JP5903166B2 - ブチルフタリドの誘導体、並びにその製造法及び使用 - Google Patents

Description

本発明は、或る化合物の医療分野に属し、（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド、及びそれと酸から形成されるエステルに関し、その製造法及び使用を開示するものである。

ブチルフタリドは、急性虚血発作を患う患者における中枢神経系の機能障害に対して改善効果を有し、患者における機能の回復を促進させることができ、また主にｉｎ ｖｉｖｏで３−３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリド及び３−ヒドロキシ−３−ブチルフタリドという２つの代謝産物に変換される。

Guangdong Zhongke Drug Research & Development Co. Ltd.及びShandong Lvye Natural Drug Research & Development Co. Ltd.は、代謝産物Ｉのコハク酸エステル、グリシンエステル及びリン酸エステルを合成しており、また２００８年に脳虚血性疾患を予防するようなその使用を示している。特許文献１は、ブチルフタリド同族体３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリド及び３−ヒドロキシ−３−ブチルフタリドの新規な使用を開示している。それらはともに以下の効果を有することが分かっている：
１）脳外傷に起因する脳虚血によって引き起こされるラットにおける神経症状を著しく改善させること；
２）脳虚血によって引き起こされるラットにおける記憶障害を改善させること；
３）脳虚血によって引き起こされるラットにおける脳浮腫を軽減させること；
４）脳虚血によって引き起こされるラットにおける卒中を低減させること；
５）脳虚血によって引き起こされるラットにおけるエネルギー代謝を改善させること；
６）虚血性脳領域における脳血流を増大させること；
７）局所脳虚血を伴うラットにおける脳梗塞の面積を低減させるとともに、神経障害の症状を軽減させること；
８）血小板凝集対抗性（anti-platelet aggregation）及び血栓形成対抗性（anti-thrombosis）；
９）認知症の予防及び治療。

当社の研究者らは、代謝産物Ｉが、２つの異なる光学異性体を有することを発見し、また、不斉合成法によって、下図に示されるようなＳ体及びＲ体両方の３−３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリド（代謝産物Ｉ）の化合物を調製した。

さらに、動物試験から、Ｒ体は、脳虚血を伴うラットにおける脳梗塞体積（cerebral infarct volume）に影響を及すことができず、脳虚血の症状を改善させることができないのに対し、Ｓ体は、脳虚血の症状を改善させるとともに、脳虚血を伴うラットにおける脳梗塞体積を減少させる効果を有することが見出されている。代謝産物ＩのＳ体（請求項１の化合物）は睡眠を改善させることも見出されている。

中国特許出願第２００４１００３６６２８．３号

代謝産物ＩのＳ体（請求項１の化合物）は、油性液体であり、水に不溶性である。それ故、それを、注射液の剤形へと調製するために、本発明者らは、製剤の要件を満たすよう、酸とエステルを形成した後に塩を形成することによってそれを水溶性化合物とするような更なる研究を行った。

本発明の目的は、虚血性発作用の３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリドの誘導体、並びにその製造法及び使用を提供することである。

上述の目的を達成するために、本発明は以下の技術的な解決策を採用している。

不斉合成によって、下図に示されるような式１の化合物を調製すること、

及び、下図に示されるようなＲ体の化合物を調製すること。

動物試験から、Ｒ体の化合物は、ラットにおいて脳虚血の脳梗塞体積を低減させる効果を有することなく、脳虚血の症状を改善させることができず、また睡眠を改善させる効果を有しないのに対し、Ｓ体は、脳虚血の症状を改善させる極めて良好な効果を有するとともに、動物において睡眠状態を改善させることができることが分かる。

式１の化合物は水に不溶性の油性物質である。それ故、本発明者らは、それと酸とからエステルを形成することを可能にする。ここでは酸とは医薬上許容される無機酸又は有機酸を指す。無機酸とは、硝酸、硫酸又はリン酸を指す。有機酸は、酸ラジカルに加えて更に一種の基、アミノ基、ヒドロキシ基又はカルボキシル基から選択される少なくとも１つの基（one type of group, and at least one group）を含有する。エステル由来の塩は、水溶性であるとともに、注射液又は凍結乾燥粉末注射の剤形へと調製することができる。

