JP5883355B2 - バイオフィルム除去剤組成物 - Google Patents

Description

本発明はバイオフィルム除去剤組成物に関する。より詳細には、微生物及び微生物産生物質からなるバイオフィルムを除去し、微生物が関与する様々な分野においてバイオフィルムに起因する危害を防止するためのバイオフィルム除去剤組成物に関する。

バイオフィルムは生物膜やスライムとも言われ、一般に水系で微生物が物質の表面に付着・増殖することによって微生物細胞内から多糖やタンパク質、核酸などの高分子物質を産生して構造体を形成したものを指す。バイオフィルムが形成されると、微生物を原因とする危害が発生して様々な産業分野で問題を引き起こすことが知られている。例えば、食品プラントの配管内にバイオフィルムが形成されると、このバイオフィルムが剥がれ落ち、製品内への異物混入につながるだけでなく、微生物由来の毒素で食中毒の原因となる。更に、金属表面へのバイオフィルム形成は金属腐食の原因となり、設備の老朽化を促進する。

更に、バイオフィルムを形成した微生物集合体に対しては、水系に分散浮遊状態にある微生物に対する場合と比較して、殺菌剤・制菌剤のような微生物制御薬剤の効果が十分に出ないことも多い。例えば医療の面では近年、医療器具の狭い隙間や空孔内に微生物が残存してバイオフィルムを形成し、これを原因とする院内感染例が数多く報告されている。ヒト口腔内においては歯に形成するバイオフィルム、いわゆるデンタルプラーク（歯垢）がう蝕や歯周病の原因となることは良く知られており、これらの問題について長い間検討がなされている。

このようなバイオフィルムを除去する技術として、特許文献１、２のようにプロテアーゼ類を用いた方法が知られている。また、非特許文献１〜３にはキレート剤の持つバイオフィルム除去の効果について報告されている。しかしながら、いずれの方法においても効果的にバイオフィルムを除去するには至っておらず、いまだに大きな課題となっている。

特開２０１０−６７２０号公報 特開平６−２６２１６５号公報

Appl Environ Microbiol 46,1236(1983) Antimirob Agent Chemother 35,1258(1991) Water Res 34,4229(2000)

本発明は、微生物及び微生物産生物質からなるバイオフィルムを効果的に除去し得るバイオフィルム除去剤組成物及びバイオフィルム除去方法を提供する。

本出願人は、上記課題につき鋭意検討した結果、プロテアーゼと一定以上のｐＫＣａを持つキレート剤をアルカリ性条件下で用いることにより、優れたバイオフィルム除去効果を発現することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが９以上であるバイオフィルム除去剤組成物に関する。

また、本発明は、上記本発明のバイオフィルム除去剤組成物を対象物に適用するバイオフィルム除去方法に関する。

また、本発明は、（Ａ）プロテアーゼと（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤とを含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが９以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法に関する。

また、本発明は、（Ａ）プロテアーゼを含む濃縮液と、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤を含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが９以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法に関する。

以下、（Ａ）プロテアーゼを（Ａ）成分、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤を（Ｂ）成分として説明する。

本発明によれば、対象物に存在するバイオフィルムを効率的に除去し得るバイオフィルム除去剤組成物が提供される。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物は、（Ａ）成分としてプロテアーゼを含有する。（Ａ）成分はバイオフィルムの主な構成成分の１つであるタンパク質に作用し、分子中のペプチド結合を分解する。これによりバイオフィルム自体を脆弱化・低分子化することで水への溶解性を向上させ、表面から剥離しやすくすると考えられる。

（Ａ）成分であるプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ類、メタロプロテアーゼ類、システインプロテアーゼ類、及びアスパラギン酸プロテアーゼ類から選ばれる１種又は２種以上が挙げられるが、バイオフィルム除去性の観点からこれらのうちセリンプロテアーゼが好ましく、中でもスブチリシンプロテアーゼがより好ましい。

スブチリシンプロテアーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰ由来のプロテアーゼが好ましく、中でもアルカリ域、具体的にはｐＨ９以上、１４以下に至適ｐＨを持つアルカリプロテアーゼが好ましい。特に汎用性の観点から、ノボザイムズジャパン社から入手できるアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、エスペラーゼ、カンナーゼ、オボザイム、ジェネンコア・インターナショナル社から入手できるプラフェクト、プロペラーゼといった市販されている酵素溶液を用いることが好ましく、また特開２００７−６１１０１号公報に記載されたプロテアーゼを含有する酵素溶液についても好適に使用することができる。

これらのプロテアーゼは１種を単独で、あるいは２種以上を組合せて用いることができる。また、その濃度は特に制限されるものではなく、その種類とタンパク質分解活性能により適宜選択が可能である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ａ）成分のタンパク質分解活性は、バイオフィルム除去効果及びコストの観点から、本発明のバイオフィルム除去剤組成物１ｋｇあたり、０．１ＰＵ以上、更に１ＰＵ以上、更に１０ＰＵ以上、更に１００ＰＵ以上が好ましく、そして、２５００ＰＵ以下、更に２０００ＰＵ以下、更に１５００ＰＵ以下、更に１０００ＰＵ以下が好ましい。また、（Ａ）成分のタンパク質分解活性は、本発明のバイオフィルム除去剤組成物１ｋｇあたり、０．１〜２５００ＰＵが好ましく、１〜２０００ＰＵがより好ましく、１０〜１５００ＰＵが更に好ましく、１００〜１０００ＰＵがより更に好ましい。

なお、本発明のバイオフィルム除去剤組成物中の（Ａ）成分のタンパク質分解活性は次の方法により測定される。
１ｗ／ｖ％の濃度でカゼイン（ハマーステイン：メルク社）を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）１ｍＬを３０℃で５分間保温した後、本発明のバイオフィルム除去剤０．１ｇと混合し、３０℃で１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸−０．２２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム−０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸）２ｍＬを加え、室温で１０分間放置する。次に酸変性タンパク質をろ過（Ｎｏ．２ろ紙；ワットマン社製）し、ろ液０．５ｍＬにアルカリ性銅溶液［１ｗ／ｖ％酒石酸カリウム・ナトリウム水溶液：１ｗ／ｖ％硫酸銅水溶液：炭酸ナトリウムの０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液溶解物（炭酸ナトリウム濃度２ｗ／ｖ％）＝１：１：１００（Ｖ／Ｖ）］２．５ｍＬを添加し３０℃、１０分間保温する。さらに、希釈フェノール試薬［フェノール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で２倍に希釈したもの］０．２５ｍＬを加え、３０℃で３０分間保温後、このサンプルの６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。また、上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えたものをブランクとして同様に吸光度を測定する。次にサンプルとブランクとの吸光度差により、遊離してきた酸可溶性のタンパク質分解物量（チロシン換算された量）が得られ、これを反応時間（本条件の場合：１５分）及び酵素溶液量（本条件の場合：０．１ｇ）で除して、タンパク質分解活性（ＰＵ／ｇ）を求めることができる。なお、１ＰＵは、上記の反応条件において１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とする。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ａ）成分のプロテアーゼの含有量は、経済性とバイオフィルム除去性と酵素安定性の観点から、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．０００２質量％以上、更に好ましくは０．０００５質量％以上、そして、好ましくは０．０２５質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下である。また、本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ａ）成分のプロテアーゼの含有量は、経済性と効果の観点から、好ましくは０．０００１〜０．０２５質量％、より好ましくは０．０００２〜０．０１質量％、更に好ましくは０．０００５〜０．００４質量％である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物は、（Ｂ）成分として２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤を含有する。キレート剤の効果としてはバイオフィルムを構成するタンパク質等の高分子物質間の金属架橋構造を形成する金属イオンを捕捉し、構造を破壊することでバイオフィルム自体を脆弱化させ、水への溶解性を向上させると共に、表面から除去しやすくするものと考えられる。また、このようにバイオフィルムを脆弱化させることによって、（Ａ）成分のバイオフィルムに対する分解作用を促進する働きも併せて期待される。

（Ｂ）成分のキレート剤の２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａは、バイオフィルム除去効果の観点から、５以上であり、好ましくは６以上であり、より好ましくは７以上であり、更に好ましくは８以上である。

