JP5824568B2 - Ｄダイマー測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、フィブリンの分解産物であるＤダイマーの測定方法に関する。

臨床検査、特に血液凝固線溶検査の分野では、Ｄダイマーを測定することが知られている。Ｄダイマーは血液凝固分子マーカーの１つであり、Ｄダイマーの測定は、凝固・線溶系を亢進する各種血栓症やＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）の診断及びそれらの病態把握や治療効果判定などの指標を得るために重要である。

Ｄダイマーを測定する方法としては種々の方法が知られており、Ｄダイマー測定用試薬も販売されている。特許文献１〜５には、１種類のモノクローナル抗体を担体粒子に感作したＤダイマー測定用試薬が記載されている。

また、深部静脈血栓症の除外診断においては、Ｄダイマー濃度の測定が有用であることが知られている（特許文献６及び７参照）。Ｄダイマー濃度にカットオフ値を設定し、被験者のＤダイマー濃度がカットオフ値を下回る場合、該被験者は深部静脈血栓症ではないと判断できる。したがって、被験者が深部静脈血栓症であるか否かを正確に判断するためには、Ｄダイマーの低濃度域において高い測定感度が要求される。

従来は、Ｄダイマーの測定感度を向上させる目的で、測定用試薬中のＤダイマーに対する抗体の濃度を高めたり、増感剤を試薬に添加したりしていた。しかし、これらの方法ではバックグラウンドが増加し、反応液に粘度や発泡が生じるという問題があった。

特公平７−４６１０４号公報 特開２０００−１９３６６３号公報 特開２００６−１０５６３３号公報 特開２００６−２３４６７６号公報 特許第３８５７４６８号公報 特許第４１８１４５９号公報 特表２００９−５３６３３１号公報

本発明は、測定用試薬中のＤダイマーに対する抗体の濃度を高めたり、増感剤を試薬に添加したりすることなく、低濃度域においても高感度にＤダイマーを測定できる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、Ｄダイマーに反応するが、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体を含む試薬を用いることにより、１種類の抗体を感作した従来の試薬よりもＤダイマーの検出感度が向上し、低濃度域においてもＤダイマーを測定できることを見出して、本発明を完成した。

すなわち、本発明によれば、生体試料と、Ｄダイマーに反応するがＤダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬とを混合する工程と、混合物中で抗原抗体反応により生じる、Ｄダイマーと担体粒子との凝集の度合いを測定する工程とを含み、上記第１のモノクローナル抗体がＸ画分、Ｙ画分及びＤダイマーとは反応するが、Ｄ画分及びＥ画分とは反応せず、上記第２のモノクローナル抗体がＤダイマーとは反応するが、Ｘ画分、Ｙ画分及びＥ画分とは反応しない、Ｄダイマー測定方法が提供される。

本発明の測定方法によれば、従来のＤダイマー測定用試薬では測定困難であった低濃度域においても試料中のＤダイマーを高感度に測定することが可能となる。

DD-M1653抗体、DD-M1039抗体及びDD-M46抗体のフィブリン／フィブリノゲン分解産物に対する反応性の違いを示すグラフである。 実施例１〜３並びに比較例１及び２の各第２試薬を用いてＤダイマー標準品を測定した場合の波長800 nmにおける１分間あたりの吸光度変化量を示すグラフである。 実施例４〜６並びに比較例３及び４の各第２試薬を用いてＤダイマー標準品を測定した場合の波長800 nmにおける１分間あたりの吸光度変化量を示すグラフである。

本発明は、Ｄダイマーに反応するが、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体を含むＤダイマー測定用試薬（以下、本発明の試薬ともいう）である。

本明細書において「Ｄダイマー」とは、トロンビンなどの酵素の作用により血液中のフィブリノゲンが凝固されて形成されるポリマーである安定化フィブリンが、プラスミンなどの酵素によって分解されて生じるフィブリン分解産物である。
なお、Ｄダイマーは当該技術において、ＤＤ／Ｅ画分又はＤＤ／Ｅ画分の多量体の総称としても知られている。「ＤＤ／Ｅ画分の多量体」としては、ＤＤ／Ｅ画分の３量体であるＤＸＤ／ＹＹ画分、ＤＤ／Ｅ画分の５量体であるＹＸＹ／ＤＸＸＤ画分、ＤＤ／Ｅ画分の７量体であるＤＸＸＤ／ＹＸＸＹ画分などが知られている。また、当該技術においては、ＤダイマーとＤＤ／Ｅ画分の多量体とを合わせて「ＸＤＰ画分」とも総称される。

