JP5865838B2 - 線維芽細胞増殖因子−２３の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Description

本発明は、試料中の線維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３と記す）の測定方法、及び、ＦＧＦ−２３の測定試薬に関する。

ＦＧＦ−２３は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員であり、主として骨組織で産生される251アミノ酸からなるポリペプチドであり、腎臓に作用し、腎尿細管でのリンの再吸収を阻害する。近年、低リン血症性くる病、腫瘍性骨軟化症、腎不全等の疾患におけるＦＧＦ−２３の関与が示俊されている（非特許文献１参照）。

ＦＧＦ−２３は、Ｎ末端の24アミノ酸が脱離した227アミノ酸からなるポリペプチドが修飾を受け、糖鎖が付加した構造として、約32.5kDaの成熟したタンパクとして細胞外に放出される。また、ＦＧＦ−２３は、トロンビンによりＮ末端より197番目と198番目の間の結合が切断され、198−251番目のフラグメントがＣ末フラグメントとして血中に存在する。

これまでに、ＦＧＦ−２３に対する抗体が取得され（特許文献１及び２；非特許文献２参照）、当該抗体を用いた、血清又は血漿中のＦＧＦ−２３の免疫測定法が報告されており（特許文献１；非特許文献２参照）、本測定法に基づく測定キットも市販されている［Human Intact FGF-23 ELISA Kit(Immutopics社)、Human FGF-23 (C-Term) ELISA Kit(Immutopics社)、FGF-23測定試薬（カイノス社）］。

しかしながら、これまでの免疫測定法は、プレート法による測定方法であり、この方法は、測定感度が低く、測定範囲が狭い等の問題があった。特に慢性腎臓病（CKD）患者、及び、透析患者においては数pg/mL〜数万pg/mLの濃度域の検体が存在し、低濃度検体においては、精度不良により正しい測定値が得られず、また、高濃度検体においては測定範囲をオーバーしてしまう等の課題があった。

WO2003/057733パンフレット 特表２００４−５０４０６３号公報

腎と骨代謝, vol.15, No.4, p.351〜356 (2002). N ENGL J MED, vol.348, No.17, p.1656〜1663 (2003).

本発明の目的は、高感度で、測定範囲の広い、試料中のＦＧＦ−２３の測定方法及び測定試薬を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、磁性粒子を担体として用いる免疫測定法により、高感度で、測定範囲の広い、ＦＧＦ−２３の測定が可能となる、という知見を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。

［１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＦＧＦ−２３の測定方法。
（１）試料中のＦＧＦ−２３を、水性媒体中で、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程；及び、
（３）工程（２）で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。
［２］ 第２抗体が、標識化された抗体である［１］記載の測定方法。
［３］ 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である［２］記載の測定方法。
［４］ 工程（３）の磁性粒子上の免疫複合体の測定が、化学発光の測定により行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］ 試料が、血清又は血漿である［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法。

［６］ 磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有することを特徴とする、試料中のＦＧＦ−２３測定試薬。
［７］ 第２抗体が、標識化された抗体である［６］記載の測定試薬。
［８］ 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である［７］記載の測定試薬。
［９］ さらに、化学発光測定試薬を含む［６］〜［８］のいずれかに記載の測定試薬。
［１０］ 試料が、血清又は血漿である［６］〜［９］のいずれかに記載の測定試薬。

