JP5826697B2 - Ｎｋ細胞活性を制御するための組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＫ細胞の細胞表面上に存在する２以上の阻害的受容体と交叉反応し、哺乳類対象又は生物試料中のＮＫ細胞の細胞毒性を増強する抗体、抗体断片及びそれらの誘導体に関する。本発明は、かかる抗体、断片、変異形及び誘導体を作製する方法、かかる抗体、断片、変異形及び誘導体を含む薬学的組成物、並びにかかる分子及び組成物の使用、特に対象中のＮＫ細胞活性又は細胞毒性を増加させるための治療におけるそれらの使用にも関する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、リンパ球の亜集団であり、非従来的免疫に関与する。ＮＫ細胞は、血液試料、白血球／顆粒球除去療法、収集物などから、当該技術において公知の様々な技術によって取得することができる。

ＮＫ細胞の特徴及び生物学的特性には、ＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７などの表面抗原の発現；細胞表面上に、α／β又はγ／δＴＣＲ複合体が存在しないこと；「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現していない細胞に結合し、特異的な細胞溶解酵素を活性化することによって、これを死滅させることができること；ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する腫瘍細胞又はその他の異常細胞を死滅させることができること；免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインを放出することができること；並びに複数回の細胞分裂を行って、親細胞と類似の生物特性を有する娘細胞を産生できること、が含まれる。本発明において、「活性な」ＮＫ細胞とは、生物学的に活性なＮＫ細胞を表し、より具体的には、標的細胞を溶解させる能力を有するＮＫ細胞を表す。例えば、「活性な」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、且つ「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現していない細胞（ＫＩＲ非適合性細胞）を死滅させることができる。

それらの生物学的特性に基づいて、ＮＫ細胞の調節に依拠した様々な治療及びワクチン戦略が当該技術において提案されている。しかしながら、ＮＫ細胞の活性は、刺激信号と阻害信号の両方が関与する複雑な機序によって制御される。従って、ＮＫ細胞によって媒介される有効な療法には、これらの細胞の刺激と阻害信号の中和がともに必要となり得る。

ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的阻害受容体によって、負の制御を受けている(Karre et al., 1986;Ohlen et al., 1989)。これらの特異的受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子の多型性決定基又は他の細胞上に存在するＨＬＡに結合し、ＮＫ細胞の溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と称される受容体ファミリーに属するメンバーの一部が、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の群を認識する。

ＫＩＲは、ＮＫ細胞を含む、リンパ球のサブセットの一部に存在する受容体の巨大なファミリーである。ＫＩＲの命名は、細胞外ドメイン（ＫＩＲ２Ｄ又はＫＩＲ３Ｄ）の数及び細胞質尾部が長い（ＫＩＲ２ＤＬ又はＫＩＲ３ＤＬ）か、又は短い（ＫＩＲ２ＤＳ又はＫＩＲ３ＤＳ）どうかに基づいている。ヒトの中では、特定のＫＩＲの有無は、単一固体中に存在するＮＫ集団内で、ＮＫ細胞ごとに変動し得る。ヒト集団内では、ＫＩＲ分子の多型性レベルも比較的高く、ある種のＫＩＲ分子は一部の個体に存在するが、全ての個体に存在するわけではない。ある種のＫＩＲ遺伝子産物は、適切なリガンドに結合したときに、リンパ球活性の刺激を引き起こす。確認されている刺激性ＫＩＲは全て、免疫刺激モチーフ（ＩＴＡＭ、ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）を有するアダプター分子と会合する、帯電した膜貫通残基を有する短い細胞質尾部を有している。他のＫＩＲ遺伝子産物は、性質上、阻害的である。確認された阻害性ＫＩＲは全て、長い細胞質尾部を有しており、ＫＩＲのサブタイプに応じて、ＨＬＡ抗原の異なるサブセットと相互作用するようである。阻害的ＫＩＲは、ホスファターゼを動員する一又は数個の阻害的モチーフを、それらの細胞質内部分の中に提示する。公知の阻害的ＫＩＲ受容体には、ＫＩＲ２ＤＬとＫＩＲ３ＤＬサブファミリーのメンバーが含まれる。２つのＩｇドメイン（ＫＩＲ２Ｄ）を有するＫＩＲ受容体は、ＨＬＡ−Ｃアロタイプ：ＫＩＲ２ＤＬ２（以前は、ｐ５８．２と表記されていた。）を特定し、又は密接に関連する遺伝子産物ＫＩＲ２ＤＬ３はグループ２ ＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ１、３、７及び８）によって共有されるエピトープを認識するのに対して、ＫＩＲ２ＤＬ１（ｐ５８．１）は、相反性のグループ１ ＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ２、４、５及び６）によって共有されるエピトープを認識する。ＫＩＲ２ＤＬ１による認識は、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の８０位に位置するＬｙｓ残基の存在によって支配されている。ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３の認識は、８０位に位置するＡｓｎ残基の存在によって支配されている。重要なことは、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の大部分は、８０位にＡｓｎ又はＬｙｓ残基の何れかを有しているということである。３つのＩｇドメインを有するＫＩＤの１つ、ＫＩＲ３ＤＬ１（ｐ７０）は、ＨＬＡ−Ｂｗ４対立遺伝子によって共有されるエピトープを認識する。最後に、３つのＩｇドメインＫＩＲ３ＤＬ２を有する分子のホモ二量体（ｐ１４０）は、ＨＬＡ−Ａ３及びーＡ１１を認識する。

阻害的ＫＩＲとその他のクラスＩ阻害的受容体（Ｍｏｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ， １９９７；Ｖａｌｉａｎｔｅ ｅｔ ａｌ， １９９７ａ；Ｌａｎｉｅｒ， １９９８）が、ＮＫ細胞によって同時発現される場合があり得るが、任意の特定の個体のＮＫレパートリーでは、単一のＫＩＲを発現する細胞が存在するので、対応するＮＫ細胞は、特定のクラスＩ対立遺伝子グループを発現する細胞によってのみ遮断される。

ＫＩＲがミスマッチであるＮＫ細胞集団又はクローン（すなわち、宿主のＨＬＡ分子と適合しないＫＩＲを発現するＮＫ細胞の集団）は、同種異系間移植で見られる移植片抗白血病効果の媒介因子である可能性が最も高いことが示されている（Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ある個体で、この効果を再現する一つの方法は、ＫＩＲ／ＨＬＡ相互作用を遮断する試薬を使用することであろう。

ＫＩＲ２ＤＬ１に対して特異的なモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１のＣｗ４（などの）対立遺伝子との相互作用を遮断することが示されている（Ｍｏｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対するモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ２／３のＨＬＡＣｗ３（などの）対立遺伝子との相互作用を遮断することも記載されている（Ｍｏｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。しかしながら、臨床の現場でこのような試薬を使用するためには、所定の患者がクラス１又はクラス２ ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の何れを発現しているかに関わらず、全ての患者を治療するために、２つの治療用ｍＡｂを開発することが必要であろう。さらに、何れの治療用抗体を使用するかを決定する前に、各患者が発現しているＨＬＡ型を予め決定しなければならないため、治療の費用がずっと高くなるであろう。

「Watzl et al., Tissue Antigens, 56, p.240(2000)」は、ＫＩＲの複数のイソタイプを認識する交叉反応抗体を作製したが、それらの抗体は、ＮＫ細胞活性の増強を引き起こさなかった。「G.M. Spaggiara et al., Blood, 100, pp. 4098-4107 (2002)」は、様々なＫＩＲに対する数多くのモノクローナル抗体を用いて実験を行った。それらの抗体の一つＮＫＶＳＦ１は、ＣＤ１８５ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２）及びｐ５０．３（ＫＩＲ２ＤＳ４）の共通エピトープを認識すると述べられている。ＮＫＶＳＦ１はＮＫ細胞活性を増強できることは示唆されておらず、治療用に使用できることも示唆されていない。従って、ＮＫ細胞活性の調節における実際的且つ効果的なアプローチは、当該技術において、これまで使用することはできず、特異的試薬を用いたＨＬＡ対立遺伝子特異的介入がなお必要とされている。

本発明は、ＮＫ細胞の活性化における現行の問題を克服する新規抗体、組成物及び方法を提供し、さらなる有利な特徴及び利点を提供する。一つの典型的な側面において、本発明は、実質的に全てのヒトにおいて、ヒトＮＫ細胞の活性化を促進する単一の抗体を提供する。より具体的には、本発明は、様々な阻害的ＫＩＲ群と交叉反応し、それらの阻害的シグナルを中和して、このような阻害的ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞中で、ＮＫ細胞の細胞毒性の増強をもたらす、新規な特異的抗体を提供する。本発明の抗体は、このように複数のＫＩＲ遺伝子産物と交叉反応できるので、ヒト対象のＨＬＡタイプを予め決定する負担又は支出なしに、ほとんどのヒト対象においてＮＫ細胞活性を増加させるために効果的に使用することができる。

第一の側面において、本発明は、ＮＫ細胞の表面に存在する少なくとも２つの阻害的ＫＩＲ受容体と交叉反応し、ＮＫ細胞の阻害的シグナルを中和し、ＮＫ細胞の活性を増強する抗体、抗体の断片及びそれらのうち何れかの誘導体を提供する。より好ましくは、前記抗体は、ヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基を結合する。さらに具体的には、本発明の抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３受容体を結合する。本発明において、「ＫＩＲ２ＤＬ２／３」という用語は、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３受容体の一方又は両方を表す。これらの２つの受容体は、極めて高い相同性を有し、おそらく、同一遺伝子の対立遺伝子形態であると思われ、当該技術によって、互換的であると考えられる。従って、ＫＩＲ２ＤＬ２／３は、本発明において、単一の阻害的ＫＩＲ分子であると考えられるので、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３のみと交叉反応し、他の阻害的ＫＩＲ受容体とは交叉反応しない抗体は、本発明の範囲に属しない。

本発明の抗体は、少なくとも２つの阻害的ＫＩＲ受容体へのＭＨＣ又はＨＬＡ分子の結合を特異的に阻害し、ＮＫ細胞活性を促進する。両活性は、本明細書において使用される、「ＫＩＲの阻害的活性を中和する」という用語によって推定される。本発明において、「ＮＫ細胞活性を促進する」、「ＮＫ細胞の細胞毒性を促進する」、「ＮＫ細胞を促進する」、「ＮＫ細胞活性を増強する」、「ＮＫ細胞の細胞毒性を促進する」又は「ＮＫ細胞を増強する」本発明の抗体の能力とは、本発明の抗体によって、表面上に阻害的ＫＩＲ受容体を発現しているＮＫ細胞が、当該阻害的ＫＩＲ受容体に対応するリガンド（例えば、特定のＨＬＡ抗原）を表面上に発現する細胞を溶解させ得ることを意味する。特定の側面において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体へのＨＬＡ−Ｃ分子の結合を特異的に阻害する抗体を提供する。別の具体的な側面において、本発明は、ＮＫ細胞活性をインビボで促進する抗体を提供する。

少なくとも約９０％のヒト集団に、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＤ２ＤＬ２／３のうち少なくとも一つが存在するので、本発明のより好ましい抗体は、ＨＬＡ−Ｃアロタイプ関連細胞のほとんど（それぞれ、グループ１ ＨＬＡ−Ｃアロタイプと、グループ２ ＨＬＡ−Ｃアロタイプ）に対して、ＮＫ細胞活性を促進することができる。このため、本発明の組成物は、ほとんどのヒト個体において、典型的には、約９０％以上のヒト個体において、ＮＫ細胞を効果的に活性化し、又は増強するために使用することができる。従って、本発明に係る単一の抗体組成物をほとんどのヒト対象を治療するために使用することができ、対立遺伝子群を決定し、又は抗体カクテルを使用する必要はめったにない。

本発明は、阻害的ＫＩＲに対して交叉反応し、阻害的ＫＩＲを中和する抗体を作製することができ、このような抗体は、幅広い範囲のヒトの群で、ＮＫ細胞を効果的に活性化できることを初めて実証する。

このため、本発明の具体的な目的は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ ヒト受容体の両方を特異的に結合し、これらのＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を逆転させる抗体に存する。一実施形態において、前記抗体は、ハイブリドーマＤＦ２００によって産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と競合する。場合によっては、抗体ＤＦ２００と競合する前記抗体は、抗体ＤＦ２００自体ではない。

別の実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１と競合し、必要に応じて、抗体ＮＫＶＳＦ１と競合する前記抗体は抗体ＮＫＶＳＦ１でない。

別の実施形態において、前記抗体は抗体１−７Ｆ９と競合する。好ましくは、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。

「競合する」という用語は、特定のモノクローナル抗体（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３）に対して言及する場合、ある抗体が、組換えＫＩＲ分子又は表面に発現されたＫＩＲ分子の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３）と競合することを意味する。例えば、ある抗体が、結合アッセイにおいてＤＦ２００のＫＩＲ分子への結合を減少させれば、その抗体は、ＤＦ２００と「競合する」。ＤＦ２００と「競合する」抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体又はＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方への結合に関して、ＤＦ２００と競合し得る。

好ましい実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方を結合し、これらのＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を逆転させ、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体又はＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方への結合に関して、ＤＦ２００、１−７Ｆ９又はＮＫＶＳＦ１と競合する抗体を提供する。必要に応じて、前記抗体はＮＫＶＳＦ１でない。必要に応じて、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方を結合し、これらのＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を逆転させ、並びにＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体への結合についてＥＢ６と競合し、ＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体への結合についてＧＬ１８３と競合し、又はＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体への結合についてＥＢ６と競合し且つＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体への結合についてＧＬ１８３と競合する抗体を提供する。必要に応じて、前記抗体はＮＫＶＳＦ１でない。必要に応じて、前記抗体はＤＦ２００でない。必要に応じて、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。

有利な側面において、本発明は、ＤＦ２００と競合し、モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的若しくは本質的に同じ、又は同じ、ＫＩＲ分子上のエピトープ又は「エピトープ部位」を認識し、結合し、前記エピトープ又は「エピトープ部位に対して免疫特異性を有する抗体を提供する。好ましくは、前記ＫＩＲ分子は、ＫＩＲ２ＤＬ１ヒト受容体又はＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体である。

本発明の具体的な目的は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３ヒト受容体の両方に存在する共通の決定基を結合し、これらのＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を逆転させる抗体に存する。該抗体は、より具体的には、ハイブリドーマＤＦ２００によって産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００又はハイブリドーマＮＫＶＳＦ１によって産生される抗体ＮＫＶＳＦ１と実質的に同一のＫＩＲ上エピトープを結合する（該抗体は、ＮＫＶＳＦ１ではない。）。

好ましい実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の最も好ましい抗体は、ハイブリドーマＤＦ２００によって産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００である。

抗体ＤＦ２００を産生するハイブリドーマは、２００４年６月１０日に「Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France」に登録された、識別番号「ＤＦ２００」、登録番号ＣＮＣＭ「ＣＮＣＭ Ｉ−３２２４」として、ＣＮＣＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。抗体ＮＫＶＳＦ１は、Ｓｅｒｏｔｅｃ（Cergy Sainte-Christophe，France）から、カタログ番号ＭＣＡ２２４３で入手できる。ＮＫＶＳＦ１は、本明細書において、ｐａｎ２Ｄ ｍＡｂとも称される。

本発明は、実質的に同様の抗原特異性と活性を有する（例えば、親抗体と交叉反応することができ、阻害的ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞の細胞毒性活性を増強する。）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、イムノアドヘシン、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲ及びＳｃＦｖなどの（これらに限定されない。）、本明細書に記載されている抗体の機能的断片及び誘導体も提供する。さらに、本発明の抗体は、ヒト化、ヒト又はキメラであり得る。

本発明は、毒素、放射性核種、検出可能部分（例えば、蛍光）又は固相支持体に抱合され、又は共有結合された本発明の抗体を含む抗体誘導体も提供する。

本発明は、上述されているような抗体、それらの断片、又はそれら何れかの誘導体を含む薬学的組成物も提供する。従って、本発明は、医薬を製造するための方法における、本明細書に開示されている抗体の使用にも関する。好ましい実施形態において、前記医薬又は薬学的組成物は、癌若しくはその他の増殖性疾患、感染症の治療用であり、又は移植に使用するためのものである。

別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体を含む組成物を提供し、前記抗体は、前記二つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体の少なくとも一つを発現するＮＫ細胞に対する、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、前記抗体はリポソーム中に取り込まれる。必要に応じて、前記組成物は、遺伝子治療のために遺伝子を送達するための核酸分子；ＮＫ細胞中の遺伝子を抑制するためにアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ若しくはｓｉＲＮＡを送達するための核酸分子；又は前記リポソーム中に追加して取り込まれた、ＮＫ細胞を標的として死滅させるための毒素若しくは薬物から選択される追加の物質を含む。

