JP5850503B2 - 筋ジストロフィーを処置するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、筋ジストロフィーを処置するための組成物に関する。

筋ジストロフィーは、骨格筋の変性および壊死が生じる疾患であり、臨床的には進行性の筋萎縮および筋力低下を呈する遺伝性の疾患である。筋ジストロフィーでは、筋細胞膜タンパク質の欠損および／または変異に起因して細胞膜が破壊され、次いで、筋細胞が崩壊して壊死する。筋ジストロフィーは種々のタイプが知られているが、いずれのタイプにおいても筋細胞の壊死によって特徴付けられる（非特許文献１参照）。

筋ジストロフィーを有する患者では、血中のCK、LDH、GOT、GPT、アルドラーゼなどの筋細胞由来の酵素についての測定値が高い。筋ジストロフィーの患者では、筋細胞の細胞膜の安定化に関わるジストロフィンが欠損している。ジストロフィン以外の筋細胞膜タンパク質は、ジストロフィン結合蛋白質と総称され、ジストログリカン複合体（α、β）、サルコグリカン複合体（α、β、γ、δ）、シントロフィン複合体などが知られており、これらのタンパク質における変異もまた筋ジストロフィーにおいて観察される。

日本国公開特許公報「特開２００７−３２６８７２号公報（２００７年１２月２０日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００６−２９８８７６号公報（２００６年１１月２日公開）」 日本国公表特許公報「特表２００８−５２８５１０号公報（２００８年７月３１日公表）」

Gregory Q. Wallace and Elizabeth M. McNally "Mechanisms of Muscle Degeneration, Regeneration, and Repair in the Muscular Dystrophies" Annu. Rev. Physiol. 71: 37−57 (2009) Masaya Tanno et al. "Induction of Manganese Superoxide Dismutase by Nuclear Translocation and Activation of SIRT1 Promotes Cell Survival in Chronic Heart Failure" The Journal Of Biological Chemistry 285: 8375−8382 (2010)

筋ジストロフィーは、ジストロフィンやサルコグリカンの原因タンパク質の異常によって生じ得る。近年、筋芽細胞の移植または注入、あるいは原因遺伝子の導入などの遺伝子治療が試みられている。しかしながら、筋ジストロフィーの有効な治療法は見出されていない。

上記の課題を解決するために、本発明に係る組成物は、ＳＩＲＴ１活性化因子を有効成分として含んでいることを特徴としている。ＳＩＲＴ１活性化因子とは、Ｓｉｒ２ファミリータンパク質（すなわち、サーチュインタンパク質）を活性化する能力を有する因子である。ＮＡＤ依存性ヒストン脱アセチル化酵素であるＳｉｒ２ファミリータンパク質は、酵母および線虫において寿命延長作用を有しており、Ｓｉｒ２ファミリータンパク質の１つであるＳＩＲＴ１は、高等動物において、神経幹細胞、心筋細胞などに発現している。

本発明に係る組成物において、ＳＩＲＴ１活性化因子は、ポリフェノールであることが好ましく、フラボン、スティルベン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、カルコン、タンニンおよびアントシアニンからなる群より選択される化合物、またはその誘導体であることがより好ましく、レスベラトロール（ＲＳＶ）、ブテイン、ピセアタンノール、イソリキリチゲニン、フィセチン、ルテオリン、テトラヒドロキシフラボンおよびケルセチンからなる群より選択される化合物、またはその誘導体であることがさらに好ましく、ＲＳＶ、またはその誘導体であることが最も好ましい。

上記構成を採用することによって、本発明は、筋ジストロフィーを処置することができる。また、本発明を用いれば、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化状態を劇的に改善することができる。すなわち、本発明は、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化を抑制するために用いられることが好ましい。

本発明に係る組成物は、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子をさらに含んでいてもよい。本発明に係る組成物において、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子は、細胞内ｃＧＭＰを増加させる因子であることが好ましく、ｃＧＭＰの非水解性アナログ、またはホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ−５）の酵素活性を阻害する因子がより好ましく、ＣＰＴ−ｃＧＭＰまたはタダラフィル（Ｔａｄ）がさらに好ましい。

本発明に係るキットは、ＳＩＲＴ１活性化因子を備えていることを特徴としている。上記構成を採用することによって、本発明は、筋ジストロフィーを処置することができる。本発明に係るキットは、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子をさらに備えていてもよい。また、本発明に係るキットは、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化を抑制するために用いられることが好ましい。