プラスミンなどの酵素は、血液中に存在するフィブリノゲンも分解することが当該技術において知られている。フィブリノゲンがプラスミンなどの酵素によって分解されると、ＤＤ／Ｅ画分の構成要素であるＤ画分、Ｅ画分、Ｘ画分、Ｙ画分のようなフィブリノゲン分解産物が生じる。そのため、血栓症患者の血液中には、安定化フィブリンが分解されて生じるＤダイマーとフィブリノゲンが分解されて生じるフィブリノゲン分解産物とが混在する。

本明細書において「Ｄダイマーの高分子画分」とは、安定化フィブリンをプラスミンなどの酵素により短時間分解させて得られるフィブリン分解産物である。そのようなＤダイマーの高分子画分としては、例えば安定化フィブリンをプラスミンによって0.25〜４時間、好ましくは0.25〜２時間分解させることにより得られるフィブリン分解産物が挙げられる。
本明細書において「Ｄダイマーの低分子画分」とは、安定化フィブリンをプラスミンなどの酵素により長時間分解させて得られるフィブリン分解産物である。そのようなＤダイマーの低分子画分としては、例えば安定化フィブリンをプラスミンによって10〜30時間、好ましくは15〜25時間分解させることにより得られるフィブリン分解産物が挙げられる。

本発明の試薬に用いられる抗体は、Ｄダイマーと反応するが、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる２種類のモノクローナル抗体であれば特に限定されない。以下、該２種類のモノクローナル抗体について、一方を「第１のモノクローナル抗体」と称し、他方を「第２のモノクローナル抗体」と称する。そのような抗体としては、Ｄダイマーの高分子画分及び低分子画分と反応する第１のモノクローナル抗体と、該高分子画分とは反応するが、該低分子画分との反応性が該第１のモノクローナル抗体とは反応性が異なる第２のモノクローナル抗体が好ましい。

本発明の試薬に用いられる第１のモノクローナル抗体は、Ｘ画分、Ｙ画分及びＤダイマーとは反応するが、Ｄ画分及びＥ画分とは反応しない抗体がより好ましい。
本発明の試薬に用いられる第２のモノクローナル抗体は、Ｄダイマーとは反応するが、Ｘ画分、Ｙ画分及びＥ画分とは反応しない抗体がより好ましい。そのような第２のモノクローナル抗体は、Ｄ画分と反応する抗体であってもよいし、Ｄ画分と反応しない抗体であってもよい。

上記の第１及び第２モノクローナル抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどのいずれの哺乳動物に由来するものであってもよいが、それらの中でもマウスが好ましい。また、抗体のアイソタイプはIgG、IgM、IgE、IgAなどのいずれであってもよい。抗体は、抗体のフラグメント及びその誘導体を含む。具体例としては、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント等が挙げられる。

上記の第１及び第２モノクローナル抗体は、当該技術において公知の免疫学的手法により得ることができる。すなわち、抗原としてのＤダイマーとアジュバントとを任意に混合して動物を免疫し、該動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することによりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

具体的には、以下の方法により本発明の試薬に用いられる第１及び第２のモノクローナル抗体を得ることができる。
（抗原の取得）
抗原として用いるＤダイマーは、プラスミンのようなフィブリンを分解できる酵素をフィブリンに作用させて得ることができる。該Ｄダイマーは、ＤＤ／Ｅ画分より大きい分子量の画分を含むものが好ましい。このようなものとしては、ＤＤ／Ｅ画分の２〜５量体が挙げられる。また、Ｄダイマーのアミノ酸配列に基づいて、当該技術において公知の遺伝子工学的手法により得られる組み換え型のＤダイマーを抗原として用いてもよい。
Ｄダイマーの原料となるフィブリンは市販のものを用いてもよいし、フィブリノゲンにトロンビン、第ＸＩＩＩ因子及びカルシウム塩を作用させて得られるものを用いてもよい。

（免疫方法）
上記のようにして得られる抗原を、アジュバントと任意に混合し、適当な緩衝液に溶解又は懸濁して得られる抗原液で、動物を免疫することができる。該抗原液中の抗原の濃度は、50〜500μg/ml程度が好ましい。抗原の免疫原性が低い場合は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアータンパク質を任意に抗原と結合させてもよい。

アジュバントとしては、当該技術において公知のアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、Ribi（MPL）、Ribi（TDM）、Ribi（MPL + TDM）、百日咳ワクチン（Bordetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチド（MPD）、アルミニウムアジュバント（ALUM）及びこれらの組み合わせが挙げられる。初回免疫時にFCAを用い、追加免疫時にFIAやRibiアジュバントを用いる組み合わせが特に好ましい。