本発明は、インビトロ、エキソビボ又はインビボで、ヒトＮＫ細胞活性を制御する方法であって、有効量の本発明の抗体、かかる抗体の断片、これらのうち何れかの誘導体又はこれらの何れかの少なくとも一つを含む薬学的組成物に、ヒトＨＫ細胞を接触させることを含む、方法も提供する。好ましい方法は、有効量の本発明の薬学的組成物を投与することを含み、癌、感染性疾患又は免疫疾患を有する患者において、最も好ましくは、エキソビボ又はインビボで、ヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を増加させることを目的する。

さらなる側面において、本発明は、阻害的ＫＩＲポリペプチド上に存在するエピトープを含む抗原で免疫化された哺乳類宿主（典型的には、ヒト以外の哺乳動物宿主）から得られ、（ｂ）不死化された細胞（例えば、ミエローマ細胞）に融合された（ａ）Ｂ細胞を含むハイブリドーマを提供し、該ハイブリドーマは、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体を結合するモノクローナル抗体を産生し、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体を発現するＮＫ細胞の集団において、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を少なくとも実質的に阻害することができる。必要に応じて、前記ハイブリドーマは、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生しない。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体を結合する。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基を結合する。好ましくは、前記ハイブリドーマは、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子の、ヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、及び８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子の、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する抗体を産生する。好ましくは、前記ハイブリドーマは、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３又はＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方の何れかの上に存在する、ハイブリドーマＤＦ２００によって産生されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープに結合する抗体を産生する。このようなハイブリドーマの例は、ＤＦ２００である。

本発明は、複数のＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物と交叉反応し、かかるＫＩＲの阻害的活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）ＫＩＲ２ＤＬポリペプチド含む免疫原で、ヒト以外の哺乳動物を免疫する工程と；
（ｂ）前記免疫された哺乳動物から、前記ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを結合する抗体を調製する工程と；
（ｃ）少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物と交叉反応する、（ｂ）の抗体を選択する工程と；
（ｄ）ＮＫ細胞を増強する、（ｃ）の抗体を選択する工程と；
を含む方法も提供する。一実施形態において、前記ヒト以外の哺乳動物は、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されたトランスジェニック動物である（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座と固有の免疫グロブリン遺伝子の欠失を有するヒト以外の哺乳動物、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ^ＴＭ（Ａｂｇｅｎｉｘ−Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）など、又はヒトＩｇをコードする遺伝子の微小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を有するヒト以外の哺乳動物、ＨｕＭａｂ−マウス^ＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ−Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）など）。必要に応じて、前記方法は、霊長類、好ましくはカニクイザルのＮＫ細胞又はＫＩＲポリペプチドを結合する抗体を選択することをさらに含む。必要に応じて、本発明は、さらに、抗体を評価する方法であって、上記方法に従って作製された抗体が、霊長類、好ましくはカニクイザルに投与され、好ましくは、前記サルが前記抗体の毒性の指標の有無について観察される、方法を含む。

本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体を作製する方法であって、前記抗体が、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対する、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、
ａ）阻害的ＫＩＲ２ポリペプチド含む免疫原で、ヒト以外の哺乳動物を免疫する工程と；
ｂ）前記免疫された動物から、前記ＫＩＲポリペプチドを結合する抗体を調製する工程と；
ｃ）少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交叉反応する、（ｂ）の抗体を選択する工程と；
前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対する、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができる、（ｃ）の抗体を選択する工程と；を含み、工程（ｃ）及び（ｄ）の順序が必要に応じて逆転され、任意の数の前記工程が必要に応じて一回以上反復される、方法も提供する。好ましくは、免疫化に使用される阻害的ＫＩＲポリペプチドはＫＩＲ２ＤＬポリペプチドであり、工程（ｃ）で選択される抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３と交叉反応する。好ましくは、前記抗体は、少なくとも二つの異なるＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基を認識し、最も好ましくは、前記ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３である。必要に応じて、前記方法は、霊長類、好ましくはカニクイザルのＮＫ細胞又はＫＩＲポリペプチドを結合する抗体を選択することをさらに含む。必要に応じて、本発明は、さらに、抗体を評価する方法であって、上記方法に従って作製された抗体が、霊長類、好ましくはカニクイザルに投与され、好ましくは、前記サルが前記抗体の毒性の指標の有無について観察される、方法を含む。

必要に応じて、上記方法では、工程ｃ）又はｄ）で選択される抗体はＮＫＶＳＦ１ではない。好ましくは、上記方法の工程（ｂ）で調製される抗体は、モノクローナル抗体である。好ましくは、上記方法の工程（ｃ）で選択される抗体は、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子の、ヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合及び８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子の、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する。好ましくは、上記方法の工程（ｄ）で選択される抗体は、ＮＫ細胞毒性に増強、例えば任意の実質的な増強、すなわち、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％以上のＮＫ細胞毒性の増強、例えば、標的ＮＫ細胞毒性の少なくとも約５０％の増強（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％（例えば、約６５から１００％など）の、ＮＫ細胞の細胞毒性の増強）を引き起こす。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じ、ＫＩＲ２ＤＬ１及び／又はＫＩＲ２ＤＬ２／３上のエピトープに結合する。必要に応じて、前記方法は、前記工程に加えて又は前記工程に代えて、選択されたモノクローナル抗体の断片を作製し、（例えば、放射性核種、細胞毒性剤、レポーター分子などに抱合することによって）選択されたモノクローナル抗体の誘導体を作製し、又はこのようなモノクローナル抗体の配列に対応する配列から生成され、若しくはこのようなモノクローナル抗体の配列に対応する配列を含む抗体断片の誘導体を作製する追加の工程を含む。

本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体を作製する方法であって、前記抗体が、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対する、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、
（ａ）少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交叉反応するモノクローナル抗体又は抗体断片を、ライブラリー又はレパートリーから選択する工程と；
（ｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団における、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができる、（ａ）の抗体を選択する工程と；を含む方法をさらに提供する。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基を結合する。必要に応じて、工程（ｂ）で選択される前記抗体は、ＮＫＶＳＦ１でない。好ましくは、工程（ｂ）で選択される抗体は、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合及び８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を阻害する。好ましくは、工程（ｂ）で選択される抗体は、ＮＫ細胞毒性に増強、例えば任意の実質的な増強、又は少なくとも５％、１０％、２０％、３０％以上のＮＫ細胞毒性の増強、例えば、標的ＮＫ細胞毒性の少なくとも約５０％の増強（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％（例えば、約６５から１００％など）の、ＮＫ細胞の細胞毒性の増強）を引き起こす。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じ、ＫＩＲ２ＤＬ１及び／又はＫＩＲ２ＤＬ２／３上のエピトープに結合する。必要に応じて、前記方法は、選択されたモノクローナル抗体の断片を作製する工程、選択されたモノクローナル抗体の誘導体を作製する工程、又は選択されたモノクローナル抗体断片の誘導体を作製する工程をさらに含む。

さらに、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体を作製する方法であって、前記抗体が、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団において、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、
ａ）前記モノクローナル抗体の産生が可能な条件下で、本発明のハイブリドーマを培養する工程と；
ｂ）前記モノクローナル抗体を前記ハイブリドーマから分離する工程と；を含む方法を提供する。必要に応じて、前記方法は、前記モノクローナル工程の断片を作製する工程、前記モノクローナル抗体の誘導体を作製する工程、又はかかるモノクローナル抗体断片の誘導体を作製する工程をさらに含む。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基を結合する。

また、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体を作製する方法であって、前記抗体が、前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団における、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、
ａ）前記モノクローナル抗体をコードする核酸を、本発明のハイブリドーマから単離する工程と；
ｂ）前記核酸を修飾して、前記モノクローナル抗体の機能的配列に対応するアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に実質的に類似する（例えば、このような配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％（約７０から９９％など）同一である。）アミノ酸配列を含み、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗体の免疫反応性断片、又はこのような免疫反応性断片を含む融合タンパク質から選択される、修飾され又は誘導体化された抗体をコードする配列を含む修飾された核酸を取得する、必要に応じて実施される工程と、
ｃ）前記核酸又は修飾された核酸（すなわち、同一アミノ酸配列をコードする関連核酸）を発現ベクター中に挿入し、適切な条件下で増殖された宿主細胞中に前記発現ベクターが存在するときに、前記コードされる抗体又は抗体断片が発現されることが可能である、工程と；
ｄ）形質移入がなければ、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に、前記発現ベクターを形質移入する工程と；
ｅ）前記抗体又は抗体断片の発現を引き起こす条件下で、前記形質移入された宿主細胞を培養する工程と；
ｆ）前記形質移入された宿主細胞によって産生された抗体又は抗体断片を単離する工程と；を含む、方法が提供される。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基を結合する。

本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を結合する抗体と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含み、前記抗体が、前記２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体のうち少なくとも一つを発現するＮＫ細胞において、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができ、前記抗体が、患者又はＮＫ細胞を含む生物学的試料において、ＮＫ細胞の細胞毒性を検出可能に増強するのに有効な量で存在する、組成物も提供することが理解されるであろう。好ましくは、前記抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上に存在する共通の決定基を結合する。前記組成物は、例えば、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、阻害的ＫＩＲ受容体に結合し、これを阻害する第二の抗体、抗感染剤、標的誘導剤又は補助化合物から選択される、第二の治療剤を必要に応じてさらに含むことができる。有利な免疫調節剤は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γから選択され得る。前記化学療法剤の例には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞毒性抗生物質、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン、他のビンカアルカロイド及びそれらの誘導体またはプロドラッグが含まれる。ホルモン剤の例には、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン、タモキシフェン、トレミフェン、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、ビカルタミド アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール メドロキシ、クロルマジノン、メゲストロール、他のＬＨＲＨアゴニスト、他の抗エストロゲン、他の抗アンドロゲン、他のアロマターゼ阻害剤及び他のプロゲスターゲンが含まれる。好ましくは、阻害的ＫＩＲ受容体に結合して、これを阻害する前記第二の抗体は、少なくとも二つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基を結合する前記抗体によって結合されるエピトープとは異なる阻害的ＫＩＲ受容体のエピトープに結合する抗体又は抗体の誘導体若しくは断片である。

本発明は、さらに、ＮＫ細胞活性を検出可能に増強することが必要とされる患者に、本発明の組成物を投与する工程を含む、ＮＫ細胞活性を検出可能に増強する方法を提供する。ＮＫ細胞活性の増強を必要とする患者は、このような増強が、治療効果を促進し、強化し、及び／又は誘導し得る（又は、疾病若しくは疾患を有し、患者と実質的に同じような特徴を有する（例えば、臨床試験によって決定し得る。）患者の少なくともかなりの割合において、このような効果を促進し、強化し、及び／又は誘導する）疾病又は疾患を有する任意の患者であり得る。このような治療を必要とする患者は、例えば、癌、別の増殖性疾患、感染性疾患又は免疫疾患に罹患し得る。好ましくは、前記方法は、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、阻害的ＫＩＲ受容体に結合し、これを阻害する第二の抗体、抗感染剤、標的誘導剤又は補助化合物から選択される、適切な追加の治療剤を前記患者に投与する追加の工程を含み、前記追加の治療剤は、前記抗体ともに単一剤形として、又は別個の剤形として、前記患者に投与される。抗体（又は抗体断片／誘導体）の投薬と追加の治療剤の投薬は、両者で、ＮＫ細胞活性の増強を含む前記患者における治療応答を検出可能に誘導し、促進し、及び／又は強化するのに十分である。別個に投与される場合、前記抗体、断片又は誘導体と前記追加の治療剤は、検出可能な総合的な治療的有用性を患者にもたらす条件下で（例えば、タイミング、投薬の数に関して）、望ましく投与される。

さらに、本発明によって包含されるのは、ヒト以外の霊長類、好ましくはサルのＮＫ細胞及び／又はサルのＫＩＲ受容体を特異的に結合できる本発明の抗体である。候補医薬である本発明の抗体の毒性、投与量及び／又は活性又は効力を評価する方法も、包含される。一側面において、本発明は、ＨＫ細胞を有するヒト以外の霊長類レシピエンド動物に、本発明の抗体を投与し、前記動物に対する、又は、好ましくは標的組織に対する、前記薬剤の有毒な、又は有害な、又は不利な何らかの効果を評価することによって、動物又は標的組織に対して毒性がある抗体の用量を決定する方法を包含する。別の側面において、本発明は、ＨＫ細胞を有するヒト以外の霊長類レシピエンド動物に、本発明の抗体を投与し、前記動物に対する、又は、好ましくは標的組織に対する、前記薬剤の有毒な、又は有害な、又は不利な何らかの効果を評価することによって、動物又は標的組織に対して毒性がある抗体を同定する方法である。別の側面において、本発明は、感染、疾病又は癌の、ヒト以外の霊長類モデルに、本発明の抗体を投与し、前記感染、疾病若しくは癌又はそれらの症候を軽減する抗体を同定することによって、感染された疾病又は腫瘍の治療に有効である抗体を同定する方法である。好ましくは、本発明の前記抗体は、（ａ）ヒトＮＫ細胞の表面に存在する少なくとも２つの阻害的ヒトＫＩＲ受容体と交叉反応し、及び（ｂ）ヒト以外の霊長類のＮＫ細胞又はＫＩＲ受容体と交叉反応する抗体である。

さらに、本発明によって包含されるのは、生物学的試料又は生物中で、細胞表面上に阻害的ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を検出する方法であって、
ａ）検出可能な部分に抱合され、又は共有結合されている本発明の抗体に、前記生物学的試料又は生物を接触させる工程と；
ｂ）前記生物学的試料又は生物における前記抗体の存在を検出する工程と；
を含む方法である。

本発明は、細胞表面上に阻害的ＫＩＲを有するＮＫ細胞を試料から精製する方法であって、
ａ）細胞表面上に阻害的ＫＩＲを有する前記ＮＫ細胞が前記抗体に結合できる条件下で、固相支持体（例えば、ビーズ、マトリックスなど）に抱合され、又は共有結合された本発明の抗体を前記試料に接触させる工程と；
ｂ）固相支持体に抱合され、又は共有結合された前記抗体から、前記結合されたＮＫ細胞を溶出する工程と；
を含む方法も提供する。

さらなる側面において、本発明は、図１２に示されているように、抗体ＤＦ２００又は抗体Ｐａｎ２Ｄの軽鎖可変領域又は一以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、抗体、抗体断片又は抗体若しくは抗体断片の誘導体を提供する。さらに別の側面において、本発明は、ＤＦ２００若しくはＰａｎ２Ｄの軽鎖可変領域配列又はこれらの抗体の一方又両方の一以上の軽鎖可変領域ＣＤＲの全部又は実質的に全部と高度に類似している配列を含む、抗体、抗体断片又は抗体若しくは抗体断片の誘導体を提供する。

さらなる側面において、本発明は、図１３に示されているように、抗体ＤＦ２００の重鎖可変領域又は一以上の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、抗体、抗体断片又は抗体若しくは抗体断片の誘導体を提供する。さらに別の側面において、本発明は、ＤＦ２００の重鎖可変領域配列の全部又は実質的に全部と高度に類似している配列を含む、抗体、抗体断片又は抗体若しくは抗体断片の誘導体を提供する。