本発明を用いれば、筋ジストロフィーを処置することができ、特に、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化状態を劇的に改善する。

マウス骨格筋における線維化を示す免疫染色像、ならびに線維化の程度をフィブロネクチンおよび筋線維の断面積にて示したグラフである。 マウス骨格筋における線維化の程度を、フィブロネクチンｍＲＮＡの発現量にて示したグラフである。 骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）におけるＳＩＲＴ１の細胞内局在を示す免疫染色像、および核画分におけるＳＩＲＴ１の相対値を示すグラフである。 骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）におけるＳＩＲＴ１の細胞内局在を示すウエスタンブロット、および核画分または細胞質画分におけるＳＩＲＴ１の相対値を示すグラフである。 Ｃ２Ｃ１２細胞に対する、ＳＩＲＴ１についてのＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングの結果を示す図である。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。 マウス骨格筋におけるＳＩＲＴ１の免疫染色像（左）、およびその結果を数値化したグラフである。 ＲＳＶ、ならびに、ＲＳＶ配糖体である３−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（３Ｇ−ＲＳＶ）および４’−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）の構造を示す図である。 １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いた、ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶおよび４’Ｇ−ＲＳＶのラジカル消去活性を示す図である。 ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶおよび４’Ｇ−ＲＳＶによるヒストンＨ３脱アセチル化を示す図である。上段に、実験スキームを示し、中段に、ヒストンＨ３脱アセチル化を示すＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示し、下段に、ヒストンＨ３脱アセチル化を定量化した結果を示す。

〔１〕筋ジストロフィーを処置するための有効成分としてのＳＩＲＴ１活性化因子
本発明は、細胞レベルおよび動物レベルでの実験系を用いて、ＳＩＲＴ１の活性化が筋ジストロフィーの処置に有効であることを見出して完成されたものである。すなわち、本発明は、筋ジストロフィーを処置するための、ＳＩＲＴ１活性化因子を用いる技術を提供する。本発明は、本発明者ら独自の新知見に基づいて完成されたものであり、従来の技術水準からは容易になし得なかった画期的な発明である。

本発明者らはこれまでに心不全に関する研究を行っている。酸化ストレスは、慢性心不全における主要な役割を担い、ＮＡＤ^＋依存性ヒストン／タンパク質デアセチラーゼ（ＳＩＲＴ１）は、核内に発現されている場合に酸化ストレス条件下での細胞の生存（抗アポトーシス作用）を促進する。また、本発明者らは、心臓におけるＳＩＲＴ１の機能的役割、および心不全に対する治療におけるＳＩＲＴ１の利用を検討し、ＳＩＲＴ１を活性化することが知られているレスベラトロール（ＲＳＶ）が、酸化ストレスに起因するアポトーシスを抑制するとともに、心不全モデルであるＴＯ−２ハムスターの心不全を抑制し得ることを見出している（非特許文献２参照）。このように、ＳＩＲＴ１を活性化することによって抗アポトーシス効果が得られることが、よく知られている。

特許文献１には、ＳＩＲＴ１のデアセチラーゼ活性を増加させる作用物質を用いて、真核細胞内のｐ５３の活性を阻害し、アポトーシスから細胞を保護する方法、および寿命を延長させる方法が開示されている。特許文献２には、サーチュインの活性化を用いた、眼疾患の治療に関する技術が開示されており、サーチュインの活性化が、細胞死の予防、老化の予防、細胞死の治療、延命、寿命延長、癌発生の予防に利用可能であることも記載されている。特許文献３には、サーチュインの活性化を用いた、紅潮または体重増加を処置する技術が開示されている。

上述したように、筋ジストロフィーは、壊死（ネクローシス）によって特徴付けられる疾患である。ネクローシスがアポトーシスと同じ「細胞死」であるとはいえ、その発生機序が大きく異なることは周知である。特許文献１には、サーチュイン活性化化合物を、細胞死に関係する慢性疾患などの治療のために投与することができる旨が示唆されており、細胞死の観点から、筋ジストロフィーを例示されている。しかし、アポトーシスによって特徴付けられる疾患の改善に有効である物質が、壊死（ネクローシス）によって特徴付けられる疾患の状態改善に有効であるなどということは、技術常識でも技術水準でもない。よって、筋ジストロフィーが細胞死に関係する慢性疾患の例として特許文献１に挙げられているに過ぎず、抗アポトーシス技術の適用対象として特許文献１に挙げられているのではないことを、当業者は十分理解している。同様の理由により、当業者は、特許文献２に記載の細胞死がネクローシスではなくアポトーシスであることを、十分理解している。