本発明により、高感度で、測定範囲の広い、試料中のＦＧＦ−２３の測定方法及び測定試薬が提供される。

実施例１のＦＧＦ−２３の測定方法の最小測定濃度を示すグラフであり、試料中のＦＧＦ−２３濃度と発光量との関係を表すグラフである。横軸はＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を、縦軸は発光量(RLU)を表す。Ｉは平均値±2SDの範囲を示す。また、破線は、ブランク＋2SDの発光量を表す。 実施例２のＦＧＦ−２３の測定方法の測定範囲を示すグラフであり、試料中のＦＧＦ−２３濃度と発光量との関係を表すグラフである。横軸はＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を、縦軸は発光量(RLU)を表す。 透析患者由来の血清（患者血清Ｄ）を用いた、実施例３の測定方法における希釈直線性を示すグラフであり、希釈率とＦＧＦ−２３濃度との関係を表すグラフである。横軸は当該血清の希釈率を、縦軸は決定されたＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を表す。 透析患者由来の血清（患者血清Ｅ）を用いた、実施例３の測定方法における希釈直線性を示すグラフであり、希釈率とＦＧＦ−２３濃度との関係を表すグラフである。横軸は当該血清の希釈率を、縦軸は決定されたＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を表す。 プレートを使用する比較例１のＦＧＦ−２３の測定方法の最小測定濃度を示すグラフであり、試料中のＦＧＦ−２３濃度と吸光度との関係を表すグラフである。横軸はＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を、縦軸は吸光度(Abs)を表す。Ｉは平均値±2SDの範囲を示す。また、破線は、ブランク＋2SDの発光量を表す。 プレートを使用する比較例２のＦＧＦ−２３の測定方法の測定範囲を示すグラフであり、試料中のＦＧＦ−２３濃度と吸光度との関係を表すグラフである。横軸はＦＧＦ−２３濃度(pg/mL)を、縦軸は吸光度(Abs)を表す。

（測定方法）
本発明の試料中のＦＧＦ−２３の測定方法は、磁性粒子を担体として用いる、サンドイッチ法による試料中のＦＧＦ−２３の免疫測定法であり、以下の工程を含む測定方法である。
（１）試料中のＦＧＦ−２３を、水性媒体中で、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程；及び、
（３）工程（２）で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。

＜工程（１）＞
工程（１）において、試料中のＦＧＦ−２３は、水性媒体中で、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントと反応し、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が生成する。

ここで、試料中のＦＧＦ−２３と、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントとの反応は、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が生成する限りは、いかなる反応でもよく、例えば試料中のＦＧＦ−２３と、磁性粒子、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントとを反応させて、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体もしくはそのフラグメントとＦＧＦ−２３との免疫複合体を生成させた後に、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを反応させても、試料中のＦＧＦ−２３と、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントとを、同時に反応させてもよい。磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体もしくはそのフラグメントとＦＧＦ−２３との免疫複合体を生成させた後に、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを反応させる場合には、当該免疫複合体を生成させた後に洗浄工程を設けることもできる。

工程（１）においてＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントと磁性粒子とは試料中のＦＧＦ−２３と反応させる前に予め、結合させておいてもよい。ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントの磁性粒子への結合は、物理吸着による結合、リンカーを介する結合、抗体のFc領域−Fc領域と結合する抗体、アビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）−ビオチン等の２つの親和性物質間の相互作用を利用した結合等が挙げられる。抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ領域と結合する抗体との相互作用を利用する場合、例えば磁性粒子上に固定化したＦｃ領域と結合する抗体と、第１抗体若しくはそのフラグメントとの相互作用により、第１抗体若しくはそのフラグメントを磁性粒子上に結合させることができる。アビジン類とビオチンとの相互作用を利用する場合、例えば磁性粒子上に固定化したアビジン類と、ビオチン結合第１抗体若しくはそのフラグメント中のビオチンとの相互作用により、第１抗体若しくはそのフラグメントを磁性粒子上に結合させることができる。

反応溶液中の磁性粒子の濃度は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、通常、0.1〜10 mg/mLである。反応温度は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする温度であれば特に限定はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、20〜40℃が特に好ましい。反応時間は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする時間であれば特に限定はなく、通常、5分間〜1時間であり、5〜20分間が好ましい。

ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントが予め、結合した磁性粒子を用いる場合、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントが結合した磁性粒子は、本発明のＦＧＦ−２３の測定方法を可能とする限り、いかなる方法によって製造することができる。例えば0.1〜10 mg/mLの磁性粒子の懸濁液に、0.1〜10μg/mLの第１抗体若しくはそのフラグメント溶液を添加し、37℃で5分間〜1時間反応させることにより、第１抗体若しくはそのフラグメントが結合した磁性粒子を製造することができる。

