胞の直接的な選別およびクローニングを可能とする（以下参照）。

ＣＤ１５４アッセイ：
この手順は、近年、詳細に記載されている[Chattopadhyay et al., Nat.Med. 11:1113, 2005; Frentsch et al., Nat.Med. 11: 1118, 2005]。それはＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に限定される。

ＣＤ１０７アッセイ：
この手順[Betts et al., J.Immunol.Methods 281:65, 2003]は、細胞障害能を有するＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の可視化を可能とする。

ＣＦＳＥ希釈アッセイ：
この手順は、Ａｇ認識後のその増殖によりＡｇ特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を検出する[Mannering et al., J.Immunol.Methods 283:173, 2003]。

方法の適用
本出願において記載したＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法は、迅速で、効率的で、特異的で、多用途な手順である。要約すると、伝統的な方法と比較しての利点は以下の通りである：
１．より高い感度；
２．未分画ＰＢＭＣまたはさらには未分画血液（新鮮または凍結のいずれか）を使用することができる。事前の精製工程の必要がなく、このことがこの技術をより簡単にし、そして血液容量の点における負担をより少なくさせている；
３．事前の長期の増殖が必要でない；
４．タンパク質Ａｇまたは組織もしくは細胞の調製物のＡｇを使用する場合には、特異的なエピトープの限定されたセットに対するレパートリーよりもむしろそうしたＡｇに対する全Ｔ細胞レパートリーを検出することができる；
５．ＨＬＡ拘束性の制限がない；
６．ペプチドＡｇとも適合性；
７．Ｔ細胞活性化の種々の解読値と適合性
８．同じ刺激技術を使用して、Ａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させ、続いて選別し、そしてさらなる特徴付けのためにＣＤ４＋Ｔ細胞株およびクローンを生成することができる。

従って、記載の方法は多くの適用を有する。

それ故、本発明はまた、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）Ｔ細胞応答を検出する工程
（１つ以上の疾病に関連したＡｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、前記被験体において疾病を診断するための方法に関する。

本発明はまた、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）Ｔ細胞応答を検出する工程
（１つ以上の疾病に関連したＡｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、疾病を患う前記被験体において免疫療法の効果をモニタリングするための方法に関する。

実際に、本発明者らは、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための本発明の方法が、疾病を診断するためと、いくつかの設定において免疫療法の免疫学的効果をモニタリングするための両方のために有用であり得ることを発見した。

好ましい態様において、前記疾病は自己免疫疾病からなる群より選択される。この群は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、セリアック病および多発性硬化症を含むがそれに限定されない。

本発明の別の態様において、前記疾病は、癌疾病からなる群より選択される。この群は、メラノーマ、大腸癌、腎臓癌、および血液学的悪性疾患、例えば白血病、リンパ種および多発性骨髄腫を含むがそれらに限定されない。

別の態様において、前記疾病は感染症からなる群より選択される。この群は、M. tuberculosis、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルスなどの感染病原体によって引き起こされる疾病を含むがそれらに限定されない。

別の態様において、前記疾病は、骨髄移植および類似の手順を複雑化させる移植片対宿主疾病である。

診断適用のために、本発明の方法を使用して、疾病、好ましくは自己免疫疾病に関連した１つ以上のＡｇ特異的Ｔ細胞応答を検出することができる。例えば、前記方法を使用して、１型糖尿病に関連したプレプロインスリン特異的またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）特異的なＴ細胞応答を検出することができる。

本明細書において使用する「免疫療法をモニタリングする」という表現は、in vivoにおいて免疫調節剤を投与した後に、所与の被験体において誘導されるＴ細胞応答の変化の測定を指す。

モニタリング適用については、疾病のタイプに応じて異なるタイプの状況が見られる。

自己免疫疾病において、免疫調節療法を使用して、病的な免疫応答を鈍らせることができる。この結果を達成するための１つの戦略は、多くの免疫調節剤に基づいた非Ａｇ特異的な介入に依拠する。例えば、薬剤、例えばシクロスポリンＡ(Stiller et al., Science 223:1362, 1984; Feutren et al., Lancet 19:119, 1986; Bougneres et al., Diabetes 39:1264, 1990)、ダクリズマブ、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、インターロイキン−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体(Herold et al., N.Engl.J.Med. 346:1692, 2002; Keymeulen et al., N.Engl.J.Med. 352:2598, 2005)、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、例えばリツキシマブ(Pescovitz et al., N.Engl.J.Med. 361:2143, 2009)、自己骨髄非破壊的な造血幹細胞移植(Voltarelli et al., JAMA 297:1568, 2007)、自己臍帯血細胞注入(Haller et al., Diabetes Care 32:2041, 2009)、ビタミンＤ、制御性Ｔ細胞適応療法が、Ｔ１Ｄの予防および／または介入のために試験されているか、または試験される可能性がある。第２のアプローチは、Ａｇ特異的戦略、すなわち、免疫寛容誘発形態の疾病に関連したＡｇの投与に依拠する。例えば、薬剤、例えば（プロ）インスリン(DPT-1, N.Engl.J.Med. 346:1685, 2002; Skyler et al., Diabetes Care 28:1068, 2005; Nanto-Salonen et al., Lancet 372:1746, 2008)、ＧＡＤ(Ludvigsson et al., N.Engl.J.Med. 359:1909, 2008)、ＮＢＩ−６０２４(Alleva et al., Scand.J.Immunol. 63:59, 2006)、ＤｉａＰｅｐ２７７(Raz et al., DiabetesMetab.Res.Rev. 23:292, 2007)、およびその組合せ、β細胞Ａｇと組み合わせた抗ＣＤ３(Bresson et al., J.Clin.Invest. 116:1371, 2006)、in vitroまたはin vivoにおけるＤＣへのＡｇのローディング(Mukhopadhaya et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:6374, 2008)、エピトープ−ＨＬＡマルチマー(Casares et al., Nat.Immunol. 3:383, 2002; Masteller et al., J.Immunol. 171:5587, 2003; Mallone et al., Blood 106:2798, 2005)が、Ｔ１Ｄの予防および／または介入のために試験されているか、または試験される可能性がある。

癌および感染症における病気発生は、病的な免疫応答によって引き起こされるのではなく、むしろ、免疫系による制御を回避する組織細胞または感染病原体によって引き起こされる。それ故、癌または感染細胞／感染病原体に対する免疫応答は、疾病に拮抗しようとする生理学的適応である。これらの生理学的機序を、非Ａｇ特異的戦略（例えば、メラノーマにおける単独でまたは種々の薬剤と組み合わせた、細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４の遮断；Yuan et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:20410, 2008; Maker et al., Ann.Surg.Oncol. 12:1005, 2005)、またはＡｇ特異的アプローチ、すなわち免疫原性形態の疾病関連Ａｇ（群）の投与（いわゆるワクチン接種）のいずれかを使用して治療的にブーストすることができる。これらの後者のアプローチは、Ａｇを単独でまたは種々のアジュバント剤と組み合わせて投与することによって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連Ａｇの投与；Di Pucchio et al, Cancer Res. 66:4943, 2006; Peterson et al., J.Clin.Oncol. 21:2342, 2003)；ＡｇでパルスされたＤＣを投与することによって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連ＡｇでパルスされたＤＣの注入；Palucka et al., J.Immunother. 26:432, 2003; Banchereau et al., Cancer Res. 61:6451, 2001; Thurner et al., J.Exp.Med. 190:1669, 1999)または疾病関連Ａｇ特異的Ｔ細胞の養子移植によって（例えば、メラノーマにおける腫瘍関連Ａｇ特異的Ｔ細胞の注入；Vignard et al., J. Immunol. 175:4797, 2005)遂行され得る。

それ故、このような介入によって誘導される免疫変化を追跡することは治療的に関心がある。成功裏の介入は、疾病関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答の減少（自己免疫疾病の場合）または減少（癌および感染症の場合）を実現すべきである。疾病関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答におけるこのような変化は、定量的（例えばＡｇ特異的Ｔ細胞の頻度の変化）または定性的（例えばこのようなＴ細胞の表現型および／または機能の変化）であり得る。臨床的に効力のあるこれらの免疫代用マーカーを入手できることは、多種多様な適用のために非常に有用であり得る。例えば、患者の免疫応答に基づいた処置する患者および使用する治療剤のより良好な選択（例えば、ＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答を提示する患者におけるＧＡＤ投与）；治療用量または投与レジメンの最適化および／またはテーラーメイド（例えば、免疫変化が記録されない場合の投与用量／投与頻度の増加）、従ってリスク・ベネフィットの比の向上；処置に応答するその確率による処置患者の予後層別化；誘導される免疫変化の維持に基づいてまたは基づかずに再度患者を処置するかどうかの決定。

それ故、本発明のＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法は、これらの免疫変化の誘導をモニタリングするのに非常に有用であり得る。

Ｔ細胞応答を検出する工程ｃ）を、例えば、分泌される所与のサイトカインの量を測定することによって前記のように実施することができる。

好ましい態様において、Ｔ細胞応答を検出する工程ｃ）は、ＥＬＩＳｐｏｔによって実施される。

本明細書において使用する「疾病関連抗原（Ａｇｓ）」という表現は、免疫応答の分子ターゲットを構成するタンパク質またはペプチドを指す。前記分子ターゲットは、免疫応答によってターゲティングされる組織（群）または細胞（群）によって発現される。疾病関連Ａｇの発現は、ターゲット組織に限定され得るか、またはさらに他の身体区画まで広がり得る。疾病関連Ａｇは最初に、自己抗体またはＴ細胞免疫応答のターゲットであるとして、またはターゲット組織によるその選択的な発現に基づいて同定され得る。疾病関連タンパク質抗原のいくつかの例は、Ｔ１Ｄについては、プレプロインスリン（ＰＰＩ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）および亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）；ウェゲナー肉芽腫症についてはミエロペルオキシダーゼよびプロテイナーゼ３；多発性硬化症におけるミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；セリアック病におけるグリアジン；メラノーマ癌におけるチロシナーゼ、メラン−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびＮＹ−ＥＳＯ１；M. tuberculosis感染についてはＥＳＡＴ−６およびＨＩＶ感染についてはｇａｇである。

疾病関連ペプチドＡｇの例は、Ａｇ提示細胞（ＤＣを含む）による処理および異なるＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子の状況での提示の後に、前記の該タンパク質Ａｇから得られる。それ故、前記ペプチドＡｇは、その起源のＡｇだけに依存するのではなく、それらが提示されるＨＬＡ分子にも依存して異なる。例えば、マウスおよびヒトの両方についてのＴ１Ｄ関連ペプチドＡｇのリストを、DiLorenzo et al., Clin.Exp.Immunol. 148:1, 2007に見出し得る。

「疾病関連抗原」という表現はまた、免疫応答のターゲットを構成する組織または細胞を指す。疾病関連組織／細胞を、前記疾病の病態生理学および臨床症状に基づいて疾病のターゲットとして同定することができる。疾病関連組織／細胞のいくつかの例は、Ｔ１Ｄについてはインスリン産生膵β細胞；多発性硬化症における乏突起神経膠細胞；セリアック病における腸上皮；メラノーマ癌における悪性メラノサイト；結核感染についてのM. tuberculosis；およびＨＩＶ感染についてのＨＩＶである。

疾病関連Ａｇに対して開始される免疫応答は、病的な免疫応答（すなわち自己免疫疾病の場合）、または別の進行中の生理学的過程の結果を制限することを目的とした、生理学的で有益な可能性のある免疫応答（すなわち癌または感染症の場合）であり得る。前記疾病の根底にある病的または生理学的免疫応答のおかげで、このような応答の検出を使用して、これらの疾病を診断することができるか、またはその天然のまたは治療により改変された展開を追跡することができる。それ故、疾病関連Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を測定することによって、本明細書において記載した方法を、前記疾病の免疫診断およびモニタリング（例えば免疫の段階、治療経過観察）の両方に適用することができる。

当業者は、適切な疾病関連Ａｇを選択する方法を知っているだろう。このような選択は、多種多様な戦略に基づく。Ｔ１Ｄ関連Ａｇについてのこのような戦略の例を、Wenzlau et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007; Peakman et al., J.Clin.Invest. 1999; Nepom et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001; Arif et al., J.Clin.Invest. 2004; Toma et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2005; Blancou et al., J.Immunol. 2007; Skowera et al., J.Clin.Invest. 2009に見出し得る。Ｔ１Ｄ関連ペプチドエピトープについてのこのような戦略のレビューを、Di Lorenzo et al., Clin.Exp.Immunol. 148:1, 2007およびMartinuzzi et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 1150:61, 2008に見出し得る。