活性化されたＳＩＲＴ１が筋ジストロフィーの改善に有効であることは、当業者が容易に予測し得ることではない。特に、筋ジストロフィーのモデルマウスにおいて観察される骨格筋の線維化状態が劇的に改善されることは、格別顕著な効果である。

本発明者らは、ポリフェノールの１つのＲＳＶが、ＳＩＲＴ１を活性化することによってスーパーオキシドディスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）を誘導して、細胞の酸化ストレス耐性を向上させ、その結果、遺伝的に心不全を生じるＴＯ−２ハムスターの寿命を優位に延長させることを見出している。すなわち、１つの局面において、「ＳＩＲＴ１活性化因子」は、ポリフェノールであり得、フラボン、スティルベン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、カルコン、タンニンおよびアントシアニンからなる群より選択される化合物、またはその誘導体であり得る。好ましくは、「ＳＩＲＴ１活性化因子」は、ＲＳＶ、ブテイン、ピセアタンノール、イソリキリチゲニン、フィセチン、ルテオリン、テトラヒドロキシフラボンおよびケルセチンからなる群より選択される化合物、またはその誘導体であり、より好ましくは、ＲＳＶ、またはその誘導体である。ＲＳＶの誘導体としては、グリコシド配糖体が好ましく、より好ましくは、ＲＳＶの３−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（３Ｇ−ＲＳＶ）および４’−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）が挙げられ、４’−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）が最も好ましい。

なお、他の局面において、ＳＩＲＴ１活性化因子は、天然から分離されたものであっても合成されたものであってもよく、以下に示すＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ１７２０およびＳＲＴ２１８３、

ならびにＳＩＲＴ１活性化因子３（２−アミノ−Ｎ−シクロペンチル−１−（３−メトキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノキサリン−３−カルボキサミド）（Nature 450(29): 712−716 (2007)およびJournal of Biomolecular Screening 11(8): 959−967 (2006)参照）、さらには特許文献１においてスクリーニングされたサーチュイン活性化剤もまた、ＳＩＲＴ１活性化因子に包含される。

当業者は、ＮＡＤおよびＳｉｒ２ファミリータンパク質（例えば、ＳＩＲＴ１）を含む酵素反応系を用いたスクリーニング法によって、ＳＩＲＴ１活性化因子を容易に取得し得る。

本発明者らは、ＳＩＲＴ１が核と細胞質との間を移動することによってその活性が調節されることなどを見出している。すなわち、さらなる局面において、「ＳＩＲＴ１活性化因子」は、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子であり得る。本明細書中にて使用される場合、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子は、Ｓｉｒ２ファミリータンパク質（すなわち、サーチュインタンパク質）を細胞質から核内へ移行させる能力を有する因子が意図される。後述する実施例にて示すように、細胞内ｃＧＭＰを増加させると骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の核内移行が増強されて、ＳＩＲＴ１の活性化が促進される。すなわち、一実施形態において、ＳＩＲＴ１を核内移行させる因子は、細胞内ｃＧＭＰを増加させる因子であり得る。細胞内ｃＧＭＰを増加させる因子としては、ｃＧＭＰの非水解性アナログ（例えば、ＣＰＴ−ｃＧＭＰ）、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ−５）の酵素活性を阻害する因子（例えば、タダラフィル（Ｔａｄ））が挙げられるが、これらに限定されない。なお、Ｔａｄは、生体内でｃＧＭＰを分解するホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ−５）の酵素活性を阻害し、これにより、ＮＯ作動性神経に作用して血管を拡張させて、血流量を増加させる。Ｔａｄは、勃起不全の治療薬（Ｃｉａｌｉｓ（登録商標））としてもよく知られている。

また、当業者は、培養細胞におけるＳＩＲＴ１の核内移行を検出する系を用いたスクリーニング法によって、ＳＩＲＴ１活性化因子を容易に取得し得る。

本発明において、ＳＩＲＴ１活性化因子は単独で用いられても複数組み合わせて用いられてもよい。複数組み合わせて用いられる場合、ＳＩＲＴ１活性化因子の少なくとも１つがＳＩＲＴ１を核内移行させる因子であってもよい。