有機酸は、アミノ酸であってもよく、具体的には、グリシン、アラニン、リシン、アルギニン、セリン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、ピログルタミン酸、トリプトファン又はバリンを指す。

なお、グリシンと形成される、下図に示されるようなエステルが好ましい。

有機酸はまた、ジカルボン酸、具体的には、樟脳酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、グルタル酸、エタン二酸又はマロン酸であってもよい。

なお、コハク酸と形成される、下図に示されるようなエステルが好ましい。

また、有機酸とは、パモ酸、ヒドロキシナフトエ酸、ゲンチシン酸、サリチル酸、ヒドロキシ酢酸、マンデル酸、乳酸、４−アセトアミド安息香酸又はニコチン酸を指すものであってもよい。

式Ｉの化合物は、無機酸、好ましくはリン酸と、下図に示されるようなエステルを形成する。

上記のエステルは更に、水溶性の問題を解決するように水溶性化合物へと調製されるような塩を形成するため、注射剤形を調製するのに使用することができる。

グリシンと式Ｉの化合物によって形成されるエステルは好ましくは、下図に示されるような塩酸塩を形成する。

本発明は更に、式Ｉの化合物の二塩基酸エステルの塩を提供し、これは、カリウム、ナトリウム、マグネシウム又は有機アミンと形成される塩を指すものである。有機アミンラジカルは、トロメタミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、グリシン、リシン又はアルギニンであってもよい。

ここでは、下図に示されるナトリウム塩が好ましい。

水溶性の問題を解決するために、リン酸と式Ｉの化合物によって形成されるエステルは、生理的に許容される塩基と塩を更に形成することができ、これは、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又は有機アミン塩を指すものである。有機アミンとしては、リシン、グリシン、アルギニン、トロメタミン、ジエタノールアミン又はトリエタノールアミンが挙げられる。

リン酸と式Ｉの化合物によって形成されるエステルは好ましくは、下記構造式を有する二ナトリウム塩を形成する。

本発明は更に、治療有効量の一般式（１）の化合物又はその塩と、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、虚血性発作を治療するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は経口製剤又は注射製剤であってもよい。

筋刺激及び血管刺激にかかる実験から、上記医薬組成物は、酸と式Ｉの化合物によって形成されるエステルが更に塩を形成した後に、注射によって投与されることが示される。筋刺激及び血管刺激はいずれも観測されないため、該医薬組成物を注射製剤として使用することができる。

実施例１：各種化合物の調製：
本実施例中の化合物は極めて強い一貫性を有する。それ故、詳細で正確かつ便宜的な方法で各種化合物の製造法を説明するために、方法を一例によって示す。下記合成経路では、各化合物を通し番号によって示している。例示をより簡潔にするために、以下の製造法では、化合物を通し番号に置き換えている。

上記スキームにおけるＲが異なる基である場合、異なる化合物１ａ、１ｂ及び１ｃが得られる。

（１）．化合物３の合成：
ジイソプロピルアミン（１．３ｍｏｌ）を２０００ｍＬ容の丸底フラスコに入れ、１０００ｍＬの無水ジクロロメタンを添加した。溶解後、トリエチルアミン（２．０ｍｏｌ）を添加し、化合物２（１．０ｍｏｌ）を氷浴内で滴加させた。滴加の完了後、反応混合物を室温まで暖め、一晩撹拌した。５００ｍＬのジクロロメタンを添加して希釈させ、反応混合物をそれぞれ、５％の希塩酸（５００ｍＬ×１回）、水（５００ｍＬ×１回）及びブライン（５００ｍＬ×１回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、凝縮すると、２０２．４ｇの化合物３が得られた。粗収率は９９％であり、ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０６．１であった。