尚、（Ｂ）成分のｐＫＣａは下記の方法で測定することができる。
＜キレート剤のｐＫＣａの測定方法＞
緩衝液として０．１ｍｏｌ／リットルのＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ１０．０）溶液を調製する。この緩衝液を用いて全ての試料溶液を調製する。また、これら試料溶液の温度をすべて２０℃にして測定を行う。Ｃａ²⁺濃度の測定には、一例として、オリオン（株）製のイオンメーター９２０ＡとＣａ²⁺イオン電極を用いることができる。
先ず、塩化カルシウム濃度と電極の電位の関係を求め、検量線を作成する。塩化カルシウムの５．３６×１０^-2ｍｏｌ／Ｌ溶液、キレート剤の５．３６×１０^-4ｍｏｌ／Ｌ溶液を調製する。調製したキレート剤溶液１００ｍｌに塩化カルシウム溶液を１ｍｌ加え、５分間撹拌する。残存しているＣａ²⁺濃度をＣａ²⁺イオン電極を用いて測定する。キレート剤はＣａ²⁺と１：１でキレート錯体を形成すると仮定して下記の式からｐＫＣａ（カルシウム安定度定数、Ｃａ安定度定数）を求める。

２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤としては、アミノカルボン酸系キレート剤、有機リン酸系キレート剤、ポリリン酸系キレート剤及びそれらの塩から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。

具体的には、アミノカルボン酸系キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（１２．２）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（６．６）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）（１０．７）、Ｎ−ヒドロキシエチル−エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）（７．２）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、（６．３）、アスパラギン酸二酢酸（ＡＳＤＡ）（７．０）、及びグルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）（６．５）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。また、有機リン酸系キレート剤としては、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）（６．８）、及びアミノトリメチレンホスホン酸（ＡＴＭＰ）（５．４）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられ、ポリリン酸系キレート剤としてはトリポリリン酸（５．０）等が挙げられる（括弧内の数値は上記方法で測定した当該キレート剤のｐＫＣａである）。

更に、バイオフィルム除去性能の観点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、アスパラギン酸二酢酸（ＡＳＤＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上が好ましく、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、メチルグリシン二酢酸、グルタミン酸二酢酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上がより好ましく、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上が更に好ましく、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩から選ばれる１種又は２種以上がより更に好ましい。

これらのキレート剤の塩としては、アルカリ金属塩、４級アンモニウム塩、塩基性アミノ酸塩、アルカノールアミン塩等が好ましく、アルカリ金属塩、アルカノールアミン塩がより好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｂ）成分のキレート剤の含有量は、バイオフィルム除去性の観点から、好ましくは０．００５質量％以上であり、更には０．０１質量％以上、より更には０．０２質量％以上である。そして、好ましくは２質量％以下であり、より好ましくは０．３質量％以下であり、更には０．２質量％以下であり、更に好ましくは０．１質量％以下である。また、本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｂ）成分のキレート剤の含有量は、バイオフィルム除去性の観点から、好ましくは０．００５〜２質量％、より好ましくは０．００５〜０．３質量％、更に好ましくは０．０１〜０．２質量％、より更に好ましくは０．０２〜０．１質量％である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物において、（Ａ）成分と（Ｂ）成分の合計含有量は、バイオフィルム除去性と保存安定性の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０４質量％以上、そして、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下、更に好ましくは０．５質量％以下である。また、本発明のバイオフィルム除去剤組成物において、（Ａ）成分と（Ｂ）成分の合計含有量は、バイオフィルム除去性と保存安定性の観点から、好ましくは０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％、更に好ましくは０．０４〜０．５質量％である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物において、（Ａ）成分の含有量と（Ｂ）成分の含有量の質量比（Ｂ）／（Ａ）は、バイオフィルム除去性と（Ａ）成分の安定性の観点から、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、そして、好ましくは１５０以下、より好ましくは１００以下、更に好ましくは５０以下である。また、（Ａ）成分の含有量と（Ｂ）成分の含有量の質量比（Ｂ）／（Ａ）は、好ましくは１０〜１５０であり、より好ましくは１５〜５０である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物において、本発明のバイオフィルム除去剤組成物１ｋｇ当たりの（Ａ）成分のタンパク質分解活性（ＰＵ）と（Ｂ）成分の含有質量（質量％）との比率Ｒ_A/Bは、バイオフィルム除去性の観点から、１０ＰＵ／質量％以上が好ましく、１００ＰＵ／質量％以上がより好ましく、１０００ＰＵ／質量％以上がより好ましく、そして、１０００００ＰＵ／質量％以下が好ましく、５００００ＰＵ／質量％以下がより好ましく、２００００ＰＵ／質量％以下が更に好ましい。また、（Ａ）成分のタンパク質分解活性（ＰＵ）と（Ｂ）成分の含有質量（質量％）との比率Ｒ_A/Bは、１０〜１０００００ＰＵ／質量％が好ましく、１００〜５００００ＰＵ／質量％がより好ましく、１０００〜２００００ＰＵ／質量％が更に好ましい。

