JP5863145B2 - Spore aerobic bacteria detection method and DNA chip used therefor - Google Patents
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Description
本発明は、被検試料中の有胞子好気性細菌を検出する方法、及び、当該検出方法に使用するＤＮＡチップに関する。 The present invention relates to a method for detecting spore aerobic bacteria in a test sample, and a DNA chip used for the detection method.
土壌及び水などの自然界には多種の有胞子好気性細菌（例えば、Bacillus属細菌）が存在している。その中には、食品中に存在することでヒトや家畜にとって有害な事象（食品の腐敗や食中毒）をもたらすものがある。
有胞子好気性細菌は高温殺菌にも耐える芽胞形成を経て増殖することができるので、食品や飼料製品中でその存在を検出することが、食品産業や飼料産業における品質管理上の重要事項となっている。
有胞子好気性細菌の検出方法としては、検出対象菌の１６ＳリボソームＲＮＡコード配列（以後、16S rDNA配列）から見いだしたプローブを使用した方法が知られている（例えば、特許文献１及び２）。
There are many types of sporic aerobic bacteria (for example, Bacillus genus bacteria) in nature such as soil and water. Some of them cause events that are harmful to humans and livestock (food decay and food poisoning) due to their presence in food.
Spore aerobic bacteria can grow through spore formation that can withstand high-temperature sterilization, so detecting their presence in food and feed products is an important quality control issue in the food and feed industries. ing.
As a method for detecting a spore aerobic bacterium, a method using a probe found from a 16S ribosomal RNA coding sequence (hereinafter, 16S rDNA sequence) of a detection target bacterium is known (for example, Patent Documents 1 and 2).
有胞子好気性細菌のなかでも、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）やパエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）は芽胞を形成するため耐熱性が高く、さらに菌種によってその耐熱性が異なる。したがって、試料中で各菌種の存在を個別に検出することは最適な殺菌条件を設定するために重要である。
上記６種類の細菌の検出について、従来は、食品等の被検試料を平板培地で培養し、発生したコロニーを単離して生化学性状解析あるいは遺伝子解析に付することで行っていた。
しかしながら、従来法では、１つのコロニーを６種類の菌種それぞれについて別個に解析に付する必要があり、検査の簡便性及び迅速性の点で課題があった。
また、16S rDNA配列から見いだした従来のプローブを固定してなるＤＮＡチップでは、クロスハイブリダイゼーションによる擬陽性が起こりやすい類縁種の識別（例えば、バチルス・サブチリスとバチルス・リチェニフォルミスとの識別や、バチルス・メガテリウムとバチルス・フレクサス（Bacillus flexus）との識別）に適応できないという懸念がある。
Among sporic aerobic bacteria, Bacillus coagulans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis Since megaterium and Paenibacillus polymyxa form spores, they have high heat resistance, and the heat resistance varies depending on the bacterial species. Therefore, individually detecting the presence of each bacterial species in the sample is important for setting optimum sterilization conditions.
Conventionally, detection of the above six types of bacteria has been performed by culturing a test sample such as a food on a plate medium, isolating the generated colonies, and subjecting them to biochemical property analysis or gene analysis.
However, in the conventional method, it is necessary to separately analyze one colony for each of the six types of fungi, and there is a problem in terms of simplicity and speed of inspection.
In addition, in a DNA chip formed by fixing a conventional probe found from a 16S rDNA sequence, identification of related species that are likely to be falsely positive due to cross-hybridization (for example, identification between Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, There is concern that it is not adaptable to identification between Bacillus megaterium and Bacillus flexus.
本発明者らが上記課題について鋭意検討した結果、上記６種類の細菌のそれぞれについて、16S rDNA配列と23S rDNA配列との間のＩＴＳ（Internal Transcribed spacer）領域に由来する特定のヌクレオチド配列を検出プローブとして用いると、上記６種類の細菌を個別的かつ一度に検出することができることを見いだした。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。 As a result of intensive studies on the above problems by the present inventors, a specific nucleotide sequence derived from the ITS (Internal Transcribed spacer) region between the 16S rDNA sequence and the 23S rDNA sequence was detected for each of the above six types of bacteria. It has been found that the above six types of bacteria can be detected individually and at one time. The present invention has been made based on such knowledge.
すなわち、本発明は、
（１）下記（Ａ）〜（Ｆ）の６種類の細菌：
（Ａ）バチルス・コアグランス
（Ｂ）ジオバチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｃ）バチルス・リチェニフォルミス
（Ｄ）バチルス・サブチリス
（Ｅ）バチルス・メガテリウム及び
（Ｆ）パエニバチルス・ポリミキサ
からなる群より選ばれる１種以上の細菌の被検試料中における存在を検出する方法であって、
被検試料中の核酸と、下記（ａ）〜（ｆ）のプローブ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・コアグランス検出用プローブの１種以上、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス検出用プローブの１種以上、
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号５に示される塩基配列からなるプローブ、及び
配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・リチェニフォルミス検出用プローブの１種以上、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号７に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号７に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・サブチリス検出用プローブの１種以上、
（ｅ）配列番号８に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・メガテリウム検出用プローブの１種以上、並びに
（ｆ）配列番号９に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、パエニバチルス・ポリミキサ検出用プローブの１種以上、とをハイブリダイズさせることを特徴とする、検出方法、
並びに
（２）下記（Ａ）〜（Ｆ）の６種類の細菌：
（Ａ）バチルス・コアグランス
（Ｂ）ジオバチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｃ）バチルス・リチェニフォルミス
（Ｄ）バチルス・サブチリス
（Ｅ）バチルス・メガテリウム及び
（Ｆ）パエニバチルス・ポリミキサ
からなる群より選ばれる１種以上の細菌の被検試料中における存在を検出するためのＤＮＡチップであって、
下記（ａ）〜（ｆ）のプローブ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・コアグランス検出用プローブの１種以上、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス検出用プローブの１種以上、
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号５に示される塩基配列からなるプローブ、及び
配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・リチェニフォルミス検出用プローブの１種以上、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号７に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号７に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・サブチリス検出用プローブの１種以上、
（ｅ）配列番号８に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・メガテリウム検出用プローブの１種以上、並びに
（ｆ）配列番号９に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、パエニバチルス・ポリミキサ検出用プローブの１種以上、
を基板に固定してなることを特徴とするＤＮＡチップ、
に関するものである。
That is, the present invention
(1) The following six types of bacteria (A) to (F):
(A) Bacillus coagulans (B) Geobacillus stearothermophilus (C) Bacillus licheniformis (D) Bacillus subtilis (E) Bacillus megaterium and (F) Paenibacillus polymixer A method for detecting the presence of one or more bacteria in a test sample, comprising:
Nucleic acids in the test sample and probes (a) to (f) below:
(A) a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
One or more types of probes for detecting Bacillus coagulans selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and
One or more types of probes for detecting Geobacillus stearothermophilus selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(C) a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
One or more types of probes for detecting Bacillus licheniformis selected from the group consisting of a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 ,
(D) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and
One or more probes for detecting Bacillus subtilis selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(E) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and
One or more types of probes for detecting Bacillus megaterium selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and (f) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 ,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 9,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A detection method characterized by hybridizing with one or more probes for detecting Paenibacillus polymixer selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10;
And (2) the following six types of bacteria (A) to (F):
(A) Bacillus coagulans (B) Geobacillus stearothermophilus (C) Bacillus licheniformis (D) Bacillus subtilis (E) Bacillus megaterium and (F) Paenibacillus polymixer A DNA chip for detecting the presence of one or more bacteria in a test sample,
Probes (a) to (f) below:
(A) a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
One or more types of probes for detecting Bacillus coagulans selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and
One or more types of probes for detecting Geobacillus stearothermophilus selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(C) a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
One or more types of probes for detecting Bacillus licheniformis selected from the group consisting of a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 ,
(D) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and
One or more probes for detecting Bacillus subtilis selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(E) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and
One or more types of probes for detecting Bacillus megaterium selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and (f) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 ,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 9,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
One or more types of probes for detecting Paenibacillus polymixer selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A DNA chip characterized by being fixed to a substrate,
It is about.