また、工程（１）において、試料中のＦＧＦ−２３とＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、磁性粒子とからなる免疫複合体を生成させた後に、当該免疫複合体にＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを結合させる場合、当該第２抗体を結合させる前に免疫複合体が結合した磁性粒子の洗浄工程を設けることができる。磁性粒子の洗浄は、磁性粒子上にＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させることができる限りは、いかなる洗浄であってよく、例えば磁性粒子上にＦＧＦ−２３とＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントとの免疫複合体を生成させる反応後の反応混合物の中から磁性粒子以外の成分を除去し、磁性粒子が残った反応容器に洗浄液を添加し、磁性粒子を洗浄する方法や、反応後の反応混合物に洗浄液を添加すると同時に、磁性粒子以外の成分を除去し、磁性粒子を洗浄する方法等が挙げられる。磁性粒子以外の成分の除去は、例えば磁力により磁性粒子を集めて、残った成分を吸引することにより行うことができる。洗浄液としては、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えば後述の水性媒体、後述の水性媒体に界面活性剤が添加された水性媒体等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

尚、工程（１）において、塩類を共存させてもよい。塩類としては、本発明のＦＧＦ−２３の測定方法を可能とする塩類であれば特に制限はなく、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられ、塩化ナトリウムが好ましい。塩類の反応中の濃度は、本発明の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば40〜400 mmol/Lであり、70〜250 mmol/Lが好ましい。

また、工程（１）においては、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液、アルカリホスファターゼ安定化緩衝液等が挙げられる。

＜工程（２）＞
工程（２）において、工程（１）後の磁性粒子、すなわち、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が結合した磁性粒子は磁力によって集められ、磁力により集められた磁性粒子は、それ以外の成分と分離される。磁性粒子を集めるための磁力は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする磁力であれば特に制限はない。磁力により集められた磁性粒子と、それ以外の成分との分離は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする分離であれば特に制限はない。

また、工程（２）の後に、又は、工程（２）と同時に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を結合した磁性粒子を洗浄する工程を含んでいてもよい。磁性粒子の洗浄は、例えば前述の方法等によって行うことができる。

＜工程（３）＞
次いで、工程（３）において、工程（２）により分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することにより、試料中のＦＧＦ−２３を測定することができる。免疫複合体の測定方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。

(1)ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントが標識化されていない場合
第２抗体若しくはそのフラグメントに結合する第３抗体若しくはそのフラグメントに標識が結合した標識化第３抗体若しくはそのフラグメントを、第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が結合している磁性粒子と反応させて、磁性粒子上に、第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、第２抗体若しくはそのフラグメント、及び、第３抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を形成させ、該免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。第２抗体若しくはそのフラグメントに結合する第３抗体若しくはそのフラグメントとしては、例えば第２抗体のＦｃ領域に結合する抗体若しくはそのフラグメント等が挙げられる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられるが、化学発光の測定が好ましい。

(2)ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントが標識化されている場合
磁性粒子上に形成された、第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、標識化されたＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられるが、化学発光の測定が好ましい。

(A)化学発光の測定
化学発光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(A-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した光（ｈν）の強度を発光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。

酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、アルカリホスファターゼと反応して光を生成するアルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］カン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ^ＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ^ＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（Ｌｕｍｉｇｅｎ^ＴＭ ＡＰＳ−５）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して光を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と発光化合物との組み合わせ等が挙げられる。発光化合物としては、例えば、ルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。

酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと反応して光を生成するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］等が挙げられる。

酵素として、ルシフェラーゼを用いる場合、ルシフェラーゼと反応して光を生成するルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。