本発明の、これらの及びその他の有利な側面及び特徴は、さらに、本明細書のその他の箇所に記載されているであろう。

図１は、様々なヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基に結合するモノクローナル抗体ＤＦ２００を図示している。 図２は、Ｃｗ４陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲ２ＤＬ媒介性阻害を中和するモノクローナル抗体ＤＦ２００を図示している。 図３は、モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＤＦ２００のＦａｂ断片、並びにＣｗ４陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲ２ＤＬ媒介性阻害及びＣｗ３陽性標的細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ２／３陽性ＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲ２ＤＬ媒介性阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来抗体を図示している。 図４は、ＤＦ２００及びＥＢ６抗体のＦ（ａｂ’）_２断片の存在下における、ＨＬＡ Ｃｗ４陽性標的細胞のＮＫクローンによる細胞溶解の再構成を図示している。 図５及び図６は、モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）、ヒト抗体１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５及び１−６Ｆ１並びにＣｗ４陽性標的細胞（図５ではＣｗ４形質移入細胞、図６ではＥＢＶ細胞）に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲ２ＤＬ媒介性阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来抗体を図示している。 図５及び図６は、モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）、ヒト抗体１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５及び１−６Ｆ１並びにＣｗ４陽性標的細胞（図５ではＣｗ４形質移入細胞、図６ではＥＢＶ細胞）に対するＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲ２ＤＬ媒介性阻害を中和するＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的な従来抗体を図示している。 図７は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対する抗ＫＩＲ抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））分析によって得られた競合結合実験の結果を示すエピトープマップを図示しており、重複する円はＫＩＲ２ＤＬ１への結合の重複を表している。結果から、１−７Ｆ９は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対して、ＥＢ６及び１−４Ｆ１と競合するが、ＮＫＶＳＦ１及びＤＦ２００とは競合しないことが明らかである。次に、抗体１−４Ｆ１は、ＥＢ６、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１及び１−７ Ｆ９と競合する。抗体ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対して、ＤＦ２００、１−４Ｆ１及びＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＬ１に対して、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１及びＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。 図８は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対する抗ＫＩＲ抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析によって得られた競合結合実験の結果を示すエピトープマップを図示しており、重複する円はＫＩＲ２ＤＬ３への結合の重複を表している。結果は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対して、１−４Ｆ１が、ＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００及びｇｌ１８３及び１−７Ｆ９と競合することを示している。１−７Ｆ９は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対して、ＤＦ２００、ｇｌ１８３及び１−４Ｆ１と競合するが、ＮＫＶＳＦ１とは競合しない。ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対して、ＤＦ２００、１−４Ｆ１及びＧＬ１８３と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＬ３に対して、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１及び１−７Ｆ９と競合するが、ＧＬ１８３とは競合しない。 図９は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対する抗ＫＩＲ抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析によって得られた競合結合実験の結果を示すエピトープマップを図示しており、重複する円はＫＩＲ２ＤＳ１への結合の重複を表している。結果は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対して、抗体１−４Ｆ１は、ＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００及び１−７Ｆ９と競合することを示している。抗体１−７Ｆ９は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対して、１−４Ｆ１と競合するが、ＤＦ２００及びＮＫＶＳＦ１とは競合しない。ＮＫＶＳＦ１は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対して、ＤＦ２００及び１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。ＤＦ２００は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対して、ＮＫＶＳＦ１及び１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しない。 図１０は、カニクイザルＮＫ細胞へのｍＡｂｎｏ結合を実証するＮＫＶＳＦ１（ｐａｎ２Ｄ）ｍＡｂ滴定を図示している。カニクイザルＮＫ細胞（ＮＫバルク１６日）を異なる量のＰａｎ２Ｄ ｍＡｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ抱合されたヤギ（Ｆａｂ’）_２断片抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体とともにインキュベートした。陽性細胞のパーセントは、アイソタイプ対照（精製されたマウスＩｇＧ１）を用いて決定した。試料は、二つ組みで行った。平均蛍光強度＝ＭＦＩ。 図１１は、（Ａ）ＫＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質であるＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃの、ＨＬＡ−Ｃｗ３（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンドなし）又はＨＬＡ−Ｃｗ４（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンド）の何れかを発現するＬＣＬ７２１．２２１細胞への結合、および（Ｂ）ＫＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質であるＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃおよびＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃの、ＫＩＲ特異的ｍＡｂ（ＤＦ２００、ｐａｎ２Ｄ、ＥＢ６及びＧＬ１８３）への結合を図示している。ＫＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＨＬＡ−Ｃｗ４を発現するＬＣＬ７２１．２２１細胞に結合したが、ＨＬＡ−Ｃｗ４を発現する細胞には結合せず、正しいフォールディングであることが確認された。ＫＩＲ２ＤＬ１特異的ｍＡｂであるＤＦ２００およびｐａｎ２Ｄは、用量依存的様式でＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃに結合したが、ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃへの結合は減少した。 図１２は、抗体ＤＦ２００及びＰａｎ２Ｄ ｍＡｂの軽鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列を比較のために並列した図である。 図１３は、抗体ＤＦ２００の重鎖可変領域を表す。

発明の詳細な説明

抗体
本発明は、ヒト阻害的ＫＩＲ受容体の共通の決定基、好ましくは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基を結合し、これらのＫＩＲ受容体のうち少なくとも一つを発現するＮＫ細胞の増強を引き起こす新規抗体及び断片又はそれらの誘導体を提供する。本発明は、予想外の結果を示し、特にヒト対象において、ＮＫをベースとした新規且つ効果的な療法に対する道筋を開く、このような交叉反応する中和抗体を作製できることを初めて開示する。好ましい実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１ではない。

本発明において、「共通の決定基」とは、ヒト阻害的ＫＩＲ受容体の複数の遺伝子産物によって共有される決定基又はエピトープを表す。好ましくは、共通の決定基は、ＫＩＲ２ＤＬ受容体グループの少なくとも２つのメンバーによって共有される。より好ましくは、前記決定基は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３によって共有される。本発明の幾つかの抗体は、ＫＩＲ２ＤＬの複数の遺伝子産物を認識することに加えて、ＫＩＲ３ＤＬ受容体グループの遺伝子産物など、他の阻害的ＫＩＲ上に存在する決定基も認識する。決定基又はエピトープは、前記メンバーによって共有されるペプチド断片又はコンフォメーションエピトープを表し得る。より具体的な実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体ＤＦ２００によって認識されるエピトープと実質的に同一のエピトープに特異的に結合する。この決定基は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３上にともに存在する。

本発明において、共通の決定基を「結合する」抗体という用語は、特異性及び／又は親和性をもって、前記決定基を結合する抗体を表す。

本明細書において使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を表す他、特段の記載がなければ、又は明確に反対の記載がなければ、前記ポリクローナル及びモノクローナル抗体の断片及び誘導体も表す。重鎖中の定常ドメインの種類に応じて、完全長の抗体は、典型的には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのうち幾つかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのように、サブクラス又はイソタイプにさらに分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」及び「μ」と称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭは、生理的な状況において最も一般的な抗体であり、且つ実験室条件で最も簡単に作製されるので、本発明で使用される抗体の好ましいクラスである。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の最終目標の一つは、ＮＫ細胞を枯渇させることなく、阻害的ＫＩＲとその対応するＨＬＡリガンドとの相互作用をインビボで遮断することなので、低エフェクター機能を媒介するＦｃ受容体に対応するアイソタイプ（ＩｇＧ４など）が典型的には好ましい。

本発明の抗体は、当該技術で公知の様々な技術によって作製することができる。典型的には、本発明の抗体は、ヒト以外の動物、好ましくはマウスを、阻害的ＫＩＲポリペプチド、好ましくはＫＩＲ２ＤＬポリペプチド、より好ましくはヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含む免疫原で免疫することによって作製される。前記阻害的ＫＩＲポリペプチドは、ヒト阻害的ＫＩＲポリペプチドの完全長配列、又はそれらの断片若しくは誘導体、典型的には免疫原性断片（すなわち、阻害的ＫＩＲ受容体を発現している細胞の表面上に暴露されるエピトープを含むポリペプチドの一部）を含み得る。このような断片は、典型的には、成熟したポリペプチド配列の少なくとも約７個、さらに好ましくは成熟したポリペプチド配列の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含有する。断片は、典型的には、受容体の細胞外ドメインに実質的に由来する。さらに好ましいのは、完全長ＫＩＲＤＬポリペプチドの細胞外Ｉｇドメインの少なくとも一つ、より好ましくは両方を含み、ＫＩＲ２ＤＬ受容体中に存在する少なくとも一つのコンフォメーションエピトープを模倣することができるヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドである。別の実施形態において、前記ポリペプチドは、ＫＩＲ２ＤＬ１ポリペプチドのアミノ酸１から２２４位の細胞外Ｉｇドメインの、少なくとも約８つの連続するアミノ酸を含む（ＫＩＲ遺伝子ファミリーを記載するＰＲＯＷウェブサイトに従ったアミノ酸の付番、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm）。

最も好ましい実施形態において、前記免疫原は、脂質膜中に、典型的には細胞の表面に、野生型ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、前記免疫原は、必要に応じて処理又は溶解された、無傷のＮＫ細胞、特に無傷のヒトＮＫ細胞を含む。

ヒト以外の哺乳動物を抗原で免疫化する工程は、マウスでの抗体の産生を刺激するために、当該技術で周知の任意の様式で実施することができる（例えば、E. Harlow and D. Lane, Antibodies:A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照）。次いで、必要に応じて、完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとともに、緩衝液中に、免疫原を懸濁し、又は溶解する。免疫原の量、緩衝液の種類及びアジュバントの量を決定する方法は、当業者に周知であり、いかなる意味においても、本発明を限定するものではない。これらのパラメータは、異なる免疫原については異なる場合があり得るが、容易に解明される。

同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫化の位置及び頻度も、当該技術において周知である。典型的な免疫化プロトコールでは、１日目に、ヒト以外の動物に抗原を腹腔内注射し、約１週後に再度抗原を腹腔内注射する。この後、必要に応じて、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとともに、２０日目前後に、抗原のリコール注射を行う。リコール注射は、静脈内に行われ、連続数日間、反復することができる。その後、通例、アジュバントなしに、静脈内又は腹腔内の何れかで、４０日目に強化注射を行う。このプロトコールによって、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が産生される。免疫化に使用される抗原に対して誘導される抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコールも使用することができる。

ポリクローナル抗体の調製の場合、免疫されたヒト以外の動物から血清を得て、その中に存在する抗体を周知の技術によって単離する。阻害的ＫＩＲ受容体と反応する抗体を得るために、固相支持体に連結された上記免疫原の何れかを用いて、血清をアフィニティー精製することもできる。

別の実施形態では、免疫化されていないヒト以外の哺乳動物からリンパ球を単離し、インビトロで増殖し、次いで、細胞培養において免疫原に曝露する。次いで、リンパ球を採集し、以下に記載された融合工程を実施する。

モノクローナル抗体の場合、次の工程は、免疫されたヒト以外の哺乳動物から脾細胞を単離した後、これらの脾細胞を不死化された細胞と融合して、抗体を産生するハイブリドーマを形成させる。ヒト以外の哺乳動物からの脾細胞の単離は当該技術において周知であり、典型的には、麻酔されたヒト以外の哺乳動物から脾臓を取り出し、脾臓を小片に切断し、脾臓カプセル(splenic capsule)から細胞ろ過器のナイロンメッシュを通して、脾細胞を適切な緩衝液中に絞り取り、単一細胞の懸濁液を得る。細胞を洗浄し、遠心し、全ての赤血球を溶解する緩衝液中に再懸濁する。この溶液を再び遠心し、最後に、ペレット中に残存するリンパ球を新鮮な緩衝液中に再懸濁する。

一旦単離され、単一の細胞懸濁液中に存在した時点で、リンパ球は不死化細胞株に融合することができる。これは、典型的には、マウスのミエローマ細胞株であるが、ハイブリドーマの作製に有用な他の多くの不死化細胞株も、当該技術において公知である。好ましいマウスのミエローマ株には、「Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A」から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、並びに「American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A」から入手可能なＸ６３、Ａｇ８６５３及びＳＰ−２細胞から得られるマウスのミエローマ株が含まれるが、これらに限定されるものではない。融合は、ポリエチレングリコールなどを用いて行われる。次いで、得られたハイブリドーマを、融合されていない親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一以上の物質を含有する選択培地中で増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如していれば、ハイブリドーマに対する培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑える物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むであろう。

ハイブリドーマは、典型的には、マクロファージの支持細胞上で増殖される。マクロファージは、脾細胞を単離するために使用されるヒト以外の哺乳動物の同腹仔から得ることが好ましく、典型的には、ハイブリドーマを播種する数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激される。融合法は、「Goding, “Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,” pp. 59-103 (Academic Press, 1986)」に記載されており、参照により、その開示内容は本明細書に援用される。

前記細胞は、コロニー形成と抗体産生に十分な時間、選択培地中で増殖させる。これは、通常、約７日から約１４日の間である。次いで、複数の阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交叉反応する抗体の産生について、このハイブリドーマコロニーをアッセイする。その中でハイブリドーマが増殖されるウェルに適合できる任意のアッセイを使用し得るが、このアッセイは、典型的には、比色分析のＥＬＩＳＡタイプのアッセイである。他のアッセイには、免疫沈降及びラジオイムノアッセイが含まれる。一以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定するために、所望の抗体の産生に関して陽性のウェルを調べる。二以上のコロニーが存在すれば、細胞を再度クローニングし、単一の細胞のみが、所望の抗体を産生するコロニーを確実に生じるように増殖させ得る。モノクローナル抗体が唯一つ検出され、産生されるように、典型的には、単一の明白なコロニーを有する陽性細胞を再クローニングし、再アッセイする。抗体は、例えば、「Ward et al., Nature, 341 (1989) p. 544」に開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーを選択することによって作製することもできる。

本発明の抗体は、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害、具体的には、ＫＩＲ２ＤＬ受容体によって媒介される阻害、より具体的には、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方による阻害を中和することができる。このように、これらの抗体は、ＭＨＣクラスＩ分子と相互作用したときに、少なくとも部分的に且つ検出可能に、ＫＩＲ受容体によって媒介される阻害的シグナル伝達経路を遮断するという意味で、「中和」又は「阻害的」抗体である。より重要なことは、これらの抗体が高い効力で様々な対象に使用できるように、この阻害活性が、数個のタイプの阻害的ＫＩＲ受容体、好ましくは数個のＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物、より好ましくは少なくともＫＩＲ２ＤＬ１とＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方に対して表される。ＫＩＲによって媒介される、ＮＫ細胞の細胞毒性の阻害は、結合又は細胞アッセイなど、様々なアッセイ又は検査によって評価することができる。

複数の阻害剤ＫＩＲ受容体と交叉反応する抗体がいったん同定されると、無傷のＮＫ細胞中のＫＩＲ受容体の阻害的効果を中和する能力について、抗体を検査することができる。特定の変異形において、ＫＩＲ２ＤＬ陽性ＮＫクローンによるＨＬＡ−Ｃ陽性標的の溶解を前記抗体が再生させる能力によって、中和活性を表すことができる。別の特定の実施形態では、抗体の中和活性は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３（又は密接に関連するＫＩＲ２ＤＬ２）受容体へのＨＬＡ−Ｃ分子の結合を阻害する抗体の能力によって定義され、さらに好ましくは、
−Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７及びＣｗ８から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子の（又は８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ分子の）、ＫＩＲ２ＤＬ２／３への結合；並びに
−Ｃｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５及びＣｗ６から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子の（又は８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ分子の）、ＫＩＲ２ＤＬ１への結合；
を変化させる抗体の能力として定義される。

別の変異形では、本発明の抗体の阻害的活性は、本明細書に記載されている実施例に開示されているように、細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて評価することができる。

別のバリアントでは、ＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦ産生）を刺激するために、試験抗体、及びＮＫ集団のＫＩＲ分子によって認識される一つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞株とともに、ＮＫ細胞がインキュベートされるサイトカイン放出アッセイにおいて、本発明の抗体の阻害的活性を評価することができる。典型的なプロトコールでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生は、培養から約４日後に、フローサイトメトリーによる細胞表面及び細胞質内の染色及び分析によって、評価される。簡潔に述べると、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）は、少なくとも約４時間の培養の間、約５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加することができる。次いで、透過処理（ＩｎｔｒａＰｒｅｐ^ＴＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＰＥ−抗−ＩＦＮ−γ又はＰＥ−ＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による染色の前に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６ ｍＡｂとともに細胞をインキュベートすることができる。ポリクローナル活性化されたＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γ産生は、ＥＬＩＳＡ(GM-CSF:DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN;IFN-γ:OptE1A set, Pharmingen)を用いて、上清中で測定することができる。

本発明の抗体は、ＫＩＲによって媒介される、ＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を部分的に又は完全に中和し得る。本明細書によって使用される「ＫＩＲによって媒介される、ＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和する」という用語は、細胞毒性の古典的なクロム放出試験によって測定した場合、所定のＫＩＲを発現するＮＫ細胞集団を、同族のＭＨＣクラスＩ分子（ＮＫ細胞上に発現されているＫＩＲによって認識される。）を発現する標的細胞と接触させたときに、抗体なしで得られた特異的な溶解レベルに比べて、それらのＫＩＲによって遮断されないＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を使用した場合と同じ比で得られる特異的溶解の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％以上（例えば、約２５から１００％）まで増加させる能力を意味する。例えば、本発明の好ましい抗体は、一致した、又はＨＬＡ適合性の、又は自家の標的細胞集団（すなわち、前記抗体の不存在下で、ＮＫ細胞によって効果的に溶解されないと思われる細胞集団）の溶解を誘導することができる。従って、本発明の抗体は、インビボでＮＫ細胞活性を促進すると定義することもできる。