〔２〕有効成分の利用
（１）組成物
本発明は、筋ジストロフィーを処置するための有効成分を含有する組成物を提供する。本明細書中にて使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、治療的（発症後）に行われ得るものだけでなく、予防的（発症前）に行われ得るものもまた包含される。「筋ジストロフィーを処置するための有効成分」は、上述したＳＩＲＴ１活性化因子が意図され、本明細書中にて「有効成分」と省略され得る。

本発明に係る組成物中に使用されるキャリアおよび賦形剤は、薬学的に受容可能なものであれば特に限定されない。本明細書中にて使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、組成物を受容した個体において有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアが意図される。このようなキャリアは当業者に周知である。また、薬学的に受容可能な賦形剤については、当該分野において公知であり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ．１９９１）に十分に記載されている。さらに、本発明に係る組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような１つ以上の成分をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤などのような補助物質が、本発明に係る組成物中に存在し得る。

本発明に係る組成物は、経口投与に好ましい錠剤、カプセルなどの形態として調製され得る。また、本発明に係る組成物は、液体溶液もしくは懸濁液、または注射のための液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体形態、あるいは局所的に塗布されるクリームとしてとして調製され得る。そして、本発明に係る組成物の直接送達は、一般に、経口、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内または筋肉内）、または塗布により達成される。経口送達の場合、本発明に係る組成物は、タブレット状、顆粒状、カプセル状などの経口的に摂取可能な形状であり得、所望の作用を発現させる量の有効成分が含有されていれば、その形状が特に限定されない。

本発明に係る組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る組成物における有効成分の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該組成物を用いて後述の投与量範囲で有効成分を投与できるような量であれば特に限定されない。また、本発明に係る組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、および投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定される。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行われてもよい。

（２）キット
本発明はまた、筋ジストロフィーを処置するための有効成分を備えているキットを提供する。本明細書中にて使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは、上記材料を使用するための指示書を備えている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、容器中に内包された溶液形態の組成物を梱包していてもよい。本発明に係るキットは、異なる２つ以上の物質を同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD−ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットは、上述した組成物を構成するためにもちいられてもよく、上述した組成物に含まれる物質を別々に備えていても、上述した組成物とさらなる成分とを別々に備えていてもよい。

（３）筋ジストロフィーを処置する方法
本発明はさらに、筋ジストロフィーを処置するための方法を提供する。本発明に係る方法は、筋ジストロフィーを処置するための有効成分を被験体に投与する工程を包含する。本発明に係る方法における有効成分の適用は、上述した組成物およびキットの使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中にて参考として援用される。

本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。

〔材料および方法〕
Ｃ５７ＢＬ１０マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０−ＳｃＮ Ｊｉｃ）およびＭｄｘマウス（Ｃ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘ Ｊｉｃ）を、株式会社ホクドーより購入した。マウスから単離した大腿二頭筋を液体窒素で凍結した後に、クリオスタットを用いて切片化した。得られた切片を、４％パラホルムアルデヒドを含む中性リン酸ナトリウム緩衝液で固定し、次いで、定法に従ってヒツジ抗フィブロネクチン抗体（ＡＨＰ０８，ＵＫ−Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識したロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて免疫染色し、さらにアクチンをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ラベルファロイジンで染色した。染色した切片を、コンフォーカル顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ ２１００ＭＰ ＢｉｏＲａｄ社）を用いて観察した（図１上）。得られた画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３で解析した。コントロールマウスのフィブロネクチン染色像の、１画像あたり蛍光ピクセル数の平均を１００として、他の画像の蛍光ピクセル数を表した。筋の横断径は、ファロイジンで染色された部分のピクセル数をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ Ｃｓ３によって解析した。各群に３匹のマウスを用い、一匹のマウス標本について８つの視野を撮影し、合計２４視野の平均をグラフに表示した（図１下）。上グラフについて、＊，未処置Ｍｄｘコントロール群と比較（ｐ＜０．０５）；＃，ＲＳＶ投与Ｍｄｘ群と比較（ｐ＜０．００１）；＋，未処置コントロールマウス群と比較（有意差なし）。下グラフについて、＊，未処置Ｍｄｘコントロール群と比較（ｐ＜０．０５）；＆，未処置コントロールマウス群と比較（ｐ＜０．０５），＃，ＲＳＶ投与Ｍｄｘ群と比較（有意差なし）；＋，未処置コントロールマウス群と比較（有意差なし）。