(A-2)標識が発光物質である場合
標識が発光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の発光物質に起因する光の強度を、発光強度計等で測定することにより行うことができる。発光物質としては、本発明の測定を可能とする発光物質であれば特に制限はなく、例えばアクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。

(B)蛍光の測定
蛍光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(B-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して蛍光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した蛍光の強度を蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、蛍光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して蛍光を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と蛍光化合物との組み合わせ等が挙げられる。蛍光化合物としては、例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。

酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと反応して蛍光を生成するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又はその類似化合物等が挙げられる。

酵素として、β−グルクロニダーゼを用いる場合、β−グルクロニダーゼと反応して蛍光を生成するβ−グルクロニダーゼの基質としては、例えばＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ−βＧｌｕＵ（積水メディカル社製）等が挙げられる。

(B-2)標識が蛍光物質である場合
標識が蛍光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の蛍光物質に起因する蛍光の強度を、蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。蛍光物質としては、本発明の測定を可能とする蛍光物質であれば特に制限はなく、例えばＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ−イソチオシアナート）、ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等が挙げられる。

(C)吸光度の測定
吸光度の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(C-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して色素を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した色素の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、色素を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。

酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼと反応して色素を生成するペルオキシダーゼの基質としては、例えば過酸化水素と酸化発色型色原体との組み合わせ等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えば、ロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。

ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。

磁性粒子上に生成した免疫複合体の測定における測定値に基づいた、試料中のＦＧＦ−２３濃度の決定は、例えば、以下の方法で行うことができる。
既知濃度のＦＧＦ−２３を用いて上記工程（１）から工程（３）を行い、ＦＧＦ−２３の濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を作成し、次いで、測定すべき試料を用いて測定を行い、得られた測定値を予め作成した検量線に照らし合わせて、測定すべき試料中のＦＧＦ−２３濃度を決定する。

（試料）
本発明における試料としては、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿、血清等が好ましい。

（水性媒体）
本発明において使用される水性媒体としては、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、pH1〜11の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。

グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝剤、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。

（磁性粒子）
本発明における磁性粒子としては、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする磁性粒子であれば特に限定はなく、例えばフェライトで被覆したラテックス、フェライトで被覆したポリマー粒子等が挙げられる。また、抗体の結合を容易にするために、ビオチンと結合する性質を有するアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンを表面に固定化した磁性粒子も使用することができる。磁性粒子の粒径は、特に限定されないが、例えば1μm〜6μmであり、好ましくは1μm〜3μmである。本発明における磁性粒子としては、市販の磁性粒子を用いることができる。市販の磁性粒子としては、例えばDynabeads M-280 Streptavidin（ダイナル社製）、Dynabeads M-280 Tosylactivated（ダイナル社製）、Dynabeads MyOne Streptavidin T1（ダイナル社製）、Dynabeads MyOne Tosylactivated（ダイナル社製）、Estapor(メルク社製)、Sera-Mag Magnetic Streptavidin Particles(サーモサイエンティフィック社製)、MAGNOTEX-SA(ＪＳＲ社製)等が挙げられる。

（抗体）
本発明におけるＦＧＦ−２３に結合する抗体（第１抗体及び第２抗体）は、本発明のＦＧＦ−２３の測定を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体フラグメントを用いることもできる。抗体フラグメントとしては、例えば、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab')₂、ペプシン処理−還元処理により得られるFab'等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が挙げられる。磁性粒子として、アビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンがその表面に固定化された磁性粒子を用いる場合には、第１抗体にビオチンが結合したビオチン結合第１抗体を用いることができる。

本発明において使用されるＦＧＦ−２３に結合する第１抗体と第２抗体において、それぞれの抗体が結合するＦＧＦ−２３の部位は同じであっても、異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。

本発明において使用される抗体は、ＦＧＦ−２３そのもの、又は、ＦＧＦ−２３中のエピトープに相当するペプチドを抗原として用いて通常の抗体の作製方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。ＦＧＦ−２３に結合する抗体としては、例えばFERM BP-7838、FERM BP-7839、FERM BP-7840、FERM BP-8268としてそれぞれ寄託されたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体等が挙げられる。