あるいは、「ＫＩＲによって媒介される阻害を中和する」という用語は、ＮＫ細胞クローン又は一若しくは数個の阻害的ＫＩＲを発現する形質移入体と、ＮＫ細胞上のＫＩＲの一つによって認識されるＨＬＡ対立遺伝子を一つだけ発現する標的細胞とを使用するクロムアッセイにおいて、抗体を用いて得られた細胞毒性のレベルが、公知の遮断抗ＭＨＣクラスＩ分子（Ｗ６／３２抗ＭＨＣクラスＩ抗体など）を用いたときに得られた細胞毒性の、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％以上（例えば、約２５から１００％）となるべきことを意味する。

特定の実施形態において、前記抗体は、（ハイブリドーマＤＦ２００によって産生される）モノクローナル抗体ＤＦ２００と実質的に同じエピトープを結合する。このような抗体は、本明細書では、「ＤＦ様抗体」と称される。さらに好ましい実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。より好ましくは、本発明の「ＤＦ２００様抗体」は、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１以外の抗体である。最も好ましい抗体は、（ハイブリドーマＤＦ２００によって産生される）モノクローナル抗体ＤＦ２００である。

対象の抗体と「実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する」という用語は、その抗体が対象の抗体と「競合する」ことを意味する。モノクローナル抗体ＤＦ２００と「実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する」という用語は、その抗体がＤＦ２００と「競合する」ことを意味する。一般的に、対象のモノクローナル（例えば、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、１７Ｆ９）抗体と「実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する」抗体とは、一以上の任意のＫＩＲ分子に関して、好ましくは、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３からなる群から選択されるＫＩＲ分子に関して、その抗体が、前記対象の抗体と「競合する」ことを意味する。別の例では、対象の抗体と実質的に同一の、ＫＩＲ２ＤＬ１分子上のエピトープ又は決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１への結合に関して、前記対象の抗体と「競合する」。対象の抗体と実質的に同一の、ＫＩＲ２ＤＬ２／３分子上のエピトープ又は決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ２／３への結合に関して、前記対象の抗体と「競合する」。

対象の抗体と「実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する」という用語は、前記対象の抗体が特異的に結合するあらゆる全てのＫＩＲ分子に関して、ある抗体が前記対象の抗体と「競合する」ことを意味する。モノクローナル抗体ＤＦ２００と「実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する」という用語は、ＤＦ２００が特異的に結合する、あらゆる全てのＫＩＲ分子に関して、ある抗体がＤＦ２００と「競合する」ことを意味する。例えば、モノクローナル抗体ＤＦ２００又はＮＫＶＳＦ１と実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＳ１及びＫＩＲ２ＤＳ２への結合に関して、それぞれ、前記ＤＦ２００又はＮＫＶＳＦ１と「競合する」。

本明細書に記載されているモノクローナル抗体と実質的に又は本質的に同一のエピトープに結合する一又は複数の抗体を同定することは、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのうち任意の一つを用いて、容易に決定することができる。このような多数のアッセイは、一般的に実施され、当該技術で周知である（例えば、米国第５，６６０，８２７号を参照、１９９７年８月２６日に付与、参照により、本明細書に明確に援用される。）。本明細書に記載されているモノクローナル抗体と同一又は実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するために、本明細書に記載されている抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、全く必要でないことが理解されるであろう。

例えば、検査すべき試験抗体が、異なる採取源の動物から取得され、あるいは、異なるＩｇアイソタイプの抗体である場合には、対照（例えば、ＤＦ２００）及び試験抗体が混合（又は予め吸着）され、ＫＩＲ２ＤＬ１とＫＩＲ２ＤＬ２／３（何れも、ＤＦ２００によって結合されることが知られている。）の両方を含有する試料に与えられる、単純な競合アッセイを使用することができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティングを基本とするプロトコール、及びＢＩＡＣＯＲＥの使用（例えば、実施例の部に記載されているように）は、このような単純な競合研究での使用に適している。

ある種の実施形態では、阻害的ＫＩＲ抗原試料に与える前に、ある期間にわたって、様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０又は約１：１００）を対照抗体（例えば、ＤＦ２００）と予め混合するであろう。別の実施形態では、ＫＩＲ抗原試料への曝露の間、対照抗体及び様々な量の試験抗体を単純に混合することができる。結合した抗体を遊離抗体と区別することができ（例えば、非結合抗体を除去するために、分離又は洗浄技術を使用することによって）、及びＤＦ２００を試験抗体から区別することができる限り（例えば、種特異的若しくはアイソタイプ特異的二次抗体を用いることによって、又は検出可能な標識で特異的に標識されているＤＦ２００によって）、試験抗体は、２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ抗原へのＤＦ２００の結合を減少させるかどうかを決定することができ、試験抗体がＤＦ２００と実質的に同一のエピトープを認識することが示唆されるであろう。完全に無関係な抗体の不存在下での（標識された）対照抗体の結合は、対照の高値としての役割を果たすことができる。対照の低値は、正確に同じ種類（ＤＦ２００）の非標識抗体とともに、標識（ＤＦ２００）抗体をインキュベートすることによって取得することができ、この場合、競合が起こり、標識抗体の結合を減少させるであろう。試験アッセイでは、試験抗体の存在下において、標識された抗体の反応性が有意に減少することが、試験抗体が実質的に同じエピトープを認識する（すなわち、標識された（ＤＦ２００）抗体と「交叉反応する」）ことの指標となる。約１：１０から約１：１００の間の任意のＤＦ２００：試験抗体比で、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原の各々へのＤＦ２００の結合を、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、又は、より好ましくは少なくとも約７０％（例えば、約６５から１００％）減少させる全ての試験抗体は、ＤＦ２００と実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する抗体と考えられる。好ましくは、このような試験抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ抗原の各々へのＤＦ２００の結合を、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）減少させるであろう。

競合は、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。このような試験では、所定のＫＩＲを有する細胞は、例えば、まずＤＦ２００とともにインキュベートし、次いで、蛍光色素又はビオチンで標識された試験抗体とともにインキュベートすることができる。飽和量のＤＦ２００とともにプレインキュベーションを行った際に得られた結合が、ＤＦ２００とのプレインキュベーションを行わない抗体によって得られる結合（蛍光を用いて測定される。）の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％）であれば、抗体は、ＤＦ２００と競合すると呼ばれる。あるいは、飽和量の試験抗体とともにプレインキュベーションを行った細胞に対して、（蛍光色素又はビオチンによって）標識されたＤＦ２００を用いて得られた結合が、抗体とのプレインキュベーションを行わずに得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％）であれば、抗体は、ＤＦ２００と競合すると呼ばれる。

試験抗体を予め吸着し、両ＫＩＲ２ＤＬ１とＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方が固定化されている表面に、飽和濃度で与えられる単純な競合アッセイも、有利に使用することができる。単純な競合アッセイにおける表面は、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥチップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、ＤＦ２００）を、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３の飽和濃度で、前記表面に接触させ、対照抗体のＫＩＲ２ＤＬ１とＫＩＲ２ＤＬ２／３表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の不存在下における、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下において、対照抗体によるＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面の結合が有意に減少することが、試験抗体が対照抗体と「交叉反応する」ように、試験抗体が対照抗体と実質的に同一のエピトープを認識することを示す。ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原の各々への対照（ＤＦ２００など）抗体の結合を、少なくとも約３０％、又はより好ましくは約４０％減少させる全ての試験抗体は、対照（例えば、ＤＦ２００）と実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合する抗体と考えることができる。好ましくは、このような試験抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ抗原の各々への対照抗体（例えば、ＤＦ２００）の結合を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上）減少させるであろう。対照抗体と試験抗体の順序は入れ替えることができることが理解されるであろう。すなわち、まず対照抗体を表面に結合することができ、試験抗体は、その後、競合アッセイにおいて、前記表面と接触される。第二の抗体（抗体は交叉反応すると仮定する。）について見られた結合の減少の程度がさらに大きくなると予想されるので、ＫＩＲ２Ｄｌ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３抗原に対してさらに高い親和性を有する抗体を、まず、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３含有表面に結合することが好ましい。このようなアッセイのさらなる例は、実施例、及び、例えば、「Saunal and Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183:33-41」（参照により、その内容が本明細書に援用される。）に記載されている。

例示のために、ＤＦ２００に関して記載されているが、上記免疫学的スクリーニングアッセイは、ＮＫＶＳＦ１、１−７Ｆ９、ＥＢ６、ＧＬ１８３及び本発明に係る他の抗体と競合する抗体を同定するために使用できることも理解されるであろう。

脊椎動物又は細胞中で免疫化及び抗体の産生が行われたら、抗体を単離するために、特許請求の範囲に記載されているように、具体的な選択工程を実施することができる。この点に関して、具体的な実施形態において、本発明は、
ａ）阻害的ＫＩＲ２ポリペプチド含む免疫原で、ヒト以外の哺乳動物を免疫する工程と；
ｂ）前記免疫された動物から、前記ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを結合する抗体を調製する工程と；
ｃ）少なくとも２つの異なる阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物と交叉反応する、（ｂ）の抗体を選択する工程と；
ｄ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対して、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができる、（ａ）の抗体を選択する工程と；
を含む、このような抗体を作製する方法にも関する。少なくとも２つの異なる阻害的ＫＩＲ遺伝子産物と交叉反応する抗体の選択は、例えば、上記のように、２以上の異なる阻害的ＫＩＲ抗原に対する抗体をスクリーニングすることによって達成することができる。

さらに好ましい実施形態において、工程（ｂ）で調製される抗体はモノクローナル抗体である。このように、本明細書において使用される「前記免疫された動物から抗体を調製する」という用語には、免疫された動物からＢ細胞を取得すること、及び抗体を発現するハイブリドーマを産生するためにこれらのＢ細胞を使用すること、並びに免疫された動物の血清から抗体を直接取得することが含まれる。別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）で選択される抗体は、少なくともＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３と交叉反応する抗体である。

さらに別の好ましい実施形態では、工程（ｄ）で選択された抗体は、ＫＩＲによって遮断されないＮＫ細胞を、同じエフェクター／標的比で用いたときに得られる溶解又は細胞毒性と比較して、同族のＨＬＡクラスＩ分子を発現する標的細胞に対して、（標準的なクロム放出アッセイで測定した場合に）該抗体によって認識される少なくとも一つのＫＩＲを提示するＮＫ細胞によって媒介される少なくとも約１０％の特異的溶解を引き起こし、好ましくは、少なくとも約４０％の特異的溶解、少なくとも約５０％の特異的溶解、又はより好ましくは、少なくとも約７０％の特異的溶解（例えば、約６０から１００％の特異的溶解）を引き起こす。あるいは、一若しくは数個の阻害的ＫＩＲを発現するＮＫ細胞クローンと、ＮＫクローン上のＫＩＲの一つによって認識されるＨＬＡ対立遺伝子を一つだけ発現する標的細胞とを使用するクロムアッセイで使用したときに、工程（ｄ）で選択された抗体は、抗体を用いて得られた細胞毒性のレベルは、遮断抗ＭＨＣクラスＩ ｍＡｂ（Ｗ６／３２抗ＭＨＣクラスＩ ｍＡｂなど）を用いたときに得られた細胞毒性の、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％以上となるべきである。

直前に記載されている方法の工程（ｃ）と（ｄ）の順序は、変更することができる。必要に応じて、前記方法は、前記工程に加えて又は前記工程に代えて、例えば、本明細書の他の部分に記載されているように、前記モノクローナル抗体の断片を作製する工程又は前記モノクローナル抗体若しくはこのような断片の誘導体を作製する追加の工程をさらに含み得る。

好ましい実施形態において、本発明の適用可能な方法に従って抗体を作製するために使用される、ヒト以外の動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物である。また、ヒト以外の哺乳動物は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ^ＴＭ（Ａｂｇｅｎｉｘ）又はＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ^ＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ）などの、「ヒト」抗体を産生するように、遺伝的に改変し、又は操作することができる。

別の改変において、本発明は、抗体を取得する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物と交叉反応するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、又はそれらのうち何れかの誘導体を、ライブラリー又はレパートリーから選択する工程と；
（ｂ）前記少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ２ＤＬ受容体遺伝子産物を発現するＮＫ細胞の集団に対して、ＫＩＲによって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を中和することができる、（ａ）の抗体、断片又は誘導体を選択する工程と；
を含む方法をさらに提供する。

前記レパートリーは、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によって必要に応じて提示される、抗体又はその断片のあらゆる（組換え）レパートリーであり得る。阻害的抗体の選択は、上に開示されているように、及び実施例においてさらに説明されているように、実施することができる。

別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する決定基を結合して、前記受容体の阻害的活性を中和することができる抗体を産生する、ヒト以外の宿主から得られるＢ細胞を含む、ハイブリドーマを提供する。より好ましくは、本発明の該側面のハイブリドーマは、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１を産生するハイブリドーマではない。本発明の該側面に係るハイブリドーマは、ヒト以外の免疫された哺乳動物から得られる脾細胞を不死化細胞株と融合させることによって、上述のように作製することができる。この融合によって産生されたハイブリドーマは、本明細書の他の箇所に記載されているように、このような交叉反応抗体の存在に関してスクリーニングすることができる。好ましくは、前記ハイブリドーマは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基を認識し、これらのＫＩＲ受容体のうち少なくとも一つを発現するＮＫ細胞の増強を引き起こす抗体を産生する。より好ましくは、前記ハイブリドーマは、ＤＦ２００と実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合して、ＮＫ細胞活性を増強する抗体を産生する。最も好ましくは、このハイブリドーマは、モノクローナル抗体ＤＦ２００を産生するハイブリドーマＤＦ２００である。

本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されているハイブリドーマは、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などの、適切な培地中で、さらに大量に増殖させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水癌として、インビボで増殖させることができる。

所望のモノクローナル抗体を産生するまで十分に増殖させた後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地（又は腹水液）を細胞から分離し、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。典型的には、精製は、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ若しくはプロテインＧ−セファロース、又はアガロース又はセファロースビーズなどの固相支持体に連結された抗マウスＩｇを用いたクロマトグラフィーによって達成される（全て、例えば、「Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC」に記載されており、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。）。結合された抗体は、典型的には、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシン又は酢酸緩衝液）を使用することによって、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出され、抗体含有画分を直ちに中和する。必要に応じて、これらの画分をプールし、透析し、濃縮する。

別の実施形態によれば、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する決定基を結合する抗体をコードするＤＮＡが、本発明のハイブリドーマから単離され、適切な宿主に形質移入するために、適切な発現ベクター中に配置される。次いで、抗体、又はそれらの変異形（ヒト化された様式のモノクローナル抗体、抗体の活性断片、又は抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体など）を組換え産生するために、宿主を使用する。好ましくは、本実施形態で使用されるＤＮＡは、少なくとも２つの異なるＫＩＲ２ＤＬ遺伝子産物上に存在する決定基を認識し、これらのＫＩＲ受容体のうち少なくとも一つを発現するＮＫ細胞の増強を引き起こす抗体をコードする。より好ましくは、前記ＤＮＡは、ＤＦ２００と実質的に同一のエピトープ又は決定基に結合して、ＮＫ細胞活性を増強する抗体をコードする。最も好ましくは、このＤＮＡは、モノクローナル抗体ＤＦ２００をコードする。

本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定される。ＤＮＡを単離したら、ＤＮＡは発現ベクター中に配置することができ、次いで、発現ベクターを宿主細胞（形質移入が行われていない状態で、免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．コリ細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞など）中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当該技術で周知である（例えば、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); and Pluckthun, Immunol. Revs., 130, pp. 151 (1992)を参照）。

モノクローナル抗体の断片及び誘導体
本発明の抗体、好ましくは、ＤＦ−２００様抗体の断片及び誘導体（別段の記載又は明確に反対の記載がなければ、本願で使用される「抗体」という用語に包含される。）、当該技術で公知である技術によって作製することができる。「免疫反応性断片」は、無傷の抗体の一部（一般的には、抗原結合部位又は可変領域）を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ断片；二重特異性抗体；連続するアミノ残基の一つの連続配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本明細書において、「一本鎖抗体断片」又は「一本鎖ポリペプチド」と称される。）である任意の抗体断片（（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）軽鎖可変ドメインを一つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有し、付随する重鎖部分を伴わないそれらの断片、及び（３）重鎖可変領域を一つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、又は重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有し、付随する軽鎖部分を伴わないそれらの断片などが含まれるが、これらに限定されない。）；並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片は、従来の技術に従って、前記単離された抗体をプロテアーゼ消化することによって作製することができる。免疫反応性断片は、公知の方法を用いて修飾することが可能であり、例えば、インビボでのクリアランスを遅らせ、より望ましい薬物動態特性を得るために、前記断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾し得ることを理解できるであろう。ＰＥＧをＦａｂ’断片に連結し、部位特異的に抱合する方法は、例えば、「Leong et al, Cytokine 16(3):106-119 (2001) and Delgado et al, Br. J. Cancer 73(2):175-182 (1996)」（その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。）に記載されている。

