JP5896398B2

JP5896398B2 - Screening method for pigmentation prevention or improvement agent and pigmentation prevention or improvement agent found by the screening method

Info

Publication number: JP5896398B2
Application number: JP2011207060A
Authority: JP
Inventors: 貴亮山田; 靖司長谷川; 坂井田　勉; 勉坂井田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: JP2013067582A

Description

本発明は、哺乳動物の組織における色素沈着を予防又は改善する方法に関する。また、色素沈着の予防又は改善剤のスクリーニング方法及びそのスクリーニング方法によって見出された色素沈着の予防又は改善剤に関する。 The present invention relates to a method for preventing or ameliorating pigmentation in mammalian tissue. Further, the present invention relates to a method for screening a pigmentation prevention or improvement agent and a pigmentation prevention or improvement agent found by the screening method.

我々の生体組織の色は、メラノサイトによって産生されるメラニンにより大きく左右される。例えば皮膚では、紫外線などの刺激により、ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）やｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＤＮ１）が産生・分泌され、メラノサイトの活性化を促す。活性化したメラノサイトは、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ（ＴＹＲ）、ＴＹＲ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＴＹＲＰ１）及びＤｏｐａｃｈｒｏｍｅｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ（ＤＣＴ）などの一連のメラニン合成関連酵素の働きにより、メラニン合成を活発に行うようになり、その結果、皮膚の黒化が起こる（非特許文献１）。また、毛包組織では、毛球部に存在するメラノサイトが周囲のケラチノサイトにメラニンを受け渡すことで、毛髪の黒髪化が起こる。 The color of our tissues is greatly influenced by the melanin produced by melanocytes. For example, in the skin, stem cell factor (SCF) and endothelin-1 (EDN1) are produced and secreted by stimulation such as ultraviolet rays, and activation of melanocytes is promoted. Activated melanocytes become active in the synthesis of melanin by the action of a series of melanin synthesis-related enzymes such as Tyrosinase (TYR), TYR-related protein-1 (TYRP1) and Dopachrome tautomerase (DCT). Skin darkening occurs (Non-patent Document 1). Further, in the hair follicle tissue, melanocytes present in the hair bulb part deliver melanin to the surrounding keratinocytes, whereby the hair becomes dark.

メラノサイトの異常は、組織の色素沈着を引き起こすことから、先天性あるいは後天性の様々な色素異常症等に関与する。例えば、雀卵斑、黒子症、老人性色素斑、肝斑、シミ、日焼けなどがある（非特許文献２〜４）。これらの疾患等では、メラノサイトの数や機能が先天的あるいは後天的に増大することで、メラニン合成が活発になり、組織の色素が過剰に沈着することが知られている。したがって、これらの治療には、組織に存在するメラノサイトの数を減らすか、メラノサイトの機能を低下させ、組織の色素沈着を抑制する必要がある。 Melanocyte abnormalities cause tissue pigmentation and are therefore involved in various congenital or acquired pigmentation disorders. For example, there are sparrow egg spot, melanosis, senile pigment spot, liver spot, spot, sunburn, etc. (Non-patent Documents 2 to 4) In these diseases and the like, it is known that the number and function of melanocytes increase innately or acquiredly, so that melanin synthesis becomes active and tissue pigments are excessively deposited. Therefore, in these treatments, it is necessary to reduce the number of melanocytes present in the tissue or to reduce the function of melanocytes and suppress the pigmentation of the tissue.

その他にも、美容的観点から、皮膚の色を正常に保つことは、非常に高い関心を集めている。これまでに、シミの改善方法としては、様々な美白剤がスクリーニングされ、色素沈着を予防又は改善する方法として開発されてきた。例えば、アスコルビン酸誘導体、ハイドロキノン配糖体、コウジ酸などの美白剤が適用されている（特許文献１〜３）。これらの美白剤は、メラノサイトにおけるメラニン合成阻害効果やメラニン還元効果を発揮し、皮膚の黒化を改善する。また、老人性色素斑や肝斑などの代表的な色素増加症の治療には、前述の美白剤の適用やケミカルピーリング、紫外線照射療法などが一般的に用いられている（特許文献４、５）。しかしながら、これらの方法による皮膚色の調節効果は、限定的または対処療法的であり満足のいくものではないため、より簡便で効果が高く根本的な改善方法の開発が望まれていた。 In addition, maintaining a normal skin color from a cosmetic point of view has attracted a great deal of attention. So far, various whitening agents have been screened as methods for improving spots, and have been developed as methods for preventing or improving pigmentation. For example, whitening agents such as ascorbic acid derivatives, hydroquinone glycosides, and kojic acid have been applied (Patent Documents 1 to 3). These whitening agents exhibit a melanin synthesis inhibitory effect and a melanin reducing effect in melanocytes, and improve skin blackening. Further, for the treatment of typical hyperpigmentation such as senile pigment spot and liver spot, application of the above-mentioned whitening agent, chemical peeling, ultraviolet irradiation therapy, etc. are generally used (Patent Documents 4 and 5). ). However, since the skin color adjustment effect by these methods is limited or coping therapy and is not satisfactory, the development of a simpler, more effective and fundamental improvement method has been desired.