免疫にする動物はマウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどのいずれであってもよく、好ましくはマウス、より好ましくはBALB/cマウスである。
免疫法は、使用する抗原の種類やアジュバントの有無により適宜選択することができる。例えばマウスを用いる場合、アジュバント混合抗原液0.05〜１ml（抗原10〜200μg）を腹腔内、皮下、筋肉内又は尾静脈内に注射し、初回免疫から約４〜21日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することにより、抗原液にアジュバントを用いずに免疫を行ってもよい。追加免疫の約５〜10日後に血液を採取して抗体価を測定する。抗体価は、後述する抗体価アッセイのような当該技術において公知の方法にしたがって測定できる。最終免疫から約３〜５日後に、免疫された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。

（モノクローナル抗体の作製）
モノクローナル抗体は、当該技術において公知の方法、例えばKohler及びMilstein, Nature, 256, 495-497 (1975)に記載の方法にしたがって作製できる。
用いる骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒトなどいずれに由来するものであってもよく、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が挙げられる。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生するものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14などを用いるのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来のものが好ましい。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコール（PEG）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。PEGを用いる場合、約30〜60％のPEG（平均分子量1000〜6000）を含む適当な培地又は緩衝液中に脾臓細胞と骨髄腫細胞とを１〜10：１、好ましくは５〜10：１の混合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH６〜８の条件下で約30秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄し、PEG含有溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート上に播種して培養する。

上記のようにして融合させた細胞を選択培地上で培養して、ハイブリドーマの選択を行うことができる。選択培地としては、融合細胞のみが増殖し得る培地であればよく、例えば、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HAT）培地が用いられる。ハイブリドーマの選択は、通常、細胞融合の１〜７日後に培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換し、さらに２〜３日毎に同様にして培地交換を繰り返しながら培養し、培養終了後、顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウェルを選択することにより行うことができる。

このようにして得られたハイブリドーマが所望の抗体を産生しているか否かは、そのハイブリドーマの培養上清を採取して、抗体価アッセイを行うことにより確認できる。抗体価アッセイは当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば固相に固定化した抗原タンパク質に段階希釈した培養上清を添加し、さらに蛍光物質、酵素又は放射性同位体（RI）で標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体など）を反応させることにより抗体を検出できる。

上記の抗体価アッセイにより所望の抗体を産生していることが確認されたハイブリドーマは、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などにより、単一クローンを分離できる。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウェル程度となるように培地で段階希釈して培養することにより、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを単離できる。

ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、モノクローナル抗体の必要量やハイブリドーマの性状により適宜選択できる。例えば該ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが挙げられる。マウスの腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数mg/mlの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマの場合には、細胞培養の培養上清からモノクローナル抗体を取得できる。この場合、抗体産生量は低いが、免疫グロブリンや他の夾雑物の混入が少ないので精製が容易である。

ハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から抗体を取得する場合、例えばプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）のような免疫抑制作用を有する物質を予め投与したBALB/cマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約10⁶個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマを移植する場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスなどを用いるのが好ましい。

細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば細胞維持に用いられる静置培養の他に、高密度培養法又はスピナーフラスコ培養法などによりハイブリドーマを培養して、抗体を含有する培養上清を得ることができる。培地に血清を添加すると、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれることとなり、抗体の精製が煩雑になることが多いので、培地への血清の添加量は可能な限り少なくするのが好ましい。ハイブリドーマを慣用される方法により無血清培地に馴化させ、無血清培地で培養することがさらに好ましい。これにより、抗体精製が容易になる。

腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知の方法により行うことができ、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いる塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、DEAEイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などに基づく方法により行うことができる。

目的のモノクローナル抗体がマウスIgGである場合、プロテインＡ結合担体又は抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法を用いて抗体を精製できる。

本発明の試薬に用いられる第１のモノクローナル抗体としては、例えば受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６８７として独立行政法人産業技術総合研究所に平成１６年２月１７日付けで寄託されたハイブリドーマにより産生されるマウス抗体（以下、「DD-M1653抗体」ともいう）が挙げられる。
本発明の試薬に用いられる第２のモノクローナル抗体としては、例えば受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９６８及びＮＩＴＥ Ｐ−９６９として独立行政法人製品評価技術基盤機構に平成２２年７月２３日付けでそれぞれ寄託された各ハイブリドーマにより産生されるマウス抗体（以下、それぞれ「DD-M1039抗体」及び「DD-M46抗体」ともいう）が挙げられる。

本発明のＤダイマー測定用試薬における、第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体との濃度比は特に限定されず、例えば９：１〜１：９の範囲から適宜選択できる。

本発明のＤダイマー測定用試薬は、上記のようなＤダイマーには反応するが、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体を含む。上記の担体としては、有機高分子化合物、無機化合物、赤血球などが挙げられる。有機高分子化合物としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、セルロース、ラテックス、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、シリカ、アルミナなどが挙げられる。