本発明の方法は、後述する実施例で示されるように、被検試料（特に食品）中におけるバチルス・コアグランス、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・サブチリス、バチルス・メガテリウム及びパエニバチルス・ポリミキサの存在を一度の検出手順で個別的かつ同時に検出することができる。したがって、食品等の製品検査に要する時間及び費用を従来法よりも低減することができる。 The method of the present invention, as shown in the examples described later, is Bacillus coagulans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus. The presence of Megathelium and Paenibacillus polymixer can be detected individually and simultaneously in a single detection procedure. Therefore, it is possible to reduce the time and cost required for the inspection of products such as food as compared with the conventional method.
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の検出対象は下記（Ａ）〜（Ｆ）の６種類の細菌である。
（Ａ）バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）
（Ｂ）ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）
（Ｃ）バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）
（Ｄ）バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）
（Ｅ）バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
（Ｆ）パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）
（Ａ）〜（Ｆ）の細菌は、いずれも自然界に存在する有胞子好気性細菌であり、かつ、食品製品や飼料製品中に混入した場合に、ヒトや家畜にとって有害な事象（食品の腐敗や食中毒等）を引き起こすことが知られている（防菌防黴 Vol.32, No.3, pp.135〜151, 2004）。
バチルス・コアグランス及びジオバチルス・ステアロサーモフィラスは、耐熱性の高い芽胞を形成するため、缶詰やレトルト食品等の変敗細菌であることが知られている。また、両菌種はフラットサワー型変敗の原因菌であり、発育に伴って乳酸を産生して食品の酸敗を引き起こす。
バチルス・サブチリス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・メガテリウム、パエニバチルス・ポリミキサは、デンプンを多く含む食品の変敗細菌として知られており、パンや洋菓子、米飯などで検出されることが多く、異臭・酸敗を引き起こす。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The detection targets of the present invention are the following six types of bacteria (A) to (F).
(A) Bacillus coagulans
(B) Geobacillus stearothermophilus
(C) Bacillus licheniformis
(D) Bacillus subtilis
(E) Bacillus megaterium
(F) Paenibacillus polymyxa
The bacteria (A) to (F) are all naturally occurring spore aerobic bacteria and, when mixed in food products and feed products, are harmful to humans and livestock (food decay And food poisoning, etc.) are known (antibacterial and antifungal Vol.32, No.3, pp.135-151, 2004).
Bacillus coagulans and Geobacillus stearothermophilus are known to be spoilage bacteria such as canned foods and retort foods because they form highly heat-resistant spores. In addition, both bacterial species are causative bacteria of flat sour-type deterioration, and produce lactic acid as it grows, causing food to become irritated.
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, and Paenibacillus polymixer are known as degraded bacteria in foods high in starch and are often detected in bread, Western confectionery, cooked rice, etc.・ Causes rancidity.
被検試料としては、検出対象である上記６種類の細菌のうち少なくとも１種類が存在している可能性があり、かつ、その存在の有無を確認する必要のあるものであれば、特に限定されない。被検試料の性状は、固体、液体及び気体のいずれであってもよい。したがって、例えば、牛乳、水、緑茶、酸性飲料等の飲料や、食肉、チルド食品、生鮮食品（肉、野菜、魚）、弁当・惣菜などの幅広い食品や、飼料等が被験試料として利用可能である。更に、食品製造の設備や製造環境中の空気などの環境試料も本発明の被検試料として利用可能である。 The test sample is not particularly limited as long as there is a possibility that at least one of the above six types of bacteria to be detected exists and it is necessary to confirm the presence or absence thereof. . The property of the test sample may be any of solid, liquid, and gas. Therefore, for example, beverages such as milk, water, green tea, acidic beverages, a wide range of foods such as meat, chilled foods, fresh foods (meat, vegetables, fish), bento boxes and side dishes, and feeds can be used as test samples. is there. In addition, environmental samples such as food production equipment and air in the production environment can be used as the test sample of the present invention.