本発明の方法の別の適用は、治療タンパク質の免疫原性（または免疫寛容原性）のin vitroにおける研究のためのその使用に関する。

本明細書において使用する「治療タンパク質」という用語は、治療効果を達成するためにヒト被験者にin vivoにおいて投与されるかまたは投与されることが計画される、任意のアミノ酸長のタンパク質またはペプチド化合物を指す。このような治療タンパク質の例は、疾病関連Ａｇ（前記に定義した通り）、異なる種の抗体（その天然形または部分的／完全にヒト化された形態のいずれか）、サイトカイン、ホルモンまたはホルモン類似体、凝固因子、酵素、細菌またはウイルスタンパク質であるがそれらに限定されない。このようなタンパク質は、天然タンパク質に限定されないが、例えば選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、または異なるタンパク質の部分を融合させることによって得られた、改変タンパク質またはキメラ構築物も含む。理論によって固めたくはないが、治療タンパク質の免疫原性の評価が関連する２つの異なる治療設定が存在する。

１つの最初の治療設定は、免疫寛容原性効果（例えば自己免疫疾病の場合）または免疫原性効果（例えば癌または感染症の場合）を誘導する目的での、in vivo投与のための疾病関連Ａｇ（前記に定義した通り）の使用に関する。前記の所望の治療効果を達成する能力をin vitroにおいてまず評価することが重要である。

別の治療設定において、目的は、投与されたタンパク質に対して任意の種類の免疫原性応答を誘導することではなく、前記タンパク質が治療効果（このために前記タンパク質は設計されている）を達成することを可能とするためにこのような応答を回避することである。このような設定の例は、サイトカインに基づいた免疫療法、ホルモン補充療法、および凝固因子の欠損（例えば血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ因子）または酵素欠損（例えばムコ多糖症ＶＩＩにおけるβ−グルクロニダーゼ）のための補充療法を含むがそれらに限定されない。全てのこれらの状況において、投与されたタンパク質に対する免疫原性応答の開始は望ましくない。なぜなら、これは所望の治療効果を達成するためには逆効果であるからである（例えば、サイトカイン放出症候群などの副作用；または治療タンパク質の中和／分解）。

それ故、本発明はまた、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）Ｔ細胞応答を検出する工程
（治療タンパク質を、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、前記治療タンパク質の免疫原性を評価するための方法に関する。

本発明の方法の別の適用は、Ａｇまたはエピトープの発見（「マッピング」としても知られる）のための、すなわち、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答を誘起するものを選択するためにＡｇおよびエピトープをスクリーニングするための、その使用である。

本明細書において使用する「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞によって認識されるタンパク質Ａｇの部分を指す。エピトープは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合することのできる種々のアミノ酸長のペプチドである。このようにして形成されたペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞上に発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識されることができ、従って、Ｔ細胞の活性化およびエピトープＡｇ特異的Ｔ細胞応答が開始される。

ＡｇおよびエピトープはＴ細胞の規定された分子ターゲットであるので、in vitroにおける適用（例えば診断、予後または治療目的のためのＡｇ特異的Ｔ細胞応答の検出）またはin vivoにおける投与（例えば自己免疫疾病におけるＡｇまたはエピトープに基づいた免疫寛容原性療法；あるいは癌および感染症におけるＡｇまたはエピトープに基づいたワクチン接種）のために使用するための適切なタンパク質またはペプチドを設計するためにこのようなターゲットを正確に同定することはしばしば適切である。さらに、所与のＭＨＣ分子（例えばＨＬＡ−Ａ２、A*0201；またはＨＬＡ−ＤＲ４、DR*0401）に結合するエピトープおよび／またはＴＣＲシグナル伝達およびＴ細胞活性化のトリガーを支配する一般的な法則の定義が、所与のエピトープの挙動を予測することのできるコンピューター化アルゴリズムを開発する目的でしばしば求められる。このようなアルゴリズムの開発は、頻繁に、多くの実験データセットが入手できることを必要とする。

それ故、本発明は、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）Ｔ細胞応答を検出する工程
（候補Ａｇまたはエピトープを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、候補Ａｇおよびエピトープをスクリーニングするための方法に関する。

前記候補Ａｇはまた、免疫応答によってターゲティングされる組織（群）もしくは細胞（群）、または、当業者に公知の生化学的または分子生物学技術によって候補Ａｇまたはエピトープでコーティング、ローディングまたはそれを発現させるようにした任意のタイプの細胞であり得る。

本発明の方法のさらに別の適用は、Ｔ細胞クローンを産生するためのその使用に関する。

従って、本発明は、以下の工程：
ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）特異的な免疫学的特性を提示する少なくとも１つのＴ細胞を単離する工程
（Ａｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、前記被験体から前記の特異的な免疫学的特性を提示するＴ細胞クローンを産生するための方法に関する。

前記の特異的な免疫学的特性は、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加えられたＡｇの、単離Ｔ細胞による認識を含むがそれらに限定されない。例えば、前記の特異的な免疫学的特性はまた、ＩＦＮ−γの産生、または認識されたＡｇを提示する細胞に対して細胞障害作用を発揮する能力も含み得る。ＩＦＮ−γを産生または細胞障害作用を提示するＴ細胞クローンは、例えば癌および感染症の処置に有用であり得る。

例えば、別の可能な特異的な免疫学的特性は、ＩＬ−１０の産生であり得る。ＩＬ−１０を産生するＴ細胞クローンは、自己免疫疾病の処置のための制御性Ｔ細胞として使用することができる。

当業者は、血液試料またはＰＢＭＣ試料から一旦単離された前記のＡｇ特異的Ｔ細胞を増殖させる方法をよく知っている。Ｔ細胞クローニング法としても知られるこのような方法の例を、Reijonen et al., Diabetes 51:1375, 2002; Mallone et al., Blood 106:2798, 2005; Mannering et al., J.Immunol.Methods 298:83, 2005; Yee et al., J.Immunol. 162:2227, 1999; Mandruzzato et al., J.Immunol. 169:4017, 2002; Oelke et al., Nat.Med. 9:619, 2003; Skowera et al., J.Clin.Invest. 118:3390, 2009に見出し得る。

当業者は、異なる免疫学的特性に基づいて生存状態の前記Ａｇ特異的Ｔ細胞を単離するのに適した方法もよく知っている。例えば、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１０産生Ｔ細胞の選択を、Miltenyiサイトカイン捕捉アッセイによって行なうことができる。別の例としては、細胞障害性Ｔ細胞の選択を、ＣＤ１０７のアップレギュレーションに基づいて行なうことができる[Betts et al., J.Immunol.Methods 281:65, 2003]。

本発明の方法のさらに別の適用は、Ａｇ特異的制御性Ｔ細胞を生成するためのその使用に関する。

本明細書において使用する「制御性Ｔ細胞」という用語は、免疫系の活性化を制御および抑制するように作用し、これにより、免疫系の恒常性および自己Ａｇに対する寛容性を維持する、Ｔ細胞の特殊な亜集団群を指す。規定された疾病関連Ａｇを認識する前記制御性Ｔ細胞を、自己免疫および移植片対宿主疾病などの病的状況において免疫寛容性を回復するために治療的に使用することができる。多数のポリクローナル（すなわち多数の規定されていないＡｇを認識する）制御性Ｔ細胞を生成するための効率的な方法が記載されている[Putnam et al., Diabetes 58:652, 2009]。それにも関わらず、所与のＡｇに特異的な多数の制御性Ｔ細胞の生成は、依然として達成されていない。本明細書において記載する方法は、この目的に有用であることが証明され得る。

従って、本発明は、以下の工程：
ａ）免疫寛容誘発特性を有するＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料またはＰＢＭＣ試料を培養する工程；
ｂ）場合により、前記ＤＣを成熟させる工程；
ｃ）特異的な免疫学的特性を提示する少なくとも１つのＴ細胞を単離する工程
（Ａｇを、工程ａ）および／またはｂ）の最中に加える）
を含む、前記被験体から前記の特異的な免疫学的特性を提示するＡｇ特異的制御性Ｔ細胞を生成するための方法に関する。

前記の特異的な免疫学的特性は、工程ａ）および／またはｂ）の最中に添加されるＡｇの、単離Ｔ細胞による認識を含むがそれらに限定されない。例えば、前記の特異的な免疫学的特性はまた、前記の制御性Ｔ細胞と物理的に接触してまたは空間的に近くに置かれたＴ細胞の増殖、サイトカイン分泌、細胞障害作用および他のエフェクター機能を抑制する能力；単独で、またはＩＦＮ−γなどの非制御性サイトカインと組み合わせて、ＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βファミリー、ＩＬ−３５などの制御性サイトカインを産生する能力；ＩＬ−２の存在下においてのみ増殖する能力；制御性Ｔ細胞集団群に典型的なマーカーを発現する能力を含み得る。このようなマーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子レセプター（ＧＩＴＲ）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）、ＨＬＡ−ＤＲ、細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ４５ＲＡ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）を含むがそれらに限定されない。

当業者は、血液試料またはＰＢＭＣ試料から一旦単離された前記の制御性Ｔ細胞を増殖させる方法をよく知っている。このような方法の例を、Putnam et al., Diabetes 58:652, 2009 and in Miyara et al., Immunity 30:899, 2009に見出し得る。

当業者はまた、異なる免疫学的特性に基づいて生存状態の前記の制御性Ｔ細胞を単離するのに適した方法もよく知っている。例えば、ＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞の選択は、Miltenyiサイトカイン捕捉アッセイによって行なうことができる。別の例としては、ＣＤ２５が高くＣＤ１２７が陰性である制御性Ｔ細胞の選択は、細胞表面染色に基づいて行なうことができる[Liu et al., J. Exp. Med. 203:1701, 2006, Seddiki et al., J. Exp. Med. 203:1693, 2006, Putnam et al., Diabetes 58:652, 2009 and in Miyara et al., Immunity 30:899, 2009]。

本明細書において使用する「免疫寛容誘発特性を有するＤＣ」という用語は、制御性Ｔ細胞を生じることのできるＤＣを指す。調節特性を有するサイトカインを以前に記載された培養プロトコールに加えることによって、前記の免疫寛容誘発特性を有するＤＣを得ることができる。

好ましい態様において、前記の調節サイトカインはＩＬ−１０である。典型的には、ＩＬ−１０は、１〜１，０００ng/ml、好ましくは１０〜１００ng/mlの量で使用される。ＩＬ−１０を多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＩＬ−１０であっても、または組換えＩＬ−１０であってもよい。ＩＬ−１０は、例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

別の好ましい態様において、前記の制御性サイトカインは、ＴＧＦ−β１などのＴＧＦ−βファミリーのメンバーである。典型的には、ＴＧＦ−β１は、１〜１，０００ng/ml、好ましくは１〜１００ng/ml、さらにより好ましくは１〜１０ng/mlの量で使用される。ＴＧＦ−β１を多種多様な起源から得ることができる。それは精製ＴＧＦ−β１であっても、または組換えＴＧＦ−β１であってもよい。ＴＧＦ−β１は例えばR&D SystemsまたはPeproTechのような種々の会社から市販されている。

さらに他の態様において、前記の制御性サイトカインは、制御活性を発揮することが知られる他のサイトカイン、あるいはＩＬ−１０、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーおよび／または他の制御性サイトカインの任意の組合せである。制御活性を有する他のサイトカインの例は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＬ−３５を含むがそれらに限定されない。

好ましい態様において、工程ａ）を、ｔ（ａ）ｍｉｎからｔ（ａ）ｍａｘまでの時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

典型的には、工程ａ）の最小インキュベーションｔ（ａ）ｍｉｎは、約１２時間、好ましくは約１６時間、さらにより好ましくは約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、さらにより好ましくは約２４時間であり得る。

典型的には、工程ａ）の最大インキュベーションｔ（ａ）ｍａｘは、約１０日間、好ましくは約７日間、さらにより好ましくは約６日間、約５日間、約４日間、約３日間、約２日間、さらにより好ましくは約１日間であり得る。

上に開示した最小および最大インキュベーション時間ｔ（ａ）ｍｉｎおよびｔ（ａ）ｍａｘを組み合わせることができる。

好ましい態様において、工程ａ）を、約１６時間〜約７日間、好ましくは約２０時間〜約４日間の時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

好ましい態様において、工程ａ）を、約２４時間の時間ｔ（ａ）をかけて行なう。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは特許請求の範囲によって定義される保護の範囲を制限するものではない。