ある側面において、本発明は、図１２に示されている、ＤＦ−２００の軽鎖可変領域配列を含む、抗体、抗体断片又は抗体誘導体を提供する。別の側面において、本発明は、図１２に示されている、Ｐａｎ２Ｄの軽鎖可変領域配列を含む、抗体、抗体断片又は抗体誘導体を提供する。別の側面において、本発明は、図１２に示されている、ＤＦ−２００の一又は複数の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、抗体、抗体断片又は抗体誘導体を提供する。さらに別の側面において、本発明は、図１２に示されている、Ｐａｎ２Ｄの一又は複数の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、抗体、抗体断片又はそれらの誘導体を提供する。このような配列の機能的な変異形／類縁体は、これらの開示されたアミノ酸配列中に、標準的な技術を用いて、適切な置換、付加及び／又は欠失を行うことによって作製することが可能であり、これには配列の比較が役に立つ場合がある。このように、例えば、Ｐａｎ２ＤとＤＦ−２００の間で保存されているＣＤＲ残基は、本明細書に開示されている他の抗体に関してこれらの抗体が有する、競合プロファイルの差に寄与しておらず（但し、Ｐａｎ２ＤとＤＦ−２００は競合する。）、従って、それらの特定の各エピトープに対するこれらの抗体の特異性に寄与し得ない限り、このような残基は修飾に適した標的であり得る。別の側面では、これらの抗体の一つの配列中に残基が存在するが、別の抗体には存在しない位置は、欠失、置換及び／又は挿入に適切であり得る。

ある側面において、本発明は、図１３に示されている、ＤＦ−２００の重鎖可変領域配列を含む、抗体、抗体断片及び抗体誘導体を提供する。別の側面において、本発明は、図１３に示されている、ＤＦ−２００の一又は複数の重鎖可変領域ＣＤＲを含む、抗体、抗体断片及びそれらの抗体誘導体を提供する。このような配列の機能的な変異形／類縁体は、これらの開示されたアミノ酸配列中に、標準的な技術を用いて、適切な置換、付加及び／又は欠失を行うことによって作製することが可能であり、これには配列の比較が役に立つ場合がある。別の側面では、これらの抗体の一つの配列中に残基が存在するが、別の抗体には残基が存在しない位置は、欠失、置換及び／又は挿入に適切であり得る。

あるいは、本発明の抗体、好ましくはＤＦ−２００様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、本発明の断片をコードするように修飾することができる。次いで、修飾されたＤＮＡは発現ベクター中に挿入され、適切な細胞を形質転換し、又は形質移入するために使用され、次いで、前記細胞が所望の断片を発現する。

別の実施形態において、本発明の抗体、好ましくはＤＦ−２００様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、例えば、相同な非ヒト配列に代えて、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（e.g., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)）、又は、非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、発現ベクター中に挿入する前に修飾することができる。このように、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代用とされる。

このように、別の実施形態によれば、本発明の抗体、好ましくはＤＦ−２００様抗体は、ヒト化される。本発明の抗体の「ヒト化された」形態は、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又は、マウス免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、それらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２又は抗体の他の抗原結合部分配列など）である。通例、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、元の抗体の望ましい特異性、親和性及び能力を維持しつつ、元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されることができる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は導入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列中の何れにも存在しない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良し、最適化するために施される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体中では、元の抗体のＣＤＲ領域に対応する全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域及び全て又は実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、通例ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、「Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323(1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992)」を参照されたい。

本発明の抗体をヒト化する方法は、当該技術で周知である。一般的に、本発明のヒト化抗体は、元の抗体からヒト化抗体中に導入されたアミノ酸残基を一又は複数有する。これらのマウス又は他の非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と称され、通例、「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って、実施することができる（Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)）。従って、このような「ヒト化」抗体は、元の抗体由来の対応する配列によって、原型のヒト可変ドメインが僅かに置換されているキメラ抗体である（Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567）。実際、本発明のヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基と、おそらくは幾つかのＦＲ残基とが、元の抗体中の類似の部位から得られる残基によって置換されているヒト抗体である。

ヒト化抗体の製造に使用すべきヒト可変ドメインの選択（軽鎖及び重鎖ドメインの両方）は、抗原性を減少させるのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、本発明の抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される(Sims et al., J. Immunol., 151, pp. 2296(1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901(1987))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られるフレームワークを使用する。同じフレームワークを、数個の異なるヒト化抗体に対して使用することができる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, pp.4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51, pp. 1993))。

さらに、複数の阻害的ＫＩＲ受容体に対する高親和性と他の好ましい生物特性を保持しながら、抗体をヒト化することが重要である。この最終目標を達成するために、好ましい方法に従い、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の予想三次元立体構造を描き、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることによって、候補免疫グロブリン配列の機能において、残基が果たしていると思われる役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原への結合能に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、所望の抗体特性（標的抗原に対する増加した親和性など）が達成されるように、コンセンサス配列及び移入配列から、ＦＲ残基を選択し、合体させることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与える上で、直接且つ最も大きく関与している。

「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫化に使用されるマウスとして、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）(Abgenix, Fremont, CA)を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって、免疫グロブリン遺伝子が置換されている、本発明のマウス宿主である。このため、本マウスによって産生される抗体、又は本マウスのＢ細胞から作製されるハイブリドーマ中で産生される抗体は、すでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号（参照により、その全体が本明細書に援用される。）に記載されている。ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Medarex）を用いて、類似の方法を行うことが可能である。

ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作された他のトランスジェニック動物を免疫化のために使用することによって(Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255)、又はファージディスプレイ法を使用して、抗体レパートリーを選択することによって、様々な他の技術に従って作製することもできる。このような技術は当業者に公知であり、本願に開示されているモノクローナル抗体から出発して、実施することができる。

本発明の抗体、好ましくはＤＦ２００様抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）（キメラ抗体においては、重鎖及び／又は軽鎖の一部は元の抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは別の種に由来し、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である。）に誘導化することも可能であり、所望の生物活性を発揮する限りにおいて、かかる抗体の断片に誘導化することも可能である(Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851 (1984)。

本発明の範囲に属する他の誘導体には、機能化された抗体（すなわち、トキシン（リシン、ジフテリアトキシン、アブリン及びシュードモナスのエキソトキシンなど）、検出可能な部分（蛍光部分、放射性同位体又は造影剤など）、又は固相支持体（アガロースビーズなど）に抱合され、又は共有結合されている抗体）が含まれる。これらの他の因子を抗体に抱合又は共有結合させる方法は、当該技術で周知である。

トキシンへの抱合は、その細胞表面上の交叉反応性ＫＩＲ受容体の一つを提示するＮＫ細胞を標的として死滅させるのに有用である。本発明の抗体が、このような細胞の細胞表面に結合すると、抗体は内部に取り込まれて、細胞の内部でトキシンが放出され、その細胞を選択的に死滅させる。このような使用は、本発明の別の実施形態である。

本発明の抗体を診断目的で使用する場合には、検出可能な部分への抱合が有用である。このような目的には、その細胞表面上に交叉反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在について、生物学的試料をアッセイすること、及び交叉反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞の存在を生物中に検出することが含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなアッセイ法及び検出法も、本発明の別の実施形態である。

固相支持体への本発明の抗体の抱合は、その細胞表面上に交叉反応性ＫＩＲを有するＮＫ細胞を、生体液などの採取源からアフィニティー精製するためのツールとして有用である。この精製法は、本発明の別の実施形態であり、得られたＮＫ細胞の精製集団も同様である。

別の実施形態において、少なくとも２つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体遺伝子産物上に存在する共通の決定基を結合し、前記二つの異なるヒト阻害的ＫＩＲ受容体の少なくとも一つを発現するＮＫ細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性の、ＫＩＲによって媒介される阻害を中和することができる本発明の抗体（ＮＫＶＳＦ１を含む。）を、単独で、又は動物に誘導して送達するための別の物質とともに、リポソーム（イムノリポソーム）中に取り込むことができる。このような他の物質には、遺伝子治療のために遺伝子を送達するための核酸；又はＮＫ細胞中の遺伝子を抑制するためにアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ若しくはｓｉＲＮＡを送達するための核酸；又はＮＫ細胞を標的として死滅させるための毒素若しくは薬物が含まれる。

それらの公表されている結晶構造(Maenaka et al. (1999), Fan et al. (2001), Boyington et al. (2000))に基づく、ＫＩＲ２ＤＬ１、−２及び−３（ＫＩＲ２ＤＬ１−３）の細胞外ドメインのコンピュータモデリングは、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ１−３交叉反応性マウスモノクローナル抗体ＤＦ２００とＮＫＶＳＦ１との相互作用において、一部の領域又はＫＩＲ２ＤＬ１、−２及び−３が関与していることを予想した。このため、一実施形態において、本発明は、アミノ酸残基（１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１２７，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１８１，１９２）によって規定される領域内で、ＫＩＲ２ＤＬ１に専ら結合する抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、アミノ酸残基（１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１２７，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１８１，１９２）によって規定される領域外のアミノ酸残基と相互作用せずに、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する抗体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、及びＲ１３１がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体に結合しない抗体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、及びＲ１５７がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体に結合しない抗体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、及びＲ１５８がＡｌａであるＫＩＲ２ＤＬ１の変異体に結合しない抗体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１残基に結合する抗体（１３１，１５７，１５８）を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＳ３（Ｒ１３１Ｗ）に結合し、野生型ＫＩＲ２ＤＳ３に結合しない抗体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３の両方並びにＫＩＲ２ＤＳ４に結合する抗体を提供する。

ある抗体が、上記定義のエピトープ領域の一つの中で結合するかどうかの決定は、当業者に公知の方法で実施することができる。このようなマッピング／性質決定法の一例として、抗ＫＩＲ抗体に対するエピトープ領域は、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３タンパク質中の露出したアミン／カルボキシルの化学的な修飾を用いた、エピトープ「フットプリンティング」によって決定され得る。このようなフットプリンティング技術の一つの具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析法によって検出される、水素−重水素交換）の使用であり、ＨＸＭＳにおいては、受容体及びリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素／重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に関与している骨格アミド基は、逆交換から保護されるので、重水素化されたままとなるであろう。この時点で、ペプシンによるタンパク質分解、高速小孔高性能液体クロマトグラフィー分離及び／又はエレクトロスプレイイオン化質量分析によって、該当する領域を同定することができる。例えば、「Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259(1999)」及び/又は「Engen, J.R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A」を参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）である。核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）においては、典型的には、遊離抗原及び抗原結合ペプチド（抗体など）と複合体を形成した抗原の、二次元ＮＭＲスペクトルのシグナルの位置が比較される。抗原は、典型的には、抗原に対応するシグナルのみが、ＮＭＲスペクトルに観察され、抗原結合ペプチドからのシグナルが観察されないように、１５Ｎで選択的に同位体標識されている。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸から生じる抗原シグナルは、典型的には、遊離抗原のスペクトルと比べて、複合体のスペクトルにおける位置がシフトしており、このようにして、結合に関与するアミノ酸を同定することができる。例えば、「Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44):149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998);及び「Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun;9(3):516-24」を参照されたい。エピトープマッピング／特定は、質量分析法を用いて実施することも可能である。例えば、「Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503」及び「Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1;71(9):1792-801」を参照されたい。

エピトープマッピング及び同定においては、プロテアーゼ消化技術も有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化（例えば、３７℃及びｐＨ７から８でのｏ／ｎ消化において、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ２ＤＬ２／３に対して約１：５０の比率のトリプシンを使用することによって）の後に、ペプチド同定のため質量分析（ＭＳ）を行うことによって決定することができる。抗ＫＩＲ結合物質によってトリプシン切断から保護されたペプチドは、続いて、トリプシン消化を行った試料と、抗体とともにインキュベートされ、次いで、例えばトリプシンによる消化を行った試料（これにより、結合物質に対するフットプリントが明らかとなる。）とを比較するによって同定することができる。類似のエピトープ特定法では、キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も使用することができ、又は他の酵素を代わりに使用することができる。さらに、酵素消化は、抗原決定配列である可能性を有する配列が、表面に露出されていない抗ＫＩＲポリペプチドに関して、ＫＩＲ２ＤＬ１の領域内に存在するかどうか、従って、免疫原性／抗原性に関連していない可能性が最も高いかどうかを分析するための簡易な方法となり得る。同様の技術の論述については、例えば、「Ｍａｎｃａ， Ａｎｎ Ｉｓｔ Ｓｕｐｅｒ Ｓａｎｉｔａ． １９９１；２７（１）：１５−９」を参照されたい。

カニクイザルとの交叉反応性
抗体ＮＫＶＳＦ１は、カニクイザルから得られたＮＫ細胞にも結合することが明らかとなった。実施例７を参照されたい。従って、本発明は、ヒトＮＫ細胞の表面に存在する少なくとも２つの阻害的ヒトＫＩＲ受容体と交叉反応し、さらにカニクイザル由来のＮＫ細胞にも結合する抗体、並びにその断片及び誘導体を提供する。この一実施形態において、前記抗体は抗体ＮＫＶＳＦ１ではない。本発明は、ヒトＮＫ細胞の表面に存在する少なくとも２つの阻害的ヒトＫＩＲ受容体と交叉反応する抗体並びにその断片及び誘導体の毒性を検査する方法であって、カニクイザルにおいて前記抗体を検査することを含む、方法も提供する。

組成物及び投与
本発明は、ＮＫ細胞の表面に存在する少なくとも２つの阻害的ＫＩＲ受容体と交叉反応し、それらの阻害的シグナルを中和し、これらの細胞の活性を増強する抗体、その断片及び誘導体を、任意の適切なビヒクル中に、患者又はＮＫ細胞を含む生物試料中でＮＫ細胞の細胞毒性を検出可能に増強するのに有効な量で、含む薬学的組成物も提供する。該組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含む。このような組成物は、「本発明の抗体組成物」とも称される。一実施形態において、本発明の抗体組成物は、上記抗体の実施形態で開示されている抗体を含む。抗体ＮＫＶＳＦ１は、本発明の抗体組成物中に存在し得る抗体の範囲に属する。

本明細書において使用される「生物学的試料」という用語には、生体液（例えば、血清、リンパ、血液）、細胞試料又は組織試料（例えば、骨髄）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

これらの組成物に使用することができる薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル・シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースとした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂などの塩又は電解質が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物は、患者又は生物試料中のＮＫ細胞の活性を増強する方法で使用することができる。本方法は、前記組成物を前記患者又は生物試料と接触させる工程を含む。このような方法は、診断目的と治療目的の両方に対して有用であろう。

生物試料とともに使用する場合、前記抗体組成物は、試料の性質に応じて（液体又は固体）、前記試料と単純に混合し、又は前記試料に直接加えることによって投与することができる。前記生物試料は、任意の適切な装置（プレート、袋、フラスコなど）中で、前記抗体と直接接触させることができる。患者とともに使用する場合、前記組成物は、患者に投与するために調合されなければならない。

本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、口腔、経膣、又は埋め込まれた容器を介して、投与され得る。本明細書において「非経口」という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下内、肝臓内、病変部内及び頭蓋内注射又は注入技術が含まれる。好ましくは、前記組成物は、経口、腹腔内又は静脈内に投与される。

本発明の前記組成物の無菌注射可能形態は、水性又は油性懸濁液とすることができる。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術において公知の方法に従って調合し得る。無菌の注射用調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非経口的に許容される無毒の希釈剤又は溶媒中の無菌注射可能溶液又は懸濁液とすることもできる。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル溶液及び等張の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体として、都合よく使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドなど、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油又はひまし油（特に、ポリオキシエチル化された様式）などの、薬学的に許容される天然油と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、エマルジョン及び懸濁液などの薬学的に許容される剤形の調合において一般的に使用されているカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤など、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤も含有することができる。Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓなどの一般的に使用される他の界面活性剤、及び薬学的に許容される固体、液体又はその他の剤形の製造において一般的に使用されるその他の乳化剤又は生物学的利用度の増強剤も、製剤の目的に対して使用することができる。