特開２０００−３５１９０５JP 2000-351905 A 特開昭６０−５６９１２JP-A-60-56912 登録２６５５９８３号Registration 2655983 特開２０００−１８６０３６JP2000-186036 特開２００６−１７６５２３JP 2006-176523 A

ＹａｍａｇｕｃｈｉＹ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，３５，１９３−１９９（２００９）Yamaguchi Y. , Et al. , Biofactors, 35, 193-199 (2009). ＡｏｋｉＨ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１５６，１２１４−１２２３（２００７）Aoki H.I. , Et al. , Br. J. et al. Dermatol. , 156, 1214-1223 (2007) ＮｏｂｌｅｓｓｅＥ．，ｅｔａｌ．，ＳｋｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９，９５−１００（２００６）Noblesse E.M. , Et al. , Skin Pharmacol. Physiol. , 19, 95-100 (2006) 最新皮膚科学体系（中山書店），８，色素異常症，１３−１２８The latest dermatology system (Nakayama Shoten), 8, Dyspigmentation, 13-128

かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術に関する問題点を解決し、組織の色素沈着を予防又は改善する方法を提供することにある。 In view of such a situation, the present invention is to solve the above-mentioned problems related to the prior art and to provide a method for preventing or improving tissue pigmentation.

このような事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定のＷｎｔシグナル経路を抑制する物質が、組織の色素沈着を予防又は改善させることを見出し、本発明を完成するに至った。 Under such circumstances, as a result of intensive studies, the present inventors have found that a substance that suppresses a specific Wnt signal pathway prevents or improves pigmentation of tissues, and has completed the present invention. .

すなわち、本発明は以下の通りである。 That is, the present invention is as follows.

（１）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質を含有することを特徴とする色素沈着の予防又は改善剤。
（２）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、Ｗｎｔ１の発現阻害剤、Ｗｎｔ３ａの発現阻害剤、Ｗｎｔ７ａの発現阻害剤、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害剤、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害剤、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害剤から１種又は２種以上選択されることを特徴とする（１）記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（３）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、Ｗｎｔ１の発現阻害剤、Ｗｎｔ３ａの発現阻害剤、Ｗｎｔ７ａの発現阻害剤、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害剤、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害剤、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害剤から２種組み合わせることを特徴とする（１）記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（４）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、Ｗｎｔ７ａの発現阻害剤であることを特徴とする（１）に記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（５）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、Ｗｎｔ７ａの発現阻害剤とＷｎｔ１の発現阻害剤、Ｗｎｔ３ａの発現阻害剤、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害剤、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害剤、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害剤から１種組み合わせることを特徴とする（１）に記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（６）Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎが、それぞれ下記配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは塩であることを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（７）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（８）Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであることを特徴とする（１）から（８）のいずれかに記載の色素沈着の予防又は改善剤。
（９）Ｗｎｔシグナル経路の抑制による色素沈着の予防又は改善効果を示す物質のスクリーニン方法。 (1) An agent for preventing or improving pigmentation, comprising a substance that suppresses the Wnt signal pathway.
(2) The substance that suppresses the Wnt signal pathway is one of Wnt1 expression inhibitor, Wnt3a expression inhibitor, Wnt7a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, and Norrin expression inhibitor Or, two or more types are selected, The preventive or ameliorating agent for pigmentation according to (1).
(3) There are two types of substances that suppress the Wnt signaling pathway: Wnt1 expression inhibitor, Wnt3a expression inhibitor, Wnt7a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, and Norrin expression inhibitor The preventive or ameliorating agent for pigmentation according to (1), which is combined.
(4) The agent for preventing or improving pigmentation according to (1), wherein the substance that suppresses the Wnt signal pathway is an expression inhibitor of Wnt7a.
(5) The substance that suppresses the Wnt signal pathway is one of Wnt7a expression inhibitor and Wnt1 expression inhibitor, Wnt3a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, and Norrin expression inhibitor The preventive or ameliorating agent for pigmentation according to (1), which is combined.
(6) Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b and Norrin are the following SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, The prevention of pigmentation according to any one of (1) to (5), characterized in that it is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by Or an improving agent.
(7) The substance that suppresses the Wnt signal pathway is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or It is an antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein containing substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof, or a part thereof. The agent for preventing or improving pigmentation according to any one of (1) to (6), which is characterized in that
(8) The substance that suppresses the Wnt signal pathway is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or The prevention or improvement of pigmentation according to any one of (1) to (8), which is an siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding a protein containing substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof Agent.
(9) A method for screening a substance exhibiting an effect of preventing or improving pigmentation by inhibiting the Wnt signal pathway.