未分画ヒトＰＢＭＣは、Ｔ細胞を刺激するａｃＤＣを生じる。（ａ）ａｃＤＣを示したような異なる刺激を用いて成熟させることによって得られた、ＴＴＸまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ応答の比較（詳細については方法および補足図１を参照されたい）。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＩＦＮ−γのシグナルを印す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０３および^＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ〜ｄ）ＴＴＸ、ＫＬＨまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γ（ｂ）、ＩＬ−１０（ｃ）およびＩＬ−４（ｄ）応答のＥＬＩＳｐｏｔによる検出について前記で選択したａｃＤＣ成熟プロトコールの比較。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＴＴＸ特異的サイトカインシグナルを示す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０４。全てのパネルにおいて、少なくとも３回の実験の１つの代表を示す。 未分画ヒトＰＢＭＣは、Ｔ細胞を刺激するａｃＤＣを生じる。（ａ）ａｃＤＣを示したような異なる刺激を用いて成熟させることによって得られた、ＴＴＸまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ応答の比較（詳細については方法および補足図１を参照されたい）。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＩＦＮ−γのシグナルを印す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０３および^＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ〜ｄ）ＴＴＸ、ＫＬＨまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γ（ｂ）、ＩＬ−１０（ｃ）およびＩＬ−４（ｄ）応答のＥＬＩＳｐｏｔによる検出について前記で選択したａｃＤＣ成熟プロトコールの比較。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＴＴＸ特異的サイトカインシグナルを示す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０４。全てのパネルにおいて、少なくとも３回の実験の１つの代表を示す。 未分画ヒトＰＢＭＣは、Ｔ細胞を刺激するａｃＤＣを生じる。（ａ）ａｃＤＣを示したような異なる刺激を用いて成熟させることによって得られた、ＴＴＸまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ応答の比較（詳細については方法および補足図１を参照されたい）。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＩＦＮ−γのシグナルを印す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０３および^＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ〜ｄ）ＴＴＸ、ＫＬＨまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γ（ｂ）、ＩＬ−１０（ｃ）およびＩＬ−４（ｄ）応答のＥＬＩＳｐｏｔによる検出について前記で選択したａｃＤＣ成熟プロトコールの比較。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＴＴＸ特異的サイトカインシグナルを示す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０４。全てのパネルにおいて、少なくとも３回の実験の１つの代表を示す。 未分画ヒトＰＢＭＣは、Ｔ細胞を刺激するａｃＤＣを生じる。（ａ）ａｃＤＣを示したような異なる刺激を用いて成熟させることによって得られた、ＴＴＸまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ応答の比較（詳細については方法および補足図１を参照されたい）。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＩＦＮ−γのシグナルを印す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０３および^＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ〜ｄ）ＴＴＸ、ＫＬＨまたは対照Ａｇに対するＩＦＮ−γ（ｂ）、ＩＬ−１０（ｃ）およびＩＬ−４（ｄ）応答のＥＬＩＳｐｏｔによる検出について前記で選択したａｃＤＣ成熟プロトコールの比較。点線は、サイトカインの非存在下において得られたＴＴＸ特異的サイトカインシグナルを示す。有意なバックグラウンド増加の非存在下における「サイトカインなし」条件との比較について^＊ｐ＜０．０４。全てのパネルにおいて、少なくとも３回の実験の１つの代表を示す。 ａｃＤＣとｍｏＤＣとの比較、およびａｃＤＣにより増幅されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの再現性。（ａ）ａｃＤＣ（上）とｍｏＤＣ（下）との間の表現型比較。未分画ＰＢＭＣを４８時間かけて、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単独（青いプロファイル）でまたはＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β（最後の２４時間の間に加える；赤いプロファイル）と組み合わせて培養することによってａｃＤＣを得た。精製した単球を７日間かけて同じサイトカイン混液（ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを最後の２４時間の間に加える）と共に培養することによってｍｏＤＣを生成した。アイソタイプ対照染色（影の付いたプロファイル）とサイトカインの非存在下における培養液（点線のプロファイル）との比較を示す。成熟ａｃＤＣおよびｍｏＤＣを抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αを用いて成熟させることによって類似の結果が得られた（示さず）。（ｂ）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βで成熟させるかまたは未成熟のままであるａｃＤＣおよびｍｏＤＣの、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける刺激能。ａｃＤＣについては、全ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、４８時間、M. tubercolosisＰＰＤの存在下または非存在下において以前のように培養した。自己単球をＰＢＭＣ接着によって単離し（１×１０^６個／ウェル）、そして前記のように７日間刺激して、ｍｏＤＣを得た。その後、新鮮な自己ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、ＰＰＤを含むまたは含まないｍｏＤＣに４８時間かけて加えた。続いて非接着性細胞を回収し、そしてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにかけた。（ｃ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析アッセイ間の変動性。同じ採血に由来する凍結した３つのＰＢＭＣアリコートを解凍し、そして記載のように試験した。変動係数（ＣＶ）＝９．６％。基礎（「Ａｇなし」）およびＴＴＸ誘導ＩＦＮ−γスポット数を、正味の（基礎を差し引いた）ＴＴＸ応答と共に、ここにおよびその後のパネルｄ、ｅ（抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αで成熟させたａｃＤＣ培養液）に示す。（ｄ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析前および分析アッセイ間変動性。ＰＢＭＣを、４つの異なる時機に同じ個体から得て、そして記載の通りに試験した。ＣＶ＝５．４％。（ｅ）新鮮な試料と凍結保存試料との間の変動性。１回の採血に由来するＰＢＭＣを、新鮮なまままたは凍結させてのいずれかで試験し、そしてその後、解凍時に試験した。ＣＶ＝６．９％。全てのパネルは、３回実施した実験の代表である。 ａｃＤＣとｍｏＤＣとの比較、およびａｃＤＣにより増幅されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの再現性。（ａ）ａｃＤＣ（上）とｍｏＤＣ（下）との間の表現型比較。未分画ＰＢＭＣを４８時間かけて、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単独（青いプロファイル）でまたはＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β（最後の２４時間の間に加える；赤いプロファイル）と組み合わせて培養することによってａｃＤＣを得た。精製した単球を７日間かけて同じサイトカイン混液（ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを最後の２４時間の間に加える）と共に培養することによってｍｏＤＣを生成した。アイソタイプ対照染色（影の付いたプロファイル）とサイトカインの非存在下における培養液（点線のプロファイル）との比較を示す。成熟ａｃＤＣおよびｍｏＤＣを抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αを用いて成熟させることによって類似の結果が得られた（示さず）。（ｂ）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βで成熟させるかまたは未成熟のままであるａｃＤＣおよびｍｏＤＣの、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける刺激能。ａｃＤＣについては、全ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、４８時間、M. tubercolosisＰＰＤの存在下または非存在下において以前のように培養した。自己単球をＰＢＭＣ接着によって単離し（１×１０^６個／ウェル）、そして前記のように７日間刺激して、ｍｏＤＣを得た。その後、新鮮な自己ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、ＰＰＤを含むまたは含まないｍｏＤＣに４８時間かけて加えた。続いて非接着性細胞を回収し、そしてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにかけた。（ｃ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析アッセイ間の変動性。同じ採血に由来する凍結した３つのＰＢＭＣアリコートを解凍し、そして記載のように試験した。変動係数（ＣＶ）＝９．６％。基礎（「Ａｇなし」）およびＴＴＸ誘導ＩＦＮ−γスポット数を、正味の（基礎を差し引いた）ＴＴＸ応答と共に、ここにおよびその後のパネルｄ、ｅ（抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αで成熟させたａｃＤＣ培養液）に示す。（ｄ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析前および分析アッセイ間変動性。ＰＢＭＣを、４つの異なる時機に同じ個体から得て、そして記載の通りに試験した。ＣＶ＝５．４％。（ｅ）新鮮な試料と凍結保存試料との間の変動性。１回の採血に由来するＰＢＭＣを、新鮮なまままたは凍結させてのいずれかで試験し、そしてその後、解凍時に試験した。ＣＶ＝６．９％。全てのパネルは、３回実施した実験の代表である。 ａｃＤＣとｍｏＤＣとの比較、およびａｃＤＣにより増幅されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの再現性。（ａ）ａｃＤＣ（上）とｍｏＤＣ（下）との間の表現型比較。未分画ＰＢＭＣを４８時間かけて、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単独（青いプロファイル）でまたはＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β（最後の２４時間の間に加える；赤いプロファイル）と組み合わせて培養することによってａｃＤＣを得た。精製した単球を７日間かけて同じサイトカイン混液（ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを最後の２４時間の間に加える）と共に培養することによってｍｏＤＣを生成した。アイソタイプ対照染色（影の付いたプロファイル）とサイトカインの非存在下における培養液（点線のプロファイル）との比較を示す。成熟ａｃＤＣおよびｍｏＤＣを抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αを用いて成熟させることによって類似の結果が得られた（示さず）。（ｂ）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βで成熟させるかまたは未成熟のままであるａｃＤＣおよびｍｏＤＣの、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける刺激能。ａｃＤＣについては、全ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、４８時間、M. tubercolosisＰＰＤの存在下または非存在下において以前のように培養した。自己単球をＰＢＭＣ接着によって単離し（１×１０^６個／ウェル）、そして前記のように７日間刺激して、ｍｏＤＣを得た。その後、新鮮な自己ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、ＰＰＤを含むまたは含まないｍｏＤＣに４８時間かけて加えた。続いて非接着性細胞を回収し、そしてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにかけた。（ｃ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析アッセイ間の変動性。同じ採血に由来する凍結した３つのＰＢＭＣアリコートを解凍し、そして記載のように試験した。変動係数（ＣＶ）＝９．６％。基礎（「Ａｇなし」）およびＴＴＸ誘導ＩＦＮ−γスポット数を、正味の（基礎を差し引いた）ＴＴＸ応答と共に、ここにおよびその後のパネルｄ、ｅ（抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αで成熟させたａｃＤＣ培養液）に示す。（ｄ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析前および分析アッセイ間変動性。ＰＢＭＣを、４つの異なる時機に同じ個体から得て、そして記載の通りに試験した。ＣＶ＝５．４％。（ｅ）新鮮な試料と凍結保存試料との間の変動性。１回の採血に由来するＰＢＭＣを、新鮮なまままたは凍結させてのいずれかで試験し、そしてその後、解凍時に試験した。ＣＶ＝６．９％。全てのパネルは、３回実施した実験の代表である。 ａｃＤＣとｍｏＤＣとの比較、およびａｃＤＣにより増幅されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの再現性。（ａ）ａｃＤＣ（上）とｍｏＤＣ（下）との間の表現型比較。未分画ＰＢＭＣを４８時間かけて、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４単独（青いプロファイル）でまたはＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１β（最後の２４時間の間に加える；赤いプロファイル）と組み合わせて培養することによってａｃＤＣを得た。精製した単球を７日間かけて同じサイトカイン混液（ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを最後の２４時間の間に加える）と共に培養することによってｍｏＤＣを生成した。アイソタイプ対照染色（影の付いたプロファイル）とサイトカインの非存在下における培養液（点線のプロファイル）との比較を示す。成熟ａｃＤＣおよびｍｏＤＣを抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αを用いて成熟させることによって類似の結果が得られた（示さず）。（ｂ）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βで成熟させるかまたは未成熟のままであるａｃＤＣおよびｍｏＤＣの、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける刺激能。ａｃＤＣについては、全ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、４８時間、M. tubercolosisＰＰＤの存在下または非存在下において以前のように培養した。自己単球をＰＢＭＣ接着によって単離し（１×１０^６個／ウェル）、そして前記のように７日間刺激して、ｍｏＤＣを得た。その後、新鮮な自己ＰＢＭＣ（１×１０^６個／ウェル）を、ＰＰＤを含むまたは含まないｍｏＤＣに４８時間かけて加えた。続いて非接着性細胞を回収し、そしてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにかけた。（ｃ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析アッセイ間の変動性。同じ採血に由来する凍結した３つのＰＢＭＣアリコートを解凍し、そして記載のように試験した。変動係数（ＣＶ）＝９．６％。基礎（「Ａｇなし」）およびＴＴＸ誘導ＩＦＮ−γスポット数を、正味の（基礎を差し引いた）ＴＴＸ応答と共に、ここにおよびその後のパネルｄ、ｅ（抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αで成熟させたａｃＤＣ培養液）に示す。（ｄ）ａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの分析前および分析アッセイ間変動性。ＰＢＭＣを、４つの異なる時機に同じ個体から得て、そして記載の通りに試験した。ＣＶ＝５．４％。（ｅ）新鮮な試料と凍結保存試料との間の変動性。１回の採血に由来するＰＢＭＣを、新鮮なまままたは凍結させてのいずれかで試験し、そしてその後、解凍時に試験した。ＣＶ＝６．９％。全てのパネルは、３回実施した実験の代表である。 ａｃＤＣにより増殖されたＡｇ特異的Ｔ細胞を単離およびクローニングすることができる。（ａ）ａｃＤＣ ＥＬＩＳｐｏｔおよびＴ細胞クローン生成手順の図解。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をタンパク質Ａｇと共にＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣに０日後に加えて、続いて１日後にＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βを加えることによってａｃＤＣを誘導した。２日後に、非接着性細胞をＥＬＩＳｐｏｔウェルに６時間かけて移し、そして続いて回収し、そして培養液に戻した。Ａｇ特異的応答を、ＥＬＩＳｐｏｔによって定量した。８〜１０日後に、増殖（ＣＦＳＥ^低度）細胞の対応する画分を１つの細胞毎に選別し、３回の刺激サイクルを通して増殖させ、そして２８日後にＡｇ特異性について試験した。（ｂ）ＴＴＸまたは対照刺激の後の代表的なａｃＤＣ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ。（ｃ）ＥＬＩＳｐｏｔウェルから回収したＰＢＭＣのＣＦＳＥの増殖。標準 ｖｓ ａｃＤＣにより引き起こされる増殖の比較を示す。（ｄ）ＴＴＸ特異的ＣＦＳＥ^低度画分を選別しそしてクローニングした。細胞内ＩＦＮ−γ染色によるＴＴＸおよび対照でパルスされたＤＣ上におけるこれらのクローンの１つの想起アッセイを示す。 タンパク質／ペプチドＡｇおよび異なる刺激期間は、異なるＴ細胞応答をトリガーする。（ａ）ａｃＤＣおよびｍｏＤＣにより引き起こされるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを図１ｂのように、６価ワクチン（Ｈｅｘａ）で刺激した磁力的にＣＤ４を枯渇させたまたは枯渇させていないＰＢＭＣに対して実施した。（ｂ）ａｃＤＣ混液の存在下または非存在下において培養したＰＢＭＣに対して行なったＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ。ＨＬＡ−Ａ２^＋（Ａ^＊０２０１）−ＤＲ４^＋（ＤＲ^＊０４０１）被験体からのＰＢＭＣを、示したように、ＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｆｌｕ ＭＰ_{５８〜６６}ペプチド、ＤＲ４拘束性Ｆｌｕ ＨＡ_{３０６〜３１８}ペプチドまたはＴＴＸで刺激した。ペプチドを培養の開始から２４時間後に加えたが、ＴＴＸは最初から導入した。（ｃ）ＣＤ４５ＲＡ^＋またはＣＤ４５ＲＯ^＋細胞を磁力的に枯渇させたまたは枯渇させないままにしたＰＢＭＣに対して実施したａｃＤＣ刺激におけるＴＴＸ特異低ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答。結果を、枯渇されていないＰＢＭＣに正規化した相対的ＩＦＮ−γ応答として表現する。（ｄ）ＣＦＳＥで標識されたａｃＤＣにより刺激されたＰＢＭＣ上でのＴＴＸおよびＫＬＨに対するＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０のＥＬＩＳｐｏｔ応答。（ｅ）ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、パネルｄのアッセイウェルから回収し、そしてさらに１０日間さらなる刺激およびサイトカインの非存在下において培養した。異なるＡｇに対するＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＦＳＥの増殖を示す。パネルａ〜ｅの刺激は、ａｃＤＣをＴＮＦ−α／ＰＧＥ_２／ＩＬ−１βで成熟させることによって行なわれ、そして３回の独立した実験の代表である（パネルｃを除いて、３回の別々の実験の平均±ＳＥＭを示す）。 Ａｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌およびＣＤ１３７アップレギュレーションは、ＰＢＭＣおよび全血中においてａｃＤＣにより増幅される。（ａ）ａｃＤＣの非存在下（上の列）または存在下（下の列）においてＰＢＭＣに対して実施されたＩＦＮ−γ捕捉アッセイ。４８時間のインキュベーション後、分泌ＩＦＮ−γを、製造業者の指示に従って、非接着細胞の表面上で捕捉した。パーセントの付いた数字は、ＰＢＭＣの中のＩＦＮ−γ^＋ＣＤ４^＋（左）またはＩＦＮ−γ^＋ＣＤ８^＋（右）画分を示す。（ｂ）上のように、４８時間の培養中のａｃＤＣによる増幅を含む（下の列）または含まない（上の列）精製ＰＢＭＣに対して実施されたＣＤ１３７アップレギュレーションアッセイ。（ｃ）同じ採血に由来する全血を、平行して、ａｃＤＣと共に（下）またはその非存在下において（上）、Ａｇを加えることによって刺激した。４８時間の培養終了時に、赤血球を溶解し、そして試料をパネルｂと同様に分析した。ドットプロットをここでＣＤ４^＋（左）またはＣＤ８^＋（右）Ｔ細胞上でゲーティングし、ＰＢＭＣと全血との比較を可能とした。それ故、パーセントの付いた数字は、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の間のＣＤ１３７^＋画分を示す。結果は、抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−γ成熟混液を使用して３回実施した代表的な実験を指す。 ａｃＤＣは、全血中のサイトカイン分泌を増幅する。（ａ）全血（２５０μl）を、４８時間かけて、ａｃＤＣ（成熟のための抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−γを含む）の存在下（丸）または非存在下（四角）においてＴＴＸと共にまたはその非存在下において培養した。血漿上清を回収し、そしてサイトカインをLuminexビーズアッセイによって測定した。有意なＡｇ特異的分泌を示したサイトカインのみを示す。結果を、基礎値（白抜きの記号によって示す）を差し引いた後の、正味のＴＴＸで刺激されたサイトカイン濃度（黒い記号）として表現する。（ｂ）２つの異なる被験体（それぞれ丸および菱形の記号）におけるａｃＤＣによる刺激後の、ＰＢＭＣ（黒い記号）と全血（白抜きの記号）との比較。結果を、基礎値を差し引いた後の、正味のＴＴＸで刺激されたサイトカイン濃度として表現する。代表的な実験を、１０回以上の実験が実施された両方のパネルに示す。 ａｃＤＣに基づいたアッセイの図解。未分画ＰＢＭＣ（新鮮または凍結）または未希釈ヘパリン処理全血のいずれかを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共に２４時間かけてタンパク質Ａｇの存在下においてインキュベーションする。続いて成熟刺激をさらに２４時間かけて加え、その後、増幅したＴ細胞応答を多種多様な解読値によって測定することができる。上の灰色のパネルはＰＢＭＣを用いて試験したＴ細胞の解読値を列挙し；下の灰色のパネルは、全血を用いて得られた解読値を示す。ａｃＤＣ増幅技術はまたペプチドＡｇとも適合性であり、これは成熟刺激と共に２４時間後に加えられる。 ＫＬＨ免疫化マウスにおけるＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答のａｃＤＣによる増幅。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＫＬＨまたはアジュバント単独（各々ｎ＝３）を用いて皮下免疫化し、そしてその単核球（１×１０^６）は、ａｃＤＣ混液（ＬＰＳ成熟）を使用してまたはサイトカインを全く使用せずに、ＫＬＨまたは対照Ａｇを用いてin vitroにおいて想起した。^＊ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．、有意ではない。結果は３連で実施した代表的な実験を指す。 ＨＬＡマルチマーによって同定されたエピトープ特異的Ｔ細胞のａｃＤＣにより引き起こされる増殖。（ａ）Ｆｌｕまたは対照ペプチドをローディングしたＨＬＡ−Ａ２ペンタマー（ＰＭｒｓ）を使用したＦｌｕ ＭＰ_{５８〜６６}特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のex vivoにおける検出。（ｂ）ＰＭｒｓによって検出されるＦｌｕ ＭＰ_{５８〜６６}特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のin vitroにおける増殖。ＰＢＭＣを、ＦｌｕＭＰ_{５８〜６６}ペプチドの非存在下（最初の縦列）または存在下（２番目および３番目の縦列）において培養した。培養を４８時間かけて行なうか（最初および２番目の横列）、または非接着細胞を洗浄し、再播種し、そしてさらに７日後まで培養した（３番目および４番目の横列）。これらの培養を、示したように、ａｃＤＣ混液の存在下または非存在下において実施した。Ｆｌｕ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、対応するＨＬＡ−Ａ２ ＰＭｒｓを用いて同定し（最初および２番目の縦列）、そしてバックグラウンド染色を対照ＰＭｒ（３番目の縦列）を用いて決定した。（ｃ、ｄ）同じ実験を実施して、Ｆｌｕまたは対照ペプチドのローディングされたＨＬＡ−ＤＲ４テトラマー（ＴＭｒｓ）を使用してＦｌｕ ＨＡ_{３０６〜３１８}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を検出した。ａｃＤＣ成熟を、抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−αを用いて誘導した。結果は、３回の独立した実験の代表である。 ａｃＤＣにより増幅されるＩＬ−１β分泌は、接着細胞に由来する。ＰＢＭＣを、ａｃＤＣ手順に従ってＴＴＸを用いてまたはＡｇを全く用いずに刺激した（抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−α成熟）。４８時間後、接着細胞および非接着細胞（２×１０^５個／ウェル）を、別々に、ＩＬ−１β ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて６時間かけて試験した。＊ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．、有意ではない。結果は、３連で実施した代表的な実験を指す。