本発明では、被検試料中の核酸と細菌種特異的プローブとのハイブリダイゼーションを利用して細菌検出を行う。したがって、ハイブリダイゼーション効率を高めるために、被検試料を前処理する。
具体的には、ハイブリダイゼーションに先立つ前処理として、被検試料中に含まれる菌の培養及び回収、菌体からの核酸抽出、並びに、PCRによるITS領域（本発明の核酸プローブがハイブリダイズする領域）の増幅を行う。なお、被検試料中にPCRを阻害する物質が含まれている場合には、PCR前に核酸を精製する工程を行ってもよい。
これらの各工程は、当該技術分野で一般的に使用されている培地、核酸抽出キット、核酸精製キット、PCR関連試薬（DNAポリメラーゼ、バッファーなど）等を用いて、当該技術分野で公知の手順にしたがって行うことができる。以下に、菌の培養、菌体からの核酸抽出及びITS領域のPCR増幅の具体的な手順の例を説明する。
菌の培養
被検試料が固形食品である場合、当該固形食品を液体培地とともにホモジナイズして培養する、あるいは試料を平板培地へ塗布してコロニーを得る方法などが挙げられる。被検試料が飲料の場合には、ろ過により菌体を濃縮したフィルターを平板培地に貼り付けて培養する、あるいはフィルターを液体培地に懸濁させて培養する方法などが挙げられる。使用する培地は、検出対象菌種の増殖を阻害する成分を含まない限り特に制限されない。
菌体からの核酸抽出
抽出する核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。抽出法は当該技術分野で周知の方法を用いることができる。ＤＮＡの場合、例えば、proKなどの酵素や界面活性剤により溶菌したものからＤＮＡを抽出し、最終的にはフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製することができる。また、市販の抽出キットを使用してもよく、ＤＮＡの場合、例えばQIAGEN社製 DNeasy Blood & Tissue Kit、富士フイルム社製 自動核酸抽出装置 QuickGene-810 QuickGene SP Kit、TaKaRaBio社製 FastPure DNA Kit、MoBio社製 UltraClean Microbial DNA Kitなどを使用することができる。
ITS領域のPCR増幅
ITS領域のPCR増幅には当該技術分野で周知の方法を用いることができる。使用するプライマーは、６種類の検出対象菌のITS領域を増幅できるものであれば特に制限されない。６種類の検出対象菌においてITS領域は16S rDNA配列と23S rDNA配列との間に存在しており、これらの配列はいずれも公知であるため、16S rDNA配列及び23S rDNA配列の中からITS領域増幅用プライマーを設計することができる。
使用するプライマー対の数について、６種類の検出対象菌の各々に特異的なプライマー対を用いてもよく、複数の菌種に共通するプライマー対を用いてもよい。16S rDNA配列及び23S rDNA配列の中には６種類の検出対象菌間で共通する配列が存在するため、そのような共通配列をプライマーとすることでプライマー対の数を減らすことができる。具体例として、６種類の検出対象菌のITS領域を同時に増幅できる共通プライマーの配列を以下に示す。
フォワードプライマー（16S rDNA配列から設計）：CCGCGGTGAATACGTTCC （配列番号：１９）
リバースプライマー（23S rDNA配列から設計）：GCTCCTAGTGCCAAGGCAT （配列番号：２０）
ITS領域のPCR増幅に用いるプライマーは、当該技術分野における周知の方法に従い作成することができる。
In the present invention, bacteria are detected using hybridization between a nucleic acid in a test sample and a bacterial species-specific probe. Therefore, in order to increase the hybridization efficiency, the test sample is pretreated.
Specifically, as pretreatment prior to hybridization, culture and recovery of bacteria contained in a test sample, extraction of nucleic acids from bacterial cells, and ITS region by PCR (region to which the nucleic acid probe of the present invention hybridizes) ). In addition, when the substance which inhibits PCR is contained in a test sample, you may perform the process of refine | purifying a nucleic acid before PCR.
Each of these steps is carried out according to a procedure known in the technical field using a medium, a nucleic acid extraction kit, a nucleic acid purification kit, a PCR-related reagent (DNA polymerase, buffer, etc.) generally used in the technical field. Therefore it can be done. Below, the example of the specific procedure of culture | cultivation of a bacterium, nucleic acid extraction from a microbial cell, and PCR amplification of ITS area | region is demonstrated.
Bacterial culture When the test sample is a solid food, the solid food is homogenized with a liquid medium and cultured, or the sample is applied to a plate medium to obtain colonies. When the test sample is a beverage, a method of culturing by attaching a filter on which bacterial cells are concentrated by filtration to a flat plate medium, or culturing by suspending the filter in a liquid medium can be used. The medium to be used is not particularly limited as long as it does not contain a component that inhibits the growth of the species to be detected.
Nucleic acid extraction from bacterial cells The nucleic acid to be extracted may be either DNA or RNA. As the extraction method, a method well known in the art can be used. In the case of DNA, for example, DNA can be extracted from those lysed by an enzyme such as proK or a surfactant, and finally purified by phenol / chloroform extraction or ethanol precipitation. Commercially available extraction kits may also be used. In the case of DNA, for example, DNeasy Blood & Tissue Kit manufactured by QIAGEN, automatic nucleic acid extraction device QuickGene-810 QuickGene SP Kit manufactured by FUJIFILM, FastPure DNA Kit manufactured by TaKaRaBio, MoBio An UltraClean Microbial DNA Kit manufactured by the company can be used.
PCR amplification of ITS region
Methods well known in the art can be used for PCR amplification of the ITS region. The primer to be used will not be restrict | limited especially if the ITS area | region of six types of detection object microbe can be amplified. In 6 types of bacteria to be detected, the ITS region exists between the 16S rDNA sequence and the 23S rDNA sequence, and since these sequences are known, the ITS region is amplified from the 16S rDNA sequence and the 23S rDNA sequence. Primers can be designed.
Regarding the number of primer pairs to be used, primer pairs specific to each of the six types of detection target bacteria may be used, or primer pairs common to a plurality of bacterial species may be used. Since the 16S rDNA sequence and the 23S rDNA sequence have sequences common to six types of detection target bacteria, the number of primer pairs can be reduced by using such a common sequence as a primer. As a specific example, common primer sequences capable of simultaneously amplifying ITS regions of six types of detection target bacteria are shown below.
Forward primer (designed from 16S rDNA sequence): CCGCGGTGAATACGTTCC (SEQ ID NO: 19)
Reverse primer (designed from 23S rDNA sequence): GCTCCTAGTGCCAAGGCAT (SEQ ID NO: 20)
Primers used for PCR amplification of the ITS region can be prepared according to a well-known method in the technical field.
本発明の方法では、被検試料中の核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを利用して細菌検出を行う。
（Ａ）のバチルス・コアグランスの検出には、以下の配列番号１に示される塩基配列及びその相補配列、並びに配列番号２に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ａ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
CAGTTTTGAAGGTTCAATCCTTCA（配列番号：１）
CGAGAATCGCTTATTTTTGGATTT（配列番号：２）
上記プローブのうち少なくとも１種類を用いれば、バチルス・コアグランスの検出を行うことができるが、検出精度を更に高めるために、２種類以上を併用してもよい。
In the method of the present invention, bacteria are detected using hybridization between a nucleic acid and a probe in a test sample.
The detection of Bacillus coagulans in (A) consists of a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and its complementary sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and its complementary sequence. At least one of the probes (probe (a)) is used.
CAGTTTTGAAGGTTCAATCCTTCA (SEQ ID NO: 1)
CGAGAATCGCTTATTTTTGGATTT (SEQ ID NO: 2)
If at least one of the probes is used, Bacillus coagulans can be detected, but two or more types may be used in combination in order to further improve the detection accuracy.
上記のバチルス・コアグランス検出用プローブの１種以上と、以下の配列番号１１に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用するとバチルス・コアグランスの検出精度をより高めることができるので好ましい。
TAGGAGAAATAAACCAAGTAAACCGAG（配列番号：１１）
When one or more of the above-mentioned probes for detecting Bacillus coagulans and one or more probes consisting of a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 below and a complementary sequence thereof are used in combination, Bacillus coagulans This is preferable because the detection accuracy can be further increased.