本発明におけるＷｎｔシグナル経路とは、線虫から哺乳動物まで、広く保存されている細胞内シグナル経路である。Ｗｎｔシグナル経路を活性化するタンパク質であるＷｎｔは、細胞表面のＷｎｔ受容体に結合することによって、β−カテニンの安定化を介して遺伝子発現を誘導するβ−カテニン経路、ＪＮＫやＲｈｏキナーゼを活性化するＰＣＰ経路、ＰＫＣなどを活性化するＣａ^２＋経路のいずれかを活性化し、細胞増殖、細胞運動及び細胞極性など様々な細胞の機能に関与する。現在までに、ヒトのＷｎｔタンパク質は、１９種類同定されており（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６）、さらにリガンドとしてＷｎｔ受容体に結合するタンパク質としてＮｏｒｒｉｎ、ＩＧＦＢＰ−４、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、ＳＯＳＴが発見されている（非特許文献５）。本発明においては、Ｗｎｔシグナル経路を抑制する物質としてＷｎｔ１の発現阻害物質、Ｗｎｔ３の発現阻害物質、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質を用いる。 The Wnt signal pathway in the present invention is an intracellular signal pathway that is widely conserved from nematodes to mammals. Wnt, a protein that activates the Wnt signaling pathway, activates the β-catenin pathway, JNK and Rho kinase, which induces gene expression through β-catenin stabilization by binding to the Wnt receptor on the cell surface. It activates either the PCP pathway that activates, the Ca ²⁺ pathway that activates PKC, etc., and participates in various cell functions such as cell proliferation, cell motility and cell polarity. To date, 19 types of human Wnt proteins have been identified (Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8b, Wnt9b, Wnt9b, Wnt8 , Wnt11, Wnt16), and Norrin, IGFBP-4, R-spondin, and SOST have been discovered as proteins that bind to Wnt receptors as ligands (Non-patent Document 5). In the present invention, Wnt1 expression inhibitory substance, Wnt3 expression inhibitory substance, Wnt7a expression inhibitory substance, Wnt7b expression inhibitory substance, Wnt10b expression inhibitory substance, and Norrin expression inhibitory substance are used as substances that suppress the Wnt signal pathway. .

山本英樹ら，医学のあゆみ，２３３（３０），９４８−９５４（２０１０）Hideki Yamamoto et al., History of Medicine, 233 (30), 948-954 (2010)

本発明で用いるＷｎｔ１の発現阻害物質、Ｗｎｔ３の発現阻害物質、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質は、単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。Ｗｎｔ３ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質から選択される１種とＷｎｔ１の発現阻害物質の組み合わせ、又は、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、ＷＷｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質から選択される１種とＷｎｔ３ａの発現阻害物質の組み合わせ、又は、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質から選択される１種とＷｎｔ７ａの発現阻害物質の組み合わせ、又は、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質から選択される１種とＷｎｔ７ｂの発現阻害物質の組み合わせ、又は、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質とＮｏｒｒｉｎの発現阻害物質の組み合わせが好ましく、より好ましくは、Ｗｎｔ１の発現阻害物質、Ｗｎｔ３ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質から選択される１種とＷｎｔ７ａの発現阻害物質との組み合わせが最も好ましい。 The Wnt1 expression inhibitor, Wnt3 expression inhibitor, Wnt7a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, and Norrin expression inhibitor used in the present invention may be used alone or in combination. You may use combining a seed | species or more. Wnt3a expression inhibitor, Wnt7a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, Norrin expression inhibitor in combination with Wnt1 expression inhibitor, or Wnt7a expression inhibitor Substance, Wnt7b expression inhibitor, WWnt10b expression inhibitor, Norrin expression inhibitor and a combination of Wnt3a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, Norrin A combination of an expression inhibitory substance and a Wnt7a expression inhibitor, or a Wnt10b expression inhibitor, a Norrin expression inhibitor and a combination of Wnt7b expression inhibitor, or Wnt10b Expression inhibitor and Norri A combination of Wnt7 expression, Wnt3a expression inhibitor, Wnt7b expression inhibitor, Wnt10b expression inhibitor, Norrin expression inhibitor and Wnt7a The combination with the expression inhibitory substance is most preferable.