実施例
実施例１：ＰＢＭＣ由来の促進された共培養ＤＣ（ａｃＤＣ）は、共培養Ｔ細胞のＡｇ特異的応答（タンパク質Ａｇによる刺激）を増幅する
材料および方法：
０日後に、全ＰＢＭＣ（２．５×１０^６個の細胞／ウェル）を、４８ウェルプレートの、１，０００Ｕ/mlのＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ/mlのＩＬ−４（両方共にR&D Systemsから）、および関連タンパク質Ａｇ（１０μg/ml）の補充されたＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen）に播いた。試験したタンパク質抗原は破傷風トキソイド（ＴＴＸ）、M. tubercolosis精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、６価ワクチンのインファンリックスヘキサ(GlaxoSmithKline)、プロインスリン（ＰＩ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリンＣ−ペプチド、プレＰＩリーダー配列、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３であった。陰性対照として使用したタンパク質の一例はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。

１日後に、炎症誘発刺激を加えて、ＤＣの成熟を誘導した。

いくつかの成熟プロトコールを開発して、以下に記載したように試験した。

成熟プロトコールＡ：１０００Ｕ/mlのＴＮＦ−α、１０ng/mlのＩＬ−１β（両方共にR&Dから）および１μMのＰＧＥ_２（Calbiochem）
これは、ＦａｓｔＤＣを得るのに使用したのと同じサイトカイン混液であり[Dauer et al., J.Immunol. 170:4069, 2003]、そして慣用的な（７日後の）ＤＣを生成するためにいくつかの他のグループによって記載されている。さらに、本発明者らは、低用量のＩＬ−７（０．５ng/ml；R&D）を加え、これは本発明者らが、ＥＬＩＳｐｏｔ検出システムを使用してＡｇ特異的に（すなわちバックグラウンドの増加を伴うことなく）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を大きく増殖させるために以前記載した[Martinuzzi et al., J.Immunol.Methods 333:61, 2008]。このプロトコールは、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４などを産生するＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するのに適していた。

成熟プロトコールＢ：抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ；クローンＧ２８−５、１０μg/ml）、ＩＦＮ−α ２ａ（Roferon-A, Roche; 1,000 U/ml)
慣用的な７日後のＤＣのための類似の成熟混液が記載されている[Luft et al., Int.Immunol. 14:367, 2002]。さらに、本発明者らは、低用量のＩＬ−７（０．５ng/ml）を使用して応答をさらに増幅させた。

このプロトコールは、例えばＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０などを産生するＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するのに適していた。

成熟プロトコールＣ：ＬＰＳ１００ng/mlおよび低用量のＩＬ−７（０．５ng/ml）
このプロトコールは、ＩＬ−１０基礎（非刺激）分泌の大きな増加に因り、ＩＬ−１０ではなく例えばＩＦＮ−γを産生するＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するのに適していた。

成熟プロトコールＤ：ポリＩ：Ｃ ２０μg/mlおよび低用量のＩＬ−７（０．５ng/ml）
このプロトコールは、ＩＬ−１０基礎（非刺激）分泌の大きな増加に因り、ＩＬ−１０ではなく例えばＩＦＮ−γを産生するＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するのに適していた。

Ｔ細胞検出手順：ＥＬＩＳｐｏｔ。非接着細胞を洗浄し、新鮮なＡＩＭ-Ｖ培地に再懸濁し、そして所望の抗サイトカイン捕捉Ａｂｓ（例えば抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−４；全てU-CyTechから)を用いて一晩かけてコーティングされた、９６ウェルＰＶＤＦプレートの３つのウェル（０．３×１０^６個の細胞／ウェル）に分配した。さらなるＡｇまたはサイトカインは加えず、そしてプレートを６時間３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした。ビオチニル化二次Ａｂｓおよび標準的な比色定量検出（例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ−ＢＣＩＰ）を用いて顕色させた。スポットを、Bioreader 5000 Pro S-F (BioSys）ＥＬＩＳｐｏｔ解読機または同等物で計測し、そして３つのウェルの平均を計算した。全てのＥＬＩＳｐｏｔ解読値は、スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６個のＰＢＭＣとして表現した。陽性応答のカットオフは、平均基礎反応性（すなわちＢＳＡまたは無抗原に対する反応性）より上の３ＳＤに設定された。