TAGGAGAAATAAACCAAGTAAACCGAG (SEQ ID NO: 11)
（Ｂ）のジオバチルス・ステアロサーモフィラスの検出には、以下の配列番号３に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ｂ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
ACTGTCGATACACAGCGCTTTC（配列番号：３）
The detection of Geobacillus stearothermophilus in (B) includes at least a probe (probe (b)) comprising a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 below and a complementary sequence thereof. One type is used.
ACTGTCGATACACAGCGCTTTC (SEQ ID NO: 3)
上記のジオバチルス・ステアロサーモフィラス検出用プローブと、以下の配列番号１２に示される塩基配列及びその相補配列、並びに、以下の配列番号１３に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用すると、ジオバチルス・ステアロサーモフィラスの検出精度をより高めることができるので好ましい。
GATAACCGGAAAAGCGGAGG（配列番号：１２）
GAAGGTTATTTGACCCCGAGC（配列番号：１３）
Selected from the group consisting of the above-mentioned Geobacillus stearothermophilus detection probe, the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the complementary sequence thereof, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the complementary sequence thereof It is preferable to use in combination with one or more types of probes having a base sequence that can increase the detection accuracy of Geobacillus stearothermophilus.
GATAACCGGAAAAGCGGAGG (SEQ ID NO: 12)
GAAGGTTATTTGACCCCGAGC (SEQ ID NO: 13)
（Ｃ）のバチルス・リチェニフォルミスの検出には、以下の配列番号４に示される塩基配列及びその相補配列、並びに、以下の配列番号５に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ｃ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
CTTATAGACAGGTGCGTTTGGATCT（配列番号：４）
GAAGGATCATTCCTTCAAAGCGTG（配列番号：５）
上記プローブのうち少なくとも１種類を用いれば、バチルス・リチェニフォルミスの検出を行うことができるが、検出精度を更に高めるために、２種類以上を併用してもよい。
For detection of Bacillus licheniformis in (C), from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 below and its complementary sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 below and its complementary sequence At least one type of probe (probe (c)) having a selected base sequence is used.
CTTATAGACAGGTGCGTTTGGATCT (SEQ ID NO: 4)
GAAGGATCATTCCTTCAAAGCGTG (SEQ ID NO: 5)
If at least one of the probes is used, Bacillus licheniformis can be detected, but two or more types may be used in combination in order to further improve the detection accuracy.
上記のバチルス・リチェニフォルミス検出用プローブと、以下の配列番号１４に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用すると、バチルス・リチェニフォルミスの検出精度をより高めることができるので好ましい。
ACTAGATAACGAAAGTAGACATTCACATTCA（配列番号：１４）
When the aforementioned Bacillus licheniformis detection probe is used in combination with one or more probes consisting of a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 below and its complementary sequence, This is preferable because the detection accuracy of niformis can be further increased.
ACTAGATAACGAAAGTAGACATTCACATTCA (SEQ ID NO: 14)
（Ｄ）のバチルス・サブチリスの検出には、以下の配列番号６に示される塩基配列及びその相補配列、並びに、配列番号７に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ｄ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
TTACGGAATATAAGACCTTGGGTCTT（配列番号：６）
ATAAACAGAACGTTCCCTGTCTTGT（配列番号：７）
上記プローブのうち少なくとも１種類を用いれば、バチルス・サブチリスの検出を行うことができるが、検出精度を更に高めるために、２種類以上を併用してもよい。
The detection of Bacillus subtilis in (D) is based on the base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and its complementary sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and its complementary sequence. At least one of the probes (probe (d)) is used.
TTACGGAATATAAGACCTTGGGTCTT (SEQ ID NO: 6)
ATAAACAGAACGTTCCCTGTCTTGT (SEQ ID NO: 7)
If at least one of the probes is used, Bacillus subtilis can be detected, but two or more types may be used in combination in order to further improve the detection accuracy.
上記バチルス・サブチリス検出用プローブと、以下の配列番号１５に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用すると、バチルス・サブチリスの検出精度をより高めることができるので好ましい。
GTAATACAAGATATCACATAGTGATTCTTTTTAACG（配列番号：１５）
When the aforementioned Bacillus subtilis detection probe is used in combination with one or more probes consisting of a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 below and its complementary sequence, the detection accuracy of Bacillus subtilis can be improved. Since it can raise more, it is preferable.
GTAATACAAGATATCACATAGTGATTCTTTTTAACG (SEQ ID NO: 15)
（Ｅ）のバチルス・メガテリウムの検出には、以下の配列番号８に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ｅ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
AATAACACAACAATATGTTGTACCATTTATTC（配列番号：８）
上記のプローブのうち少なくとも１種類を用いれば、バチルス・メガテリウムの検出を行うことができるが、検出精度を更に高めるために、２種類を併用してもよい。
For the detection of Bacillus megaterium in (E), at least one of probes (probe (e)) comprising a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 below and its complementary sequence is used. It is done.
AATAACACAACAATATGTTGTACCATTTATTC (SEQ ID NO: 8)
If at least one of the above probes is used, Bacillus megaterium can be detected, but two types may be used in combination in order to further improve the detection accuracy.
上記のバチルス・メガテリウム検出用プローブと、以下の配列番号１６に示される塩基配列及びその相補配列、並びに、配列番号１７に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用すると、バチルス・メガテリウムの検出精度をより高めることができるので好ましい。
TGCTGAGGAAAAGTGAAACTTTTC（配列番号：１６）
TTTTTACATGACGTACGTTTTGACAC（配列番号：１７）
The probe comprising the above-mentioned probe for detecting Bacillus megaterium, the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and the complementary sequence thereof, and the base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the complementary sequence thereof It is preferable to use one or more of these in combination since the detection accuracy of Bacillus megaterium can be further increased.
TGCTGAGGAAAAGTGAAACTTTTC (SEQ ID NO: 16)
TTTTTACATGACGTACGTTTTGACAC (SEQ ID NO: 17)
（Ｆ）のパエニバチルス・ポリミキサの検出には、以下の配列番号９に示される塩基配列及びその相補配列、並びに、以下の配列番号１０に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブ（プローブ（ｆ））のうち少なくとも１種類が用いられる。
GAATATTCCTTTAAGCTGATCTTGTGTAAA（配列番号：９）
AACAAGTGAAATAAAGGTAGCTGCCT（配列番号：１０）
上記プローブのうち少なくとも１種類を用いれば、パエニバチルス・ポリミキサの検出を行うことができるが、検出精度を更に高めるために、２種類以上を併用してもよい。
For detection of the Paenibacillus polymixer of (F), a base selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 below and its complementary sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 below and its complementary sequence At least one kind of probe (probe (f)) comprising an array is used.