本名発明で用いるＷｎｔ１の発現阻害物質、Ｗｎｔ３ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質は、市販品を利用できるが、化学合成や生体又は植物から調整しても良い。また、微生物、培養細胞、植物細胞などからも調整できる。 Commercially available Wnt1 expression inhibitory substance, Wnt3a expression inhibitory substance, Wnt7a expression inhibitory substance, Wnt7b expression inhibitory substance, Wnt10b expression inhibitory substance, and Norrin expression inhibitory substance used in the present invention can be used. Or from living organisms or plants. It can also be prepared from microorganisms, cultured cells, plant cells, and the like.

本発明の色素沈着の予防又は改善剤は、薬理学的に許容される担体を混合した組成物、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、口腔内崩壊剤、口腔内崩壊フィルム、液剤、注射剤、坐剤、除法剤、貼付剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤などとして、経口的又は非経口的に投与することができる。 The agent for preventing or improving pigmentation of the present invention is a composition in which a pharmacologically acceptable carrier is mixed, for example, a tablet (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), a powder, a granule, and a capsule (including soft capsules). Orally disintegrating agent, Orally disintegrating film, Solution, Injection, Suppository, Detergent, Patch, Ointment, Gel, Cream, Poultice, Patch, Liniment, Spray, Inhalant, Spray As an agent or the like, it can be administered orally or parenterally.

本名発明で用いるＷｎｔ１の発現阻害物質、Ｗｎｔ３ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ａの発現阻害物質、Ｗｎｔ７ｂの発現阻害物質、Ｗｎｔ１０ｂの発現阻害物質、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質の投与量は、投与対象、投与方法又は処置時間等により異なるが、通常、成人に対し経口または非経口的に投与する場合、有効成分として、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。本発明の色素脱失の予防又は改善剤は、１日１回又は２〜３回に分けて投与しても良い。 The dosage of Wnt1 expression inhibitory substance, Wnt3a expression inhibitory substance, Wnt7a expression inhibitory substance, Wnt7b expression inhibitory substance, Wnt10b expression inhibitory substance, or Norrin expression inhibitory substance used in the present invention is the subject of administration, administration method or Usually, when it is orally or parenterally administered to an adult, the active ingredient is 0.001 mg to 1000 mg / day, preferably 0.01 mg to 100 mg / day, although it varies depending on the treatment time. Since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage may be sufficient, or administration beyond the range may be necessary. The agent for preventing or improving depigmentation of the present invention may be administered once a day or divided into 2 to 3 times a day.

本発明の組成物の製造に用いられても良い薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質があげられ、例えば固形製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などがあげられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味料、酸味剤、発泡剤、香料などの添加物を用いることもできる。 Examples of pharmacologically acceptable carriers that may be used in the production of the composition of the present invention include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials, such as solvents, solubilizers, suspensions, etc. Suspending agents, tonicity agents, buffering agents, soothing agents and the like can be mentioned. Further, if necessary, additives such as ordinary preservatives, antioxidants, coloring agents, sweeteners, sour agents, foaming agents, and fragrances can be used.

なお、本発明の色素沈着の予防又は改善剤は、上記の物質以外でも使用することができる。 In addition, the agent for preventing or improving pigmentation of the present invention can be used in addition to the above substances.

また、本発明を完成するに至った技術は、皮膚の色素沈着抑制効果を示す物質をより精度よくかつ迅速、正確にスクリーニングする技術を含み、特にＷｎｔシグナル経路の抑制による色素沈着を予防又は改善する物質をスクリーニングする方法として用いることができる。 In addition, the technology that has led to the completion of the present invention includes a technology for screening a substance exhibiting a skin pigmentation inhibitory effect more accurately, quickly and accurately, and in particular, prevents or improves pigmentation due to inhibition of the Wnt signal pathway. It can be used as a method for screening a substance to be screened.