ａｃＤＣの表現型分析：
ａｃＤＣおよび慣用的な（７日後の、単球由来の）ＤＣ（未成熟または成熟のいずれか）の表現型を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃに特異的なｍＡｂで染色することによって決定した。エンドサイトーシス活性をデキストラン−ＦＩＴＣと共にインキュベーションし、続いて取り込まれた蛍光を評価することによって評価した。全ての細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ）で分析した。

結果：
ａｃＤＣの特徴付けにより、慣用的な７日後のＤＣのそれと同一な表現型が判明した。ＣＤ１４のダウンレギュレーションは、ＨＬＡ-ＤＲおよび共刺激分子の発現増加と平行して起こったが、デキストラン取り込みは成熟時に減少した。

本発明者らは、ＥＬＩＳｐｏｔ検出システムを使用して、タンパク質Ａｇでパルスした時にＡｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅するａｃＤＣの能力を試験した。２４時間の成熟期間後に、非接着細胞を、抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−２または抗ＩＬ−４捕捉ＡｂでコーティングされたＥＬＩＳｐｏｔプレートに移し、そしてさらに６時間かけてさらにＡｇまたはサイトカインの補充を全く行なうことなく培養した。ａｃＤＣにより引き起こされる培養液は、慣用的な単球により引き起こされる条件（すなわちサイトカインを全く添加しない）と比較して、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答の誘起においてはるかにより効率的であった。関連しないタンパク質またはＡｇ希釈剤のみに対するバックグラウンド応答は有意に増加しなかった。さらに、ａｃＤＣは、未成熟のままのａｃＤＣと比較して（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のみで処理）、炎症誘発刺激で成熟させた場合にはるかにより効率的であった。ａｃＤＣの効率は、慣用的な７日後のＤＣと類似し、そしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＩＬ−４を含む種々のサイトカイン応答を増幅する上で同様に効果的であった。例えば、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２およびＩＬ−１βで成熟させたａｃＤＣを用いての特異的シグナルの中央値の増加は、単球と比較して、ＩＦＮ−γについては２．２倍（１．５〜８．７の範囲）であり、ＩＬ−１０については１．４倍（１．２〜５．０の範囲）であった。

実施例２：ペプチドＡｇによる刺激
材料および方法：
実施例１に記載したのと同じ実験を、タンパク質Ａｇによる刺激の代わりに、ペプチド抗原刺激を使用して行なった。試験したペプチドＡｇの例は、インフルエンザマトリックス（ＭＰ）_{５８〜６６}、インフルエンザヘマグルニチン（ＨＡ）_{３０６〜３１８}、ＧＡＤ_{５５５〜５６７}、ＧＡＤ_{１１４〜１２３}、ＰＩ_{Ｂ１０〜１８}であった。陰性対照として使用したペプチドの例はピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤ）_５〜１３およびコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）_{２６１〜２７３}であった。

結果：
タンパク質ＡｇでパルスされたａｃＤＣ培養液中に誘起されたシグナルは専ら、ＣＤ４＋Ｔ細胞を起源としていた。なぜなら、これらの細胞を除去した時に前記シグナルが完全に消失したからであった。Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、より長い培養期間（７日間）かけてしか誘起することができなかった。７日後のＤＣを使用して全ＰＢＭＣまたはＣＤ４枯渇ＰＢＭＣを刺激した場合に同じことが当てはまり、従って、ａｃＤＣに特異的な欠陥特徴は除外される。このＣＤ４特異的刺激は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非効率的な活性化に起因せず、しかしむしろ、内部移行Ａｇの交差提示を誘起するのに最適ではない培養条件に起因していた。実際に、タンパク質Ａｇではなくペプチドエピトープを使用した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方がトリガーされ、そして両方が、単球と比較してａｃＤＣによって有意に増幅された。従って、本発明者らは、特異的なペプチドエピトープを認識するＡｇ特異的Ｔ細胞を増殖および検出するための、ａｃＤＣ培養技術の改変形を綿密に作った。この場合、対象のペプチドを１日後に炎症誘発刺激と共に加える。この改変形は、所与のエピトープに対して特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の検出を可能とする。

従って、ａｃＤＣ培養プロトコールを使用して、タンパク質またはペプチドＡｇのいずれかを用いてＴ細胞を刺激することができる。

実施例３：血中における直接的なａｃＤＣの誘導
サイトカイン混液およびタンパク質／ペプチドＡｇを、実施例１（タンパク質Ａｇについて）または実施例２（ペプチドＡｇについて）のように、予めＰＢＭＣ精製または血液希釈を全く行なっていない新しく採血したヘパリン処理した血液試料中に直接的に加えた。４８時間の培養終了時に、血漿および／またはＰＢＭＣを回収し、そしてＥＬＩＳＡ（R&D）、サイトメトリックビーズアレイ（BD）、もしくはＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（Biorad）アッセイを使用した血漿中のサイトカイン測定によって、または赤血球溶解後の細胞画分に対するMiltenyiサイトカイン捕捉アッセイによって、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答について分析した。またこの場合、ａｃＤＣにより引き起こされる培養液中において誘起されたＡｇ特異的応答は、単球により引き起こされる培養液中において誘起されるものよりも高かった。使用する成熟プロトコールに依存して、これは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１βを含む試験した多くのサイトカインについて該当した。

実施例４：ａｃＤＣ培養の下流にあるＴ細胞の増殖、選別およびクローニング、並びにＴ細胞応答の分析
ａｃＤＣ培養系はまた：１）さらなる機能的な特徴付け（例えばＲＴ−ＰＣＲ技術による）のためのＡｇ特異的Ｔ細胞の選別；並びに２）さらなる分析のためのＴ細胞株およびクローンを生成するために適している。

ＰＢＭＣを、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、０．５〜１μM）で予め標識し、ａｃＤＣ培養にかけ、そして前記のようにＥＬＩＳｐｏｔプレートに移した。６時間のＥＬＩＳｐｏｔでのインキュベーション後に、細胞を回収し、そしてさらに刺激を与えることなくさらに５日間かけて培養液中に戻した。この培養の終了時に、増殖しているＣＦＳＥ^低度細胞を１細胞毎に選別し、そして以前に記載されたプロトコールを使用して３回の刺激を通してさらに増殖させた[Mannering et al., J.Immunol.Methods 298:83, 2005]。一例として、破傷風トキソイド（ＴＴＸ）特異的応答が、０．０４４％の頻度でＥＬＩＳｐｏｔによって検出され、これは３．０％のＴＴＸ特異的ＣＦＳＥ^低度画分の選択に関連し、これは約６８倍の増殖に対応する。またこのin vitroにおける培養について、ａｃＤＣに基づいた培養は、慣用的な単球に基づいた増殖よりも優れていることが判明し、これは約１０倍低いＴＴＸ特異的細胞（０．２９％）を生じた。ＴＴＸ特異的ＣＦＳＥ^低度画分を選別し、そしてクローニングすることにより、ＴＴＸ特異的ＣＤ４^＋クローンが得られた。このアプローチはまた、ａｃＤＣ培養液から検出された応答が実際にＡｇ特異的であったことを確認した。

実施例５：ａｃＤＣ培養系は、β細胞特異的ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞応答を検出する
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、インスリン産生β細胞をターゲティングするＴ細胞により媒介される自己免疫疾病である。その発症率は着実に増加している（フランスにおいては１年当たり１００，０００中１５人までが新たに診断される；１年あたり３〜４％の発症率の増加）。その独特な疫学から（それは主に小児および若年成人に生涯にわたり罹患する）、それは慢性的で費用がかかり衰弱させる疾病であり、重度の合併症（心臓血管疾病、腎症および末期腎疾病、網膜症および盲目）に至る。

Ｔ１Ｄの臨床的発症および診断は、病的カスケードの後期の事象であり、これは大半のβ細胞がすでに自己反応性Ｔ細胞によってそれより以前の数カ月／数年間かかって破壊された後に行なわれる。その段階において、免疫機序の修正を目的とした原因関連療法のための余地は殆ど残されておらず、そしてインスリン補充が唯一の治療選択肢である。それ故、疾病の予測および経過観察のために適切なバイオマーカー、並びに全身的な免疫抑制を回避しつつβ細胞特異的Ｔ細胞応答を選択的に消失させることのできる適切な抗原（Ａｇ）特異的療法が重大にも欠失している。

Ｔ１Ｄのために、現在使用されている自己抗体は限界を有する。なぜならＴ１Ｄ患者の１５％は自己抗体陰性であり；自己抗体はＴ１Ｄ発症までの時間を予測せず；そしてそれらは成功裏な免疫介入後に変化しないからである。

あるいは、Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋Ｔ細胞応答またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答）を、初期バイオマーカーとして使用することができる。

サイトカインＥＬＩＳｐｏｔは、種々の条件において特異的な免疫応答の調査のために広く使用されているアッセイである。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、この方法によって容易に検出することができる。ヒトＴ１ＤについてのＣＤ８＋β細胞ターゲットエピトープに関する情報が殆どないということが依然として限界であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定するための既存の技術（ＥＬＩＳｐｏｔおよびテトラマーに基づいた）が、見込みある結果をもたらしている(Toma et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102:10581, 2005; Mallone et al., Diabetes 56:613, 2007)。

Ａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血中に非常に低い頻度で存在し（約０．００１〜０．０００１％、そのＣＤ８＋対応物よりもさらに低い）、特に自己免疫設定におけるその検出を困難なものとしている。

Alleva et al. (J Clin Invest. 107:173, 2001)は、直接的なＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、Ｔ１Ｄ患者におけるインスリンＢ９〜２３エピトープに対する細胞応答の検出を報告した。

Arif et al., (J Clin Invest. 113:451, 2004)は、間接的なＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用していくつかのプロインスリン由来ペプチドに対する細胞応答の検出を報告した。この文献において、末梢血単核球を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ前に抗原性ペプチドと共にインキュベーションした。

しかしながら、そうした研究は、最初に行なった研究室以外での復元をすることが全体的に困難であった。これは、このような手順の技術的なハードル、およびこれらの検出システムの全体的に低い感度を明白にする。

それ故、本発明者らは、本出願において記載したａｃＤＣに基づいた手順を使用して。Ｔ１Ｄのβ細胞特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を調べた。種々のグループの患者を考察し、そしていくつかの重要な観察を行なった：最初に、診断時に引き抜かれたＴ１Ｄ成人は、プロインスリン（ＰＩ）特異的応答の高い罹患率（８３．３％）によって特徴付けられ、これは長年の患者においてこれらの応答が稀であることと対照的であった（５．４％；Ｐ＜０．０００１）。これに対し、ＧＡＤ特異的応答も同じように、Ｔ１Ｄの期間に関係なく、より低い頻度ではあるが提示された。第二に、新たに発症したＴ１Ｄ小児は全くＰＩ特異的Ｔ細胞応答を示さなかった。健康な対照（成人および小児の両方）は２つの症例を除いて全くＰＩ特異的Ｔ細胞応答を示さなかった（頻度８．７％）。どちらの症例においても、これらの被験者は、以前には認識されていなかったＴ１Ｄリスク因子を有し、１つの症例においてはＨＬＡ−ＤＲ４／ＤＱ８感受性ハプロタイプに陽性であり、そして他方においては抗ＧＡＤ Ａｂｓに対して陽性であった。リスクのある第１度近親（ｎ＝１０；頻繁には他のＡｂマーカーと共に、膵島細胞Ａｂに陽性な個体として定義）は、どうにか中間の写真を示し、試験した個体の３０．０％がＰＩ特異的応答に陽性であった。重要なことには、試験した１０人の個体の中の僅か１人が、現在までにＴ１Ｄを発症し、そしてａｃＤＣに基づいたＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってＴ１Ｄ進行のリスクが高いと正しく同定されている。理論によって固めたくはないが、本発明者らは、新たに発症したＴ１Ｄ患者と長年のＴ１Ｄ患者との間に観察した差異は、インスリン処置によって誘導された制御応答を反映し、これは、リスクのある被験者における自己免疫によるβ細胞の破壊を遮断することによって疾病を予防することを目的とした臨床試験についての重要な示唆であると仮定する。この制御応答は、いくつかの場合、小児に見られるように、インスリン療法とは独立した天然の応答であり得る。

