JP5812466B2 - 青枯病予防剤および青枯病の予防方法 - Google Patents

Description

本発明は、バクテリオファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を利用する青枯病予防剤、および当該青枯病予防剤を用いる青枯病の予防方法に関する。

青枯病（立枯病）は、ナス科植物をはじめ２００種以上の植物に感染し枯死させる農業上深刻な被害をもたらす病害である。病気の進行が急激の場合には青みが残ったまま枯れることもあり、この名がついたと言われている。青枯病になった植物の地際部の茎を切断し、その茎を水につけると、乳白色の粘液（細菌粘塊）を出すのが特徴である。

青枯病対策の主農薬には、クロロピクリンまたは臭化メチルが提案されているが、いずれも劇薬である。臭化メチルについては、その上オゾン層破壊物質であり、平成１７年に使用中止となっている。一般に、比較的温暖地域で発生する青枯病であるが、地球温暖化傾向が拍車をかけ、青枯病菌の蔓延と農作物生産低下により、既に世界的に年間９．５兆円程度の損失が生じている。

前述のように、青枯病は比較的温暖地域で発生する。しかし、米国では低温適応したrace３biovar２phylotype IIの青枯病菌株によるジャガイモの青枯れが既に大きな脅威となっており、日本への侵入も時間の問題とされている。そのため、青枯病菌を効果的に予防または防除等するための代替手段が日本だけでなく、世界レベルで開発、研究されている。

例えば、特許文献１には、ナス科植物の土壌病害防除方法が記載されている。具体的には、シュドモナス・ソラナシアラム（Pseudomonas solanacearum、現在の学名はRalstonia solanacearumであり青枯病菌と同意）菌株Ｍ４Ｓの生菌、および、当該菌と病原性のシュドモナス・ソラナシアラムとの両者を溶菌するバクテリオファージを固定化し、得られた固定化物を土壌に施用する方法が記載されている。また、特許文献２には、青枯病菌に対して溶菌性を示すバクテリオファージ自身を植物または土壌に散布する、青枯病菌の防除方法が記載されている。さらに、当該バクテリオファージを土壌に添加することによる土壌の改良方法も記載されている。

一方、特許文献３、および、非特許文献１ないし非特許文献３には、青枯病菌に特異的に感染するバクテリオファージについて詳細に記載されている。例えば、青枯病菌を溶菌しない特性を持っている、φＲＳＭ１型線状ファージ、φＲＳＭ３型線状ファージおよびφＲＳＳ１型線状ファージの詳細について記載されている。

特開昭６３−２２００５号公報 特開２００５−２７８５１３号公報 特開２０１１−０４１５２７号公報

Takashi Yamada, Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, Akiko Fujiwara, Shoji Usami and Makoto Fujie、2007、New bacteriophages that infect the phytopathogen Ralstonia solanacearum.、Microbology 153、2630-2639 Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, Akiko Fujiwara, Hideki Satsuma, Makoto Fujie, Shoji Usami, and Takashi Yamada、2007、Genomic Characterization of Filamentous Integrative Bacteriophages,φRSS1 and φRSM1, That Infect Ralstonia solanacearum.、J. Bacteriol 189、5792-5802 Askora A., Kwasaki T., Usami S., Fujie M., and Yamada T.、2009、Host recognition and integration of filamentous phage φRSM in the phytopathogen, Ralstonia solanacearum.、Virology 384、69-76

しかしながら、前述したように、青枯病に対する問題は近年深刻となっている為、race（分離宿主および宿主範囲）、biovar（生理型、酸の生産能の違い）およびphylotype（菌群）の異なる様々な青枯病菌株による青枯病の発症を予防および防除等できる、多様なワクチン的物質（先立って弱い病原体を注入することにより抗体を作り上げ、それ以降の同様の病原体による感染症にかかりにくくする物質）が必要である。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、異なる様々な青枯病菌株による青枯病の発症、すなわち異なる様々な植物品種での青枯病の発症を予防できる青枯病予防剤、および、当該青枯病予防剤を利用する青枯病の予防方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する為に、本発明者らが鋭意研究を行った結果、φＲＳＭ１型線状ファージ（Ralstonia phage RSM1、ＤＤＢＪにおけるアクセッション番号ＡＢ２５９１２３）（以下、φＲＳＭ１ファージ）、または、φＲＳＭ３型線状ファージ（Ralstonia phage RSM3、ＤＤＢＪにおけるアクセッション番号ＡＢ４３４７１１）（以下、φＲＳＭ３ファージ）が感染した青枯病菌は、その病原性を失いトマト等の植物に接種しても青枯病を発症しないことを発見した（φＲＳＭ１ファージは微生物の識別の表示：φＲＳＭ１／Ｍ４Ｓ、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８５として、φＲＳＭ３ファージは微生物の識別の表示：φＲＳＭ３／１０６６０３、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１０８６として、いずれも青枯病菌に両ファージが感染した状態で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている（いずれも受領日は２０１１年４月１９日））。また、これらのファージを感染させた青枯病菌をトマト等の植物に予め接種しておくと、その後に強病原性を有する青枯病菌を接種しても、強い抵抗性を示し、少なくとも２ヶ月間以上青枯病を発症しないことも発見した。