本発明により見出されたＷｎｔシグナル経路を抑制する物質を含有することを特徴とする色素沈着の予防又は改善剤により、哺乳動物の組織における色素沈着を予防又は改善することができる。 Pigmentation in a mammalian tissue can be prevented or improved by a pigmentation prevention or improvement agent characterized by containing a substance that suppresses the Wnt signal pathway found by the present invention.

本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 In order to describe the present invention in detail, specific and detailed examples will be given, but the present invention is not limited to these.

皮膚の色素沈着に対して、組織の色素合成を抑制し皮膚の色素沈着を抑制する効果に関して以下の評価を行った。 For skin pigmentation, the following evaluation was performed with respect to the effect of inhibiting tissue pigmentation and inhibiting skin pigmentation.

皮膚色素沈着抑制効果の評価
皮膚組織の色素沈着を抑制する効果を評価するため、ＨＲＤｅＦ１マウス（有色のヘアレスマウス）の背部皮膚組織に対して、一般的に色素沈着効果が知られている紫外線（ＵＶＢ）を照射する方法を用いて、これに対してＷｎｔシグナル経路を抑制する物質を投与することで、さらに色素沈着が抑制されるかについて評価した。 Evaluation of skin pigmentation inhibitory effect In order to evaluate the effect of inhibiting skin tissue pigmentation, UV rays (which are generally known to have a pigmentation effect on the back skin tissue of HRDeF1 mice (colored hairless mice)) It was evaluated whether or not pigmentation is further suppressed by administering a substance that suppresses the Wnt signal pathway using a method of irradiating UVB).

ＨＲＤｅＦ１マウス（雄性、７週齢、日本エスエルシーより購入）の背部皮膚組織に、紫外線（ＵＶＢ）を１０ｍＪ／ｃｍ^２となるように週３回、２週間照射した（紫外線照射群）。具体的には、最初の紫外線照射日を照射０日目と設定し、その日を含め２週間の間に計６回紫外線を照射した（照射０日目、２日目、４日目、７日目、９日目、１１日目、計６回）。
従来技術として、メラニン生成抑制効果が知られているアルブチンを水に溶解し、アルブチン１％水溶液を紫外線照射日の前日から１５日間塗布した（最初の紫外線照射日の前日から照射１４日目）。Ｗｎｔシグナルを抑制する物質として、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、Ｎｏｒｒｉｎ、ＩＧＦＢＰ−４、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、ＳＯＳＴのそれぞれに対するｓｉＲＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）は、５μｇを等量の１０％グルコース溶液と混合したものを、０．６μＬのｉｎｖｉｖｏ−ｅｔＰＥＩ^ＴＭ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を等量の１０％グルコース溶液と混合したものとさらに混合し、背部皮膚組織１ｃｍ^２当たり５μｇを最初の紫外線照射日の前日、照射０日目、１日目の計３回、紫外線照射を施す前に皮内注射により投与した（Ｗｎｔシグナル経路抑制群）。また、紫外線を照射しない群（未照射群）と、陰性対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、他のｓｉＲＮＡと同条件となるように投与した群（コントロール群）を設定した。
紫外線照射後１４日目に、色彩色差計ＣＲ−２００（ミノルタ社製）によりマウスの背部皮膚の明度（Ｌ値）を測定した。 The back skin tissue of HRDeF1 mice (male, 7 weeks old, purchased from Japan SLC) was irradiated with ultraviolet rays (UVB) 3 times a week for 2 weeks (ultraviolet irradiation group) at 10 mJ / cm ² . Specifically, the first ultraviolet irradiation day was set as the irradiation day 0, and ultraviolet irradiation was performed a total of 6 times during the two weeks including that day (irradiation day 0, day 2, day 4, day 7 Eyes, 9th day, 11th day, 6 times in total).
As a conventional technique, arbutin, which is known to have a melanin production inhibitory effect, was dissolved in water, and a 1% aqueous solution of arbutin was applied for 15 days from the day before the ultraviolet irradiation day (14 days after the first ultraviolet irradiation day). As a substance that suppresses Wnt signal, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wt9a, Wnt9a 4, siRNA (Life Technology) for each of R-spondin and SOST was prepared by mixing 5 μg with an equal amount of 10% glucose solution, 0.6 μL of in vivo-etPEI ^™ (manufactured by Polyplus transfection). further mixed with a mixture with an equal volume of 10% glucose solution, the dorsal skin tissue 1 cm ² per 5μg first ultraviolet irradiation day before irradiation on day 0, day 1 3 times, were administered by intradermal injection before performing the ultraviolet irradiation (Wnt signaling pathway inhibition group). In addition, a group not irradiated with ultraviolet rays (unirradiated group) and a group (control group) in which control siRNA (manufactured by Life Technologies) was administered under the same conditions as other siRNA were set as a negative control.
On the 14th day after the ultraviolet irradiation, the lightness (L value) of the back skin of the mouse was measured with a color difference meter CR-200 (manufactured by Minolta).