本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液などの経口的に許容される任意の剤形（これらに限定されない。）で経口的に投与され得る。経口用の錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥されたコーンスターチが含まれる。経口用途のために水性懸濁液が必要とされる場合には、活性成分が乳化剤及び懸濁剤と混合される。所望であれば、ある種の甘味剤、着香剤又は着色剤も添加し得る。

あるいは、本発明の組成物は、直腸投与するために、坐薬の形態で投与することもできる。これらは、室温で固体であるが、直腸の温度では液体であり、従って、直腸内で溶けて薬物を放出し得る、適切な非刺激性賦形剤と、薬剤を混合することによって調製することができる。このような物質には、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。

特に、眼、皮膚又は下部消化管の疾病など、治療の標的が局所適用によって容易に近づきやすい領域又は臓器を含む場合には、本発明の組成物は、局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域又は臓器の各々に対して、容易に調製される。

下部消化管に対する局所適用は、直腸坐剤調合物（上記参照）又は適切な浣腸調合物で実施することができる。局所経皮パッチも使用することができる。

局所適用の場合、前記組成物は、一又は複数の担体中に懸濁され、又は溶解された活性成分を含有する適切な軟膏中に調合することができる。本発明の化合物の局所投与用の担体には、ミネラル油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋および水が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、前記組成物は、薬学的に許容される一又は複数の担体中に懸濁され、又は溶解された活性成分を含有する適切なローション又はクリーム中に調合することができる。適切な担体には、ミネラル油、ソルビタンモノステアリン酸、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が含まれるが、これらに限定されるものではない。

眼科用途の場合には、前記組成物は、ＰＨ調整された等張無菌生理的食塩中の微粉化された懸濁液として、又は、好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤を加えた、又は加えない、ＰＨ調整された等張の無菌生理的食塩中の溶液として、調合することができる。あるいは、眼科用途の場合、前記組成物は、ワセリンなどの軟膏中に調合することができる。

本発明の組成物は、経鼻エアロゾル又は吸入によって、投与することもできる。このような組成物は、薬学的製剤の分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、生物的利用可能性を増強するための吸収促進物質、過フッ化炭素及び／又は従来の可溶化又は分散剤を用いて、生理的食塩水中の溶液として調製し得る。

Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）又はＸｏｌａｉｒ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）など、幾つかのモノクローナル抗体が、臨床現場において有効であることが示されており、同様の投与計画（すなわち、調剤及び／又は投与量及び／又は投与プロトコール）を、本発明の抗体とともに使用することができる。本発明の薬学的組成物中の抗体の投与に関するスケジュール及び投与量は、例えば、製造業者の指示書を用いて、これらの製品に対して公知の方法に従って決定することができる。例えば、本発明の薬学的組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアル中に、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で与えることができる。前記製品は、静脈内投与のために、９．０ｍｇ／ｍＬ 塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬ クエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬ ポリソルベート ８０、及び注射用無菌水の中に調合される。ｐＨを６．５に調整する。本発明の薬学的組成物中の抗体に対する典型的な適切な投与量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ^２の間であり得る。しかしながら、これらのスケジュールは典型的なものであり、薬学的組成物中の具体的な抗体の親和性と許容性（これらは、臨床試験において決定しなければならない。）を考慮しながら、最適なスケジュール及び投薬計画を適合できることが理解されるであろう。２４時間、４８時間、７２時間又は一週間又は一ヶ月間、ＮＫ細胞を飽和させる、本発明の薬学的組成物中の抗体の注入量及びスケジュールは、抗体の親和性及び抗体の薬物動態的なパラメータを考慮しながら決定されるであろう。

別の実施形態に従えば、本発明の抗体組成物は、前記抗体が投与される具体的な治療目的のために通常使用される薬剤を含む、別の治療剤をさらに含み得る。追加される治療剤は、治療されている当該疾病又は症状に対する単剤療法において、その治療剤に対して典型的に使用される量で、前記組成物中に存在するのが通常であろう。このような治療剤には、癌の治療に使用される治療剤、感染性疾患を治療するために使用される治療剤、他の免疫療法に使用される治療剤、サイトカイン（ＩＬ−２又はＩＬ−１５など）、他の抗体及び他の抗体の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。

例えば、癌の治療に対して、多数の治療剤を使用することができる。本発明の抗体組成物及び方法は、特定の疾病、特に、腫瘍、癌疾患、又は患者が発病するその他の疾病又は疾患の治療で一般的に使用される他の任意の方法とともに組み合わせることができる。ある治療的アプローチが、それ自体で、患者の症状に対して有害であることが知られておらず、本発明の薬学的組成物中の抗体の活性を著しく打ち消さない限り、本発明との併用が想定される。

充実性腫瘍の治療に関していえば、本発明の薬学的組成物は、手術、放射線療法、化学療法などの、古典的なアプローチとともに使用することができる。従って、本発明は、手術若しくは放射線治療と同時に、手術若しくは放射線治療の前に若しくは後に、本発明の薬学的組成物が使用され；又は従来の化学療法、放射線療法若しくは抗血管新生剤、若しくは標的に誘導される免疫毒素若しくは凝固リガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）とともに、それらの前に若しくは後に患者に投与される、併用療法を提供する。

治療計画において、本発明の抗体含有組成物とともに、一又は複数の薬剤を使用する場合には、併用した結果が、各治療が別個に実施されたときに観察される効果を加算したものである必要はない。少なくとも加算的な効果が一般に望ましいが、単剤療法の一つを上回る、何らかの増加した抗癌効果は、有益であろう。また、相乗効果を発揮することは確かに可能であり、有利であるが、併用治療が相乗効果を発揮することは必要ではない。併用抗癌療法を実施するためには、併用された抗癌作用を動物内にもたらすのに有効な様式で、別の抗がん剤とともに、本発明の抗体組成物を動物に単に投与すればよいであろう。従って、前記薬剤は、それらが腫瘍脈管構造内に同時に存在し、腫瘍環境中で併合作用をもたらすのに有効な量及び期間で、与えられるであろう。この目標を達成するために、本発明の抗体組成物と抗癌剤は、単一の併用組成物中に入れて、又は異なる投与経路を用いる２つの別個の組成物として、動物に同時に投与し得る。

あるいは、本発明の抗体組成物の投与は、例えば、分から週及び月単位にわたる間隔を置き、抗癌剤治療の前又は後に行うことができる。抗癌剤と本発明の抗体組成物中の抗体が、癌に対して、有利に併用効果を発揮することを確保するであろう。

抗血管新生治療では、多くの抗癌剤は、本発明の阻害的ＫＩＲ抗体組成物に先立って与えられるであろう。しかしながら、抗体の免疫抱合体を本発明の抗体組成物に使用するときには、様々な抗癌剤を、同時又は順次に投与することができる。

幾つかの状況では、治療のための期間を著しく延長することが望ましい場合さえあり得、この場合、抗癌剤又は抗癌治療と本発明の抗体組成物の各投与との間には、数日（２、３、４、５、６又は７）、数週（１、２、３、４、５、６、７又は８）、又は数ヶ月（１、２、３、４、５，６、７又は８）が経過する。これは、抗癌治療が腫瘍を実質的に破壊することを目的とし、本発明の抗体組成物の投与が微小転移又は腫瘍の再増殖を抑えることが目的とされる状況（手術又は化学療法など）において有利であろう。

本発明の阻害的ＫＩＲ抗体をベースとした組成物又は抗癌剤のうち何れかを２回以上投与することも想定される。これらの薬剤は、隔日若しくは隔週に、交互に投与してもよく、又は、本発明の阻害的ＫＩＲ抗体組成物を用いた治療を繰り返した後、抗癌剤療法を繰り返してもよい。何れにしろ、併用療法を用いて、腫瘍の退化を達成するために必要なものは、投与の回数にかかわらず、抗腫瘍効果を発揮するのに有効な併合量で、両薬剤を送達することだけである。

手術に関しては、任意の外科的介入を、本発明と組み合わせて実施することができる。放射線療法に関しては、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、さらには電子放射など、ＤＮＡの損傷を癌細胞内に局所的に誘導するための任意の機序が想定される。放射線同位体を癌細胞へ誘導して送達することも想定され、これは、標的誘導抗体又はその他の標的誘導手段と組み合わせて使用することができる。

他の側面では、免疫調節化合物又は療法を、本発明の抗体組成物と組み合わせて、又は本発明の抗体組成物の一部として、投与することができる。免疫調節化合物の好ましい例には、サイトカインが含まれる。このような併用アプローチでは、様々なサイトカインを使用することができる。本発明によって想定される、前記組み合わせにおいて有用なサイトカインの例には、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γが含まれる。本発明の併用治療又は組成物に使用されるサイトカインは、患者の症状及びサイトカインの相対的毒性などの臨床的指標に合わせて、標準的な投薬計画に従って投与される。

一部の実施形態において、交叉反応する阻害的ＫＩＲ抗体を含む本発明の治療用組成物は、化学療法剤若しくはホルモン治療剤とともに投与することができ、又は化学療法剤若しくはホルモン治療剤をさらに含むことができる。様々なホルモン療法剤及び化学療法剤は、本明細書に開示されている併用治療法において使用することができる。典型的なものとして想定される化学療法剤の例には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞毒性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシン アラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン、並びにそれらの誘導体及びプロドラッグが含まれるが、これらに限定されるものではない。

ホルモン剤には、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン及びブセレリンなどのＬＨＲＨアゴニスト；タモキシフェン及びトレミフェンなどの抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、シプロテロン及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール及びファドロゾールなどのアロマターゼ阻害剤；並びにメドロキシ、クロルマジノン及びメゲストロールなどの黄体ホルモンが含まれるが、これらに限定されるものではない。

当業者であれば自明であるように、化学療法剤の適切な用量は、化学療法剤が単独で投与され、又は他の化学療法剤と組み合わせて投与される、臨床療法で既に使用されている用量に近いであろう。単なる例示であるが、シスプラチンなどの薬剤及びその他のＤＮＡアルキル化剤を使用することができる。シスプラチンは、癌を治療するために広く使用されており、臨床用途で使用される有効用量は、計三つの治療単位にわたって、三週ごとに、５日間、２０ｍｇ／ｍ^２である。シスプラチンは、経口で吸収されず、従って、静脈内、皮下、腫瘍内又は腹腔内注射によって、送達されなければならない。

さらなる有用な化学療法剤には、ＤＮＡの複製、有糸分裂及び染色体分離を妨害する化合物、並びにポリヌクレオチド前駆体の合成及び忠実度を乱す薬剤が含まれる。併用療法のための典型的な数多くの化学療法剤が、米国特許６，５２４，５８３号の表Ｃに列記されており、薬剤及び適応症の開示内容は、参照により、本明細書に明確に援用される。列記されている薬剤の各々は典型例であり、限定的なものではない。当業者は、「“Remington's Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, chapter 33, 特に、pages 624-652」を参照されたい。投薬量の変動は、治療されている症状に応じて、起こり得るであろう。治療を施す医師は、各対象者に対する適切な用量を決定することができるであろう。

本発明の交叉反応性阻害的ＫＩＲ抗体組成物は、一若しくは複数の他のあらゆる抗血管新生療法とともに使用することができ、又は抗血管新生剤をさらに含むことができる。このような薬剤の例には、各々ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対して誘導された中和抗体、アンチセンスＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡアプタマー及びリボザイムが含まれる（米国特許第６，５２４，５８３号、その開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）。ＷＯ ９８／１６５５１号（参照により、本明細書に明確に組み込まれる。）に記載されているように、アンタゴニスト特性を有するＶＥＧＦの変異形を使用することもできる。併用療法とともに使用される典型的な抗血管新生剤が、さらに、米国特許６，５２４，５８３号の表Ｄに列記されており、薬剤及び適応症の開示内容は、参照により、本明細書に明確に援用される。

本発明の阻害的ＫＩＲ抗体組成物は、アポトーシスを誘導するための方法と組み合わせて有利に使用することもでき、又はアポトーシス剤を含むこともできる。例えば、アポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）を阻害する多数の癌遺伝子が同定されている。このカテゴリーに属する典型的な癌遺伝子には、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃ−１、サイクリンＤ１とは異なる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号；及び第５，５３９，０９４号、それぞれ、参照により、本明細書に援用される。）、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１及びＡ２０を含むファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現は、Ｔ細胞リンパ腫で初めて発見された。癌遺伝子ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ（アポトーシス経路中のタンパク質）に結合し、Ｂａｘを不活化させることによって機能する。ｂｃｌ−２機能の阻害は、Ｂａｘの不活化を抑制し、アポトーシス経路を進行させる。このクラスの癌遺伝子の阻害は、例えば、アンチセンスヌクレオチド配列、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は小分子化学化合物を用いて、アポトーシスの強化を得るために、本発明に使用することが想定される（米国特許第５，６５０，４９１号；５，５３９，０９４号；及び５，５８３，０３４号、それぞれ、参照により、本明細書に組み込まれる。）。

本発明の阻害的ＫＩＲ抗体組成物は、標的細胞（例えば、標的腫瘍細胞）の特異的マーカーに対して誘導される、標的誘導部分（例えば、抗体、リガンド、又はそれらの抱合体）を含む分子（「標的誘導因子」）も含むことができ、又は前記分子とともに使用することができる。一般的に言えば、本発明のこのような追加の側面において使用するための標的誘導因子は、好ましくは、腫瘍部位で、優先的に又は特異的に発現される、接近可能な腫瘍抗原を認識するのが好ましいであろう。一般的に、標的誘導因子は、表面に発現された、表面に接近可能な、又は表面に限局された腫瘍細胞の成分に結合するであろう。標的誘導因子は、高親和性特性を発揮することも好ましく、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、大腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、又はヒトの身体で生命を支えるその他の臓器若しくは組織から選択される一以上の組織など、生命を支える正常な組織に対して、インビボで著しい副作用を発揮しないことが好ましいであろう。本明細書において使用される「著しい副作用を発揮しない」という用語は、インビボに投与したときに、標的誘導因子が、化学療法中に通常遭遇されるような副作用を、無視できる程度に又は臨床的に管理可能なようにのみ生じ得る事実を表す。

腫瘍の治療において、本発明の抗体組成物は、補助化合物をさらに含むことができ、又は補助化合物とともに使用することができる。補助化合物には、一例として、セロトニンアンタゴニストなどの制吐剤、並びにフェノチアジン、置換されたベンズアミド、抗ヒスタミン、ブチロフェノン、コルチコステロイド、ベンゾジアゼピン及びカンナビノイドなどの治療；ゾレドロン酸及びパミドロン酸などのビスフォスフォネート；並びにエリスロポエチン及びＧ−ＣＳＦなどの造血系増殖因子、例えば、フィルグラスチム、レノグラスチム及びダルベポエチンが含まれ得る。

別の実施形態では、可能な限り多くの阻害的ＫＩＲ遺伝子産物の阻害的効果を中和するために、異なる交叉反応性を有する本発明の二以上の抗体（ＮＫＶＳＦ１を含む。）を、単一の組成物中に組み合わせることができる。本発明の交叉反応性阻害的ＫＩＲ抗体又はそれらの断片若しくは誘導体の組み合わせを含む組成物は、単一の交叉反応抗体によって認識される各疎外的ＫＩＲ遺伝子産物を欠如することがある、僅かなパーセントのヒト集団に存在する可能性があるので、さらに広く使用することが可能であろう。同様に、本発明の抗体組成物は、単一の阻害的ＫＩＲサブタイプを認識する一又は複数の抗体をさらに含み得る。このような組み合わせも、治療的な場面で、さらに広い用途を提供するであろう。

本発明は、ＮＫ細胞活性を増強することが必要とされる患者に、本発明の組成物を投与する工程を含む、前記患者中のＮＫ細胞活性を増強する方法も提供する。本方法は、より具体的には、増加したＮＫ細胞活性が有益であり、ＮＫ細胞による溶解に対して感受性のある細胞によって生じ、影響を受け、若しくは引き起こされ、又は不十分なＮＫ細胞活性によって引き起こされ、若しくは不十分なＮＫ細胞活性を特徴とする疾病（癌、その他の増殖性疾患、感染性疾患又は免疫疾患など）を有する患者中のＮＫ細胞活性を増加させることに向けられる。より具体的には、本発明の方法は、癌腫（膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺及び皮膚の癌腫を含み、扁平上皮癌を含む。）；リンパ系の造血系腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫及びバーキット（Ｂｕｒｋｅｔｔｓ）リンパ腫を含む。）；骨髄細胞系列の造血系腫瘍（急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む。）；間葉起源の腫瘍（繊維肉腫及び横紋筋肉腫を含む。）；他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む。）；中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む。）；間葉起源の腫瘍（繊維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む。）；並びにその他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌及び奇形癌を含む。）を含む（これらに限定されない。）、様々な癌及び他の増殖性疾患の治療のために使用される。