さらに、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージは、青枯病菌株の宿主特異性が相互に大きく異なる為、これら２つのファージを用いることで、race、biovarおよびphylotypeが異なる計１５菌株の青枯病菌株による青枯病の発症を予防可能であることを発見した。つまり、自然界における様々な青枯病菌株は、φＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージのいずれかのファージに感染する可能性が高いと予想されるということを発見した。図１は、本発明に係るφＲＳＭ型線状ファージの宿主特異性を示す図である。図１において、＋は各々の菌株に対する感受性を示し、−は非感受性を示す。φＲＳＳ１ファージ（Ralstonia phage RSS1、ＤＤＢＪにおけるアクセッション番号ＡＢ２５９１２４）は比較対照であり、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージと同様に、青枯病菌をホストとするが、溶菌しない特性を持っている（非特許文献２参照）。しかし、φＲＳＳ１ファージは、φＲＳＭ１ファージとφＲＳＭ３ファージとの感受性の組み合わせのように相互に多くの青枯病菌株に感染できなかった。図２は、種々の青枯病菌株の特性を示す図である。図２に示す詳細については、「堀田光生・土屋健一、２００２、微生物遺伝資源利用マニュアル（１２）−青枯病菌 Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所」、を参照されたい。

そこで、本発明の第１の態様に係る青枯病予防剤は、φＲＳＭ１型線状ファージおよび／またはφＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を有効成分とすることを特徴とする。

好ましくは、前記φＲＳＭ１型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌株は、Ｍ４Ｓ、Ｐｓ２９、Ｐｓ６５またはＰｓ７４のいずれかであることを特徴とする。

より好ましくは、前記φＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌株は、Ｃ３１９、Ｐｓ７２またはＰｓ７４のいずれかであることを特徴とする。

本発明の第２の態様に係る青枯病の予防方法は、第１の態様に係る青枯病予防剤を植物に接種する工程を含むことを特徴とする。

好ましくは、前記植物は、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス、タバコ、トウガラシ、シソ、ダイコン、イチゴ、バナナ、マーガレット、キクまたはヒマワリのいずれかであることを特徴とする。

より好ましくは、前記植物は、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナスまたはタバコのいずれかであることを特徴とする。

また、好ましくは、前記青枯病の予防方法は、植物個体重量あたり前記青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を１０^５〜１０^８cells／ｇ接種することを特徴とする。

より好ましくは、前記青枯病の予防方法は、植物個体重量あたり前記青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を１０^６〜１０^７cells／ｇ接種することを特徴とする。

また、好ましくは、前記青枯病予防剤は、前記植物の茎に接種することを特徴とする。

より好ましくは、前記青枯病予防剤は、前記植物の茎の地上部１〜４ｃｍの位置に接種することを特徴とする。

さらに好ましくは、前記青枯病予防剤は、前記植物の発芽後２〜４週間の時期に接種することを特徴とする。

本発明によれば、異なる様々な青枯病菌株による青枯病の発症、すなわち異なる様々な植物品種での青枯病の発症を予防できる青枯病予防剤、および、当該青枯病予防剤を利用する青枯病の予防方法が提供される。