皮膚色素沈着抑制効果の評価基準
紫外線未照射群の背部皮膚組織のＬ値から各群（紫外線照射群、Ｗｎｔシグナル経路抑制群、溶媒投与群）のＬ値を引いた値（ΔＬ値）をもとに、紫外線照射群のΔＬ値を１００％として相対的な色素沈着の割合（％）を算出した。また、算出した値をもとに、皮膚組織の色素沈着を抑制する効果の評価基準を設定し、色素沈着の割合が１００％以上であった場合を−、９５〜１００％に低下した場合を±、９０〜９５％に低下した場合を＋、８０〜９０％に低下した場合を＋＋、７０〜８０％に低下した場合を＋＋＋、５０〜７０％に低下した場合を＋＋＋＋、５０％以下に低下した場合を＋＋＋＋＋として色素沈着の抑制効果を評価したものを表１に示した。 Evaluation criteria for skin pigmentation inhibitory effect The value (ΔL value) obtained by subtracting the L value of each group (ultraviolet irradiation group, Wnt signal pathway suppression group, solvent administration group) from the L value of the dorsal skin tissue of the non-ultraviolet irradiation group In addition, the relative pigmentation ratio (%) was calculated with the ΔL value of the ultraviolet irradiation group as 100%. Also, based on the calculated value, an evaluation standard for the effect of suppressing pigmentation of the skin tissue is set, and the case where the pigmentation ratio is 100% or more is reduced to 95 to 100%. ±, + when reduced to 90-95%, ++ when reduced to 80-90%, +++ when reduced to 70-80%, +++++ when reduced to 50-70%, 50% or less Table 1 shows the results of evaluating the pigmentation inhibitory effect with +++++ as the decrease.

表１より、陽性対照であるアルブチンを塗布したマウスの皮膚の色素沈着の割合（％）は、紫外線照射群と比較して低下し、色素沈着抑制効果を示した。また、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎに対するｓｉＲＮＡを投与したマウスの皮膚の色素沈着の割合も、紫外線照射群と比較して低下し、従来技術のアルブチンと同等以上の色素沈着抑制効果を示した。その中でも、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎに対するｓｉＲＮＡを投与した個体では、さらに顕著に色素沈着の割合が低下し、アルブチンを上回り明らかな色素沈着抑制効果を示した。 From Table 1, the ratio (%) of the pigmentation of the skin of the mouse | mouth which apply | coated the arbutin which is a positive control fell compared with the ultraviolet irradiation group, and showed the pigmentation inhibitory effect. In addition, the ratio of skin pigmentation in mice administered with siRNA against Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Norrin, R-spondin is also lower than that of the ultraviolet irradiation group. The pigmentation inhibitory effect was equal to or better than that of the prior art arbutin. Among them, individuals administered siRNA to Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin showed a markedly lower pigmentation rate than arbutin, and showed a clear pigmentation inhibitory effect.

皮膚色素沈着抑制効果（相乗効果）の評価
皮膚組織の色素沈着を抑制する効果を示した物質の中から、特に高い効果を示した物質の相乗効果を評価するため、ＨＲＤｅＦ１マウスの背部皮膚組織にＷｎｔシグナル経路を抑制する物質を２種類投与し、実施例１と同様な方法により紫外線を照射後の皮膚明度の変化について色彩色差計により測定した。 Evaluation of skin pigmentation inhibitory effect (synergistic effect) In order to evaluate the synergistic effect of substances that showed a particularly high effect among substances showing the effect of suppressing pigmentation of skin tissue, it was applied to the dorsal skin tissue of HRDeF1 mice. Two types of substances that suppress the Wnt signal pathway were administered, and changes in skin lightness after irradiation with ultraviolet rays were measured by a color difference meter in the same manner as in Example 1.