（２）．化合物４の合成：
化合物３（０．８ｍｏｌ）を５００ｍＬの乾燥テトラヒドロフランに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（１．０ｍｏｌ）を−７８℃で徐々に滴加した。滴加の完了後、テトラメチルエチレンジアミン（１．２ｍｏｌ）を添加し、−７８℃で３０分間撹拌した。ラクトン（１．０ｍｏｌ）を上記の混合物中に滴加し、室温まで徐々に暖め、５時間反応させ続けた。飽和塩化アンモニウム溶液を添加することによって反応を停止させ、減圧蒸留によって有機溶媒を除去した。残渣を酢酸エチルによって抽出し、減圧下で凝縮して再結晶化させると、２２２．４ｇの化合物４が得られた。収率は９１％であった。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：８．０８〜８．０６（ｍ，１Ｈ）、８．０４〜８．０２（ｍ，１Ｈ）、７．６３〜７．６１（ｍ，１Ｈ）、７．６０〜７．５８（ｍ，１Ｈ）、３．９５〜３．９３（ｍ，２Ｈ）、３．４０〜３．３８（ｍ，１Ｈ）、２．５５（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．６４〜１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０６．２。

（３）．化合物５の合成：
２２０ｇの化合物４（０．７ｍｏｌ）を５００ｍＬのメタノールに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（１．４０ｍｏｌ）を氷浴内において少量ずつ添加し、窒素ガスの保護の下、室温で一晩撹拌した。反応の完了後、約２０ｍＬの濃塩酸を滴加して、過剰な水素化ホウ素ナトリウムを分解させた。減圧蒸留によってメタノールを除去した。残渣をジクロロメタンによって抽出し、水で洗浄し、ブラインで洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、凝縮して再結晶化させると、２０４．８ｇの化合物５が得られた。収率は９５％であった。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０８．２。

（４）．化合物６の合成：
化合物５（０．６０ｍｏｌ）を５００ｍＬのトルエンに溶解し、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（約１％）を添加し、わずかに沸騰させて、窒素ガスの保護の下、８日間還流させた。減圧蒸留によってトルエンを除去し、ジクロロメタンを添加して希釈させ、残渣を水で洗浄し、ブラインで洗浄して、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、カラムに通すと、１０６．４ｇの化合物６が得られた。収率は８６％であった。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７．２。

（５）．化合物７の合成：
化合物６（０．２ｍｏｌ）を２００ｍＬのメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（１６ｇ／４０ｍＬ）を撹拌しながら添加し、１５分かけて完了させた。この系を加熱して均質溶液とし、室温で２時間反応させ続けた。反応を停止させ、減圧蒸留によってメタノールを除去した。適量の蒸留水を残りの溶液に添加して希釈させた。系を−５℃以下まで冷却し、５％塩酸溶液でｐＨを３〜４に調節して、ジエチルエーテル（１００×３回）で抽出した。ジエチルエーテル抽出物をプールし、溶液を−５℃以下まで冷却した。０．２ｍｏｌの（＋）−（Ｒ）−α−フェニルエチルアミンをゆっくりと滴加した。この系を−５℃以下の温度に維持し、３時間放置させた。大量の結晶が沈殿したので、系を濾過して結晶を回収した。アセトン又は酢酸エチルで結晶を二度再結晶化させると、２０．３ｇの結晶が得られ、結晶の濃度は１５ｇ結晶／１００ｍＬ溶媒であった。結晶を１０体積分の蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを１３に調節した。ジエチルエーテルによる抽出によって（＋）−（Ｒ）−α−フェニルエチルアミンを回収し、塩酸で水相のｐＨを２に調節し、ジエチルエーテルで抽出して、乾燥及び凝縮すると、（＋）−（Ｒ）−３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリドの粗生成物が得られた。粗生成物をエタノールで再結晶化させると、８．７ｇの化合物７が得られた。収率は２１％であった。［α］_Ｄ＝＋６６．８０（ｃ＝１．０２、ＣＨ_３ＯＨ）。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．９１〜７．８９（ｍ，１Ｈ）、７．４１〜７．３９（ｍ，１Ｈ）、７．３３〜７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．３０〜７．２８（ｍ，１Ｈ）、５．２４（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０〜３．３８（ｍ，１Ｈ）、２．５５（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５〜２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．４５〜１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７．２。