実施例６ 促進された共培養樹状細胞（ａｃＤＣ）による抗原特異的Ｔ細胞応答の増強された検出
アブストラクト
抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞の検出はしばしばアッセイ感度によって制限される。それ故、本発明者らは、in situにおいて樹状細胞（ＤＣ）の誘導および成熟を促進することによって（促進された共培養ＤＣ、ａｃＤＣと呼ぶ）、ヒトおよびマウスの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中におけるＡｇ処理およびＴ細胞への提示を増強するためのアプローチを考案した。未分画ＰＢＭＣまたは全血を、タンパク質またはペプチドＡｇおよびサイトカイン混液と共に４８時間かけてインキュベーションし、ａｃＤＣを迅速かつ連続的に誘導、パルスおよび成熟させた。同様に、Ａｇを処理および／または隣接するＴ細胞に提示し、これによりＴ細胞活性化に至る複数の工程を圧縮し、そして時間、操作および血液必要量を最小限とした。誘起されたＴ細胞応答は、種々の解読値（サイトカイン分泌、増殖、ＣＤ１３７アップレギュレーション、ヒト白血球Ａｇマルチマーの結合）によって検出されたようにＡｇ特異的であった。ａｃＤＣに基づいたアッセイは、ウイルス、腫瘍および自己免疫疾病などの種々の設定においてＴ細胞応答をモニタリングするための価値ある適用を見出し得る。

序論
種々の外来抗原および自己抗原（Ａｇ）に対する応答を開始する上でのＴ細胞の中心的な役割にも関らず、例えば感染症または自己免疫疾病における免疫により媒介される過程の慣用的な診断検出は、主に、専らではなくても、抗体（Ａｂ）応答の測定に依拠する。しかしながら、Ａｂｓは基礎にある病態を常に媒介または反映しているわけではなく、そして免疫過程が主にＴ細胞により媒介されている場合にはより情報は少なくなるであろう（１）。現在までのＡｇ特異的Ｔ細胞アッセイの唯一の信頼できる臨床的適用は、M. tuberculosis感染の診断においてであった（２）。さらに、Ｔ細胞免疫を効果的に測定する重要性は診断適用を超える（３）。Ｔ細胞のモニタリングは、ウイルスもしくは腫瘍特異的な免疫をブーストすることを、または自己組織（４）もしくは移植組織（５）に対する免疫を消失させることを目的とした、免疫調節療法を評価するためにも必要とされる。補充タンパク質（例えば凝固因子）（６）またはワクチン（７）の免疫原性能を評価するためのＴ細胞スクリーニングツールも等しく要求される。

慣用的なヒトＴ細胞アッセイがないのは、Ｔ細胞応答を測定することが本質的に困難であることに起因する。所与のＡｇに特異的なＴ細胞は、血中に非常に低い頻度で存在する（すなわち０．１〜０．００１％）（８）。これらの細胞はex vivoにおいて時折検出可能であるが、その稀少さは、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）およびフローサイトメトリーなどの技術の感度に挑戦する。あるいは、これらの細胞の頻度を、事前の増殖工程によって増大させることができるが、これらは追加の時間および操作を必要とする。Ｔ細胞レセプターによる提示および認識のためにヒト白血球Ａｇ（ＨＬＡ）分子に結合するエピトープペプチドが、Ｔ細胞応答を誘起するために頻繁に使用される。なぜなら、それらはＡｇ提示細胞（ＡＰＣｓ）による処理を必要としないからである。Ｔ細胞活性化のためのこの最初の律速工程を迂回するが、エピトープはそれにも関わらず、Ｔ細胞を刺激するための特異的なＨＬＡ分子に結合するとして予め同定される必要がある。さらに、ペプチドは、選択されたＡｇ配列に対するＴ細胞応答の限定されたレパートリーを刺激する。

樹状細胞（ＤＣ）は、匹敵するもののない処理特性および刺激特性を与えられた特殊なＡＰＣである（９）。これらの特徴は、Ｔ細胞活性化をブーストし、従って、in vitroにおいてＡｇ特異的Ｔ細胞の検出を増強するために、前記樹状細胞を魅力的なものとする。この目的を達成するために、ＤＣは単球前駆体から慣用的には誘導され、手順は、最も一般的には顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）−４を用いての６日間の分化（１０、１１）、および一連の炎症誘発刺激を用いての少なくともさらにもう１日間かけての成熟を必要とし、これにより完全なＴ細胞刺激能が達成される（１０〜１２）。これらの時間の必要条件は、臨床実験慣行とは相容れない。より短いプロトコールが記載されているが（１３）、それらは依然としてＣＤ１４＋単球の事前の単離を必要とし、従って、血液必要量および手作業の仕事が非常に増える。

これらの限界を克服するために、本発明者らは、ＤＣを誘導および成熟させて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のin situにおいてＡｇ提示およびＴ細胞活性化を促進することができるかどうかを調べた。このアプローチの利点は２つである。一方で、それは時間、精製工程および血液必要量を減少させるだろう。他方で、それは分化ＤＣとリンパ球を接触させたままの状態とし、従ってＡｇ処理、提示およびＤＣ成熟が起こるようにＴ細胞を刺激するだろう。これらのＤＣが、同族のＴリンパ球および他の血液細胞によって囲まれながら４８時間以内に誘導およびＡｇパルスされるので、それらは促進された共培養ＤＣ（ａｃＤＣ）と呼ばれる。結果として、本発明者らは、多種多様なアッセイプラットフォームで検出されるＡｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅する、効率的で短時間の手順を開発した。

結果
ａｃＤＣはＡｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅する
ａｃＤＣが共培養Ｔ細胞のＡｇ特異的応答を増幅し得るかどうかを調べるために、ａｃＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって２４時間かけてＰＢＭＣ混合物内において誘導した。同時に、異なるタンパク質Ａｇ［例えば、破傷風トキソイド（ＴＴＸ）、M. tuberculosis精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、６価ワクチンまたは無Ａｇ］を培養開始時から加えた。さらに２４時間の成熟の後、非接着細胞を、抗インターフェロン（ＩＦＮ）−γ捕捉Ａｂでコーティングされた酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）プレートに移し、そして追加のＡｇまたはサイトカインの補充を行なうことなくさらに６時間かけて培養した（図解については、図７を参照されたい）。

最も適切な成熟プロトコールを選択するために、本発明者らは最初に、異なる刺激で成熟させたａｃＤＣの刺激能を、サイトカインの非存在下において培養したＰＢＭＣの刺激能とを比較した（図１ａ）。ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ−γ応答は、種々のプロトコールによって成熟させたａｃＤＣによって有意に増幅された。最も効果的であったのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α／プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２／ＩＬ−１β（ＰＢＭＣのみよりも、４２．０％のシグナルの増加；ｐ＝０．０３）、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）（６９．３％のシグナル増加；ｐ＜０．００１）、リポ多糖（ＬＰＳ；５５．２％の増加、ｐ＝０．０１）、および抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−α（１７０％の増加、ｐ＜０．００１）であった。重要なことに、全てのこれらのプロトコールは、Ａｇ特異的ＩＦＮ−γシグナルを増加させたが、バックグラウンドは増加させず、従って、サイトカインによる非特異的Ｔ細胞活性化は除外される。Ａｇの非存在下においてサイトカインに曝されたまたは曝されていないＰＢＭＣに由来するＴ細胞中の活性化マーカー（すなわちＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７）のアップレギュレーションがないことは、さらに非特異的活性化を除外した（データは示さず；ＣＤ１３７については図５参照）。他の成熟混液は、Ａｇ特異的シグナル（ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ／ＰＧＥ２、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−γ）を増幅しなかったか、またはそれらがバックグラウンド（抗ＣＤ４０／ＩＬ−１β）の有意な増加と共に増幅させたためのいずれかのために、除外された。

ヒトａｃＤＣは、ＩＦＮ−γ分泌応答を増幅できただけでなく、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出される他のサイトカイン応答も増幅させることができた（図１ｂ〜ｄ）。抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−α成熟はＩＦＮ−γを最も増幅させたが（２．７倍）、ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２／ＩＬ−１βは、試験した全てのサイトカイン応答をブーストした唯一の組合せであった（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４のぞれぞれについて１．２倍、５０．０倍および２．９倍）。それ故、これらの２つの成熟混液を保持した。ＩＬ−１７応答はこれらのいずれのプロトコールによっても増幅されなかった（データは示さず）。さらに、ＴＴＸ記憶応答だけが有意にバックグラウンドを超え、ＫＬＨ ｎｅｏＡｇに対するナイーブ応答はそうではなかった（図１ｂ〜ｄ）。

ａｃＤＣによるＴ細胞応答の増幅はまた、成熟のためのＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、次いでＬＰＳと共にインキュベーションしたマウス単核球血液細胞を用いて得られた。１回の低用量のキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて免疫化されたマウスからの細胞は、ａｃＤＣサイトカインの存在下において有意により高いＫＬＨ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ想起応答を示した（図８）。

ａｃＤＣの特徴付けにより、慣用的な単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣｓ）と同一な表現型が判明した（図２ａ）。ＣＤ１４ダウンレギュレーションは、ＨＬＡ−ＤＲおよび共刺激分子の増加した発現と平行して起こったが、デキストラン取り込みは、ｍｏＤＣにおいてより効率的であったが、成熟時に減少した。ａｃＤＣはまた、Ａｇ特異的Ｔ細胞応答の誘起においてｍｏＤＣと少なくとも同程度に効率的であった（図２ｂ）。予期した通り、ａｃＤＣおよびｍｏＤＣの両方が、炎症誘発刺激を用いての刺激後により効率的であった（図２ｂ）。

ａｃＤＣにより増幅されたＴ細胞応答の再現性
再現性を、同じＰＢＭＣ調製物（すなわち、分析レベルにおけるアッセイ間変動性、これは採血および処理によって導入される差異を除外する；図２ｃ）および同じ個体からの異なる時機に採取した血液に由来するＰＢＭＣ調製物（すなわち、分析前レベルおよび分析レベルにおけるアッセイ間変動性、これは採血および処理に起因する差異を含む；図２ｄ）からの異なる凍結細胞アリコートを試験することによって、再現性を評価した。両方の場合において、アッセイ変動度は１０％未満であった。顕著には、新鮮な試料と凍結した試料との間の変動（６．９％）も小さかった（図２ｅ）。

ａｃＤＣによって増殖されたＡｇ特異的Ｔ細胞を単離およびクローニングすることができる
Ａｇ特異的Ｔ細胞を選択および増殖するために、細胞に結合するダイであるカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の希釈液を、増殖の解読値として使用し（１４）、そしてａｃＤＣ手順と併用した（図３ａ）。ＰＢＭＣを最初にＣＦＳＥで標識し、その後、ａｃＤＣにより増幅されたＥＬＩＳｐｏｔ手順において使用した。それらをＥＬＩＳｐｏｔプレートから回収し、そしてさらに操作を行なうことなくさらに６〜８時間かけて培養した。その後、増殖している（ＣＦＳＥ低度）細胞をフローサイトメトリーによって同定し、単一細胞へと選別し、そして抗ＣＤ３Ａｂ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を用いての３回の刺激を通してさらに増殖させた（１５）。代表例を図３ｂ〜ｄに示す。ＴＴＸ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ応答が検出され（４４１個のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６個のＰＢＭＣ；０．０４４％）（図３ｂ）、これにより３．０％のＴＴＸ特異的ＣＦＳＥ（低度）画分が得られ、これは約６８倍の増殖に対応する。ａｃＤＣ条件は、サイトカインの非存在下における慣用的な増殖よりも優れ、これは１０倍少ないＴＴＸ特異的細胞を生じた（０．２９％、ｐ＜０．００１）。バックグラウンド増殖の有意な増加は全く観察されなかった（図３ｃ）。ＴＴＸ特異的ＣＦＳＥ（低度）画分（分裂細胞）を選別およびクローニングし、ＴＴＸｖｓ対照でパルスしたＤＣの想起アッセイによって評価したところ、ＴＴＸ特異的Ｔ細胞クローンが生成された（図３ｄ）。