Ｃ５７ＢＬ１０マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０−ＳｃＮ Ｊｉｃ）およびＭｄｘマウス（Ｃ５７ＢＬ／１０−ｍｄｘ Ｊｉｃ）より単離した大腿二頭筋から、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡから逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて変換したｃＤＮＡに対して、定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を行うことによって、フィブロネクチンｍＲＮＡ量を定量した。コントロールとして用いたβ−アクチンｍＲＮＡ量に対する割合を、未処置のコントロールマウスのデータを１００として表示した（図２）。それぞれの群に用いたマウスの数は、未処置コントロールマウス群、ＲＳＶ＋Ｔａｄ投与コントロールマウス群、および未処置Ｍｄｘマウス群はｎ＝３、Ｔａｄ投与Ｍｄｘマウス群はｎ＝５、ＲＳＶ＋Ｔａｄ投与Ｍｄｘマウス群はｎ＝６である。＊，未処置Ｍｄｘコントロール群と比較（ｐ＜０．０５）。

Ｃ２Ｃ１２細胞（国立長寿医療研究センター研究所 古山達雄博士（現 香川県立保健医療大学）より供与された。）を、コラーゲン（Ｋｏｋｅｎ社）でコートしたガラス板（マツナミ社）上に散布し、次いで培養した。１００ｎＭ タダラフィル（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）または１００μＭ ＣＰＴ（８−ＣＰＴ−ｃＧＭＰ，ナトリウム塩（８−（４−クロロフェニルチオ）グアノシン−３’，５’−サイクリックモノホルフェート） Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ ＫＧ．社）を培地に添加し、２８時間後に４％パラホルムアルデヒドを含む中性リン酸ナトリウム緩衝液を用いて細胞を固定した。コントロールを含め、細胞を、固定２４時間前に１５μＭアンチマイシンＡ（Ｓｉｇｍａ社）で処理した。固定した細胞に対して、ウサギ抗マウスＳＩＲＴ１抗体（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５６，２８１−２８６，２００４）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識したヒツジ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた免疫染色と、ヘキスト３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）による核染色を行った。染色後の細胞を、コンフォーカル顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ ２１００ＭＰ ＢｉｏＲａｄ社）を用いて観察した（図３上）。得られた画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３を用いて解析した。核領域に存在するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８蛍光ピクセル数の平均について、コントロール細胞の値を１００％として表示した。各実験について８視野からデータを集め、３回同じ実験を繰り返し、合計２４視野分からの平均値をそれぞれの棒グラフに表した（図３下）。＊＊，コントロール群と比較（ｐ＜０．０１）。

コントロールＣ２Ｃ１２細胞および１００ｎＭタダラフィル（Ｔａｄ）を２８時間作用させた細胞について、核分画と細胞質とを分画するキット（ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて、各画分を得た。コントロール細胞およびＴａｄ処理細胞において、分画２４時間前に１５μＭアンチマイシンＡ（Ｓｉｇｍａ社）を作用させ、核内に存在するＳＩＲＴ１量を増加させた。各画分について、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．）、抗ラミンＡ／Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いたウエスタンブトット法によって、タンパク質をウエスタンブロットによって検討した（図４上）。画像を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅを用いて定量化した。３回の別々の実験を行い、定量化したデータをグラフに表した（図４下）。＊＊，コントロール群と比較（ｐ＜０．０１）。＊，コントロール群と比較（ｐ＜０．０５）。

Ｃ２Ｃ１２細胞に、１００ｎＭ タダラフィル（Ｔａｄ）または１００μＭ ＣＰＴを２４時間作用させた後に、定法に従ってＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡからｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲ法を用いてＳＩＲＴ１とＧＡＰＤＨを増幅させ、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ゲルをエチジウムブロマイドで染色した（図５上）。また、細胞のタンパク質を、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．）と抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いたウエスタンブトット法で調べた（図５下）。同様の検討を合計３回行い、ＴａｄまたはＣＰＴの処理によってＳＩＲＴ１のｍＲＮＡ量およびタンパク質量が変化しないことを確認した。