本発明は、上記のようにバイオフィルムに対する作用の異なる（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを組み合わせることによって、相乗的に高いバイオフィルム除去効果を発現させることを技術的特徴とする。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物の２０℃のｐＨは９以上である。バイオフィルム除去性の観点から、２０℃のｐＨは９．５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましい。また、基材損傷性の観点から、本発明のバイオフィルム除去剤組成物の２０℃のｐＨは、１３以下であることが好ましく、１２以下であることがより好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物のｐＨの調整方法については、特に限定するものではないが、（Ｃ）成分としてｐＨ調整剤を用いることが好ましい。ｐＨ調整剤として、例えば、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の珪酸塩、アルカリ金属のリン酸塩、或いは、アルカノールアミンや塩基性アミノ酸などを処理液に配合、若しくは含有することが好ましい。バイオフィルム除去性の観点から、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の珪酸塩、及びアルカノールアミンから選ばれる１種又は２種以上のｐＨ調整剤を配合する、若しくは含有することが好ましく、汎用性、コスト等の観点から水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びモノエタノールアミンから選ばれる１種又は２種以上のｐＨ調整剤を配合する、若しくは含有することが更に好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｃ）成分のｐＨ調整剤の配合量は、バイオフィルム除去性と基材損傷性の観点から、０．００４質量％以上が好ましく、０．００８質量％以上がより好ましく、０．０１質量％以上であることが更に好ましく、そして、１質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以下であることがより好ましく、０．２質量％以下であることが更に好ましく、０．１質量％以下であることがより更に好ましい。また、同様の理由により、本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｃ）成分のｐＨ調整剤の含有量は、好ましくは０．００４〜１質量％、より好ましくは０．００８〜０．５質量％、更に好ましくは０．０１〜０．２質量％、より更に好ましくは０．０１〜０．１質量％である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物は、バイオフィルム除去性能向上の観点から、（Ｄ）成分として界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、及び両性界面活性剤から選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤が挙げられるが、バイオフィルム除去性の観点から、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、及び両性界面活性剤から選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤が好ましく、高濃度品調製時のプロテアーゼの保存安定性の観点から、非イオン界面活性剤がより好ましい。