また、本発明のＦＧＦ−２３の測定方法及び測定試薬において、ＦＧＦ−２３に結合する抗体の代わりに、ＦＧＦ−２３に結合するアプタマー等の、抗体以外の物質を用いることもできる。

（測定試薬）
本発明の試料中のＦＧＦ−２３測定試薬は、本発明の試料中のＦＧＦ−２３の測定方法に使用することができる。本発明の測定試薬は、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有する。ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントは、磁性粒子に結合されたものを用いてもよい。

ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントが磁性粒子に結合している場合、本発明の測定試薬は、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントが結合した磁性粒子、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有する。

ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントが磁性粒子に結合していない場合、本発明の測定試薬は、２つの親和性物質のうちの片方が固定化された磁性粒子、２つの親和性物質のうちのもう一方が結合した第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有する。２つの親和性物質の組み合わせとしては、例えばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等のアビジン類と、ビオチンとの組み合わせ等が挙げられる。本発明の測定試薬の１態様としては、例えばアビジン類が固定化された磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメントにビオチンが結合したビオチン結合第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有する測定試薬が挙げられる。

第２抗体若しくはそのフラグメントが標識化されている場合には、本発明の測定試薬は、さらに、第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、標識化第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体中の標識化第２抗体若しくはそのフラグメントの測定を可能とする標識測定試薬を含む。標識測定試薬は、生成した当該免疫複合体中の標識化第２抗体若しくはそのフラグメントを測定することができる試薬であれば特に制限はなく、例えば化学発光測定試薬、蛍光測定試薬等が挙げられるが、化学発光測定試薬が好ましい。

ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントが標識化されていない場合には、本発明の測定試薬は、さらに、当該第２抗体若しくはそのフラグメントに結合する第３抗体若しくはそのフラグメントに標識が結合した標識化第３抗体若しくはそのフラグメントと、第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、第２抗体若しくはそのフラグメント、及び、標識化第３抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体中の標識化第３抗体若しくはそのフラグメントの測定を可能とする標識測定試薬とを含む。第２抗体若しくはそのフラグメントに結合する第３抗体若しくはそのフラグメントとしては、例えば第２抗体のＦｃ領域に結合する抗体若しくはそのフラグメント等が挙げられる。また、当該免疫複合体中の標識化第３抗体若しくはそのフラグメントの測定を可能とする標識測定試薬は、生成した当該免疫複合体中の標識化第３抗体若しくはそのフラグメントを測定することができる試薬であれば特に制限はなく、例えば化学発光測定試薬、蛍光測定試薬、吸光度測定試薬等が挙げられるが、化学発光測定試薬が好ましい。

化学発光測定試薬は、特に、標識が酵素である場合に用いられる試薬であり、その酵素と反応して光を生成する酵素の基質を含む試薬等が挙げられる。酵素と、その酵素と反応して光を生成する酵素の基質との組み合わせについては、前述の組み合わせ等が挙げられる。

蛍光測定試薬は、特に、標識が酵素である場合に用いられる試薬であり、その酵素と反応して蛍光を生成する酵素の基質を含む試薬等が挙げられる。酵素と、その酵素と反応して蛍光を生成する酵素の基質との組み合わせについては、前述の組み合わせ等が挙げられる。

吸光度測定試薬は、特に、標識が酵素である場合に用いられる試薬であり、その酵素と反応して色素を生成する酵素の基質を含む試薬等が挙げられる。酵素と、その酵素と反応して色素を生成する酵素の基質との組み合わせについては、前述の組み合わせ等が挙げられる。

本発明の測定試薬において使用される磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントとしては、例えばそれぞれ前述の磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメント等が挙げられる。また、本発明の測定試薬には、必要に応じて、それぞれ前述の水性媒体、標識酵素の基質、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等を含有させてもよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。