本発明によって治療することができる好ましい疾患には、リンパ系統の造血系腫瘍（例えば、小細胞及び脳細胞タイプのものを含む、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）；大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）、好ましくはＴ細胞タイプのもの；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／後胸腺Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性サブタイプ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球型；及びリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）などのＴ細胞疾患を含む（これらに限定されない。）、Ｔ細胞及びＢ細胞腫瘍）が含まれる。

例えば、過形成、繊維症（特に肺繊維症、腎繊維症などその他の種類の繊維症）、血管形成、乾癬、アテローム性動脈硬化、及び血管中の平滑筋増殖（血管形成術後の狭窄又は再狭窄など）を含む、その他の増殖性疾患も、本発明に従って治療することができる。本発明の交叉反応性阻害的ＫＩＲ抗体は、好ましくはウイルス、細菌、原虫、カビ又は真菌によって引き起こされる任意の感染症を含む、感染性疾患を治療又は予防するために使用することができる。このようなウイルス性感染性生物には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹ウイルスＩ（ＨＳＶ−１）、単純疱疹ウイルス２（ＨＳＶ−１）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス（ｈｕｎｔａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス及びヒト免疫不全症候群ウイルスＩ型又は２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明に従って治療することができる細菌性感染症には、以下のもの：ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓを含む。）；腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｌ）；棹菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含む。）；リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；ガルドネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）（Ｇ． ｖａｇｉｎａｌｉｓを含む。）；ノカルジア菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；サーモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）；カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｒａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む。）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓを含む。）；フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｆ． ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ及びＦ． ｏｄｏｒａｔｕｒｎを含む。）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）；ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＢ． ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含む。）；エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ． ｃｏｌｉを含む）、クレブシエラ菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＳ． ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む。）；エドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｐ． ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＰ． ｖｕｌｇａｒｉｓを含む。）；ストレプトバシラス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；リケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）（Ｒ． ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉを含む。）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ及びＣ． ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓを含む。）；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ． ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ、Ｍ． ｌａｐｒａｅ、Ｍ． ａｖｉｕｍ、Ｍ． ｂｏｖｉｓ、Ｍ． ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ及びＭ． ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍを含む。）； 及びノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）によって引き起こされる感染症が含まれるが、これらに限定されない。

本発明に従って治療され得る原虫感染症には、リーシュマニア、コクジディオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）及びトリパノソーマによって引き起こされる感染症が含まれるが、これらに限定されるものではない。感染性疾患の完全なリストは、疾病対策センター（ＣＤＣ）にある国立感染症センター（ＮＣＩＤ）のホームページ上に記載されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｉｄｏｄ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／）、このリストは、参照により、本明細書に組み込まれる。前記疾病の全てが、本発明の交叉反応性阻害的ＫＩＲ抗体を用いた治療の候補である。

様々な感染性疾患を治療するこのような方法は、単独で、又は他の処置及び／又はこのような疾病を治療することが知られている治療剤（抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗生物質、抗寄生虫剤及び抗原虫剤を含む。）と組み合わせて、本発明の抗体組成物を使用することができる。これらの方法が、追加の治療剤を用いた追加の処置を含む場合には、これらの治療剤は、単一剤形として、又は別個の複数剤形として、本発明の抗体とともに投与することができる。別個の剤形として投与されるときには、前記追加の治療剤は、本発明の抗体の投与の前、同時、後に投与することができる。

本発明のさらなる側面及び利点は、以下の実験の部に開示されている。以下の実験の部は例示であり、本願の範囲を限定すると解釈してはならない。

＜実施例１＞
ＰＢＬの精製及びポリクローナル又はクローナルＮＫ細胞株の作製
ＰＢＬは、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント及びプラスチック接着細胞の枯渇によって、健康なドナーから得た。濃縮されたＮＫ細胞を得るために、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ（４℃で３０分）とともにＰＢＬをインキュベートした後、ヤギ抗マウス磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）（４℃で３０分）とともにインキュベートし、当該技術で公知の方法によって免疫磁気選択を行った(Pende et al.,1999)。放射線照射された支持細胞、及び１００Ｕ／ｍＬ インターロイキン２(Proleukin, Chiron Corporation)、及び１．５ｎｇ／ｍＬ フィトヘマグルチニンＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）上でＣＤ３−、ＣＤ４−、ＤＲ−細胞を培養し、ポリクローナルＮＫ細胞集団を得た。限界希釈によって、ＮＫ細胞をクローニングし、細胞表面受容体の発現について、フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞のクローンの特性を決定した。

使用したｍＡｂは、ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ３）、ＥＢ６及びＧＬ１８３（それぞれ、ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３）、ＸＡ−１４１ ＩｇＭ（ＥＢ６と同一の特異性を有する抗ＫＩＲ２ＤＬ１）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）及び抗ＤＲ（Ｄ１．１２、ＩｇＧ２ａ）であった。出願人によって作製されたＪＴ３Ａ、ＨＰ２．６及びＤＲ１．１２の代わりに、同一の特異性を有する市販のｍＡｂを使用することができる(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)。ＥＢ６及びＧＬ１８３は、市販されている(Beckman Coulter Inc., Fullerton,CA)。ＸＡ−１４１は市販されていないが、既述のように、溶解の対照再生用として、ＥＢ６を使用することができる(Moretta et al.,1993)。

適切な抗体（４℃で３０分）により、細胞を染色した後、ＰＥ又はＦＩＴＣ抱合ポリクローナル抗マウス抗体(Southern Biotechnology Associates Inc)によって染色した。ＦＡＣＳＡＮ装置(Becton Dickinson, Mountain View, CA)での細胞蛍光測定分析によって、試料を分析した。

本研究では、以下のクローンを使用した。ＣＰ１１、ＣＮ５及びＣＮ５０５は、ＫＩＲ２ＤＬ１陽性クローンであり、ＥＢ６（ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ１）又はＸＡ−１４１（ＥＢ６抗体と比べて同一の特異性を有するＩｇＭ抗ＫＩＲ２ＤＬ１）によって染色され、ＣＮ１２及びＣＰ５０２は、ＫＩＲ２ＤＬ３陽性クローンであり、ＧＬ１８３抗体（ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ３）によって染色される。

ＮＫクローンの細胞溶解活性は、ＮＫ細胞溶解に対して感受性があることが知られているＣｗ３又はＣｗ４陽性細胞株に対してエフェクターＮＫ細胞を検査する、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって評価した。全ての標的は、マイクロタイタープレート中、５０００細胞／ウェルで使用した。エフェクター：標的の比は、図に記されている（通常は、４エフェクター／標的細胞）。１／２希釈の表記モノクローナル抗体の上清を加えて又は加えずに、細胞溶解アッセイを行った。手順は、(Moretta et al.,1993)に記載されているものと実質的に同じであった。

＜実施例２＞
新しいｍＡｂの作製
(Moretta et al., 1990)に記載されているように、活性化されたポリクローナル又はモノクローナルＮＫ細胞株で、５週齢のＢａｌｂ Ｃマウスを免疫することによって、ｍＡｂを作製した。異なる細胞融合の後、まず、ＥＢ６及びＧＬ１８３陽性ＮＫ細胞株及びクローンと交叉反応する能力について、ＭＡｂを選択した。さらに、それぞれ、Ｃｗ４又はＣｗ３陽性標的のＥｂ６陽性又はＧＬ１８３陽性ＮＫクローンによって、溶解を再生する能力について、陽性モノクローナル抗体のスクリーニングを行った。

細胞の染色は、以下のように行った。抗体のパネル（１μｇ／ｍＬ又は５０μＬ上清、４℃で３０分）で細胞を染色し、続いて、ＰＥ抱合ヤギＦ（ａｂ’）_２断片抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）又はＰＥ抱合ヤギＦ（ａｂ’）_２断片抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色した。細胞蛍光測定分析は、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ．ＭＣＬ装置(Beckman Coulter)で行った。

モノクローナル抗体のうちの一つ、ＤＦ２００ ｍＡｂは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３を含む、ＫＩＲファミリーの様々なメンバーと反応することが明らかとなった。ＫＩＲ２ＤＬ１＋及びＫＩＲ２ＤＬ２／３＋ ＮＫ細胞の両方が、ＤＦ２００ｍＡｂで明るく染色された（図１）。

これらのＨＬＡクラスＩ特異的な阻害的受容体の一方又は他方（又は、ある場合には両方）を発現するＮＫクローンを、一または複数のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した。細胞毒性アッセイは、以下のように行った。ＹＴＳ−ＫＩＲ２ＤＬ１又はＹＴＳ−Ｅｃｏ細胞株の細胞溶解活性は、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって評価した。エフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｃｗ４陽性又は陰性ＥＢＶ細胞株及びＨＬＡ−Ｃｗ４をトランスフェクトされた７２１．２２１細胞に対して検査された。全ての標的は、マイクロタイタープレート中、３０００細胞／ウェルで使用した。エフェクター／標的比は、図に記されている。モノクローナルマウス又はヒト抗体の表記完全長又はＦ（ａｂ’）２断片を加えて又は加えずに、細胞溶解アッセイを行った。予想通り、ＫＩＲ２ＤＬ１^＋ ＮＫクローンは、細胞溶解活性が存在する場合でも、ＨＬＡ−Ｃｗ４を発現する標的細胞に対して細胞溶解活性をほとんど示さず、ＫＩＲ２ＤＬ３^＋ ＮＫクローンは、Ｃｗ３陽性標的に対して、殆ど又は全く活性を示さなかった。しかしながら，ＤＦ２００ｍＡｂ（ＮＫクローンのＫＩＲ２ＤＬ受容体を遮蔽するために使用された。）の存在下では、ＮＫクローンはそれらのＨＬＡ−Ｃリガンドを認識することが不可能となり、Ｃｗ３又はＣｗ４標的に対して強い細胞溶解活性を示した。

例えば、Ｃ１Ｒ細胞株（ＣＷ４^＋ ＥＢＶ細胞株、ＡＴＣＣｎ°ＣＲＬ １９９３）は、ＫＩＲ２ＤＬ１^＋ ＮＫクローン（ＣＮ５／ＣＮ５０５）によって死滅しなかったが、この阻害は、ＤＦ２００又は従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ ｍＡｂのうち何れかの使用によって、効率的に元に戻すことができた。これに対して、ＫＩＲ２ＤＬ２／３^＋ ＫＩＲ２ＤＬ１⁻表現型を発現するＮＫクローン（ＣＮ１２）は、Ｃ１Ｒ細胞を効率的に死滅させ、この死滅は、ＤＦ２００ｍＡｂによって影響を受けなかった（図２）。Ｃｗ３陽性標的に対してＫＩＲ２ＤＬ２−又はＫＩＲ２ＤＬ３−陽性ＮＫクローンを用いた場合にも、同様の結果が得られる。

同様に、Ｃｗ４＋２２１ ＥＢＶ細胞株は、ＫＩＲ２ＤＬ１^＋トランスフェクトＮＫ細胞によって死滅されなかったが、ＤＦ２００、ＤＦ２００ Ｆａｂ断片又は従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ ｍＡｂ ＥＢ６若しくはＸＡ１４１の何れかを使用することによって、効率的に阻害を元に戻すことができた。また、Ｃｗ３＋２２１ ＥＢＶ細胞株は、ＫＩＲ２ＤＬ２^＋ＮＫ細胞によって死滅しなかったが、この阻害は、ＤＦ２００又はＤＦ２００ Ｆａｂ断片のうち何れかを使用することによって元に戻すことができた。最後に、後者のＣｗ３＋２２１ＥＢＶ細胞株は、ＫＩＲ２ＤＬ３^＋ＮＫ細胞によって死滅しなかったが、この阻害は、ＤＦ２００ Ｆａｂ断片又は従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ３ ｍＡｂ ＧＬ１８３若しくはＹ２４９の何れかを使用することによって、元に戻すことができた。結果を図３に示す。

Ｃｗ４陽性標的の溶解を再生する能力について、Ｆ（ａｂ’）２断片も検査した。ＤＦ２００及びＥＢ６ ＡｂｓのＦ（ａｂ’）２断片は何れも、Ｃｗ４をトランスフェクトされた２２１細胞株及びＣｗ４＋ＴＵＢＯ ＥＢＶ細胞株の、ＫＩＲ２ＤＬ１−トランスフェクトＮＫ細胞による溶解の阻害を回復させることができた。結果を図４に示す。

＜実施例４＞
新しいヒトｍＡｂの作製
ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されたトランスジェニックマウスを、組換えＫＩＲタンパク質で免疫することによって、ヒトモノクローナル抗ＫＩＲ Ａｂを作製した。異なる細胞融合の後、まず、固定されたＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２タンパク質と交叉反応する能力について、ＭＡｂを選択した。１−７Ｆ９、１−４Ｆ１、１−６Ｆ５及び１−６Ｆ１を含む数個のモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３と反応しないことが見出された。

さらに、Ｃｗ４陽性標的細胞のＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＥＢ６陽性ＮＫ形質移入体による溶解を再生する能力について、陽性モノクローナル抗体のスクリーニングを行った。ＨＬＡクラスＩ特異的な阻害的受容体を発現するＮＫ細胞を、一または複数のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した（図５及び６）。細胞毒性アッセイは、上記のように行った。エフェクター／標的比は、図に記されており、抗体は１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬの何れかで使用した。

予想通り、ＫＩＲ２ＤＬ１^＋ ＮＫ細胞は、細胞溶解活性が存在する場合でも、ＨＬＡ−Ｃｗ４を発現する標的細胞に対する細胞溶解活性を殆ど示さなかった。しかしながら，１−７Ｆ９ ｍＡｂの存在下では、ＮＫ細胞はそれらのＨＬＡ−Ｃリガンドを認識することが不可能となり、Ｃｗ４標的に対して強い細胞溶解活性を示した。例えば、検査した２つの細胞株（ＨＬＡ−Ｃｗ４トランスフェクト７２１．２２１及びＣＷ４^＋ＥＢＶ細胞株）は、ＫＩＲ２ＤＬ１^＋ ＮＫクローン細胞によって死滅しなかったが、この阻害は、Ｍａｂ １−７Ｆ９又は従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ ｍＡｂ ＥＢ６のうち何れかを使用することによって、効率的に元に戻すことができた。Ａｂｓ ＤＦ２００及びｐａｎＫＩＲ（ＮＫＶＳＦ１とも表記される。）を１−７Ｆ９と比較した。これに対して、抗体１−４Ｆ１、１−６Ｆ５及び１−６Ｆ１は、Ｃｗ４陽性標的に対する、ＮＫ細胞による細胞溶解を再生することができなかった。

＜実施例５＞
ＤＦ２００ ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ１及びＤＦ２００ ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ３相互作
用のＢｉａｃｏｒｅ分析
組換えタンパク質の作製と精製
ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３組換えタンパク質を、Ｅ．コリ中で作製した。以下のプライマーを用いて、それぞれ、ｐＣＤＭ８クローン４７．１１ベクター（Ｂｉａｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ， １９９３）及びＲＳＶＳ（ｇｐｔ）１８３クローン６ ベクター（Ｗａｇｔｍａｎ ｅｔ ａｌ， １９９５）から、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３の細胞外ドメイン全体をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。

センス：：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＡＣＣ−３’
ビオチン化シグナルをコードする配列とともに、それらをｐＭＬ１発現ベクター中にイ
ンフレームにクローニングした（Ｓａｕｌｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ， ２００３）。

タンパク質発現は、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で行った。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補充した培地中にて、３７℃で、ＯＤ_６００＝０．６になるまで、トランスフェクトされた細菌を増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導した。

変性条件下（８Ｍ尿素）で、タンパク質を封入体から回収した。組換えタンパク質の再折り畳みは、６段階の透析で尿素濃度を減少させることによって（それぞれ、４、３、２、１、０．５ 及び０Ｍの尿素）、室温で、Ｌ−アルギニン（４００ ｍＭ， Ｓｉｇｍａ）及びβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．８、ＮａＣｌ １５０ ｍＭ緩衝液中において行った。０．５及び０Ｍの尿素透析工程の間に、還元されたグルタチオン及び酸化されたグルタチオン（それぞれ、５ｍＭ及び０．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。最後に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５、ＮａＣｌ １５０ ｍＭ緩衝液に対して、タンパク質を徹底的に透析した。再折り畳みされた可溶性タンパク質を濃縮し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ； ＡＫＴＡ ｓｙｓｔｅｍ）上で精製した。