非イオン界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリアルキレングリコール、アルキルアミンオキシド、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ポリオキシエチレンエステル、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ポリオキシアルキレンソルビタンエステル、脂肪酸サッカライドエステル、アルキルポリサッカライド、アルキルグリセリルエーテル、脂肪酸アルカノールアミドから選ばれる１種又は２種以上の非イオン界面活性剤が好ましく挙げられ、バイオフィルム除去性の観点から、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリアルキレングリコール、及びアルキルアミンオキシドから選ばれる１種又は２種以上の非イオン界面活性剤がより好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｄ）成分の界面活性剤の含有量は、コスト及びバイオフィルム除去性の観点から、好ましくは０．００２質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．００８質量％以上、より更に好ましくは０．０１質量％以上、そして、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．５質量％以下、更に好ましくは０．３質量％以下、より更に好ましくは０．１質量％以下である。また、本発明のバイオフィルム除去剤組成物における（Ｄ）成分の界面活性剤の含有量は、コスト及びバイオフィルム除去性とコストの観点から、好ましくは０．００２〜１質量％、より好ましくは０．００５〜０．５質量％、更に好ましくは０．００８〜０．３質量％、より更に好ましくは０．０１〜０．１質量％である。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物が（Ｄ）成分の界面活性剤を含有するとき、（Ｄ）成分の含有量と（Ａ）成分の含有量の質量比（Ｄ）／（Ａ）は、（Ａ）成分の安定性の観点から、０．５以上、更に１以上、更に２以上、更に４以上、更に６以上が好ましく、そして、５０以下、更に４０以下、更に３０以下、更に２０以下、更に１５以下が好ましい。また、（Ｄ）成分の含有量と（Ａ）成分の含有量の質量比（Ｄ）／（Ａ）は、０．５〜５０、更に１〜４０、更に２〜３０、更に４〜２０、更に６〜１５が好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物が（Ｄ）成分の界面活性剤を含有するとき、本発明のバイオフィルム除去剤組成物１ｋｇ当たりの（Ａ）成分のタンパク質分解活性（ＰＵ）と（Ｄ）成分の含有質量（質量％）との比率Ｒ_A/Dは、１００ＰＵ／質量％以上が好ましく、１０００ＰＵ／質量％以上がより好ましく、１００００ＰＵ／質量％以上がより好ましく、そして、１０００００ＰＵ／質量％以下が好ましく、６００００ＰＵ／質量％以下がより好ましく、３００００ＰＵ／質量％以下が更に好ましい。また、（Ａ）成分のタンパク質分解活性（ＰＵ）と（Ｂ）成分の含有質量（質量％）との比率Ｒ_A/Bは、１００〜１０００００ＰＵ／質量％が好ましく、１０００〜６００００ＰＵ／質量％がより好ましく、１００００〜３００００ＰＵ／質量％が更に好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物は、本発明の目的を損なわない範囲で、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外に増粘剤、粘度調整剤、溶剤、香料、着色剤、酸化防止剤、防腐剤、蛍光剤、賦形剤、ソイルリリース剤、漂白剤、漂白活性化剤、粉末化剤、造粒剤、コーティング剤などを含有することができる。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物は、バイオフィルムによる危害が懸念される広い分野の対象物に使用することが可能である。例えば、菌汚染リスクの高い食品製造プラント、調理施設、浴室、トイレ、台所の器具や排水溝、排水管に使用できる。また、産業用の冷却タワーなどの冷却水系、水処理膜、脱塩装置、パルプ及び紙製造系や浴槽、プール、人工池などの循環水系路に使用できる。バイオフィルムが形成されやすい医療機器である内視鏡やカテーテル、人工透析機等、更に、入れ歯、コンタクトレンズなどに使用することも可能である。