（６）．化合物８の合成：
化合物６（０．２ｍｏｌ）を２００ｍＬのメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（１６ｇ／４０ｍＬ）を撹拌しながら添加し、１５分かけて完了させた。この系を加熱して均質溶液とし、室温で２時間反応させ続けた。反応を停止させ、減圧蒸留によってメタノールを除去した。適量の蒸留水を残りの溶液に添加して希釈させた。系を−５℃以下まで冷却し、撹拌しながら５％塩酸溶液でｐＨを３〜４に調節して、ジエチルエーテル（１００×３回）で抽出した。ジエチルエーテル抽出物をプールし、溶液を−５℃以下まで冷却した。０．２ｍｏｌの（Ｓ）−α−フェニルエチルアミンをゆっくりと滴加した。この系を−５℃以下の温度に維持し、３時間放置させた。大量の結晶が沈殿したので、系を濾過して結晶を回収した。アセトン又は酢酸エチルで結晶を二度再結晶化させると、２０．３ｇの結晶が得られ、結晶の濃度は１５ｇ結晶／１００ｍＬ溶媒であった。結晶を１０体積分の蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを１３に調節した。ジエチルエーテルによる抽出によって（Ｓ）−α−フェニルエチルアミンを回収し、塩酸で水相のｐＨを２に調節し、ジエチルエーテルで抽出して、乾燥及び凝縮すると、（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）ブチルフタリドの粗生成物が得られた。粗生成物を再結晶化させると、８．７ｇの化合物７が得られた。収率は２１％であった。［α］_Ｄ＝−６６．８０（ｃ＝１．０２、ＣＨ_３ＯＨ）。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．９１〜７．８９（ｍ，１Ｈ）、７．４１〜７．３９（ｍ，１Ｈ）、７．３３〜７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．３０〜７．２８（ｍ，１Ｈ）、５．２４（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０〜３．３８（ｍ，１Ｈ）、２．５５（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５〜２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．４５〜１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７．２。

（７）．化合物１ａの合成：

１０．０ｍｍｏｌの化合物８、１０．０ｍｍｏｌの無水ブタン二酸、及び１０ｍｍｏｌのＤＭＡＰを５０ｍＬのＤＭＦに溶解し、８５℃に加熱して、６時間反応させた。反応を停止させ、００を２００ｍＬの氷水に注ぎ、０．１Ｎ塩酸でｐＨを２〜３に調節して、酢酸エチル（１００ｍＬ×３回）で抽出した。有機相をプールし、ブラインで３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸留して得られる（Ｓ）−３−（３’−コハク酸エステル）ブチルフタリドを再結晶化させると、２．８ｇの白色固体粉末が得られた。収率は９１％であった。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．８〜７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．６５〜７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．４９〜７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．４４〜７．４２（ｍ，１Ｈ）、５．５０〜５．４６（ｍ，１Ｈ）、３．８２〜３．７４（ｍ，１Ｈ）、２．７２〜２．６６（ｍ，２Ｈ）、２．６２〜２．５６（ｍ，２Ｈ）、２．０５〜２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．４５〜１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０７．３。

上記の（Ｓ）−３−（３’−コハク酸エステル）ブチルフタリドを、５０ｍＬのメタノール及び４ｍＬの１０％水酸化ナトリウム溶液に溶解し、加熱して２時間還流させ、凝縮すると、（Ｓ）−３−（３’−コハク酸エステル）ブチルフタリドのナトリウム塩（化合物１ａ）が得られた。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０５．３。