本発明に係るφＲＳＭ型線状ファージの宿主特異性を示す図である。 種々の青枯病菌株の特性を示す図である。 φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧ液体培地での培養後の様子を示す図である。 φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のコロニーの形態を示す図である。 φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３および未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の詳細な特性を示す図である。 実施例１に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の病原性の確認実験結果を示す図である。発芽１〜６週間後のトマト苗の地上２−３本葉間に１０^６〜１０^７cellsを接種した場合、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３は接種トマトの生育に影響しないが（左）、ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３は４日〜１週間後に接種上部を完全に枯死させた（右）。各５例ずつに対して１００％の再現性があった。 実施例２−１に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、１日後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。発芽１０日後のトマト苗第１本葉下に、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３または対照とする大腸菌を１０^６〜１０^７cells１次接種し、１日後、接種部から５ｍｍ上部に青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を１０^６〜１０^７cells２次接種した場合、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の１次接種トマトは健全に生長したが（左）、対照の大腸菌１次接種トマトは４日〜１週間後に完全枯死した（右）。各３例ずつに対して１００％の再現性があった。 実施例２−２に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、２週間後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。実験例２−１と同様に１次処理したトマト苗に対して、２週間後、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を１０^６〜１０^７cells２次接種した場合、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の１次接種トマトは健全に生長したが（左）、対照の大腸菌１次接種トマトは４日〜１週間後に完全枯死した（右）。各３例ずつに対して１００％の再現性があった。 実施例２−３に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、２ヶ月後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。実験例２−１と同様に１次処理したトマト苗に対して、２ヶ月後、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を１０^６〜１０^７cells２次接種した場合、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の１次接種トマトは健全に生長したが（左）、対照の大腸菌１次接種トマトは４日〜１週間後に接種部位の上部の葉が青枯れした（右）。各５例ずつに対して１００％の再現性があった。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。

（青枯病予防剤）
本発明の実施の形態１は、φＲＳＭ１ファージおよび／またはφＲＳＭ３ファージが感染している青枯病菌を有効成分とする、青枯病予防剤に関する。なお、φＲＳＭ１ファージとφＲＳＭ３ファージとは、９０％以上のＤＮＡ塩基配列相同性を有し、その大きな相違点は宿主認識タンパク質ｐＩＩＩの構造にある。前述したＤＤＢＪまたはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）等のゲノムデータベース上には、これらのファージ（φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージ）と高い相同性を示すファージ、プロファージが検出される。従って、これらのファージとゲノム配列上９０％以上の相同性を示すものについては、同一系統の特性を有するファージであることが示唆される。また、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージのその他の詳細な特性については、前述したように、特許文献３および非特許文献１ないし非特許文献３を参照されたい。

本明細書において、「青枯病（立枯病）」とは、前述したように、ナス科植物またはマメ科植物等をはじめ２００種以上の植物に感染し、枯死させる農業上深刻な被害をもたらす病害を意味する。従って、本明細書において「青枯病予防剤」とは、このような青枯病の病徴および病害等を予防、防止または発症を遅らせることができる、青枯病のワクチン的組成物であればどのようなものでも構わない。また、本実施の形態１に係る青枯病予防剤は、有効成分であるファージに感染した青枯病菌以外にも、一般に薬学、植物学的に許容される他の物質・組成物等を含有していても構わない。

φＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージの青枯病菌への感染方法は、当該技術分野において公知であるどの方法を用いても構わない。例えば、ＣＰＧ液体培地にて培養した青枯病菌の培養液に、溶原タイプの各ファージが感染している青枯病菌株から分離、精製さらに繁殖させたφＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージを、図１および図２を参照に適当な青枯病菌株に添加、培養し、増殖させる方法を用いてもよい（非特許文献１ないし非特許文献３参照）。φＲＳＭ１ファージの溶原タイプは青枯病菌株ＭＡＦＦ２１１２７０、Ｐｓ２９またはＰｓ７４等が挙げられ、φＲＳＭ３ファージの溶原タイプはＭＡＦＦ１０６６１１、ＭＡＦＦ２１１２７２またはＭＡＦＦ７３０１３９等が挙げられる。

本実施の形態１における「φＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージ（のいずれか）が感染している青枯病菌を有効成分とする青枯病予防剤」について詳細に説明する。青枯病予防剤の有効成分がφＲＳＭ１ファージが感染している青枯病菌の場合、当該青枯病菌株はφＲＳＭ１ファージが感染しうる青枯病菌株であれば、何れの菌株でも構わない。また、青枯病予防剤の有効成分がφＲＳＭ３ファージが感染している青枯病菌の場合も、当該青枯病菌株はφＲＳＭ３ファージが感染しうる青枯病菌株であれば、何れの菌株でも構わない。それぞれのファージが感染しうる青枯病菌株は、図１、および、「堀田光生・土屋健一、２００２、微生物遺伝資源利用マニュアル（１２）−青枯病菌 Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所」、を参照されたい。