本発明に用いられるバイオフィルム除去剤組成物は、使用時に各成分を別個に混合し濃度、ｐＨを調整して得ることができる。本発明に用いられるバイオフィルム除去剤組成物は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、本発明の組成物を調製することができる。また、本発明に用いられるバイオフィルム除去剤組成物は、予め（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を含有する高濃度品を調製しておき、対象物への適用前あるいは対象物への適用時に、設定濃度範囲、設定ｐＨ範囲に入るよう水で希釈する方法により調製することができる。このとき、希釈物がそのままｐＨ９以上となる場合はそのまま本発明のバイオフィルム除去剤組成物として使用することができる。また、ｐＨが９に満たない場合や更にｐＨを調整したい場合は、（Ｃ）成分を用いてｐＨを設定範囲になるよう調整する。（Ｃ）成分は、対象物への適用前若しくは適用時に添加しても良いし、高濃度品に配合しておいて、使用する際に設定ｐＨの範囲になるよう希釈しても良い。なお、高濃度系での（Ａ）成分の安定性を考慮して、（Ａ）成分を含有する組成物と（Ｂ）成分を含有する組成物とを別々に用意して、対象物への適用前あるいは対象物への適用時に設定濃度範囲に入るよう水で希釈する方法により、本発明のバイオフィルム除去剤組成物を調製することができる。すなわち、例えば、調製した高濃度品を長期間保存する必要がある場合には、（Ａ）成分を含む高濃度品（該高濃度品は（Ｂ）成分を含有しないものが好ましい。）と、（Ｂ）成分を含む高濃度品（該高濃度品は（Ａ）成分を含有しないものが好ましい。）とを、別々に調製しておき、対象への適用前あるいは適用時にそれぞれの高濃度品を水と混合する方法で組成物を調製することが好ましい。なお、この場合（Ｃ）、（Ｄ）成分については（Ａ）成分を含む高濃度品と（Ｂ）成分を含む高濃度品のどちらに含有することも可能である。
（Ａ）成分を含む高濃度品と（Ｂ）成分を含む高濃度品とを別々に調製しておき、対象物への適用前にそれぞれの高濃度品を水と混合する方法で組成物を調製する場合、組成物を調製してから適用するまでの時間は、（Ａ）成分の安定性を考慮して１週間以内であることが好ましく、２４時間以内であることがより好ましく、１２時間以内であることが更に好ましい。
（Ａ）成分を含む高濃度品としては、（Ａ）成分、水を含有する濃縮液が挙げられる。かかる濃縮液中の（Ａ）成分の含有量は限定されない。また、一般に酵素製剤として市販されている（Ａ）成分を含有する組成物、例えば酵素含有液状組成物などはそのまま高濃度品として使用することもできる。このとき（Ａ）成分を含む高濃度品は（Ｂ）成分を含有しないものが好ましい。（Ｂ）成分を含む高濃度品としては、（Ｂ）成分、水を含有する濃縮液が挙げられ、かかる濃縮液中の（Ｂ）成分の濃度は２質量％以上、更に５質量％以上、そして、６０質量％以下、更に４０質量％以下が好ましい。（Ｂ）成分を含む高濃度品は（Ａ）成分を含有しないものが好ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物を対象物に適用するバイオフィルム除去方法において、組成物の適用方法としては、浸漬、塗布、散布、及び噴霧から選ばれる方法が挙げられる。これらは、手動式の装置又は電動式の装置により行うことができる。また、組成物の適用を自動化して行うことができる。このとき、スポンジ、タオル、ブラシ、水流、超音波、エアーなどを用いて対象物に物理力を加えてもよい。バイオフィルム除去剤組成物を対象物に接触させておく時間は、付着しているバイオフィルムの量、バイオフィルム除去剤の濃度、接触時の温度、物理力の有無により異なるが、通常は数秒から数時間の範囲である。作業性を考慮すると、好ましくは１０秒以上、そして、好ましくは１時間以下、より好ましくは３０分以下、更に好ましくは１０分以下である。接触処理後は、流水などにより、除去されたバイオフィルムを速やかにすすぎ流すことが望ましい。

本発明のバイオフィルム除去剤組成物を接触させておく温度は、厳密に制御する必要はないが、５〜８０℃の範囲にあることが好ましく、１０〜５０℃がより好ましく、１５〜３０℃が更に好ましい。また、本発明のバイオフィルム除去剤組成物を接触させる際の組成物の温度は、５℃以上、更に１０℃以上、更に１５℃以上、そして、８０℃以下、更に５０℃以下、更に３０℃以下が好ましい。

一例として、本発明により、本発明のバイオフィルム除去剤組成物を対象物に、１０秒以上、１時間以下接触させた後、水で対象物をすすぐ、バイオフィルム除去方法が提供される。

《バイオフィルム除去剤組成物の調製》
表１に示す処理液を、以下の方法で調製した。得られた組成物を用いてバイオフィルムの除去性能を下記の要領で評価した。結果を表１に示す。
尚、表１中の濃度はバイオフィルム除去剤組成物全量に対する有効分濃度（質量％）である。また、表１中、ｐＫＣａは、２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａである。また、以下の記載においては、特に断りのない限り、「％」は「質量％」の意を示す。

実施例及び比較例で用いた各成分をまとめて以下に示す。純分表記の無いものは全て１００％品である。

＜プロテアーゼ＞
・プロテアーゼ：エバラーゼ１６Ｌ（ノボザイム社）、酵素含有量７質量％、タンパク質分解活性１２ＰＵ／ｇ
＜キレート剤＞
・ＥＤＴＡ・４Ｎａ：クレワットＴ（ナガセケムテック社）
・ＥＤＴＡ・２Ｎａ：クレワットＮ（ナガセケムテック社）
・ＭＧＤＡ・３Ｎａ：トリロンＭ（ＢＡＳＦ社、純分４０％）
・ＧＬＤＡ・４Ｎａ：ディゾルビンＧＬ−４７−Ｓ（アクゾノーベル社、純分４７％）
＜ｐＨ調整剤＞
・モノエタノールアミン：（和光純薬工業株式会社）
・ＮａＯＨ：（南海化学株式会社、純分２５％）
＜界面活性剤＞
・非イオン界面活性剤１：ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、商品名：プルラファックＬＦ９０１（ＢＡＳＦ社）
・非イオン界面活性剤２：アルキルアミンオキサイド、商品名：アンヒトール２０Ｎ（花王株式会社）