ＨＲＤｅＦ１マウス（雄性、７週齢、日本エスエルシーより購入）の背部皮膚組織に、紫外線（ＵＶＢ）を１０ｍＪ／ｃｍ^２となるように週３回、２週間照射した（紫外線照射群）。具体的には、最初の紫外線照射日を照射０日目と設定し、その日を含め２週間の間に計６回紫外線を照射した（照射０日目、２日目、４日目、７日目、９日目、１１日目、計６回）。Ｗｎｔシグナルを抑制する物質として、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎのそれぞれに対するｓｉＲＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）は、５μｇを等量の１０％グルコース溶液と混合したものを、０．６μＬのｉｎｖｉｖｏ−ｅｔＰＥＩ^ＴＭ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を等量の１０％グルコース溶液と混合したものとさらに混合し、背部皮膚組織１ｃｍ^２当たり５μｇを、最初の紫外線照射日の前日、照射０日目、１日目の計３回、紫外線照射を施す前に皮内注射により投与した（Ｗｎｔシグナル経路抑制群）。また、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎのそれぞれに対するｓｉＲＮＡ６種類から２種類を選び、全ての組み合わせで等量ずつ混合し、５μｇ（それぞれ２．５μｇずつ）を等量の１０％グルコース溶液と混合したものを、０．６μＬのｉｎｖｉｖｏ−ｅｔＰＥＩ^ＴＭ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を等量の１０％グルコース溶液と混合したものとさらに混合し、背部皮膚組織１ｃｍ^２当たり５μｇ（それぞれ２．５μｇずつ）を投与した（Ｗｎｔシグナル経路相乗抑制群）。また、紫外線を照射しない群（未照射群）と、陰性対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、他のｓｉＲＮＡと同条件となるように投与した群（コントロール群）を設定した。
紫外線照射後１４日目に、色彩色差計ＣＲ−２００（ミノルタ社製）によりマウスの背部皮膚の明度（Ｌ値）を測定した。 The back skin tissue of HRDeF1 mice (male, 7 weeks old, purchased from Japan SLC) was irradiated with ultraviolet rays (UVB) 3 times a week for 2 weeks (ultraviolet irradiation group) at 10 mJ / cm ² . Specifically, the first ultraviolet irradiation day was set as the irradiation day 0, and ultraviolet irradiation was performed a total of 6 times during the two weeks including that day (irradiation day 0, day 2, day 4, day 7 Eyes, 9th day, 11th day, 6 times in total). As a substance that suppresses Wnt signal, siRNA (manufactured by Life Technology) for each of Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin is obtained by mixing 0.6 μL of 5 μg with an equal amount of 10% glucose solution. In vivo-etPEI ^™ (manufactured by Polyplus transfection) was mixed with an equal volume of 10% glucose solution, and 5 μg per 1 cm ^{2 of} the back skin tissue was added on the day before the first ultraviolet irradiation day, On the first day, it was administered by intradermal injection 3 times before the ultraviolet irradiation (Wnt signal pathway suppression group). Select 2 types of siRNA for each of Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin, mix them in equal amounts in all combinations, and add 5 μg (2.5 μg each) in an equal amount of 10% glucose solution The mixture was further mixed with 0.6 μL of in vivo-etPEI ^™ (manufactured by Polyplus transfection) with an equal amount of 10% glucose solution, and 5 μg (2.5 μg each) of 1 cm ^{2 of} the back skin tissue. (Wnt signal pathway synergistic inhibition group). In addition, a group not irradiated with ultraviolet rays (unirradiated group) and a group (control group) in which control siRNA (manufactured by Life Technologies) was administered under the same conditions as other siRNA were set as a negative control.
On the 14th day after the ultraviolet irradiation, the lightness (L value) of the back skin of the mouse was measured with a color difference meter CR-200 (manufactured by Minolta).