（１）材料及び測定方法
＜測定用試料＞
健常人より得た血清（ＦＧＦ−２３濃度が10 pg/mLの血清；アリエス社より購入）を、0.2%BSA（Bovogen Biologicals社製）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）にてＦＧＦ−２３濃度が9 pg/mL、8 pg/mL、7 pg/mL、6 pg/mL、5 pg/mL、4 pg/mL、3 pg/mL、2 pg/mL、1 pg/mL、になるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＦＧＦ−２３濃度 0 pg/mL）を測定用試料に用いた。

＜磁性粒子懸濁液＞
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin T1；ダイナル社製）を用いて、以下の組成からなる磁性粒子懸濁液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ストレプトアビジン結合磁性粒子 ０．７５ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ

＜ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体とビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液＞
第１抗体として、FERM BP-7838として寄託されたハイブリドーマが生産する抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体２Ｃ３Ｂを用いて、当該抗体とNHS−ビオチンとを混合し、３７℃で１時間反応させ、反応後の混合物をセファデックスG-25カラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に供して未反応のNHS−ビオチンを除去し、ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を調製した。得られたビオチン結合抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体２Ｃ３Ｂ ５μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ

＜アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメントとアルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液＞
第２抗体フラグメントとして、FERM BP-7839として寄託されたハイブリドーマが生産する抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体３Ｃ１Ｅをペプシンで消化した後、G3000SWカラム（東ソー社製；口径：21.5 mm；長さ：60 cm）を用いたHPLCシステム（日立製作所社製）でF(ab’)₂を分離した。得られたF(ab’)₂を２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（ナカライテスク社製）で還元した後、G3000SWカラム（東ソー社製；口径：21.5 mm；長さ：60 cm）を用いたHPLCシステム（日立製作所社製）でFab’を分離した。得られたFab’とアルカリホスファターゼとを以下の手順により、マレイミド法によって結合させた。

マレイミド化試薬Sulfo-HMCS（同仁化学研究所社製）を用いて、アルカリホスファターゼをマレイミド化し、反応混合物をセファデックスG-25カラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に供して未反応のSulfo-HMCSを除去し、マレイミド化アルカリホスファターゼを得た。

調製したマレイミド化アルカリホスファターゼとFab’とを混合し、アルカリホスファターゼ標識Fab’抗体を作製した。得られたアルカリホスファターゼ標識Fab’抗体を用いて、以下の組成からなるアルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント
５μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ

（２）試料中のＦＧＦ−２３の測定
上記（１）で調製した測定用試料10 μLに、（１）で調製した磁性粒子懸濁液、ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液、及び、アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液を各30 μL加えて攪拌し、37℃で20分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液［0.1%ツイーン２０を含有する50 mmol/L ＭＯＰＳ緩衝液(pH7.35)］で磁性粒子を5回洗浄した。その後、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩を主成分とする発光基質液を100 μL加えて攪拌し、生じた発光量(RLU)を測定した。測定結果を図１に示す。

測定系として測定可能な最小濃度を規定する方法として、平均値と標準偏差を用いて統計学的に評価する方法がある。具体的には、0 pg/mL試料を5重測定した際の平均値＋2倍の標準偏差（＋2SD）よりも、（１）で調製した試料を5重測定した際の平均値−2倍の標準偏差（−2SD）が高いRLUとなれば、その試料を検出できる濃度として規定できる。

ＦＧＦ−２３濃度が0 pg/mLである試料を測定した際の発光量の平均＋2SDは173 RLU（図１の破線）であった。一方、ＦＧＦ−２３濃度が1 pg/mLである試料を測定した際の発光量の平均−2SDは186 RLUであり、0 pg/mL試料を測定した際の発光量の平均＋2SDよりも高い値であったことから、1 pg/mLのＦＧＦ−２３を測定できることを確認した。よって、この測定法において、ＦＧＦ−２３を検出できる最小濃度は1 pg/mLであると規定できる。また、図１に示したように、ＦＧＦ−２３が1 pg/mL以上の濃度では濃度依存的な発光量の増加が見られた。