ペプチドエピトープを用いての刺激、およびペプチド−ＨＬＡマルチマーで染色されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞による検出の後に、類似の増殖が得られた（図９）。新鮮なＰＢＭＣを、ａｃＤＣの非存在下または存在下においてペプチドで刺激した４８時間後および７日後に、ex vivoにおいてＨＬＡマルチマーで染色した。ex vivoにおいて検出されたＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｆｌｕ ＭＰ５８〜６６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（バックグラウンド染色を差し引いた後に０．０６３％）（図９ａ）を、ペプチド特異的刺激の４８時間後ではなく７日後に増殖させた（サイトカインの非存在下において１３．３倍ｖｓ０．５４倍の増殖）（図９ｂ）。Ｆｌｕ ＨＡ３０６〜３１８特異的ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞を分析することによって類似の結果が得られた。ex vivoにおけるペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度（バックグラウンドを差し引いた後に０．２４％）（図９ｃ）は、培養の７日後のみにおいてペプチド特異的増殖時に、およびａｃＤＣ混液を使用した場合にのみ増加した（サイトカインの非存在下において１３．５倍ｖｓ０．７９倍の増殖）（図９ｄ）。共に、これらのデータは、ａｃＤＣが、より長い培養時にＡｇ特異的Ｔ細胞の増殖を有意に増強し、そしてａｃＤＣにより増幅されたＴ細胞応答がＡｇ特異的であることを示す。

タンパク質およびペプチドＡｇは異なるＴ細胞応答をトリガーする
次に、本発明者らは、タンパク質およびペプチドＡｇでパルスされたａｃＤＣによるＴ細胞刺激を比較した。タンパク質Ａｇを使用した場合、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによって追跡される４８時間のａｃＤＣ培養液中に誘起される応答は、専らＣＤ４＋Ｔ細胞を起源とした。なぜなら、刺激開始時または終了時のいずれかにおけるその枯渇は完全に応答を消失させたからである（図４ａ）。同じことがｍｏＤＣにも該当し、このことは、この特徴が、ａｃＤＣに特有ではなかったことを実証する。弱いＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、４８時間の培養中に取り込まれたＡｇの非効率的な交差提示に起因する可能性が高かった。従って、タンパク質Ａｇを、ＨＬＡクラスＩＩまたはクラスＩ拘束性ペプチドエピトープによって置換した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答がそれぞれトリガーされ（図４ｂ）、ここでもＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇によって確認された（示さず）。さらに、両方のタイプの応答が、慣用的なＰＢＭＣと比較してａｃＤＣによって有意に増幅され（それぞれＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について３．２倍および６．３倍；ｐ＜０．０５）、このことは、タンパク質およびペプチドＡｇの両方におけるａｃＤＣ技術の有用性を実証する。

ａｃＤＣにより増幅されたＥＬＩＳｐｏｔによって検出されるＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は主に記憶細胞であった。なぜなら、ＣＤ４５ＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡ＋ではなく）Ｔ細胞の枯渇が、応答を有意に減少させたからである（８１．４％の減少、ｐ＜０．０５；図４ｃ）。これは、想起Ａｇ ＴＴＸに対する応答と、ｎｅｏＡｇ ＫＬＨに対する応答とを比較することによって確認された。実際に、ＫＬＨは、４８時間のａｃＤＣ刺激中に有意なＩＦＮ−γまたはＩＬ−１０のＴ細胞応答を誘起しなかった（図４ｄ）。しかしながら、これらの細胞（最初にＣＦＳＥ標識された）をさらにもう１週間かけて培養した場合、低いグレードのＫＬＨ特異的ＣＤ４＋応答が検出された（図４ｅ）。さらに、ＴＴＸ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞も観察され、このことは交差提示がより長い刺激で起こったことを示唆する。

ａｃＤＣはＰＢＭＣまたは全血中のいずれかにおいて異なるＴ細胞応答を増強する
本発明者らは、ａｃＤＣ増幅が、精製ＰＢＭＣを使用した他の機能的Ｔ細胞解読値にも適用されるかどうかをさらに調べた。ＩＦＮ−γ分泌を、ＣＤ４５（免疫細胞の表面に結合する）およびＩＦＮ−γに対する二重特異的ｍＡｂを用いての捕捉アッセイ（Miltenyi）によって検出した（図５ａ）。サイトカインの非存在下において有意なＴＴＸ特異的ＩＦＮ−γ分泌は検出されなかった。しかしながら、ＩＦＮ−γは、ａｃＤＣ増幅後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の両方に検出され、バックグラウンドの増加は検出されなかった。ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の数は、ＥＬＩＳｐｏｔによって検出されたものよりも高く、これは何故ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も可視化されたのかを説明し得る。Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ１３７の表面発現を用いて類似の結果が得られた（１６、１７）（図５ｂ）。両方の解読値はまた、Ａｇ特異的Ｔ細胞の下流の選別およびクローニングに適合性であった（データは示さず）。

次に、本発明者らは、ａｃＤＣが、全血中のＡｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅し得るかどうかを調べた。これらの実験は、図５ｂに示した精製ＰＢＭＣに対するものと平行して、同じ採血を使用して、ａｃＤＣ混液（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、次いで抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−α）を未希釈のヘパリン処理血液（２５０μl）にＡｇと共に直接加えることによって実施された。４８時間後、溶血した血液を、ＣＤ１３７発現のフローサイトメトリー分析によってＴ細胞活性化について調べた（図５ｃ）。ＣＤ１３７アップレギュレーションは、サイトカインを全く加えなかった場合に、精製ＰＢＭＣよりも全血においてより高い感度で検出されたが、ａｃＤＣ条件については逆であった。全血でのａｃＤＣによって得られたより低度の増幅は、それにも関わらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を増強するのに十分であった。

ａｃＤＣは、全血中のＡｇにより刺激されるサイトカイン分泌を増幅する
最後に、本発明者らは、ａｃＤＣ増幅が、全血刺激後に回収した血漿でのＡｇ特異的な大容量のサイトカイン分泌を検出できるかどうかを探索した。この目的を達成するために、ヘパリン処理した全血を、ａｃＤＣ混液（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４、次に抗ＣＤ４０／ＩＦＮ−α）およびＡｇと共に上記のようにインキュベーションした。４８時間後、血漿上清をサイトカイン測定のために回収した。いくつかのサイトカインが、Ａｇ刺激時に有意な増加を示した（図６ａ）。マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１αを除いて、正味の（すなわちバックグラウンドを差し引いた）Ａｇ特異的シグナルは、全てのマーカーについて「サイトカインなし」の条件よりもａｃＤＣにおいての方がより高かった（シグナル増幅の中央値、６．１倍；３．６〜４１．９の範囲；ｐ＜０．００１）。重要なことには、基礎分泌はａｃＤＣ暴露時に増加せず、そしていくつかの場合には減少さえし、Ａｇ特異的増幅効果を示す。ＣＤ１３７のアップレギュレーションについて本発明者らは、全血およびＰＢＭＣ中におけるサイトカインの検出の感度を比較した（図６ｂ）。サイトカインは、全血よりもＰＢＭＣを用いての方がより高い感度で検出され、濃度の中央値は、ＰＢＭＣよりも約４倍高かった（１．０〜３４．０の範囲；ｐ＜０．００１）。

驚くべきことに、Ｔ細胞によって分泌されることが知られていないいくつかのサイトカイン（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β）もまた、Ａｇ特異的活性化のマーカーとして挙動した。細胞内サイトカイン染色はさらに、Ａｇ特異的ＩＬ−１βの分泌が、非接着細胞からではなく接着細胞に由来することを示した（図１０）。

考察
ＤＣの治療能は、疾病に関連したＡｇに対する免疫原性または免疫寛容誘発Ｔ細胞応答を誘導するために活発に探索されている（１８、１９）。しかしながら、その強力なＡｇ処理および提示特性にも関わらず、ＤＣは、Ｔ細胞診断のためには活用されていない。これは、近づける循環ＤＣの頻度が低いことによって、並びに単球および他の前駆体から開始してＤＣ型ＡＰＣを生成するのに必要とされる多くの血液容量によって示される拘束におそらく起因する。ａｃＤＣ技術は、慣用的な実験適用に受け入れられる短くて簡単な方法でＡｇ特異的Ｔ細胞応答を増幅する手段を提供することによってこの欠陥を充足する。ａｃＤＣとｍｏＤＣとを並べて比較することにより、表現型および刺激能の点の両方において顕著な類似性が判明した。ａｃＤＣの顕著な利点は、未分画ＰＢＭＣまたは全血のより生理学的設定において４８時間以内にin situで生成されることである。さらに、試料必要量は最小限であり、僅かに１０^６個のＰＢＭＣ（約１mlの血液）または２５０μlの全血が必要とされるだけである。これは、特に小児におけるＴ細胞応答の長期モニタリングにおいて重要な考慮すべき事柄であり、そしてＴ細胞エピトープのためのペプチドライブラリーをスクリーニングする際の明確な利点である。

大容量の培養において、ａｃＤＣの誘導およびＡｇでのパルスを、Ｔ細胞の同時活性化（Ａｇ特異的な）と共役させ、よってＴ細胞応答に至る３つの重要な工程を確保する。このタイプのアッセイにおける可能性ある問題は、ａｃＤＣを誘導および成熟させるのに使用されるサイトカインによる非特異的なＴ細胞の活性化である。しかしながら、これは実情ではなかった。なぜなら、Ｔ細胞解読値（増殖、ＣＤ１３７のアップレギュレーション、サイトカインの分泌）についての基礎値は、ａｃＤＣプロトコールによって僅かにしか影響を受けなかったからである。バックグラウンド値の限られた（１０倍までの）増加が、以前に実証されたように、稀な（０．００１％の頻度）Ｔ細胞応答の検出を妨げないことが関連している（２０）。Ａｇ提示ａｃＤＣと応答するＴ細胞との間の掛け合い応答が、さらに相乗作用してＡｇ特異的応答を増幅させることが可能である。ａｃＤＣに基づいたアッセイにおいて検出される応答は真にＡｇ特異的であった。なぜならin vitroにおいて増殖した選別されたＴ細胞がＡｇ特異性を保持していたからである。他方で、ＨＬＡ−ペプチドエピトープマルチマー研究は、Ｔ細胞前駆体の頻度が、ａｃＤＣにより引き起こされるＡｇ刺激の開始から４８時間後まで増加しなかったことを実証した。それにも関わらず、活性化（ＣＤ１３７＋）Ｔ細胞の数は、すでに４８時間後までに増加した。このことは、機能的解読値によって検出されるようなＡｇ特異的応答が、傍観者活性化機序によって拡大および判明することを示唆する。Ｔ細胞前駆体の頻度の正確な計測を必要とする研究設定のために、ＣＦＳＥ希釈度を、ＨＬＡマルチマー染色と共役させて、増殖Ｔ細胞の最初の数を決定することができた（２１）。慣用的な臨床適用のために、４８時間以内に得られたような増幅された解読値で十分であろう。

ａｃＤＣ技術は、完全タンパク質Ａｇおよびペプチドエピトープの両方のために役立つ。タンパク質Ａｇは、エピトープ同定およびＨＬＡタイプに基づいた患者の選択の必要性を排除する。さらに、それらは、処理されたエピトープの全レパートリーを用いての刺激を可能とする。ＤＣの高いエンドサイトーシス能およびＡｇ処理能により、ａｃＤＣアッセイ（ドナー、腫瘍または自己免疫ターゲティング組織などの細胞材料をＡｇ源として使用する）もまた想定することができた。ａｃＤＣを成熟させるのに使用した刺激もまた重要なパラメーターであった。以前に報告したように（１２）、抗ＣＤ４０およびＩＦＮ−αはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４と共に、ＩＦＮ−γ産生Ｔヘルパー（Ｔｈ）１応答をより効率的に増幅したが、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βをＰＧＥ２と合わせたものは（２２）、より平衡のとれた表現型をもたらし、Ｔｈ２（ＩＬ−４）および制御性Ｔ（ＩＬ−１０）応答のより良好な検出を可能とした。

ａｃＤＣ技術は、多種多様なＴ細胞解読値と適合性であり、そのいくつかはさらなる増殖および／または特徴付けのためにＡｇ特異的細胞の下流の選別を用いて実行することができる。ａｃＤＣ技術の多用性は、単一細胞（サイトカインＥＬＩＳｐｏｔ、ＣＦＳＥ増殖、ＩＦＮ−γ捕捉、ＣＤ１３７アップレギュレーション、ＨＬＡマルチマー）およびバルク（血漿または培養上清中のサイトカイン）アッセイによって例示された。これらの異なるａｃＤＣアッセイフォーマットの感度は、各適用のために評価する必要がある。単一細胞アッセイがしばしば好ましい。なぜなら、それらは応答するＴ細胞の頻度および表現型についての情報を提供し、そしてバルクアッセイよりも頻繁により感度が高いからである。それにも関わらず、バルクアッセイは慣用的な設定において実施し易く、そしてその検出感度は、M. tuberculosisのためのＩＦＮ−γ酵素結合イムノソルベントアッセイの場合のように、多くの適用のために十分であり得る（２３）。同様に、全血を使用するアッセイはＰＢＭＣの精製を回避し、従って、細胞をより生理学的な環境に保持し、そしてさらなる簡便性を提供する。ａｃＤＣ培養液からのサイトカインは、全血よりもＰＢＭＣを用いての方がより高い感度で見かけ上は検出されたが、差異は一部には、血液およびＰＢＭＣ中における異なる細胞およびその濃度に起因し得る。実際に、ＰＢＭＣを、５×１０^３個の細胞／μlの最適濃度で再懸濁し、２５０μl／試料の全血の容量は、約１×１０^３個のＰＢＭＣ／μlに相当した。従って、精製ＰＢＭＣは、血液細胞よりも約５倍濃縮されていた。