《モデルバイオフィルムの作成方法》
緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）１株を、２５ｍｌのＬＢ培地（和光純薬工業株式会社製）で３７℃、２２時間振盪培養した。
波長６００ｎｍの濁度を測定し（濁度計 ＨＩＴＡＣＨＩ社製 Ｕ−２８００）、濁度が０．１となるようにＬＢ培地で希釈した後、底面が平面である滅菌９６ウェルプレート（ファルコン社製）の各ウェルに０．１５ｍｌ添加して、３７℃、４８時間静置培養した。また、ポジティブコントロールとして、同じプレートの異なるウェルに菌を含まないＬＢ培地を０．１５ｍｌ加えたサンプルも調製した。
上澄みを廃棄後、各ウェルに０．２ｍｌの滅菌イオン交換水（以下、滅菌水という）を添加し、室温（２５℃）にて３分間保持し、上澄みを廃棄する操作（以下、ｗａｓｈという）を２回行った。次いで、各ウェルに０．２ｍｌの滅菌水を添加し、この状態でバイオフィルム除去性能の評価に用いるまで、室温（２５℃）で保管した。

《バイオフィルム除去性能の評価》
前述の通りに作成した滅菌水を添加したモデルバイオフィルムの上澄みを廃棄し、その直後に室温（２５℃）で保存した表１に示す各バイオフィルム除去剤組成物を各ウェルに添加し、室温（２５℃）で１分間放置した。
その後、上澄みを廃棄し、２回ｗａｓｈした。また、バイオフィルム除去剤の代わりに滅菌水を用いて同様の操作を行ったものをネガティブコントロールとした。
その後、各ウェルに、クリスタルバイオレット（和光純薬工業株式会社製）の０．１質量％水溶液０．２ｍｌを添加し、室温（２５℃）で１０分間放置した。滅菌水で２回ｗａｓｈした後、９５％エタノール溶液（シグマ社製）０．２ｍｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩放置した。次いで、各ウェルに関し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度値を下記の式に代入し、バイオフィルム除去率を算出した。結果を表１に示す。
なお、上記全ての工程は無菌状態にて実施した。

バイオフィルム除去率（％）＝１００×［（Ａｎ−Ａｐ）−（Ａｓ−Ａｐ）］／（Ａｎ−Ａｐ）

式中、
Ａｓ：サンプル吸光度
Ａｎ：ネガティブコントロール吸光度
Ａｐ：ポジティブコントロール吸光度

Claims (8)

1. （Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが１０以上であるバイオフィルム除去剤組成物であって、
   （Ｂ）成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上のキレート剤である、
   バイオフィルム除去剤組成物。
2. （Ｄ）界面活性剤の含有量が１質量％以下である、請求項１記載のバイオフィルム除去剤組成物。
3. （Ｄ）界面活性剤を含有する請求項１又は２記載のバイオフィルム除去剤組成物。
4. （Ｄ）成分の含有量と（Ａ）成分の含有量の質量比（Ｄ）／（Ａ）が、０．５以上５０以下である、請求項３記載のバイオフィルム除去剤組成物。
5. 請求項１〜４の何れか１項記載のバイオフィルム除去剤組成物を対象物に適用するバイオフィルム除去方法。
6. （Ａ）プロテアーゼと（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤とを含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが１０以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法であって、
   （Ｂ）成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上のキレート剤である、
   バイオフィルム除去方法。
7. （Ａ）プロテアーゼを含む濃縮液と、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤を含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが１０以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法であって、
   （Ｂ）成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上のキレート剤である、
   バイオフィルム除去方法。
8. 対象物が医療器具である請求項５〜７の何れか１項記載のバイオフィルム除去方法。