（１）材料及び測定方法
＜測定用試料＞
WO2003/057733に記載された方法によって製造したＦＧＦ−２３を、0.2%BSA（Bovogen Biologicals社製）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）にてＦＧＦ−２３濃度が10,000 pg/mL、3,000 pg/mL、1,000 pg/mL、300 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、になるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＦＧＦ−２３濃度 0 pg/mL）を測定用試料に用いた。

（２）試料中のＦＧＦ−２３の測定
上記（１）の測定用試料を用いる以外は、実施例１と同様の方法により測定を行った。その結果を図２に示す。
図２から明らかな様に、5〜10,000 pg/mLの濃度範囲において、ＦＧＦ−２３濃度依存的、かつ、直線的に発光量が増加することが判明した。従って。本発明の測定方法により、5〜10,000 pg/mLの範囲でＦＧＦ−２３濃度を測定できることが判明した。

人工透析とは、外的な手段で血液の老廃物除去、電解質維持、水分量維持を行うことであるが、体外で循環する血液の凝固を防ぐために抗凝固剤（ヘパリン）を使用している。そのため、透析患者検体では、血清分離後にフィブリンが析出することが多く見られる。血清中に析出したフィブリンが存在すると、ＦＧＦ−２３の測定系に影響を及ぼし正確な結果を得ることができない可能性がある。

正確な測定値が得られているかどうかを判定する方法として、同時再現性試験、添加回収試験、希釈直線性試験がしばしば実施される。そこで、透析患者由来の血清（ディスカバリー ・ライフサイエンス社より購入）を用いて、実施例１の測定方法について、以下の同時再現性試験、添加回収試験、希釈直線性試験を実施した。

（１）同時再現性試験
同時再現性試験とは、同一試料（血清、血漿等）を用いて複数回、連続測定し、測定値のばらつきを評価することで、測定法の正確性を判断する方法である。

透析患者由来の３種類の血清を用いて、実施例１に記載された方法により、それぞれの血清中のＦＧＦ−２３を10重測定した。測定により得られたＦＧＦ−２３濃度と平均、変動係数(CV%)を第１表に示した。各血清に対する変動係数は1.2〜3.1%と良好であった。従って、本発明の方法を用いることにより、透析患者由来の血清中のＦＧＦ−２３を再現性良く測定できることが判明した。

（２）添加回収試験
添加回収試験とは、試料（血清、血漿等）に既知濃度の抗原（ＦＧＦ−２３）を添加したものを測定し、実際の添加量と一致するか否かを評価することで、測定法の正確さを判断する方法である。

透析患者由来の３種類の血清に、WO2003/057733に記載された方法によって製造したＦＧＦ−２３を様々な濃度で添加したものを測定用試料として用いて、実施例１に記載された方法により測定を行い、添加回収試験を行った。添加回収率を第２表に示した。各血清に対する添加回収率は、96.7〜101.6%と良好であった。従って、本発明の測定法を用いることで、透析患者由来の血清中のＦＧＦ−２３を正確に測定できることが判明した。

（３）希釈直線性試験
希釈直線性試験とは、試料（血清、血漿等）を適当な希釈液で段階的に希釈し、希釈倍率に応じて測定値が直線的に減少していくか否かを評価することで、測定法の正確さを判断する方法である。

透析患者由来の２種類の血清（患者血清Ｄ，患者血清Ｅ）を、0.2%BSA（Bovogen Biologicals社製）を含むリン酸緩衝化生理食塩水で、10段階希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＦＧＦ−２３濃度 0 pg/mL）を測定用試料に用いて、実施例１に記載された方法により測定を行い、希釈直線性試験を行った。

その際の希釈率（ｘ軸）と測定により決定されたＦＧＦ−２３濃度（ｙ軸）をプロットしたものを図３及び図４に示した。どちらの透析患者由来の血清においても良好な直線性が得られたことから、本発明の測定法を用いることで、透析患者由来の血清中のＦＧＦ−２３を正確に測定できることが判明した。