Ｔａｄ（７０ｍｇ／ｋｇ粉末飼料）を７日間経口投与したｄｄＹマウス（三協ラボサービス（株））、およびコントロールマウスを、麻酔後に４％パラホルムアルデヒドを含む中性リン酸ナトリウム緩衝液で全身還流固定した。固定したマウスから大腿二頭筋を収集した。分離した骨格筋を、同じパラホルムアルデヒド溶液で再度一晩固定した。組織をシュクロース溶液（和光純薬）で脱水した後に凍結し、次いでクリオスタットを用いて切片を作製した。ＳＩＲＴ１抗体による免疫染色、およびヘキスト３３３４２による核染色を行った切片を、コンフォーカル顕微鏡で観察した（図６上）。コントロール群およびＴａｄ投与群の各３匹についてそれぞれ６視野を撮影し、ＳＩＲＴ１が核に優位に存在している細胞の数の、全体の細胞数に占める割合の平均を、グラフで表した（図６下）。＊＊＊，コントロール群と比較（ｐ＜０．００１）。

〔結果〕
〔１：筋ジストロフィーマウスにおける骨格筋の線維化に対するＲＳＶの効果〕
コントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ１０）、および筋ジストロフィーのモデルマウスであるドゥシャンヌ筋ジストロフィ（Ｍｄｘ）マウスから収集した骨格筋をフィブロネクチン染色し、骨格筋にて生じている線維化を観察した（図１）。未処置のＭｄｘマウスでは、線維化された、白くスカスカの、特徴的な筋肉が観察された。ＲＳＶ（４ｇ／ｋｇ粉末飼料）を３２週間にわたって経口投与したＭｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ＲＳＶ）では、骨格筋の線維化が抑制されていた。ＲＳＶ（４ｇ／ｋｇ飼料）とＴａｄ（７０ｍｇ／ｋｇ飼料）とを併用して３２週間にわたって経口投与したＭｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ＲＳＶ＋Ｔａｄ）では、骨格筋の線維化がさらに抑制されており、筋線維の横断径も正常化していた。ただし、筋量においては、ＲＳＶによる効果をＴａｄが増強させることはなかった。なお、コントロールマウスでは、未処置のものも、ＲＳＶおよびＴａｄを投与したものも、骨格筋の線維化が生じていなかった。上段には、アクチンとフィブロネクチンとの二重染色像を示し、下段には、コントロールに対する、フィブロネクチン染色の割合および骨格筋の断面積の割合を示した。グラフにおいて、１は未処置のコントロールマウス、２はＲＳＶおよびＴａｄで処置したコントロールマウス、３は未処置のＭｄｘマウス、４はＲＳＶ投与したＭｄｘマウス、５はＲＳＶとＴａｄとを投与したＭｄｘマウスを示す。

このように、ＲＳＶはＭｄｘマウス骨格筋の線維化を抑制し、筋量を増加させる。そして、ＴａｄのＲＳＶとの併用は、ＲＳＶによる線維化抑制効果をさらに増強するが、ＲＳＶによる筋量増加効果には影響しないといえる。

さらに、未処置のＭｄｘマウス、ＲＳＶ投与したＭｄｘマウス、およびＲＳＶとＴａｄとを投与したＭｄｘマウスから収集した骨格筋におけるフィブロネクチンｍＲＮＡの発現量を調べた。ＲＳＶを、単独もしくはＴａｄと併用によって、粉末状にした食餌に混合してＭｄｘマウスに３２週間投与し、続いて、大腿二頭筋のフィブロネクチンｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲ法で検討した（図２）。図は、βアクチンｍＲＮＡに対する割合を示すグラフであり、グラフにおいて、１は未処置のコントロールマウス、２はＲＳＶおよびＴａｄで処置したコントロールマウス、３は未処置のＭｄｘマウス、４はＲＳＶ投与したＭｄｘマウス、５はＲＳＶとＴａｄとを投与したＭｄｘマウスを示す。示されるように、ＲＳＶ単独およびＲＳＶとＴａｄとの併用はいずれもフィブロネクチンｍＲＮＡレベルを減少させた。１、２、４および５におけるｍＲＮＡレベルは、３におけるｍＲＮＡレベルと有意に差があった（ｐ＜０．０５）。

このように、ＲＳＶは、タンパク質レベルだけではなくｍＲＮＡレベルにおいても、Ｍｄｘマウス骨格筋の線維化を抑制する。上述したように、ＲＳＶはＳＩＲＴ１を活性化することが知られている。すなわち、ＳＩＲＴ１が活性化されることによって、Ｍｄｘマウス骨格筋の線維化が抑制されたといえる。また、ＴａｄのＲＳＶとの併用は、ＲＳＶによる線維化抑制効果をさらに増強する。