GAATATTCCTTTAAGCTGATCTTGTGTAAA (SEQ ID NO: 9)
AACAAGTGAAATAAAGGTAGCTGCCT (SEQ ID NO: 10)
If at least one of the probes is used, the Paenibacillus polymixer can be detected, but two or more types may be used in combination in order to further improve the detection accuracy.
上記のパエニバチルス・ポリミキサ検出用プローブと、以下の配列番号１８に示される塩基配列及びその相補配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるプローブの１種以上とを併用すると、パエニバチルス・ポリミキサの検出精度をより高めることができるので好ましい。
CGAAACGAAATTGCGTTTTAG（配列番号：１８）
When the above-mentioned probe for detecting Paenibacillus polymixer is used in combination with one or more probes consisting of a base sequence selected from the group consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 below and its complementary sequence, the detection accuracy of Paenibacillus polymixer Can be further increased, which is preferable.
CGAAACGAAATTGCGTTTTAG (SEQ ID NO: 18)
本発明で使用するプローブは、当該技術分野において周知の方法に従い合成することができる。 The probe used in the present invention can be synthesized according to a method well known in the art.
本発明における被検試料中の核酸とプローブとのハイブリダイゼーションでは、当該技術分野で一般的に使用されているハイブリダイゼーション条件を用いることができる。好ましい条件としては以下のものがあげられる。
反応溶液：1×SSC／0.1% SDS（終濃度）
ハイブリダイゼーション温度：45℃
For the hybridization between the nucleic acid and the probe in the test sample in the present invention, hybridization conditions generally used in the art can be used. Preferred conditions include the following.
Reaction solution: 1 x SSC / 0.1% SDS (final concentration)
Hybridization temperature: 45 ° C
PCR増幅産物の検出は、当該技術分野において一般的に使用されているものを用いることができる。
例えば、蛍光物質（Cy5等）や、発色試薬（ビオチン、フルオレセイン等）、放射性物質等の標識物質で、プライマー、PCR増幅に用いるdNTP又はPCR増幅産物を標識しておくことにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
ハイブリダイゼーションに先立つ被検試料中の核酸のPCR増幅を上述した共通プライマー（６種類の検出対象菌のITSを同時に増幅できるプライマー対）を用いて行い、かつ、ハイブリダイゼーションをＤＮＡチップ（１枚の基板上の複数のスポットの各々に、予め決められた菌種の検出プローブが独立して固定されている）を用いて行う場合、１種類の標識物質で共通プライマーを標識しておけば、当該標識物質の検出手段を用いるだけで複数種類の菌種に対応するハイブリダイゼーションを一度に検出することができるので好ましい。
ＤＮＡチップとしてはアフィメトリクス型及びスタンフォード型のいずれも使用可能である。また、ＤＮＡチップは、当該技術分野において周知の手順に従い、プラスチックやシリコン、ガラス等の基板上へ、上述の各菌種検出用プローブを安定して固定化することにより作製することができる。
For detection of PCR amplification products, those commonly used in the art can be used.
For example, hybridization is detected by labeling primers, dNTPs used for PCR amplification, or PCR amplification products with fluorescent substances (Cy5, etc.), coloring reagents (biotin, fluorescein, etc.) and radioactive substances. can do.
PCR amplification of nucleic acids in a test sample prior to hybridization is performed using the above-described common primers (primer pairs capable of simultaneously amplifying ITS of six types of detection target bacteria), and hybridization is performed on a DNA chip (one A detection probe of a predetermined bacterial species is independently fixed to each of a plurality of spots on the substrate), if a common primer is labeled with one type of labeling substance, It is preferable because hybridization corresponding to a plurality of types of fungi can be detected at a time only by using a labeling substance detection means.
As the DNA chip, either an affilimetric type or a Stanford type can be used. The DNA chip can be produced by stably immobilizing each of the above-mentioned fungus species detection probes on a substrate made of plastic, silicon, glass or the like according to a procedure well known in the art.
（実施例）
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
(Example)
Next, the effects of the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１
実施例１では、本発明のプローブによる対象菌の検出について評価した。
Example 1
In Example 1, the detection of target bacteria by the probe of the present invention was evaluated.
DNAチップの作製方法
表１に示すプローブを合成した（Invitrogen 社）。各プローブは、その5’末端がアミノ基で修飾されていた。このアミノ基は、ＤＮＡチップ基板上に導入されたカルボキシル基との間でアミド結合を形成して、プローブとＤＮＡチップ基板との間に強固な結合をもたらすために導入した。
Preparation method of DNA chip The probes shown in Table 1 were synthesized (Invitrogen). Each probe was modified at its 5 ′ end with an amino group. This amino group was introduced in order to form an amide bond with the carboxyl group introduced onto the DNA chip substrate, thereby providing a strong bond between the probe and the DNA chip substrate.
表１
Probe1〜18の各合成プローブ水溶液にポリエチレングリコール（分子量300）を添加して、10μMプローブ／30%ポリエチレングリコール溶液（終濃度）を調製した。これらを5μLずつ分注した384ウェルマイクロプレートとＤＮＡチップ基板であるジーンシリコン(東洋鋼鈑社製)とをスポッティングマシンSPBIOTM2000（Hitachi Software Engineering Co. Ltd.）の所定の位置にセットし、スポッティングを実施した。
スポッティング完了後、基板を定温乾燥器内に入れ、80℃で１時間ベーキングを行い、2×SSC／0.2%SDS溶液、蒸留水で洗浄を行った。遠心乾燥後、アルミパウチで真空包装した。作製したＤＮＡチップの各スポットには、表１記載の１8種類のプローブのいずれか１つが固定化されていた。したがって、得られた１枚のＤＮＡチップ上には、１８種類のプローブが固定化されていた。ＤＮＡチップは、細菌検出実験に使用するまで−20℃で保管した。
Polyethylene glycol (molecular weight 300) was added to each probe aqueous solution of Probes 1 to 18 to prepare a 10 μM probe / 30% polyethylene glycol solution (final concentration). Set the 384-well microplate into which 5 μL of each was dispensed and the DNA chip substrate Gene Silicon (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) at a predetermined position of the spotting machine SPBIO TM 2000 (Hitachi Software Engineering Co. Ltd.), Spotting was performed.
After completion of spotting, the substrate was placed in a constant temperature dryer, baked at 80 ° C. for 1 hour, and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS solution and distilled water. After centrifugal drying, vacuum packaging was performed with an aluminum pouch. Any one of 18 kinds of probes listed in Table 1 was immobilized on each spot of the prepared DNA chip. Therefore, 18 types of probes were immobilized on the obtained single DNA chip. The DNA chip was stored at −20 ° C. until used for bacterial detection experiments.