上記の担体の形状は特に限定されず、球状、平面状などいずれの形状であってもよい。球状である場合、粒子の平均径は測定機器などに応じて適宜選択できるが、通常0.05〜0.5μmが適当である。粒子の材質としては、ラテックスが特に好ましい。

第１及び第２のモノクローナル抗体を担体に感作する方法としては、当該技術において公知の物理的吸着法及び化学的結合法のいずれであってもよいが、担持操作が簡便であるので物理的吸着法が好ましい。

上記の担体が粒子の場合、該担体粒子は、第１及び第２のモノクローナル抗体の両方が感作された担体粒子であってもよいし、第１モノクローナル抗体が感作された担体粒子と第２モノクローナル抗体が感作された担体粒子との混合物であってもよい。第１モノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体とで、担体粒子への抗体の感作条件が互いに異なる場合は、各抗体を個別に担体粒子に感作することが好ましい。

上記の担体粒子がラテックス粒子である場合、第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子は適当な緩衝液に懸濁されてなることが好ましい。その場合、懸濁液中のラテックス粒子の濃度は、好ましくは0.5〜10 mg/ml、より好ましくは0.75〜1.85 mg/mlである。また、該懸濁液中のモノクローナル抗体の濃度は、好ましくは0.1〜10 mg/ml、より好ましくは0.5〜２mg/mlである。

上記の緩衝液としては、pH５〜10、好ましくはpH６〜９にて緩衝作用を有する緩衝液が挙げられる。具体的には、例えばリン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン−塩酸、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPSなどの緩衝液が挙げられる。それらの中でもMOPSOが好ましい。

上記の緩衝液は、タンパク質安定化剤（例えばBSAなど）、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、フェニルメタンスルホニルフルオリドなど）、pH調整剤、増感剤（例えばポリビニルピロリドン、ポリアニオン、ポリエチレングリコール、多糖類など）、無機塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウムなど）、バックグラウンド抑制剤（例えばヒト抗マウス抗体（HAMA）吸収剤など）などの添加物をさらに含み得る。

本発明の試薬の一実施形態として、Ｄダイマー測定用試薬キット（以下、本発明の試薬キットともいう）が挙げられる。本発明の試薬キットは、緩衝液を含む第１試薬と、Ｄダイマーに反応するが、Ｄダイマーに対する反応性の異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む第２試薬とを含む。
本発明の試薬キットは、イムノアッセイ、例えば上記の第１及び第２のモノクローナル抗体を感作したラテックス粒子と、生体試料中のＤダイマーとを反応させるアッセイ（ラテックス凝集法）などにより該試料中のＤダイマーを検出するための試薬キットである。

本発明の試薬キットの形態は、上記のとおり第１試薬と第２試薬とからなる２試薬型の形態であるが、１つの試薬からなる１試薬型の形態であってもよい。測定精度の観点などから、試薬キットの形態としては第１試薬と第２試薬とからなる２試薬型が好ましい。より好ましくは、本発明の試薬キットは、緩衝液を含む第１試薬と、上記の本発明のＤダイマー測定用試薬からなる第２試薬とを含む形態である。

本発明の試薬キットを構成する第１試薬に含まれる緩衝液としては、本発明の試薬において担体粒子の懸濁に用い得る緩衝液と同じ緩衝液が挙げられる。また、第１試薬は、上記のタンパク質安定化剤、防腐剤、pH調整剤、増感剤、無機塩などの添加物を含んでいてもよい。

上記の第１試薬はＤダイマーと反応する抗体を含んでいてもよい。そのような抗体としては、例えば上記の本発明の試薬に含まれる第１のモノクローナル抗体及び／又は第２のモノクローナル抗体が挙げられる。第１試薬に含まれ得る抗体は、好ましくは第１のモノクローナル抗体であり、より好ましくはDD-M1653抗体である。第１試薬中のモノクローナル抗体の濃度は、好ましくは１〜100μg/ml、より好ましくは５〜50μg/mlである。

第１試薬に含まれ得るモノクローナル抗体の中は、Ｄダイマーに反応性を有すると共に、Ｄダイマーと類似の構造を有する画分、例えばＸ画分及び／又はＹ画分に対する反応性を有する抗体もある。そのような反応性を有するモノクローナル抗体を第１試薬に添加することにより、検体中にＤダイマーの構造類似成分であるＸ画分やＹ画分が存在していても、第１試薬中の該モノクローナル抗体がこれらの画分と結合する。したがって、続いて添加される第２試薬中の担体に感作されたモノクローナル抗体と、これらの画分との反応は抑制されると考えられる。これは、Ｘ画分及びＹ画分にはモノクローナル抗体との反応部位が１つしかないのに対して、Ｄダイマーにはモノクローナル抗体との反応部位が複数あることによるものと考えられる。よって、測定しようとするＤダイマーと担体に感作されたモノクローナル抗体とはより高い特異性で反応することができ、Ｄダイマーの濃度をより正確に測定することが可能になる。