バルクアッセイからの興味深い結果は、Ｔ細胞に由来しない、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−１βの刺激された分泌であった。これらのサイトカインは、接着細胞および非接着細胞に対して実施されるＩＬ−１β ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって示唆されるように、接着ＡＰＣによって産生されたようである。Ａｇ提示ａｃＤＣと対応するＴ細胞との間の正のフィードバックループはさらにａｃＤＣを活性化させ得、それらを誘導してＡｇ特異的にサインサイトカインを分泌させ得る。従って、ＡＰＣ由来サイトカインは、Ｔ細胞応答の価値ある間接的なバイオマーカーを構成し得る。

in vitroにおいてａｃＤＣ表現型を歪めることもまた、異なる特性を有するＡｇ特異的Ｔ細胞を誘導する方法を提供し得る。例えば、ＩＬ−１０処理ＤＣは免疫寛容誘発性であり、そして制御特性を有するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を生じ得る（２４、２５）。従って、ＩＬ−１０の存在下におけるａｃＤＣ刺激は、Ａｇ特異的制御性Ｔ細胞を得る戦略を提供する。

方法
抗原。以下のＡｇを使用した：ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma, Lyon, France)、ＴＴＸ（Dr. Rino Rappuoliの親切なる贈り物、Novartis, Siena, Italy)、M. tubercolosis PPD(Tubertest, Sanofi Pasteur, Lyon, France)、６価ワクチン(インファンリックスヘキサ、GlaxoSmithKline, Rixensart, Belgium)およびＫＬＨ(Sigma)。Ａｇ純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認され、そしてエンドトキシン濃度はLumulus溶解液アッセイ(Lonza, Saint Beauzire, France)によって０．０３５ＥＵ／μg未満であった。ペプチドＦｌｕ ＭＰ５８〜６６およびＦｌｕ ＨＡ３０６〜３１８は、９５％超で純粋であった(GL Biochem, Shanghai, China)。

ＰＢＭＣ中におけるａｃＤＣの誘導。研究は倫理委員会によって承認され、そして全ての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提出した。ＰＢＭＣを単離し、そして記載の通りに新鮮なまままたは凍結させてのいずれかで使用した（２６）。０日後に、ＰＢＭＣを、９６ウェルの平底プレートの、１０００Ｕ/mlのＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ/mlのＩＬ−４(R&D, Lille, France)の補充され、そしたタンパク質Ａｇ（０．１〜１０μg/ml）を含むＡＩＭ−Ｖ培地中に播種した（１０^６個の細胞／１００μl／ウェル）。２４時間後（１日後）、種々の組合せで以下の試薬を含む、成熟刺激を加えた（図１ｃ参照）：１０００Ｕ/mlのＴＮＦ−α、１０ng/mlのＩＬ−１β、１０００Ｕ/mlのＩＦＮ−γ（全てR&Dから）、１μMのＰＧＥ２(Calbiochem, San Diego, CA)；ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６（５μg/ml；Cell Sciences, Canton, MA）、ポリＩ：Ｃ（２０μg/ml；Cayla/InvivoGen, Toulouse, France）、ＬＰＳ（１００ng/ml；E. coli 055:B5から、Sigma）、抗ＣＤ４０Ａｂ（１０μg/ml；クローンＧ２８．５、社内で産生）、ＩＦＮ−α−２ａ（１０００Ｕ/ml；Roferon-A, Roche, Neuilly-sur-Seine, France）。各実験において使用される成熟混液を図の説明文において詳述する。ＩＬ−７（０．５ng/ml；R&D）を成熟刺激と共に加えた（２６）。使用した場合、ペプチドＡｇを１日後に成熟刺激と共に加えた。２日後に（培養開始から４８時間後）、非接着細胞を回収し、洗浄し、そして分析した。

全血中におけるａｃＤＣの誘導。新鮮で希釈されていないヘパリン処理血液（２５０μl）を、１．５mlのチューブに分配し、サイトカインおよびＡｇをＰＢＭＣ刺激のために加え、そして溶血した血液および／または血漿上清を４８時間後に分析した。

ＤＣ特徴付け。ｍｏＤＣを生成するために、精製単球をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４と共に６日間かけて培養し、そしてＴＮＦ−α／ＰＧＥ２／ＩＬ−１βを用いてさらに２４時間かけて成熟させた。ａｃＤＣおよび７日後のｍｏＤＣの表現型を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１１ｃ（BD)に特異的なＡｂｓで染色することによって決定した。エンドサイトーシス活性を、デキストラン−ＦＩＴＣ蛍光取り込みによって評価した。フローサイトメトリー実験を、４８８、６３３および４０７nmレーザー（BD）の備え付けられたＦＡＣＳＡｒｉａで実施した。

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。ＰＢＭＣ中におけるａｃＤＣの４８時間のインキュベーション後に、非接着細胞を洗浄し、新鮮なＡＩＭ−Ｖに再懸濁し、そして記載のように６時間かけてアッセイした（２７）。スポットをＢｉｏｒｅａｄｅｒ５０００Ｐｒｏ−ＳＦ(BioSys, Karben, Germany)で計測し、３〜６つのリプレケートの平均を決定した。ＥＬＩＳｐｏｔ解読値をＳＦＣ／１０^６個のＰＢＭＣとして表現し、そしてバックグラウンドを差し引く（ＢＳＡの存在下またはＡｇの非存在下における自発的応答について、これは全ての場合において同一であった）（２７）。

ＣＦＳＥアッセイおよびＴ細胞クローニング。ＰＢＭＣを、０．１μMのＣＦＳＥ(Invitrogen/Molecular Probes)で染色し、そして前記したようにａｃＤＣ培養液のために使用した。２日後、非接着細胞を洗浄し、ＥｌｉＳｐｏｔプレートに６時間かけて移し、その後、９６ウェルＵ底プレート中に再度播種した。５〜８日間培養した後、細胞をＣＤ４／ＣＤ８について染色した。単一のＣＤ４＋ＣＦＳＥｄｉｍ細胞を、９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに選別した。各ウェルは、２つの関連していないドナーからの、ＩＬ−２（２０Ｕ/ml；R&D）、ＩＬ−４（５ng/ml）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、３０ng/ml）、および２×１０^５個の照射ＰＢＭＣを含んでいた（１５）。細胞に、７日間毎に新鮮なサイトカインを与えた。成長しているクローンを、ＡｇでパルスされたまたはパルスされていないｍｏＤＣと共にインキュベーションした後、細胞内ＩＦＮ−γ染色によって約３週間後に試験した。

ＩＦＮ−γ捕捉およびＣＤ１３７アップレギュレーションアッセイ。ＩＦＮ−γ捕捉を、MiltenyiＩＦＮ−γアロフィコシアニンキットを使用して実施した。ＣＤ１３７を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識４Ｂ４ Ａｂ（BD）で染色した。

ＨＬＡマルチマーアッセイ。Ｆｌｕ ＭＰ５８〜６６または対照ペプチド(ProImmune, Oxford, UK)をローディングしたＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ０２０１ペンタマーを、製造業者の指示に従って使用した。Ｆｌｕ ＨＡ３０６〜３１８または対照ペプチドのローディングされたＰＥ標識ＨＬＡ−ＤＲ０４０１テトラマーはDrs. E. JamesおよびG.T. Nepom (Benaroya Research Institute, Seattle, WA)によって親切にも提供され、そして記載の通りに使用した（２８）。

マウスａｃＤＣ刺激。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、尾の付け根に完全フロイントアジュバント中の５０μgのＫＬＨを用いて皮下に免疫化した。１４日後、血液細胞を収集し、溶血し、そして４８ウェルプレート（２×１０^６個の細胞／ウェル）に播種した。マウスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（R&D）を、ＫＬＨ（０．１μg/ml）と共にまたは非存在下においてヒトａｃＤＣに対して加え；ＬＰＳ（１０ng/ml）を１日後に加え、そしてＥＬＩＳｐｏｔアッセイを記載のように２日後に実施した（２７）。

サイトカインマルチプレックスアッセイ。４８時間後のａｃＤＣ培養液からの上清を、以下のサイトカインおよびケモカイン：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦ−αを含むMilliplexパネル(Millipore/Abacus, Brisbane, QLD, Australia)を使用して、Luminexプラットフォーム(Bio-Plex 200, Bio-Rad, Gladesville, NSW, Australia)で分析した。

統計学的分析。全てのグラフは、３つ以上の独立した実験の平均±ＳＥＭとして提示する。全ての統計学的分析は両側であり、そしてGraphPad Prism 5 (La Jolla, CA)を使用して可変分布および試料サイズに従って実施した。

参考文献
本出願全体を通じて、種々の参考文献は、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は本明細書において本開示への参照により組み入れられる。

Claims (19)

1. 以下の工程：
   ａ）樹状細胞（ＤＣ）の分化を誘導する培地中において血液試料または未分画末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること
   ここで、抗原（Ａｇ）を、工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、被験体から単離した血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料中においてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を刺激するための方法。
2. 以下の工程：
   ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）Ｔ細胞応答を検出すること
   ここで、１つ以上の疾病に関連したＡｇを、工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、前記被験体において疾病を診断するためにＴ細胞応答を検出する方法。
3. 以下の工程：
   ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）Ｔ細胞応答を検出すること
   ここで、１つ以上の疾病に関連したＡｇを、工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、疾病を患う前記被験体において免疫療法の効果をモニタリングするためにＴ細胞応答を検出する方法。
4. 前記疾病が、自己免疫疾病、例えば１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、セリアック病および多発性硬化症；癌疾病、例えばメラノーマ、大腸癌、腎臓癌および血液学的悪性疾患、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫；M. tuberculosis、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルスなどの感染病原体によって引き起こされる感染症；並びに移植片対宿主疾病からなる群より選択される、請求項２または３記載の方法。
5. 以下の工程：
   ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）Ｔ細胞応答を検出すること
   ここで、治療タンパク質を工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、前記治療タンパク質の免疫原性を評価するための方法。
6. 以下の工程：
   ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）Ｔ細胞応答を検出すること
   ここで、候補Ａｇまたはエピトープを工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、候補Ａｇまたはエピトープをスクリーニングするための方法。
7. 以下の工程：
   ａ）ＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）特異的な免疫学的特性を示す少なくとも１つのＴ細胞を単離すること
   ここで、Ａｇを工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、前記被験体から前記の特異的な免疫学的特性を示すＴ細胞クローンを産生するための方法。
8. 以下の工程：
   ａ）免疫寛容誘発特性を有するＤＣの分化を誘導する培地中において被験体から得た血液試料または未分画ＰＢＭＣ試料を培養すること；
   ｂ）前記ＤＣを成熟させること；
   ｃ）特異的な免疫学的特性を示す少なくとも１つのＴ細胞を単離すること
   ここで、Ａｇを工程ａ）および／またはｂ）の間に加える
   を含む、前記被験体から前記の特異的な免疫学的特性を示すＡｇ特異的制御性Ｔ細胞を生成するための方法。
9. ＤＣの分化を誘導する前記培地が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および／またはＦｌｔ−３リガンドを含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. ＤＣの分化を誘導する前記培地が、さらにインターロイキン４（ＩＬ−４）を含む、請求項９記載の方法。
11. 工程ａ）を、１６時間〜７日間の間に含まれる時間ｔ（ａ）をかけて行なう、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 工程ａ）を、２０時間〜４日間の間に含まれる時間ｔ（ａ）をかけて行なう、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 工程ａ）を、２４時間の時間ｔ（ａ）をかけて行なう、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 工程ｂ）を、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、抗ＣＤ４０抗体、インターフェロン−α２ａ（ＩＦＮ−α ２ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）およびその混合物からなる群より選択される、少なくとも１つの炎症誘発刺激および／またはウイルスもしくは細菌の攻撃を模倣する物質の存在下において行なう、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
15. 工程ｂ）を、１２〜７２時間の間に含まれる時間ｔ（ｂ）をかけて行なう、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. 工程ｂ）を、１６〜４８時間の間に含まれる時間ｔ（ｂ）をかけて行なう、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 工程ｂ）を、２４時間の時間ｔ（ｂ）をかけて行なう、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. 前記の生物学的試料が、未分画ＰＢＭＣ試料である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
19. 前記の生物学的試料が血液試料である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。