具体的には、例えば、φＲＳＭ１ファージを感染させる青枯病菌株は、Ｍ４Ｓ、Ｐｓ２９、Ｐｓ６５、Ｐｓ７４、ＭＡＦＦ２１１２７０またはＭＡＦＦ７３０１３８等を挙げることができる。また、φＲＳＭ３ファージを感染させる青枯病菌株は、例えば、Ｃ３１９、Ｐｓ７２、Ｐｓ７４、ＭＡＦＦ１０６６０３、ＭＡＦＦ１０６６１１、ＭＡＦＦ２１１２７０、ＭＡＦＦ２１１２７１、ＭＡＦＦ２１１２７２、ＭＡＦＦ３０１５５６、ＭＡＦＦ３０１５５８またはＭＡＦＦ７３０１３９等を挙げることができる。

図１からわかるように、これら２つのファージを用いることで、race、biovarおよびphylotypeのそれぞれ異なる計１５菌株の青枯病菌株へ感染させることができる。ここで、race、biovarおよびphylotypeが異なる様々な青枯病菌株は、異なる様々な植物品種に対し青枯病を発症させる。すなわち、これら２つのファージを用いた本実施の形態１に係る青枯病予防剤（ファージワクチン）を適切に組み合わせて用いると、異なる様々な青枯病菌株による青枯病の発症、すなわち異なる様々な植物品種での青枯病の発症を予防することが可能となる。

本実施の形態１における「φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージ（のいずれも）が感染している青枯病菌を有効成分とする青枯病予防剤」については、例えば、図１に示すＭＡＦＦ２１１２７０については、いずれのファージに対しても宿主特異性を有している為、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージのいずれものファージが感染している青枯病菌を有効成分とする青枯病予防剤もあり得る為である。また、複数の種類の青枯病菌株を有効成分とした、青枯病予防剤であっても構わない為である。

ここで、ファージ感染青枯病菌株とファージ未感染青枯病菌株との差異について、具体例を挙げて詳細に述べておく。図３は、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧ液体培地での培養後の様子を示す図である。図３において、左（Uninfected cells）はφＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３培養液であり、中央（φＲＳＭ３−infected cells）はφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３培養液であり、いずれも後期対数増殖期においてＣＰＧ液体培地で振とう培養後、２時間立たせておいた状態を示している。右（ＣＰＧ）は青枯病菌を含まないＣＰＧ液体培地のみの様子を示している。図３に示すように、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３培養液は容易に沈殿するが、φＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３培養液は懸濁したままである。

図４は、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のコロニーの形態を示す図である。図４において、左上（Uninfected cells、ＣＰＧ）はφＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧプレート上のコロニーであり、右上（φＲＳＭ３−infected cells、ＣＰＧ）はφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧプレート上のコロニーであり、左下（Uninfected cells、ＭＭ）はφＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＭＭ（最小培地）プレート上のコロニーであり、右下（φＲＳＭ３−infected cells、ＭＭ）はφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＭＭプレート上のコロニーである。図４に示すように、φＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧプレート上のコロニーは、縁が粗くなっており不規則な形状をしている。しかし、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のＣＰＧプレート上のコロニーは、φＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のコロニーよりも小さく、丸い形状をしている。ＭＭプレートにおいても同様に、φＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のコロニーよりも、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３のコロニーの方が相当小さくなっている。

このように、φＲＳＭ３ファージを青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３に感染させることにより、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の形態および特徴が大きく異なる。図５は、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３および未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の詳細な特性を示す図である。

（青枯病の予防方法）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１の青枯病予防剤を植物に接種する、青枯病の予防方法に関する。

本明細書において「植物」とは、青枯病（立枯病）を発症しうる当該技術分野において公知である全ての植物を含む。例えば、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス、タバコ、トウガラシ、シソ、ダイコン、イチゴ、バナナ、マーガレット、キクまたはヒマワリ等を挙げることができる。このうち、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナスまたはタバコのいずれかが好ましい。本明細書において「接種」とは、植物の茎等に注射針を用いての注入、または爪楊枝の先端部に青枯病予防剤を付着させ茎に刺して注入等、当該分野において一般的に使用される植物体への接種の意と同様である。