本発明のＤダイマー測定用試薬キットを用いて生体試料中のＤダイマーを測定する方法について、以下に具体的に説明する。
まず、緩衝液を含む第１試薬と生体試料とを混合してインキュベートする。ここで、生体試料としては血清、血漿、尿などが挙げられる。第１試薬と生体試料とを混合する際の容量比は、５：１〜50：１程度であればよい。また、インキュベート時間は１〜10分間程度であればよい。

次いで、第１試薬と生体試料との混合物に、Ｄダイマーに対する反応性の異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む第２試薬を添加する。該混合物と第２試薬とを混合する際の容量比は、１：0.05〜１：1.5程度であればよい。

第２試薬を添加して混合すると、抗原抗体反応によりＤダイマーと第２試薬中の担体粒子との凝集が生じる。この凝集の度合いを、１分間当たりの吸光度変化量として測定する。この測定は、散乱光強度、吸光度又は透過光強度を測定可能な光学機器で行うことが好ましい。また、測定波長は300〜2400 nm、好ましくは400〜1200 nm、より好ましくは600〜1000 nmの範囲から適切な波長を選択できる。
生体試料中のＤダイマーの濃度及び／又は量は、濃度既知のＤダイマー標準物質の測定により得られる検量線を用いて、測定した吸光度変化量から算出できる。

本発明の試薬キットでは、第１試薬と第２試薬とを混合した後、両試薬の混合物に生体試料を添加して担体粒子の凝集の度合いを光学的に測定する方法にも利用可能である。

以下に、実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１． 免疫沈降法による各抗体の反応性の確認
第１のモノクローナル抗体としてDD-M1653抗体を用い、第２のモノクローナル抗体としてDD-M1039抗体及びDD-M46抗体を用いて、これらの抗体のフィブリン／フィブリノゲン分解産物に対する反応性の違いを、以下のような免疫沈降法により検討した。

フィブリン分解産物（Ｄダイマー）及びフィブリノゲン分解産物（Ｘ画分、Ｙ画分、Ｄ画分及びＥ画分）と各抗体とを反応させた後、ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体-sepharose 4Bで抗原抗体反応物を吸着した。該抗原抗体反応物を吸着したsepharose 4Bを洗浄液（10 mM NaPB(pH7.0)）で洗浄後、SDS電気泳動用試料希釈液（10%グリセロール、２% SDS、0.01% BPB含62.5 mM Tris-HCl（pH6.8））にて結合抗原を遊離させた。遊離した抗原をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、転写用緩衝液（25 mMトリス、192 mMグリシン、0.02% SDS、20%メタノール（pH8.3））中で100V、１時間でPVDF膜（Bio-rad社）に転写した。転写したPVDF膜をブロッキング用緩衝液（５%スキムミルク含10 mM NaPB(pH7.0)）でブロッキングした後、５%スキムミルク含10 mM NaPB(pH7.0)で0.1 mg/mlに希釈したウサギ抗フィブリノーゲンポリクローナル抗体溶液に該PVDF膜を浸し、室温下３時間反応させた。PVDF膜を洗浄液で洗浄後、２%スキムミルク含10 mM NaPB(pH7.0)で500倍希釈したヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体標識POD（DAKO社）に該PVDF膜を浸し、室温下１時間反応させた。PVDF膜を洗浄液で洗浄後、4-クロロ-1-ナフトール/H₂O₂発色系（Bio-rad社）で発色させて抗原を検出した。結果を表１に示す。

表１において「+」は抗体が画分に対して反応することを示し、「−」は抗体が画分に対して反応しないことを示し、「ｗ」は抗体が画分に対してわずかに反応することを示す。
表１から、DD-M1653抗体はＸ画分、Ｙ画分及びＤダイマーとは反応するが、Ｄ画分及びＥ画分とは反応しないことがわかった。また、DD-M1039抗体及びDD-M46抗体はＤダイマーとは反応するが、Ｘ画分、Ｙ画分及びＥ画分とは反応しないことがわかった。