［比較例１］
（１）材料及び測定方法
＜測定用試料＞
健常人より得た血清（ＦＧＦ−２３濃度が20 pg/mLの血清；アリエス社より購入）を、0.2%BSA（Bovogen Biologicals社製）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）にてＦＧＦ−２３濃度が16 pg/mL、14 pg/mL、12 pg/mL、10 pg/mL、8 pg/mL、6 pg/mL、4 pg/mL、2 pg/mLになるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＦＧＦ−２３濃度 0 pg/mL）を測定用試料に用いた。

（２）試料中のＦＧＦ−２３の測定
測定キットとして、プレート法によるＦＧＦ−２３測定試薬（カイノス社製）を用い、試料として、（１）で調製した測定用試料を用いて、実施例１と同様の方法により、5重測定した。その結果を図５に示す。

ＦＧＦ−２３濃度が0 pg/mLである試料を測定した際の吸光度の平均＋2SDは0.111（図５の破線）であった。ＦＧＦ−２３濃度が6 pg/mLである試料を測定した際の吸光度の平均−2SDは0.104であり、0 pg/mL試料を測定した際の吸光度の平均＋2SDよりも低い値であったことから、6 pg/mLのＦＧＦ−２３濃度は測定できないことを確認した。一方、ＦＧＦ−２３濃度が8 pg/mLである試料を測定した際の吸光度の平均−2SDは0.115であり、0 pg/mL試料を測定した際の吸光度の平均＋2SDよりも高い値であったことから、8 pg/mLのＦＧＦ−２３を測定できることを確認した。よって、この測定法において、ＦＧＦ−２３を検出できる最小濃度は8 pg/mLであると規定できる。

［比較例２］
ＦＧＦ−２３測定試薬（カイノス社製；プレート法）を用いて、同試薬に付属した標準溶液（ＦＧＦ−２３濃度 0 pg/mL、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、250 pg/mL、500 pg/mL、800 pg/mL）を測定した時の吸光度を図６に示した。10〜800 pg/mLまで、ＦＧＦ−２３濃度依存的に吸光度が増加していた。ＦＧＦ−２３測定試薬の測定範囲上限は800 pg/mLと規定されており、これより高濃度のＦＧＦ−２３を定量することは出来ない。

一方、本発明の方法においては、実施例２に示した通り、5〜10,000 pg/mLまで測定可能であることから、本発明の測定方法は、プレート法よりも、高感度で、測定範囲が広い方法であることが判明した。

本発明により、低リン血症性くる病、腫瘍性骨軟化症、腎不全等の疾患の診断に有効な、高感度で、測定範囲の広い、試料中のＦＧＦ−２３の測定方法及び測定試薬が提供される。

Claims (10)

1. 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の線維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３と記す）の測定方法。
   （１）試料中のＦＧＦ−２３を、水性媒体中で、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、ＦＧＦ−２３、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程；
   （２）工程（１）後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程；及び、
   （３）工程（２）で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。
2. 第２抗体が、標識化された抗体である請求項１記載の測定方法。
3. 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である請求項２記載の測定方法。
4. 工程（３）の磁性粒子上の免疫複合体の測定が、化学発光の測定により行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
5. 試料が、血清又は血漿である請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
6. 請求項１に記載の測定方法に用いられる、磁性粒子、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体若しくはそのフラグメント、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体若しくはそのフラグメントを含有することを特徴とする、試料中のＦＧＦ−２３測定試薬。
7. 第２抗体が、標識化された抗体である請求項６記載の測定試薬。
8. 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である請求項７記載の測定試薬。
9. さらに、化学発光測定試薬を含む請求項６〜８のいずれかに記載の測定試薬。
10. 試料が、血清又は血漿である請求項６〜９のいずれかに記載の測定試薬。

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