〔２：骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の活性化〕
上述したように、ＳＩＲＴ１は、心筋細胞において細胞質から核内へ移行した後にその活性を示すことが知られている。骨格筋細胞においてもまた、ＳＩＲＴ１が細胞質から核内へ移行して活性化している可能性がある。そこで、骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の局在およびその変化を調べた。

図３に示すように、骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）においても、ＳＩＲＴ１は細胞質にて発現していることがわかった。そして、Ｔａｄを用いて細胞を前処理することによって核内でのＳＩＲＴ１の発現が増加した。上述したように、Ｔａｄは、生体内でｃＧＭＰを分解するホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ−５）の酵素活性を阻害する。そこで、ｃＧＭＰキナーゼを活性化させるｃＧＭＰアナログであるＣＰＴ−ｃＧＭＰ（ＣＰＴ）を用いて、同様に細胞を前処理したところ、Ｔａｄの場合と同様に、核内でのＳＩＲＴ１の発現が増加した。図には、ＳＩＲＴ１抗体を用いた免疫染色像（上）、および核内のＳＩＲＴ１の相対値（下）を示した。

さらに、イムノブロッティング法を用いて、図３に示した免疫染色の結果を検証した（図４）。図には、細胞分画法で分画した細胞質画分と核画分とに対するウエスタンブロットの結果（上）、および核画分または細胞質画分におけるＳＩＲＴ１の相対値（下）を示した。核画分については、ラミニンを核タンパク質のコントロールとして、細胞質画分については、ＧＡＰＤＨを細胞質タンパク質のコントロールとして用いた。示されるように、Ｃ２Ｃ１２細胞に対してＴａｄを前処理しておくことによって細胞質でのＳＩＲＴ１の発現は有意に減少し、逆に、核でのＳＩＲＴ１の発現が有意に増加したことがわかる。

これらのことから、細胞内ｃＧＭＰを増加させると、骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の核での発現が増強されるといえる。ただし、ＴａｄまたはＣＰＴを前処理しても、細胞全体におけるＳＩＲＴ１の総発現量（ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方）には変化がない（図５）。これにより、細胞内ｃＧＭＰを増加させると骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の核内移行が増強されており、ＳＩＲＴ１の活性化が促進されているということがわかった。

〔３：マウス骨格筋におけるＳＩＲＴ１の活性化〕
培養細胞において観察された、ＴａｄによるＳＩＲＴ１の核内移行が、マウス生体内にて生じるか否かを確認した。Ｔａｄ（７０ｍｇ／ｋｇ粉末飼料）を１週間ｄｄｙマウスに経口投与した後に、マウスから骨格筋を収集し、ＳＩＲＴ１による免疫染色を行った（図６）。Ａには、骨格筋におけるＳＩＲＴ１の免疫染色像（左）およびその結果を数値化したグラフを示す。示されるように、マウス骨格筋においても、ＳＩＲＴ１の核での発現量が、コントロールマウスと比較してＴａｄ投与マウスにおいて優位に増加していた。これにより、細胞内ｃＧＭＰを増加させると骨格筋細胞におけるＳＩＲＴ１の核内移行が増強されており、ＳＩＲＴ１の活性化が促進されているということがわかった。

〔４：ＲＳＶ配糖体の抗酸化活性〕
ＲＳＶ、ならびにＲＳＶ配糖体である３−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（３Ｇ−ＲＳＶ）および４’−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）の構造を図７に示す。ＲＳＶおよびＲＳＶ配糖体のラジカル消去活性（抗酸化活性）を調べた。

ＲＳＶ配糖体を以下のように調製した。Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）基本培地に、３％スクロース、２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを最終濃度１ｐｐｍで添加した液体培地（１００ｍＬ）に、新鮮重量２０ｇの植物培養細胞を移し、１２０ｒｐｍにて２５℃で４日間振盪培養した。その後、ＤＭＳＯ（１００μＬ）に溶解した４０μｍｏｌ ＲＳＶ（東京化成）を液体培地に添加し、同一条件下にて２日間培養した。

培養後、ナイロンメッシュで培地と培養細胞とを濾別し、濾液を水飽和ｎ−ブタノールで分配抽出し、細胞をホモジナイズした後にメタノールで静置抽出した。それぞれの有機相を減圧下にて濃縮し、メタノールで５．０ｍＬに調製したものをサンプルとした。

得られたサンプルを逆相ＨＰＬＣにて分析し、変換物を確認した。この変換物を分取ＨＰＬＣで単離・精製し、ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲを用いて構造解析を行って、３Ｇ−ＲＳＶおよび４’Ｇ−ＲＳＶであることを確認した。