２． Ｄダイマー測定用試薬及び試薬キットの製造
（１）Ｄダイマーの低分子画分及び高分子画分の調製
ヒトフィブリノゲン（「Human Fibrinogen Plasminogen Depleted」；Enzyme ResearchLab社）を0.05 Mトリス緩衝液（pH 7.4）に6.62 mg/mlとなるよう溶解し、塩化カルシウム（最終濃度25 mM）、ヒトトロンビン（2 U/ml）及び第ＸＩＩＩ因子（最終濃度10μg/ml、フィブロガミンP；アベンティスファーマ社）を添加した。37℃で18時間反応させてフィブリノゲンをフィブリンに変換させた。

各反応液中に生じたフィブリン塊を約300 mLの0.05Mトリス緩衝液中で撹拌することにより１時間程度洗浄した。洗浄したフィブリン塊をカッターナイフでほぐし、3.5 ml（高分子画分用）及び1.5 ml（低分子画分用）の0.05Mトリス緩衝液に再懸濁した。各懸濁液にプラスミンを終濃度25 mU/mlとなるように添加して、37℃で撹拌しながら反応させた。
0.75時間後、高分子画分用の反応液にアプロチニンを終濃度1000 U/mlになるように添加し、分解反応を停止した。これを５μmフィルターでろ過して、Ｄダイマーの高分子画分（フィブリンのプラスミン0.75時間消化物）を得た。また、プラスミンの添加から20時間後、低分子画分用の反応液にアプロチニンを終濃度1000 U/mlになるように添加し、分解反応を停止した。これを５μmフィルターでろ過して、Ｄダイマーの低分子画分（フィブリンのプラスミン20時間消化物）を得た。

（２）Ｄダイマー測定用試薬の調製
（2-1）第１試薬の製造
各試薬を表２に示される終濃度となるように混合した緩衝液に、DD-M1653抗体を終濃度10μg/mlとなるように添加して混合した。得られた混合液について、１M水酸化ナトリウム水溶液でpHを7.1にした後、超純水で１リットルにメスアップすることにより、緩衝液を含む第１試薬を製造した。

（2-2）抗体を感作した担体粒子を含むＤダイマー測定用試薬の製造
（2-2-1）各抗体のF(ab')2化
（i）DD-M1653抗体のF(ab')2化
ペプシン（約3,500 unit/mg prot.）（SIGMA社）とDD-M1653抗体を重量比で1:20になるよう50 mMクエン酸緩衝液(pH3.7)中で混合し、37℃で１時間静置した。ここに３Mトリス溶液を添加してpHを8.0にして、混合溶液を得た。
AKTA prime plusシステム（GEヘルスケア社）に、Superdex 200pg（GEヘルスケア社）
を充填したカラムをセットし、平衡化バッファー（3.3 mM 3,3-ジメチルグルタル酸含3.3 mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）でカラムを平衡化した。
平衡化バッファーを流速１ml/分でカラムに流しながら、上記の混合溶液をゲルボリュームの1/100以下でアプライして、ただちにカラム溶出液の分取を開始した。ゲルボリュームの約1.5倍までの液量を採取し、得られた溶液の吸光度によってピークをまとめて回収した。回収した溶液の吸光度を測定して抗体濃度を算出した。

（ii）DD-M1039抗体のF(ab')2化
パパイン（約2.8 unit.）（SIGMA社）及びL-システインを、それぞれ終濃度２mg/ml、及び6.1 mg/mlとなるように0.1 M 酢酸緩衝液（pH5.5）／３mM EDTA（以下、酢酸緩衝液という）に溶解した。これを37℃で30分間反応させた。反応液を限外ろ過用遠心チューブ（アミコンYM-5（カットオフ分子量10,000）相当；ミリポア社）により酢酸緩衝液置換した。得られた溶液の吸光度からパパイン濃度を求めた。この溶液にDD-M1039抗体を、パパイン重量が抗体の1/20となるように溶解した。そして、37℃で30分間反応させ、得られた反応液に終濃度30 mMとなるようヨードアセトアミドを添加した。
AKTA prime plusシステム（GEヘルスケア社）に、Superdex 200pg（GEヘルスケア社）を充填したカラムをセットし、平衡化バッファー（3.3 mM 3,3-ジメチルグルタル酸含3.3 mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）でカラムを平衡化した。
平衡化バッファーを流速１ml/分でカラムに流しながら、上記の混合溶液をゲルボリュームの1/100以下でアプライして、ただちにカラム溶出液の分取を開始した。ゲルボリュームの約1.5倍までの液量を採取し、得られた溶液の吸光度によってピークをまとめて回収した。回収した溶液の吸光度を測定して抗体濃度を算出した。

（iii）DD-M46抗体のF(ab')2化
DD-M46抗体のF(ab')2化は、DD-M1039抗体に代えてDD-M46抗体を用いたこと以外は上記の（ii）DD-M1039抗体のF(ab')2化において述べたことと同様にして行った。