なお、「青枯病予防剤を植物に接種する」とは、前述の実施の形態１に係る青枯病予防剤を、適切な植物品種に接種することを意味する。すなわち、race（宿主範囲）等が適したファージ感染青枯病菌株を有効成分としている青枯病予防剤を接種することを意味する。

青枯病予防剤を接種する場所については、植物の茎が好ましく、植物の茎の地上部（地際部）１〜４ｃｍの位置がより好ましく、植物の茎の地上部２〜３ｃｍの位置が最も好ましい。また、青枯病予防剤の接種量については、各々の植物の種類、品種によって適当な量を接種すればよい。例えば、１０^５〜１０^８cells、好ましくは１０^６〜１０^７cellsまたは最も好ましくは１０^６cells程度のφＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌を、グラム（ｇ）あたりの植物個体重量につき接種するよう青枯病予防剤の濃度を調整すればよい。さらに、青枯病予防剤を接種する時期については、各々の植物の成長および前述の接種場所に合わせ、適当な時期において接種すればよい。例えば、植物の発芽後１〜５週間、好ましくは発芽後２〜４週間程度の時期の接種が挙げられる。

このような方法において、前述の実施の形態１の青枯病予防剤を植物に接種しておくと、青枯病菌に対して２ヶ月以上抵抗性を持つようになる。これは、菌株の異なる強病原性の青枯病菌に対しても同様の抵抗性を持つ（実施例２（２−１、２−２および２−３）参照）。

以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、調製例および実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の調整例および実施例における詳細な条件等については、「堀田光生・土屋健一、２００２、微生物遺伝資源利用マニュアル（１２）−青枯病菌 Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所」、に記載の方法に基づいて実施した。

（調製例）
青枯病菌および両ファージに対する調製例について簡単に述べる。各ファージを感染させる前の種々の青枯病菌株（全て独立行政法人農業生物資源研究所（日本）から入手）は、０．１％のカザミノ酸、１％のペプトンおよび０．５％のグルコースを含む蒸留水からなるＣＰＧ液体培地で、２８℃、２００〜３００ｒｐｍにおいて振とう培養をして調製した。ファージについては、φＲＳＭ３ファージは宿主菌である青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６１１で繁殖させ、φＲＳＭ１ファージは宿主菌である青枯病菌株Ｍ４Ｓで繁殖させた。詳細には、ＣＰＧ培養液で増殖させた両宿主菌（初期対数増殖期、ＯＤ_６００＝０．１）に、ＭＯＩ＝０．０１〜０．０５となるよう各ファージを添加し、１６〜１８時間培養後、細菌細胞を遠心分離で除去し（８，０００×ｇ）、上澄みをフィルター膜（０．２μｍ）に通し、０．５ＭＮａＣｌおよび５％ポリエチレングリコール６０００で処理し、沈殿したファージ粒子を遠心分離（１５，００×ｇ、３０分間、４℃）により調製した。これにより、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージは１０^１２ＰＦＵ/／ｍｌの収率で回収することができる。両ファージは低温（４℃）で安定して保存可能である。なお、詳細については特許文献３、および、非特許文献１ないし非特許文献３を参照されたい。

（実施例１）
本実施例１では、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の病原性の確認実験について詳細に説明する。

調整したφＲＳＭ３ファージを青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３に感染させておき（ＭＯＩ＝１０）、０．１％カザミノ酸、１％ペプトン、０．５％グルコースおよび１．７％寒天を含む蒸留水からなるＣＰＧ寒天培地（ｐＨ６．８〜７．０）上で感染単一コロニーを選抜した（制限酵素処理によって確認）。当該コロニーを、０．１％カザミノ酸、１％ペプトンおよび０．５％のグルコースを含む蒸留水からなるＣＰＧ液体培地で、２８℃においてＯＤ_６００＝０．２まで振とう培養した。その後、培養液５μｌを、発芽後１〜６週間のトマト（サターン）の第２本葉−第３本葉間に滅菌注射器を用いて接種した。対照としてφＲＳＭ３ファージを感染させていない青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３も、同条件においてトマト（サターン）に接種した。それぞれ各５株ずつこのような接種の処置を行ったトマトを、人工気象器（２８℃、明１６時間・暗８時間）内において栽培した。