図８に、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いた、ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶおよび４’Ｇ−ＲＳＶのラジカル消去活性を示す。ＤＰＰＨは、５１７ｎｍに特異的な吸収波長を有している。抗酸化物質によってラジカルが奪われると、５１７ｎｍの吸収が減少する。この反応を用いて、ラジカルの消去率を測定し、測定値に基づいて５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出し、抗酸化活性を比較した。ＤＤＰＨをメタノールに溶解し、０．１５ｍＭに調整した。ＲＳＶおよびＲＳＶ配糖体の二倍段階希釈（１／２〜１／５１２）の希釈系列サンプルを作製し、これらのサンプルとＤＤＰＨ溶液とを５００μＬずつ混合／撹拌し、暗所にて室温で３０分間反応させた後に、５１７ｎｍにおける吸収を測定した。

図８に示すように、ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶおよび４’Ｇ−ＲＳＶのＩＣ_５０は、それぞれ７９μＭ、１１０μＭおよび２５０μＭであった。このように、３Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶに匹敵する高いラジカル消去活性を示すが、４’Ｇ−ＲＳＶのラジカル消去活性はこれらよりもかなり低いことがわかった。

〔５：ＲＳＶ配糖体のヒストンＨ３脱アセチル化活性〕
ＲＳＶ配糖体がＲＳＶと同様にヒストンＨ３脱アセチル化活性を有しているか否かを調べた。

マウス由来の筋肉芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞を、１０％ ＦＢＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）および１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｍｉｘｅｄ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含む高グルコースのＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて培養した。

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇのために、培養したＣ２Ｃ１２細胞を、最終濃度１００μＭのＲＳＶおよびＲＳＶ配糖体の存在下にて１８時間培養し、１００μＭアンチマイシン（ＡＡ）を添加して６時間培養することによって、酸化ストレスを細胞に与えた。引き続く手順は定法に従った。用いた抗体は以下のとおりである：Monoclonal Anti- GAPDH Clone GAPDH-71.1 (SIGMA)、Anti-Histone H3 Acetylated (1-20) Rabbit pAb (Calbiochem)、Histone H3 antibody-ChIP Grade (ab1791) (Abcam)。

図９に示されるように、コントロール群（図中ＡＡ）に対して、３Ｇ−ＲＳＶ処置群においてはヒストンＨ３脱アセチル化の促進作用が確認できなかったが、ＲＳＶ処置群において、アセチル化ヒストンＨ３の有意な減少が観察され、４’Ｇ−ＲＳＶ処置群では、ＲＳＶ処置群よりも優れたヒストンＨ３脱アセチル化活性が観察された。このように、４’Ｇ−ＲＳＶが３Ｇ−ＲＳＶと比較してヒストンＨ３脱アセチル化を有意に促進することがわかった。

上述したように、ＳＩＲＴ１活性化因子は、ＮＡＤ依存性ヒストン脱アセチル化酵素であるＳｉｒ２ファミリータンパク質（すなわち、サーチュインタンパク質）を活性化する能力を有する因子であり、生体内においてサーチュインタンパク質が活性化されると、ヒストンＨ３の脱アセチル化が引き起こされる。ＲＳＶは、抗酸化物質としても知られているが、ＲＳＶと同程度の抗酸化活性を有する３Ｇ−ＲＳＶによって、ヒストンＨ３の脱アセチル化は引き起こされない。これらのことは、本実施例にて実証した筋ジストロフィーの治療効果があくまでもＲＳＶのＳＩＲＴ１活性化因子としての機能に基づくものであり、抗酸化物質としての機能に基づくものではないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。そして、本実施例にてＳＩＲＴ１活性化因子としてＲＳＶを用いて本発明を説明しているが、本発明に利用可能なＳＩＲＴ１活性化因子はＲＳＶに限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明を用いれば、筋ジストロフィーを処置することができ、特に、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化状態を劇的に改善することができる。このように優れたツールを提供する本発明は、医学、薬学の分野において利用可能であり、医薬品、生化学試薬の開発に大いに寄与することができる。

Claims (2)

1. レスベラトロールまたはその４’−Ｏ−β−Ｄ−グリコシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）を有効成分として含んでいる、筋ジストロフィーにおける骨格筋の線維化を改善するための組成物。
2. ＣＰＴ−ｃＧＭＰまたはタダラフィルをさらに含んでいる、請求項１に記載の組成物。