（2-2-2）各抗体のラテックス粒子への感作
（i）DD-M1653抗体のラテックス粒子への感作
F(ab')2化DD-M1653抗体の終濃度が1.25 mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸／150 mM NaCl溶液に混合した。そして、この混合液と25%（重量比）ラテックス溶液（粒径0.238μm；セキスイメディカル株式会社）とを混合した。
これに50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸／150 mM NaCl溶液／２%BSA溶液を等量加えて混合した後、10℃、38400×gで60分間遠心した。上澄みを除去し、沈殿に上澄みと等量の50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸／150 mM NaCl溶液／２%BSA／３%シュークロース溶液を添加した。
得られた混合液を、氷冷条件で超音波破砕機（大岳社製）を用いてソニケーションを行い、さらに、氷冷条件で超音波処理装置（Dr. Hielscher Gmbh UP-200S)を用いてソニケーションを実施しDD-M1653抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液を得た。

（ii）DD-M1039抗体のラテックス粒子への感作
F(ab')2化DD-M1039抗体の終濃度が1.25 mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸／150 mM NaCl溶液に混合した。以下、上記の（i）DD-M1653抗体のラテックス粒子への感作において述べたことと同様にして、DD-M1039抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液を得た。

（iii）DD-M46抗体のラテックス粒子への感作
F(ab')2化DD-M46抗体の終濃度が1.56 mg/mlとなるように、50 mM 2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸／150 mM NaCl溶液に混合した。以下、上記の（i）DD-M1653抗体のラテックス粒子への感作において述べたことと同様にして、DD-M46抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液を得た。

（2-2-3）第２試薬の製造
DD-M1653抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液と、DD-M1039抗体又はDD-M46抗体を感作したラテックス粒子の懸濁液とを混合することにより、２種類のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含むＤダイマー測定用試薬を得た。このＤダイマー測定用試薬を第２試薬として、以下の測定に用いた。

（３）ラテックス凝集法による各抗体のＤダイマーへの反応性の確認
DD-M1653抗体、DD-M1039抗体及びDD-M46抗体のフィブリン／フィブリノゲン分解産物に対する反応性の違いを、以下の手順によるラテックス凝集法により検討した。
上記（１）で調製したＤダイマーの低分子画分及び高分子画分をTBSTバッファーで100倍希釈して検体とした。各検体６μlと、上記（2-1）で調製した第１試薬84μlとを混合し、37℃で３分間反応させた。得られた反応液と、上記（2-2）で調製した各抗体をそれぞれ個別に感作したラテックス粒子の懸濁液84μlとを混合して、ラテックス凝集反応を開始させた。反応開始から１分後及び２分後の波長800 nmにおける吸光度をCS-2000i（シスメックス株式会社）を用いて測定した。これらの測定結果から１分間あたりの吸光度の変化量を求めた。結果を図１に示す。

図１より、DD-M1653抗体はＤダイマーの高分子画分及び低分子画分と反応することがわかった。また、DD-M1039抗体及びDD-M46抗体はＤダイマーの高分子画分と反応するが、Ｄダイマーの低分子画分との反応性はDD-M1653抗体とは異なり、これらの抗体はＤダイマーの低分子画分とDD-M1653抗体よりも弱く反応することがわかった。すなわち、DD-M1653抗体とDD-M1039抗体及びDD-M46抗体とは、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる抗体であることがわかる。
したがって、上記の（2-2）で製造したＤダイマー測定用試薬は、Ｄダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬である。

３． 本発明のＤダイマー測定用試薬のＤダイマーへの反応性の検討
上記の２．で製造した本発明のＤダイマー測定用試薬を用いてＤダイマー標準品を測定した。
第１試薬は、上記の２．（2-1）で製造した試薬を用いた。第２試薬は、上記の２．（2-2）で製造した試薬を用いた。第２試薬における、各抗体をそれぞれ個別に感作したラテックス粒子の懸濁液の混合率（体積比）を、以下の表３に示す。なお、第２試薬における抗体の総量は、いずれの混合率の第２試薬においても同じである。

Ｄダイマー標準品ネオ（シスメックス株式会社）を希釈して濃度１μg/mlのＤダイマー溶液を調製した。この溶液を検体とした。検体６μlと第１試薬84μlとを混合し、37℃で３分間反応させた。得られた反応液と、実施例１〜６及び比較例１〜４の各第２試薬84μlとを混合して、ラテックス凝集反応を開始させた。反応開始から１分後及び２分後の波長800 nmにおける吸光度をCS-2000iを用いて測定した。これらの測定結果から１分間あたりの吸光度の変化量を求めた。結果を図２及び３に示す。
図２及び３より、実施例１〜６のＤダイマー測定試薬の方が、比較例の試薬よりもＤダイマーに対する反応性が高いことが分かった。