表面プラズモン共鳴測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０を補充したＨＢＳ緩衝液が、ランニングバッファーとしての役割を果たした。

タンパク質の固定
上記のように作製された組換えＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３タンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）上にあるデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合により固定した。センサーチップの表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｂｉａｃｏｒｅ）で活性化した。カップリング緩衝液（１０ｍＭ 酢酸塩、ｐＨ４．５）中のタンパク質を注入した。残存する活性化された基の非活性化は、１００ｍＭ エタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて実施した。

親和性測定
速度論の測定のために、様々な濃度の可溶性抗体（１×１０^−７から４×１０^−１０Ｍ）を、前記固定された試料上に与えた。測定は、２０μＬ／分の継続的な流速で実施した。各サイクルについて、センサーチップの表面、５μＬ注入の１０ｍＭ ＮａＯＨ ｐＨ１１によって再生した。データ解析には、ＢＩＡｌｏｇｕｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ （ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１， Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用した。可溶性検体（様々な濃度で４０μＬ）を、２０μＬ／分の流速で、ＨＢＳ緩衝液中、それぞれ、５００又は５４０反射ユニット（ＲＵ）及び１０００又は７００ＲＵのＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３を含有するデキストラン層上に注入した。データは、６つの独立した実験を代表するものである。結果を下表１に示す。

表１ 固定されたＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ３に結合するＤＦ２００ ｍＡｂの
ＢＩＡｃｏｒｅ分析

Ｋ_Ｄ：解離定数

＜実施例６＞
マウス及びヒト抗ＫＩＲ抗体のＢｉａｃｏｒｅ競合結合分析
以前に記載されたとおりに（Ｇａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ １９９９， Ｓａｕｎａｌ ａｎｄ ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ １９９５）、マウス抗ＫＩＲ ２Ｄ抗体ＤＦ２００、Ｐａｎ２Ｄ、ｇｌ１８３及びＥＢ６並びにヒト抗ＫＩＲ２Ｄ抗体１−４Ｆ１、１−６Ｆ５及び１−７Ｆ９を用いて、固定されたＫＩＲ ２ＤＬ１（９００ ＲＵ）、ＫＩＲ ２ＤＬ３（２０００ ＲＵ）及びＫＩＲ ２ＤＳ１（１０００ ＲＵ）に対して、エピトープマッピング分析を行った。

全ての実験は、１５μｇ／ｍＬで様々な抗体を２分間注入し、ＨＢＳ緩衝液中、５μＬ／分の流速で行った。抗体の各対に対して、競合結合分析を２段階で実施した。第一段階では、ＫＩＲ ２Ｄ標的タンパク質上に第一のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を注入した後、（第一のｍＡｂを除去せずに）第二のｍＡｂを注入し、第二のｍＡｂのＲＵ値（ＲＵ２）をモニターした。第二段階では、まず、裸のＫＩＲ ２Ｄタンパク質上に第二のｍＡｂを直接注入し、ｍＡｂ ＲＵ値（ＲＵ１）をモニターした。第一のｍａｂによる、ＫＩＲ ２Ｄタンパク質への第二のｍＡｂの結合のパーセント阻害を、１００＊（１−ＲＵ２／ＲＵ１）によって計算した。

結果を表２、３及び４に示す。表２、３及び４において、「第一の抗体」と表記される抗体が縦の欄に列記されており、「第二の抗体」が横の欄に列記されている。検査した各抗体の組み合わせについて、チップへの抗体の直接結合レベル（ＲＵ）の値が表中に列記されている。表中では、第二の抗体のＫＩＲ２Ｄチップへの直接結合が欄の上部に列記されており、第一の抗体が存在する際の、ＫＩＲ２Ｄチップへの第二の抗体の結合に対する値が欄の下部に列記されている。各欄の右側に列記されているのは、第二の抗体結合のパーセント阻害である。表２は、ＫＩＲ２ＤＬ１チップ上への結合を示しており、表３は、ＫＩＲ２ＤＬ３チップへの抗体の結合を示しており、表４は、ＫＩＲ２ＤＳ１チップへの抗体の結合を示している。

固定されたＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３及びＫＩＲ２ＤＳ１への、マウス抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１及びＥＢ６並びにヒト抗体１−４Ｆ１、１−７Ｆ９及び１−６Ｆ１の競合結合を評価した。ＫＩＲ２ＤＬ１への抗ＫＩＲ抗体の結合を用いた実験から得られたエピトープマッピング（図７）は、（ａ）抗体１−７Ｆ９がＥＢ６及び１−４Ｆ１と競合するが、ＮＫＶＳＦ１及びＤＦ２００とは競合しないこと、（ｂ）次に、抗体１−４Ｆ１は、ＥＢ６、ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１及び１−７ Ｆ９と競合すること； （ｃ）ＮＫＶＳＦ１は、ＤＦ２００、１−４Ｆ１及びＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないこと；並びに（ｄ）ＤＦ２００は、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１及びＥＢ６と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないことを、示した。ＫＩＲ２ＤＬ３への抗ＫＩＲ抗体の結合を用いた実験から得られたエピトープマッピング（図８）は、（ａ）１−４Ｆ１がＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００、ｇｌ１８３及び１−７Ｆ９と競合すること；（ｂ）１−７Ｆ９がＤＦ２００、ｇｌ１８３及び１−４Ｆ１と競合するが、ＮＫＶＳＦ１とは競合しないこと；（ｃ）ＮＫＶＳＦ１は、ＤＦ２００、１−４Ｆ１及びＧＬ１８３と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないこと；並びに、（ｄ）ＤＦ２００は、ＮＫＶＳＦ１、１−４Ｆ１及び１−７Ｆ９と競合するが、ＧＬ１８３とは競合しないことを、示した。ＫＩＲ２ＤＳ１への抗ＫＩＲ抗体の結合を用いた実験から得られたエピトープマッピング（図９）は、（ａ）抗体１−４Ｆ１がＮＫＶＳＦ１、ＤＦ２００及び１−７Ｆ９と競合すること；（ｂ）１−７Ｆ９は、１−４Ｆ１と競合するが、ＤＦ２００及びＮＫＶＳＦ１とは競合しないこと；（ｃ）ＮＫＶＳＦ１は、ＤＦ２００及び１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないこと；並びに、（ｄ）ＤＦ２００は、ＮＫＶＳＦ１及び１−４Ｆ１と競合するが、１−７Ｆ９とは競合しないことを、示した。

＜実施例７＞
カニクイザルＮＫ細胞を用いた抗ＫＩＲ ｍＡｂ滴定
カイクイザルから得られたＮＫ細胞への結合能について、抗ＫＩＲ抗体ＮＫＶＳＦ１を検査した。サルのＮＫ細胞への抗体の結合が図１０に示されている。

サルＰＢＭＣの精製及びポリクローナルＮＫ細胞バルクの作製
カニクイザルのＰＢＭＣを Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ＣＰＴチューブ(Becton Dickinson)から調製した。ＮＫ細胞の精製は、陰性の枯渇によって行った(Macaque NK cell enrichment kit, Stem Cell Technology)。放射線照射されたヒト支持細胞、３００Ｕ／ｍＬ インターロイキン２(Proleukin, Chiron Corporation)、及び１ｎｇ／ｍＬ フィトヘマグルチニンＡ(Invitrogen, Gibco)上でＮＫ細胞を培養し、ポリクローナルＮＫ細胞集団を得た。

カニクイザルＮＫ細胞を用いたＰａｎ２Ｄ ｍＡｂ滴定
カニクイザルＮＫ細胞（ＮＫバルク１６日）を異なる量のＰａｎ２Ｄ ｍＡｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ抱合されたヤギ（Ｆａｂ’）２断片抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体とともにインキュベートした。陽性細胞のパーセントは、アイソタイプ対照（精製されたマウスＩｇＧ１）を用いて決定した。試料は、二つ組みで行った。平均蛍光強度＝ＭＦＩ。

＜実施例８＞
ＫＩＲ２ＤＬ１へのＤＦ２００及びｐａｎ２Ｄ結合のエピトープマッピング それらの公表されている結晶構造（Ｍａｅｎａｋａ ｅｔ． ａｌ． （１９９９）， Ｆａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００））に基づく、ＫＩＲ２ＤＬ１、−２及び−３（ＫＩＲ２ＤＬ１−３）の細胞外ドメインのコンピュータモデリングは、ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ１−３交叉反応性マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＤＦ２００とｐａｎ２Ｄとの相互作用において、アミノ酸Ｒ１３１^１が関与していることを予想した（１：一文字アミノ酸コード）。これを確かめるために、ヒトＦｃ（ｈＦｃ）に融合されたＫＩＲ２ＤＬ１（野生型又は点変異されたもの（例えば、Ｒ１３１Ｗ^２））の完全な細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）からなる融合タンパク質を調製した（２：ＫＩＲ２ＤＬ１中の（Ｎ末端から）１３１位のアミノ酸におけるＲのＷへの置換）。様々なＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質を作製し、評価するために使用した材料と方法は、既に記載されている(Winter and Long (2000))。要約すると、野生型ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃの作製用に公表されているｃＤＮＡ−ベクターであるＣＬ４２−Ｉｇ(Wagtmann et al. (1995))を、ＰＣＲを用いて変異導入(Quickchange II,Promega)することによって、ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃをコードするｃＤＮＡベクターを作製した。実質的に記載のとおり((Wagtmann et al.1995))、ＣＯＳ７細胞中でＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ及びＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃを産生させ、組織培地から単離した。それらが正しく折りたたまれたかどうかを調べるために、ＨＬＡ−Ｃｗ３（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンドなし）又はＨＬＡ−Ｃｗ４（ＫＩＲ２ＤＬ１リガンド）の何れかを発現するＬＣＬ７２１．２２１細胞とともに、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ及びＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃをインキュベートし、ＫＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質と細胞間の相互作用をＦＡＣＳ（細胞表面でのタンパク質の相互作用を調べるための標準的な技術）によって分析した。独立した実験の例が、図１１、パネルＡに記されている。文献から予測されたように、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合は何れも、ＬＣＬ７２１．２２１細胞を発現するＨＬＡ−Ｃｗ３を結合しなかった。これに対して、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ及びＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃは何れも、ＬＣＬ７２１．２２１細胞を発現するＨＬＡ−Ｃｗ４に結合し、これにより、それらの折り畳みが正しいことが確認された。

ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃ及びＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃの、ＫＩＲ特異的ｍＡｂ（ＤＦ２００、ｐａｎ２Ｄ、ＥＢ６及びＧＬ１８３）への結合は、タンパク質の相互作用を調べるための標準的な技術であるＥＬＩＳＡを用いて調べた。要約すると、ヤギ抗ヒト抗体を介して、ＫＩＲ２ＤＬ１（Ｒ１３１Ｗ）−ｈＦｃ及びＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃを９６ウェルプレートに連結した後、ＫＩＲ特異的ｍＡｂを様々な濃度（ＰＢＳ中、０−１μｇ／ｍＬ）で添加した。ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ変異形とｍＡｂ間の相互作用は、ＴＭＢ基質を変換するためにマウス抗体に対して特異的なペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いた、分光光度法（４５０ｎｍ）によって可視化した。独立した実験の例が、図１１、パネルＢに記されている。ＫＩＲ２ＤＬ２−３特異的ｍＡｂ ＧＬ１８３が、何れのＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質にも結合できなかったのに対して、ＫＩＲ２ＤＬ１特異的ｍＡｂであるＥＢ６、ＤＦ２００及びｐａｎ２Ｄは、用量依存的に、ＫＩＲ２ＤＬ１−ｈＦｃ変異形に結合した。単一の点変異（Ｒ１３１Ｗ）は、ＤＦ２００及びｐａｎ２Ｄの結合に影響を及ぼし、最高濃度のｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）での、野生型の約１０％と比べて、結合が減少しており、Ｒ１３１が、ＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン２の中で、ＤＦ２００及びｐａｎ２Ｄの結合部位の一部であることが確認された。

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本明細書に記載されている、全てのあらゆる例又は例示的言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をさらに明瞭にすることを意図したものにすぎず、別段の記載がなければ、本発明の範囲に限定を加えるものではない。明示の記載がなければ、本明細書中の言語は、何らかの要素が本発明の実施に不可欠であることを示唆するものと解釈すべきでない。

本明細書中の特許文書の引用及び援用は、便宜のために行っているものにすぎず、かかる特許文書の妥当性、特許性及び／又は法的効力の観点を反映するものではない。

本明細書に別段の記載がなく、又は明確に反対の記載がなければ、ある要素に関して「含む」、「有する」、「含む」又は「含有する」などの用語を使用して、本発明の任意の側面又は実施形態を本明細書で記載することは、当該要素「からなる」、「実質的に〜からなる」、「実質的に〜を含む」本発明の類似の側面又は実施形態に対する支持を与えることを意図するものである（例えば、ある要素を含むと本明細書に記載されている組成物は、本明細書に別段の記載がなく、又は明確に反対の記載がなければ、その要素からなる組成物も記載するものとして理解すべきである。）。

本発明は、本明細書に提示されている前記側面又は特許請求の範囲に記載されている主題のあらゆる修飾及び均等物を、適用法によって許容される最大限度まで含む。

Claims (12)

1. ヒトキラーＩｇ様受容体２ドメインロング（ＫＩＲ２ＤＬ）１、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびヒトＫＩＲ２ＤＬ３と交叉反応する、抗ＫＩＲ抗体またはその抗体断片であって、
   （ａ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のアミノ酸残基１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１２７，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１８１および１９２によって規定されるエピトープ領域内において、ヒトＫＩＲ２ＤＬ１と結合するか；
   （ｂ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のＲ１３１がＡｌａによって置換されているヒトＫＩＲ２ＤＬ１の変異体と結合しないか；または
   （ｃ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のヒトＫＩＲ２ＤＬ１残基１３１、１５７および１５８に結合し；
   ここにおいて、前記抗体またはその断片は、ヒトＫＩＲ２ＤＬ１、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２および／またはヒトＫＩＲ２ＤＬ３によって媒介されるＮＫ細胞の細胞毒性の阻害を減少させ、中和しおよび／または逆転させ；および
   さらに、ここにおいて、前記抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性抗体および一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）から選択される抗ＫＩＲ抗体またはその抗体断片。
2. ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体への結合に関して、ＤＦ２００（寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−３２２４）と競合する請求項１に記載の抗体または抗体断片。
3. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む請求項１に記載の抗体または抗体断片。
4. それぞれ配列番号３、配列番号５および配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲと、それぞれ配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲとを含む請求項１に記載の抗体または抗体断片。
5. キメラ抗体またはその断片である請求項１から４の何れか１項に記載の抗体または抗体断片。
6. ヒト化抗体またはその断片である請求項１、２および４の何れか１項に記載の抗体または抗体断片。
7. ヒト抗体またはその断片である請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
8. トキシン、検出可能な部分、放射性同位体、造影剤または固相支持体に抱合されているか、または共有結合されている請求項１から７の何れか１項に記載の抗体または抗体断片を含む誘導体。
9. ヒトキラーＩｇ様受容体２ドメインロング（ＫＩＲ２ＤＬ）１、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびヒトＫＩＲ２ＤＬ３と交叉反応し、ヒトＫＩＲ２ＤＬ１、ヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびヒトＫＩＲ２ＤＬ３の阻害活性を中和する抗ＫＩＲ抗体または抗体断片であって、前記抗体または抗体断片は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体への結合に関してハイブリドーマＤＦ−２００（寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−３２２４）により製造されるＤＦ−２００抗体と競合する抗体または抗体断片。
10. （ａ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のアミノ酸残基１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１２７，１２９，１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１８１および１９２によって規定されるエピトープ領域内でヒトＫＩＲ２ＤＬ１に結合し、
    （ｂ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のＲ１３１がＡｌａで置換されているヒトＫＩＲ２ＤＬ１の変異体に結合せず、または
    （ｃ）ヒトＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメイン（アミノ酸Ｈ１−Ｈ２２４）のヒトＫＩＲ２ＤＬ１残基１３１，１５７および１５８に結合する請求項９に記載の抗体または抗体断片。
11. キメラ抗体、ヒト抗体若しくはヒト化抗体またはその断片である請求項９または１０に記載の抗体または抗体断片。
12. Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）から成る群から選択される請求項９から１１の何れか１項に記載の抗体断片。

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