皮膚色素沈着抑制効果の評価基準
紫外線未照射群の背部皮膚組織のＬ値から各群（紫外線照射群、Ｗｎｔシグナル経路抑制群、Ｗｎｔシグナル経路相乗抑制群、溶媒投与群）のＬ値を引いた値（ΔＬ値）をもとに、紫外線照射群のΔＬ値を１００％として相対的な色素沈着の割合（％）を算出した。また、算出した値をもとに、皮膚組織の色素沈着を抑制する効果の評価基準を設定し、色素沈着の割合が１００％以上であった場合を−、９５〜１００％に低下した場合を±、９０〜９５％に低下した場合を＋、８０〜９０％に低下した場合を＋＋、７０〜８０％に低下した場合を＋＋＋、５０〜７０％に低下した場合を＋＋＋＋、５０％以下に低下した場合を＋＋＋＋＋として色素沈着の抑制効果を評価したものを表２に示した。 Evaluation criteria of skin pigmentation inhibitory effect The L value of each group (ultraviolet irradiation group, Wnt signal pathway suppression group, Wnt signal pathway synergy suppression group, solvent administration group) was subtracted from the L value of the back skin tissue of the UV non-irradiated group. Based on the value (ΔL value), the relative pigmentation ratio (%) was calculated with the ΔL value of the ultraviolet irradiation group as 100%. Also, based on the calculated value, an evaluation standard for the effect of suppressing pigmentation of the skin tissue is set, and the case where the pigmentation ratio is 100% or more is reduced to 95 to 100%. ±, + when reduced to 90-95%, ++ when reduced to 80-90%, +++ when reduced to 70-80%, +++++ when reduced to 50-70%, 50% or less Table 2 shows the evaluation results of the pigmentation inhibitory effect, assuming that the decrease was +++++.

表２より、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎに対するｓｉＲＮＡを単独で投与したマウスに比べて、さらに、これらの物質を２種組み合わせることによって、皮膚の色素沈着の割合は顕著に低下し、極めて高い相乗的な色素沈着促進効果を示した。 Table 2 shows that the combination of these two substances significantly reduces the rate of skin pigmentation compared to mice administered with siRNA for Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin alone. It showed an extremely high synergistic pigmentation promoting effect.

以上の結果より、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質によりＷｎｔシグナル経路を抑制することで、皮膚の色素沈着を抑制することができた。さらに、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｎｏｒｒｉｎの発現阻害物質を２種以上組み合わせることにより、さらに顕著に皮膚の色素沈着を抑制できることを発見した。また、本発明のＷｎｔシグナル経路を抑制する物質は、従来技術に比べて、短期間の処置で、従来技術以上の効果を示した。本発明で明らかにした、これらＷｎｔシグナル経路の抑制物質は、皮膚の色素沈着を抑制するのに極めて優れていることから、今後の色素沈着及び色素異常症の予防又は改善に大きく貢献できるものである。 From the above results, it was possible to suppress skin pigmentation by suppressing the Wnt signal pathway with Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin expression inhibitors. Furthermore, it has been discovered that the pigmentation of the skin can be suppressed more remarkably by combining two or more expression inhibitors of Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin. In addition, the substance that suppresses the Wnt signal pathway of the present invention showed an effect over that of the prior art in a short-term treatment as compared with the prior art. These Wnt signaling pathway inhibitors revealed in the present invention are extremely excellent in suppressing skin pigmentation, and can greatly contribute to the prevention or improvement of future pigmentation and dysplasia. is there.

本発明は、美容、または、色素異常症に対する化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品への応用が期待される。Ｗｎｔシグナル経路を抑制することにより、組織の色素沈着を予防又は改善することができ、皮膚の色の悩みや色素異常症の改善などに有効である。 The present invention is expected to be applied to cosmetics, foods, quasi-drugs and pharmaceuticals for beauty or dyschromia. By suppressing the Wnt signal pathway, pigmentation of tissues can be prevented or improved, which is effective in improving skin color problems and pigmentation disorders.

この発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。
The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above.

Claims

It comprises a combination of expression inhibitors for two or more genes from expression inhibitors of Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b and Norrin, wherein the expression inhibitor is siRNA, shRNA or antisense poly for each gene. An agent for preventing or improving pigmentation, which is a nucleotide .

1 type selected from the expression inhibitor of Wnt1, Wnt3a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin, and the expression inhibitor with respect to Wnt7a, The said expression inhibitor is siRNA, shRNA, or antisense polynucleotide characterized by the above-mentioned preventing or ameliorating agent for pigmentation, characterized in that it.

Wnt1, Wnt3a , Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b, and Norrin are represented by the following SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6, respectively. The agent for preventing or improving pigmentation according to claim 1, wherein the agent is a protein.

Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt10b and screening method for a substance showing a prophylactic or improvement effect of pigmentation characterized by an index the inhibition of expression of two or more genes selected from the Norrin.