菌体からの核酸抽出
検出対象菌として以下の表２に示す６種類の有胞子好気性細菌：バチルス・コアグランス、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・サブチリス、バチルス・メガテリウム、パエニバチルス・ポリミキサを用いた。
6 types of sporic aerobic bacteria shown in Table 2 below as bacteria for nucleic acid extraction detection from bacterial cells : Bacillus coagulans, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis Megathelium, Paenibacillus polymixer was used.
表２
各菌種について最適条件で液体培養を行い、回収した菌体にリゾチーム溶液を加えて常温で30分程度溶菌処理を行った。リゾチーム溶菌処理液を自動核酸抽出装置Magtration System 12GC（プレシジョン・システム・サイエンス社）にセットし、核酸抽出キットGC series Magtration-MagaZorb DNA Common Kit 200N（プレシジョン・システム・サイエンス社）を用いて、核酸（ＤＮＡ）の抽出精製を行った。抽出した核酸溶液の濃度を統一するため、PicoGreen dsDNA Quantitation Kit（Molecular Probes社）を用いて抽出したDNAを定量し、分析値に基づいて各菌種の核酸溶液の濃度を100pg／μLに調製した。 Liquid culture was performed under optimum conditions for each bacterial species, and a lysozyme solution was added to the collected bacterial cells, followed by lysis treatment at room temperature for about 30 minutes. Set the lysozyme lysis solution in the automatic nucleic acid extraction device Magtration System 12GC (Precision System Science) and use the nucleic acid extraction kit GC series Magtration-MagaZorb DNA Common Kit 200N (Precision System Science) DNA) was extracted and purified. In order to unify the concentration of the extracted nucleic acid solution, the extracted DNA was quantified using the PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Molecular Probes), and the concentration of the nucleic acid solution of each bacterial species was adjusted to 100 pg / μL based on the analysis value. .
PCRによる核酸の増幅
各菌種の抽出DNAを含むPCR反応液を用いてPCRを行い、ITS領域（DNAチップ中の各プローブがハイブリダイズする領域）を増幅した。PCR条件は以下の通りであった。
Amplification of nucleic acid by PCR PCR was performed using a PCR reaction solution containing extracted DNA of each bacterial species, and the ITS region (region where each probe in the DNA chip hybridizes) was amplified. PCR conditions were as follows.
PCR反応液の組成
PCR反応条件
ハイブリダイゼーション及びその検出
PCR反応後の上記PCR反応液2μLに3×SSC／0.3%SDS溶液1μLを加えて混合してハイブリダイゼーション反応溶液とした（1×SSC／0.1% SDS（終濃度））。このハイブリダイゼーション反応溶液を、作製したDNAチップ上に添加した。ハイブリダイゼーション反応溶液の蒸発を防ぐため、カバープレートをかぶせてから45℃に設定した高湿チャンバー内で120分間静置してハイブリダイゼーション反応を行った。反応後、DNAチップを常温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Bioshot(東洋鋼鈑社製)で各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。このハイブリダイゼーション実験を、Ａ〜Ｆの各菌種に由来する６種類のPCR反応液のそれぞれについて行った。
Hybridization and its detection
1 μL of 3 × SSC / 0.3% SDS solution was added to 2 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction and mixed to obtain a hybridization reaction solution (1 × SSC / 0.1% SDS (final concentration)). This hybridization reaction solution was added onto the prepared DNA chip. In order to prevent evaporation of the hybridization reaction solution, the hybridization reaction was carried out by placing it in a high-humidity chamber set at 45 ° C. for 120 minutes after covering the cover plate. After the reaction, the DNA chip is washed by immersing it in a washing solution (2 x SSC / 0.2% SDS solution, 2 x SSC solution in this order) at room temperature, and a cover glass is placed on the fluorescence detector Bioshot (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) The fluorescence of the spot area of each probe was detected. This hybridization experiment was performed for each of the six types of PCR reaction solutions derived from each of the A to F bacterial species.
結果
結果を表３に示す。表３中、「○」は陽性（対象菌種を蛍光検出）を意味し、「×」は陰性（蛍光非検出）を意味し、「△」は偽陽性（非対象菌種を蛍光検出）を意味する。
The results are shown in Table 3. In Table 3, “◯” means positive (fluorescence detection of target bacterial species), “×” means negative (fluorescence non-detection), and “△” is false positive (fluorescence detection of non-target bacterial species). Means.
表３
18種類のプローブを固定した各スポットは、対象菌種の核酸とハイブリダイズしCy5に基づく蛍光が検出された。特に、Probe1〜10（配列番号：１〜１０）は対象菌種の核酸と特異的にハイブリダイズした。したがって、本発明の配列番号：１〜１０のプローブのそれぞれが検出対象菌を特異的に検出できることが確認された。 Each spot to which 18 types of probes were immobilized hybridized with the nucleic acid of the target bacterial species, and fluorescence based on Cy5 was detected. In particular, Probes 1 to 10 (SEQ ID NOs: 1 to 10) hybridized specifically with the nucleic acid of the target bacterial species. Therefore, it was confirmed that each of the probes of SEQ ID NOs: 1 to 10 of the present invention can specifically detect the detection target bacteria.
実施例２
実施例２では、実施例１の各プローブの検出対象菌以外の菌とのクロスハイブリダイズについて評価した。
Example 2
In Example 2, each probe of Example 1 was evaluated for cross-hybridization with bacteria other than the detection target bacteria.
DNAチップの作製方法
実施例１に記載の手順に従いＤＮＡチップを作製した。作製したＤＮＡチップの各スポットには、表１記載の１8種類のプローブのいずれか１つが固定化されていた。したがって、得られた１枚のＤＮＡチップ上には、１８種類のプローブが固定化されていた。ＤＮＡチップは、細菌検出実験に使用するまで−20℃で保管した。
Preparation method of DNA chip A DNA chip was prepared according to the procedure described in Example 1. Any one of 18 kinds of probes listed in Table 1 was immobilized on each spot of the prepared DNA chip. Therefore, 18 types of probes were immobilized on the obtained single DNA chip. The DNA chip was stored at −20 ° C. until used for bacterial detection experiments.
菌体からの核酸抽出
以下の表４に示す菌種を使用した。
Nucleic acid extraction from bacterial cells The bacterial species shown in Table 4 below were used.