図６は、実施例１に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の病原性の確認実験結果を示す図である。図６に示すように、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマト（左）は青枯病を発症しなかった。同様の処置を行った他の４株のトマトについても全て健全な生育を示し、接種２ヶ月後でも全く青枯病の病徴は見られなかった（図示せず）。一方、図６に示すように、対照としたφＲＳＭ３ファージ未感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマト（右）は、全て接種後４日〜１週間以内に青枯病の病徴を示し、接種部位上部の茎／葉は枯死した。本実施例１の結果から、φＲＳＭ３ファージを感染させた青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３はトマトに対し病原性を示さないということが確認された。

（実施例２）
本実施例２では、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３で処理を行ったトマトにおける、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３に対する抵抗性実験について詳細に説明する。

まず、前述の実施例１と同様に、調整したφＲＳＭ３ファージを青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３に感染させておき（ＭＯＩ＝１０）、０．１％カザミノ酸、１％ペプトン、０．５％グルコースおよび１．７％寒天を含む蒸留水からなるＣＰＧ寒天培地（ｐＨ６．８〜７．０）上で感染単一コロニーを選抜した（制限酵素処理によって確認）。次に、当該コロニーを、０．１％カザミノ酸、１％ペプトンおよび０．５％のグルコースを含む蒸留水からなるＣＰＧ液体培地で、２８℃においてＯＤ_６００＝０．２まで振とう培養した。その後、培養液５μｌを、発芽後１．５週間のトマト（サターン）の茎（地上部２〜３ｃｍ）に滅菌注射器を用いて接種した。なお、対照として大腸菌ＪＭ１０９を、同条件においてトマト（サターン）に接種した。それぞれ各３株ずつこのように接種の処置を行ったトマト（サターン）を、人工気象器（２８℃、明１６時間・暗８時間）内において栽培した。

（実施例２−１）
本実施例２−１では、前述の接種の処置を行ったそれぞれ各３株のトマト（サターン）に対し、接種１日後に、φＲＳＭ３ファージを感染させていない強病原性である青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を、前述と同様の方法において接種（地上部３〜４ｃｍ）した場合について述べる。

図７は、実施例２−１に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、１日後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。図７に示すように、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトへ青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種（２次接種）しても青枯病を発症しなかった（左）。なお、この結果は何れのφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトの株についても同様であり、その後の発病も見られなかった。一方、図７に示すように、比較対照とした大腸菌ＪＭ１０９を接種したトマトは、全て２次接種後２〜３日で青枯病の病徴を示し４日〜１週間後枯死した（右）。本実施例２−１の結果から、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトは、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種（１日後）に対して抵抗性を示すということが確認された。

（実施例２−２）
本実施例２−２では、前述の接種の処置を行ったそれぞれ各３株のトマトに対し、接種２週間後に、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を前述と同様の方法において接種（地上部４〜５ｃｍ）した場合について述べる。

図８は、実施例２−２に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、２週間後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。図８に示すように、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトへ２次接種を行っても、何れの株も健全でありその後の発症もなかった（左）。一方、図８に示すように、比較対照とした大腸菌ＪＭ１０９を接種したトマトは、全て２次接種後２〜３日で青枯病の病徴を示し４日〜１週間後に枯死した（右）。本実施例２−２の結果から、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトは、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種（２週間後）に対してでも抵抗性を示すということが確認された。

（実施例２−３）
本実施例２−３では、前述の接種の処置を行ったそれぞれ各５株のトマトに対し、接種２ヶ月後に、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を前述と同様の方法において接種（地上部８〜１０ｃｍ）した場合について述べる。

図９は、実施例２−３に係るφＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３での処理における、２ヶ月後の青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種に対する抵抗性実験結果を示す図である。図９に示すように、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトへ２次接種を行っても、何れの株も健全でありその後の発症もなかった（左）。一方、図９に示すように、対照とした大腸菌ＪＭ１０９を接種したトマトは、全て２次接種後４日〜１週間で青枯病の病徴を示した（右）。本実施例２−３の結果から、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を接種したトマトは、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３の２次接種（２ヶ月後）に対してでも抵抗性を示すということが確認された。

さらに、前述の実施例２（２−１、２−２および２−３）と同様の方法・条件を用い、φＲＳＭ１ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ２１１２７０、φＲＳＭ３ファージ感染青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６１１で処理を行ったトマトに、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を用いて２次接種を行った場合、全く同じ抵抗性結果が確認できた（図示せず）。これは、異なる組み合わせのファージ感染青枯病菌株を接種した場合であっても、２次接種に対する抵抗性の効果は変わらないということを示している。すなわち、φＲＳＭ型線状ファージを感染させた青枯病各株を、それぞれ適当な農作物または園芸用植物等に接種することによって、青枯病菌による感染を長期（少なくとも２ヶ月以上）にわたり予防することができることが示唆される。