４． 本発明のＤダイマー測定用試薬の低濃度域におけるＤダイマー測定感度の検討
低濃度域におけるＤダイマー測定感度について、本発明のＤダイマー測定用試薬（実施例１）と従来の測定試薬（比較例１）とを比較した。
Ｄダイマー標準品ネオ（シスメックス株式会社）を希釈して濃度0.25μg/mlのＤダイマー溶液を調製した。この溶液を検体とした。検体６μlと試験例１の（2-1）で製造した第１試薬84μlとを混合し、37℃で３分間反応させた。得られた反応液と、実施例１及び比較例１の各第２試薬84μlとを混合して、ラテックス凝集反応を開始させた。反応開始から１分後及び２分後の波長800 nmにおける吸光度をCS-2000iを用いて測定した。これらの測定結果から１分間あたりの吸光度の変化量を求めた。また、Ｄダイマーを含まない検体（０μg/ml）についても同様にして測定した。各検体10サンプルずつについて、測定値の平均値（Mean）、標準誤差（SD）を算出した。また、平均値のばらつきの上限及び下限として、それぞれ平均値に標準誤差の２倍の値を加えた値（+2SD）及び引いた値（-2SD）を算出した。これらの結果を表４に示す。

実施例１の試薬では、０μg/mlの検体についての平均値+2SDの値よりも、0.25μg/mlの検体についての平均値−2SDの値の方が大きいことがわかる。これは、０μg/mlの検体の測定結果のばらつきの上限と、0.25μg/mlの検体の測定結果のばらつきの下限とが重ならないことを示す。
一方、比較例１の試薬では、０μg/mlの検体についての平均値+2SDの値よりも、0.25μg/mlの検体についての平均値−2SDの値の方が小さいことがわかる。これは、０μg/mlの検体の測定結果のばらつきの上限と、0.25μg/mlの検体の測定結果のばらつきの下限とが重なり得ることを示す。
したがって、実施例１の試薬では、Ｄダイマーを含まない検体と低濃度のＤダイマーを含む検体とを区別できるが、比較例１の試薬ではそのような区別はできないことが示唆される。
よって、本発明のＤダイマー測定試薬は低濃度域におけるＤダイマーを高感度に測定できることがわかる。

Claims (12)

1. 生体試料と、Ｄダイマーに反応するがＤダイマーに対する反応性が互いに異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬とを混合する工程と、
   混合物中で抗原抗体反応により生じる、Ｄダイマーと担体粒子との凝集の度合いを測定する工程と
   を含み、
   前記第１のモノクローナル抗体がＸ画分、Ｙ画分及びＤダイマーとは反応するが、Ｄ画分及びＥ画分とは反応せず、
   前記第２のモノクローナル抗体がＤダイマーとは反応するが、Ｘ画分、Ｙ画分及びＥ画分とは反応しない、Ｄダイマー測定方法。
2. 前記第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子が、前記第１のモノクローナル抗体を感作した担体粒子及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子の混合物である、請求項１に記載のＤダイマー測定方法。
3. 前記第２のモノクローナル抗体がＤ画分と反応しない、請求項１又は２に記載のＤダイマー測定方法。
4. 前記第２のモノクローナル抗体がＤ画分と反応する、請求項１又は２に記載のＤダイマー測定方法。
5. 前記第１のモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６８７として独立行政法人産業技術総合研究所に平成１６年２月１７日付けで寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
6. 前記第２のモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９６８として独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
7. 前記第２のモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９６９として独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
8. 前記測定工程では、Ｄダイマーと担体粒子との凝集の度合いを光学的に測定する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
9. 前記測定工程では、Ｄダイマーと担体粒子との凝集の度合いを、散乱光強度、吸光度及び透過光強度の少なくとも一つを測定することで測定する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
10. 前記混合工程では、生体試料と、緩衝液を含む試薬と、Ｄダイマーに反応するがＤダイマーに対する反応性の異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬とを混合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤダイマー測定方法。
11. 前記混合工程では、生体試料と緩衝液を含む試薬とを混合し、生体試料及び緩衝液を含む試薬の混合物と、Ｄダイマーに反応するがＤダイマーに対する反応性の異なる第１及び第２のモノクローナル抗体を感作した担体粒子を含む試薬とを混合する、請求項１０に記載のＤダイマー測定方法。
12. 前記緩衝液を含む試薬が前記第１及び／又は第２のモノクローナル抗体を含む、請求項１０又は１１に記載のＤダイマー測定方法。

Images