表４
Ａ〜Ｔの各菌種について最適条件で液体培養を行った。培養後、実施例１に記載の手順に従い溶菌処理及び核酸（ＤＮＡ）の抽出精製を行い、各菌種について濃度が100pg／μLの核酸溶液を調製した。 Liquid culture was performed under optimum conditions for each of the bacterial species A to T. After culturing, lysis treatment and nucleic acid (DNA) extraction and purification were performed according to the procedure described in Example 1 to prepare a nucleic acid solution having a concentration of 100 pg / μL for each bacterial species.
PCRによる核酸の増幅
実施例１に記載の手順に従い、各菌種の抽出DNAを含むPCR反応液を用いてPCRを行い、ITS領域（DNAチップ中の各プローブがハイブリダイズする領域）を増幅した。
Amplification of nucleic acid by PCR According to the procedure described in Example 1, PCR was performed using a PCR reaction solution containing extracted DNA of each bacterial species, and the ITS region (region where each probe in the DNA chip hybridizes) was amplified. .
ハイブリダイゼーション及びその検出
PCR反応後のPCR反応液について、実施例１に記載の手順に従い、DNAチップとのハイブリダイゼーション反応及びその検出を行った。なお、ハイブリダイゼーション実験は、Ａ〜Ｔの各菌種に由来する２０種類のPCR反応液のそれぞれについて行った。
Hybridization and its detection
The PCR reaction solution after the PCR reaction was subjected to a hybridization reaction with a DNA chip and its detection according to the procedure described in Example 1. In addition, hybridization experiment was performed about each of 20 types of PCR reaction liquid derived from each microbial species of AT.
結果
結果を表５に示す。表５中、「○」は陽性（対象菌種を蛍光検出）を意味し、「×」は陰性（蛍光非検出）を意味し、「△」は偽陽性（非対象菌種を蛍光検出）を意味する。
The results are shown in Table 5. In Table 5, “◯” means positive (fluorescence detection of target bacterial species), “×” means negative (fluorescence non-detection), and “Δ” is false positive (fluorescence detection of non-target bacterial species). Means.
表５
Probe1〜10（配列番号：１〜１０）は、いずれも検出対象外の菌とクロスハイブリダイズすることなしに、対象菌種のみを特異的にハイブリダイズした。したがって、本発明の配列番号：１〜１０のプローブのそれぞれが検出対象菌を特異的に検出できることが確認された。
Probe11〜18（配列番号：１１〜１８）はProbe1〜10と同様に対象菌種とハイブリダイズしたが、いくつかの非対象菌種ともクロスハイブリダイズした。したがって、Probe11〜18は、Probe1〜10と組み合わせる（ただし、同一の菌種を対象とするプローブの組み合わせ）ことで本発明に使用できることが確認された。
Probes 1 to 10 (SEQ ID NOs: 1 to 10) all specifically hybridized only to the target bacterial species without cross-hybridizing with bacteria that were not detected. Therefore, it was confirmed that each of the probes of SEQ ID NOs: 1 to 10 of the present invention can specifically detect the detection target bacteria.
Probes 11 to 18 (SEQ ID NOs: 11 to 18) hybridized with the target bacterial species in the same manner as Probes 1 to 10, but cross-hybridized with some non-target bacterial species. Therefore, it was confirmed that Probes 11 to 18 can be used in the present invention by combining with Probes 1 to 10 (however, a combination of probes targeting the same bacterial species).
実施例３
実施例３では、複数種類のプローブを固定化してなるＤＮＡチップを用いての対象菌種の同時検出について評価した。
Example 3
In Example 3, simultaneous detection of the target bacterial species using a DNA chip formed by immobilizing multiple types of probes was evaluated.
DNAチップの作製方法
実施例１の表１に記載のProbe1〜4及び7〜10の各合成プローブの水溶液にポリエチレングリコール（分子量300）を添加して、10μMプローブ／30%ポリエチレングリコール溶液（終濃度）を調製した。これらを5μLずつ分注した384ウェルマイクロプレートとＤＮＡチップ基板であるジーンシリコン(東洋鋼板社製)とをスポッティングマシンSPBIOTM2000（Hitachi Software Engineering Co. Ltd.）の所定の位置にセットし、スポッティングを実施した。
スポッティング完了後、基板を定温乾燥器内に入れ、80℃で１時間ベーキングを行い、2×SSC／0.2%SDS溶液、蒸留水で洗浄を行った。遠心乾燥後、アルミパウチで真空包装した。作製したＤＮＡチップの各スポットには、8種類のプローブのいずれか１つが固定化されていた。したがって、得られた１枚のＤＮＡチップ上には、８種類のプローブが固定化されていた。ＤＮＡチップは、細菌検出実験に使用するまで−20℃で保管した。
Preparation method of DNA chip Polyethylene glycol (molecular weight 300) was added to the aqueous solution of each probe 1 to 4 and 7 to 10 described in Table 1 of Example 1, and a 10 μM probe / 30% polyethylene glycol solution (final concentration) ) Was prepared. Place a 384-well microplate into which 5 μL of each of these was dispensed and Gene Silicon (manufactured by Toyo Steel Co., Ltd.), a DNA chip substrate, in a spotting machine SPBIO TM 2000 (Hitachi Software Engineering Co. Ltd.) and spot it. Carried out.
After completion of spotting, the substrate was placed in a constant temperature dryer, baked at 80 ° C. for 1 hour, and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS solution and distilled water. After centrifugal drying, vacuum packaging was performed with an aluminum pouch. One of 8 types of probes was immobilized on each spot of the prepared DNA chip. Therefore, eight types of probes were immobilized on the obtained single DNA chip. The DNA chip was stored at −20 ° C. until used for bacterial detection experiments.
菌体からの核酸抽出
検出対象菌として以下の表６に示す６種類の有胞子好気性細菌を用いた。
Six types of spore aerobic bacteria shown in Table 6 below were used as bacteria for nucleic acid extraction detection from bacterial cells .
表６
Ａ〜Ｆの各菌種について最適条件で液体培養を行った。培養後、実施例１に記載の手順に従い溶菌処理及び核酸（ＤＮＡ）の抽出精製を行い、各菌種について濃度が100pg／μLの核酸溶液を調製した。 Liquid culture was performed under optimum conditions for each of the A to F bacterial species. After culturing, lysis treatment and nucleic acid (DNA) extraction and purification were performed according to the procedure described in Example 1 to prepare a nucleic acid solution having a concentration of 100 pg / μL for each bacterial species.
PCRによる核酸の増幅
各菌種の抽出DNAの混合物を含むPCR反応液を用いてPCRを行い、ITS領域（DNAチップ中の各プローブがハイブリダイズする領域）を増幅した。PCR条件は以下の通りであった。
Amplification of nucleic acid by PCR PCR was performed using a PCR reaction solution containing a mixture of extracted DNA of each bacterial species, and the ITS region (region where each probe in the DNA chip hybridizes) was amplified. PCR conditions were as follows.