また、本発明者らは、φＲＳＭ１ファージの宿主認識タンパク質をφＲＳＭ３ファージ型に組み換えたＲＳＭファージは、φＲＳＭ３ファージと同様の宿主特異性を示すようになることも発見している。すなわち、φＲＳＭ１ファージ型の宿主認識タンパク質を有するＲＳＭファージ、および／または、φＲＳＭ３ファージ型の宿主認識タンパク質を有するＲＳＭファージが感染している青枯病菌を有効成分とすることでも、各々適当な農作物または園芸用植物等に対する青枯病予防剤となることが示唆される。なお、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージの宿主認識タンパク質の詳細については、非特許文献３を参照されたい。

本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明者らは、φＲＳＭ１ファージまたはφＲＳＭ３ファージの感染した青枯病菌は、その病原性を失いトマト等の植物に接種しても青枯病を発症しないことと、これらのファージを感染させた青枯病菌をトマト等の植物に接種しておくと、その後に青枯病菌を接種しても、強い抵抗性を示し、少なくとも２ヶ月間以上青枯病を発症しないことを発見した。さらに、φＲＳＭ１ファージおよびφＲＳＭ３ファージは、宿主特異性が相互に大きく異なる為、これら２つのファージを用いることで、race、biovarおよびphylotypeの異なる計１５菌株の青枯病の予防ワクチン的使用が可能であることを発見し、自然界におけるほとんどの青枯病菌株がこれら２つのファージに感染可能であることが予想される。

そこで、本発明によれば、異なる様々な青枯病菌株による青枯病の発症、すなわち異なる様々な植物品種での青枯病の発症を予防できる青枯病予防剤、および当該青枯病予防剤を利用する青枯病の予防方法が提供される。具体的には、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナスおよびタバコ等の主要農作物、ならびに各種園芸作物の苗（圃場および花壇等移動前ポットレベル）を本発明の技術で処理することにより、移植後の青枯病の発症を大幅に予防することができる。この結果は、世界規模で年間９．５兆円の損失と見積もられている青枯病の被害の予防、ならびに化学農薬使用による環境複合汚染および残留農薬問題等の回避に繋がる。

Claims (11)

1. φＲＳＭ１型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）およびφＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を有効成分とすることを特徴とする、青枯病予防剤。
2. 前記φＲＳＭ１型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌株は、Ｍ４Ｓ、Ｐｓ２９、Ｐｓ６５またはＰｓ７４のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の青枯病予防剤。
3. 前記φＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌株は、Ｃ３１９、Ｐｓ７２またはＰｓ７４のいずれかであることを特徴とする、請求項１または２に記載の青枯病予防剤。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の青枯病予防剤を植物に接種する工程を含むことを特徴とする、青枯病の予防方法。
5. 前記植物は、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス、タバコ、トウガラシ、シソ、ダイコン、イチゴ、バナナ、マーガレット、キクまたはヒマワリのいずれかであることを特徴とする、請求項４に記載の青枯病の予防方法。
6. 前記植物は、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナスまたはタバコのいずれかであることを特徴とする、請求項５に記載の青枯病の予防方法。
7. 前記青枯病の予防方法は、植物個体重量あたり前記φＲＳＭ１型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）およびφＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を１０^５〜１０^８cells／ｇ接種することを特徴とする、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の青枯病の予防方法。
8. 前記青枯病の予防方法は、植物個体重量あたり前記φＲＳＭ１型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）およびφＲＳＭ３型線状ファージが感染している青枯病菌（Ralstonia solanacearum）を１０^６〜１０^７cells／ｇ接種することを特徴とする、請求項７に記載の青枯病の予防方法。
9. 前記青枯病予防剤は、前記植物の茎に接種することを特徴とする、請求項４ないし８のいずれか１項に記載の青枯病の予防方法。
10. 前記青枯病予防剤は、前記植物の茎の地上部１〜４ｃｍの位置に接種することを特徴とする、請求項９に記載の青枯病の予防方法。
11. 前記青枯病予防剤は、前記植物の発芽後２〜４週間の時期に接種することを特徴とする、請求項４ないし１０のいずれか１項に記載の青枯病の予防方法。