PCR反応液の組成
PCR反応条件
ハイブリダイゼーション及びその検出
PCR反応後の上記PCR反応液2μLに3×SSC／0.3%SDS溶液1μLを加えて混合してハイブリダイゼーション反応溶液とした（1×SSC／0.1% SDS（終濃度））。このハイブリダイゼーション反応溶液を、作製したDNAチップ上に添加した。ハイブリダイゼーション反応溶液の蒸発を防ぐため、カバープレートをかぶせてから45℃に設定した高湿チャンバー内で120分間静置してハイブリダイゼーション反応を行った。反応後、DNAチップを常温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Bioshot(東洋鋼鈑社製)で各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
Hybridization and its detection
1 μL of 3 × SSC / 0.3% SDS solution was added to 2 μL of the PCR reaction solution after the PCR reaction and mixed to obtain a hybridization reaction solution (1 × SSC / 0.1% SDS (final concentration)). This hybridization reaction solution was added onto the prepared DNA chip. In order to prevent evaporation of the hybridization reaction solution, the hybridization reaction was carried out by placing it in a high-humidity chamber set at 45 ° C. for 120 minutes after covering the cover plate. After the reaction, the DNA chip is washed by immersing it in a cleaning solution (2 x SSC / 0.2% SDS solution, 2 x SSC solution in this order) at room temperature, and a cover glass is placed on the fluorescence detector Bioshot (Toyo Kohan Co., Ltd.) The fluorescence of the spot area of each probe was detected.
結果
結果を表７に示す。表７中、「○」は陽性（蛍光検出）を意味し、「×」は陰性（蛍光非検出）を意味する。
The results are shown in Table 7. In Table 7, “◯” means positive (fluorescence detection), and “x” means negative (no fluorescence detection).
表７
Probe1〜4及び7〜10を１つのチップ上に固定してなるＤＮＡチップにおいて、各Probeは対象菌種のみと特異的にハイブリダイズした。したがって、本発明のプローブを用いて６種類の検出対象菌を個別的かつ同時に検出できることが確認された。 In a DNA chip formed by fixing Probes 1 to 4 and 7 to 10 on one chip, each probe specifically hybridized only with the target bacterial species. Therefore, it was confirmed that six types of detection target bacteria can be detected individually and simultaneously using the probe of the present invention.
本発明は、食品等の製品における有害な有胞子好気性細菌の検出に利用することができる。 The present invention can be used for detecting harmful spore aerobic bacteria in products such as foods.
Claims (2)
（Ａ）バチルス・コアグランス
（Ｂ）ジオバチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｃ）バチルス・リチェニフォルミス
（Ｄ）バチルス・サブチリス
（Ｅ）バチルス・メガテリウム及び
（Ｆ）パエニバチルス・ポリミキサ
からなる群より選ばれる２種以上の細菌の被検試料中における存在を同時に検出する方法であって、
被検試料中の核酸と、下記（ａ）〜（ｆ）のプローブからなる群より選ばれる２種以上のプローブ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・コアグランス検出用プローブの１種以上、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス検出用プローブの１種以上、
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号５に示される塩基配列からなるプローブ、及び
配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・リチェニフォルミス検出用プローブの１種以上、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号７に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号７に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・サブチリス検出用プローブの１種以上、
（ｅ）配列番号８に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・メガテリウム検出用プローブの１種以上、並びに
（ｆ）配列番号９に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、パエニバチルス・ポリミキサ検出用プローブの１種以上、とをハイブリダイズさせることを特徴とする、検出方法。 The following six types of bacteria (A) to (F):
(A) Bacillus coagulans (B) Geobacillus stearothermophilus (C) Bacillus licheniformis (D) Bacillus subtilis (E) Bacillus megaterium and (F) Paenibacillus polymixer A method for simultaneously detecting the presence of two or more bacteria in a test sample,
Two or more types of probes selected from the group consisting of nucleic acids in a test sample and the following probes (a) to (f):
(A) a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
One or more types of probes for detecting Bacillus coagulans selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and
One or more types of probes for detecting Geobacillus stearothermophilus selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(C) a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
One or more types of probes for detecting Bacillus licheniformis selected from the group consisting of a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 ,
(D) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and
One or more probes for detecting Bacillus subtilis selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(E) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and
One or more types of probes for detecting Bacillus megaterium selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and (f) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 ,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 9,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A detection method comprising: hybridizing with one or more probes for detecting Paenibacillus polymixer selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
（Ａ）バチルス・コアグランス
（Ｂ）ジオバチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｃ）バチルス・リチェニフォルミス
（Ｄ）バチルス・サブチリス
（Ｅ）バチルス・メガテリウム及び
（Ｆ）パエニバチルス・ポリミキサ
からなる群より選ばれる２種以上の細菌の被検試料中における存在を同時に検出するためのＤＮＡチップであって、
下記（ａ）〜（ｆ）のプローブからなる群より選ばれる２種以上のプローブ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・コアグランス検出用プローブの１種以上、
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス検出用プローブの１種以上、
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号５に示される塩基配列からなるプローブ、及び
配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・リチェニフォルミス検出用プローブの１種以上、
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号７に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号７に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・サブチリス検出用プローブの１種以上、
（ｅ）配列番号８に示される塩基配列からなるプローブ、及び、
配列番号８に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、バチルス・メガテリウム検出用プローブの１種以上、並びに
（ｆ）配列番号９に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号９に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列からなるプローブ、
配列番号１０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプローブからなる群より選ばれる、パエニバチルス・ポリミキサ検出用プローブの１種以上、
を基板に固定してなることを特徴とするＤＮＡチップ。 The following six types of bacteria (A) to (F):
(A) Bacillus coagulans (B) Geobacillus stearothermophilus (C) Bacillus licheniformis (D) Bacillus subtilis (E) Bacillus megaterium and (F) Paenibacillus polymixer A DNA chip for simultaneously detecting the presence of two or more bacteria in a test sample,
Two or more probes selected from the group consisting of the following probes (a) to (f):
(A) a probe comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
One or more types of probes for detecting Bacillus coagulans selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and
One or more types of probes for detecting Geobacillus stearothermophilus selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(C) a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
One or more types of probes for detecting Bacillus licheniformis selected from the group consisting of a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a probe consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 ,
(D) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6,
A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and
One or more probes for detecting Bacillus subtilis selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(E) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and
One or more types of probes for detecting Bacillus megaterium selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and (f) a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 ,
A probe comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 9,
A probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
One or more types of probes for detecting Paenibacillus polymixer selected from the group consisting of probes consisting of base sequences complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10,
A DNA chip characterized by being fixed on a substrate.
Priority Applications (1)
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