（８）．化合物１ｂの合成：

１０．０ｍｍｏｌの化合物８を５０ｍＬの酢酸エチルに溶解し、１．０ｍＬのピリジン及び１０ｍｍｏｌのＤＭＡＰを添加した。混合物を０℃〜５℃に冷却し、１０．０ｍｍｏｌのグリシンを撹拌しながら添加し、０℃〜５℃に維持される温度で６時間反応させた。反応を停止させ、反応溶液を１００ｍＬの氷水に注ぎ、０．１Ｎ塩酸でｐＨを７．０に調節して、放置して有機層を分離させた。酢酸エチル（５０ｍＬ×３回）で水相を抽出した。有機相をプールし、ブラインで３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、減圧下で蒸留して得られる（Ｓ）−３−（３’−グリシン酸エステル）ブチルフタリドをエタノールから再結晶化させると、２．３ｇの白色固体粉末が得られた。収率は８７％であった。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．８〜７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．６５〜７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．４９〜７．４７（ｍ，１Ｈ）、７．４４〜７．４２（ｍ，１Ｈ）、５．５０〜５．４６（ｍ，１Ｈ）、３．８２〜３．７４（ｍ，１Ｈ）、３．６２（ｓ，２Ｈ）、２．０５〜２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．４５〜１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６４．３。

上記の（Ｓ）−３−（３’−グリシン酸エステル）ブチルフタリドを５０ｍＬのアセトン及び１０ｍＬのジエチルエーテルに溶解し、塩酸塩のジエチルエーテル溶液を滴加して、ｐＨを２に調節した。大量の白色固体が沈殿したので、濾過して乾燥させると、２．４ｇの（Ｓ）−３−（３’−グリシン酸エステル）ブチルフタリド塩酸塩（化合物１ｂ）が得られた。収率は８０％であった。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６４．３。

（９）．化合物１ｃの合成：

２０．０ｍＬのピリジンを１００ｍＬのＤＭＦに添加して、−１０℃に冷却し、２５．０ｍＬのオキシ塩化リンを撹拌しながら添加した。混合物を３０分間撹拌した後に、１０．０ｍｍｏｌの化合物８をバッチ式に添加した。３時間撹拌した後、反応を停止させた。反応溶液を１００ｍＬの氷水に注ぎ、０．１Ｎ塩酸でｐＨを２に調節し、酢酸エチル（５０ｍＬ×３回）で抽出した。有機相をプールし、ブラインで３回洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧蒸留によって溶媒を除去すると、（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドが得られた。その後、それを２０ｍＬのエタノールに溶解して、１０．６の炭酸ナトリウムを添加して、３０℃の温度で２時間反応させた。反応を停止させ、１００ｍＬのアセトンを添加した。混合物を放置して５℃で沈殿させ、濾過して、真空下で乾燥させると、白色固体粉末の２．８ｇの（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリド二ナトリウム塩（化合物１ｃ）が得られた。収率は８５％であった。
ＨＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．９１〜７．８９（ｍ，１Ｈ）、７．４１〜７．３９（ｍ，１Ｈ）、７．３３〜７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．３０〜７．２８（ｍ，１Ｈ）、５．２４（ｔ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０〜３．３８（ｍ，１Ｈ）、２．０５〜２．０３（ｍ，２Ｈ）、１．６５〜１．６３（ｍ，２Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３１．２。

実施例２：注射可能な（−）−（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル二ナトリウム）ブチルフタリド（実施例１における化合物１ｃ）凍結乾燥粉末の調製
１０ｇの調製された（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドナトリウム塩（化合物１ｃ）を取り、注射用の１０００ｍｌの水を添加して溶解させ、６０ｇのマンニトールを更に添加した。完全に溶解させた後、注射用の水を更に添加して１２００ｍｌとした。活性炭による脱炭後、混合物を微孔膜に通して濾過し、７ｍｌ容のペニシリンボトルに各ボトル３ｍｌずつ分取し、栓をし、凍結乾燥させて、グランドを行うことによって（glanded）、注射可能な凍結乾燥粉末が得られた。規格：２０ｍｇ／ボトル。

実施例３：（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル二ナトリウム）ブチルフタリド（化合物１Ｃ）のカプセルの調製
式：（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドナトリウム塩 ６０ｇ
ラクトース １０５ｇ
１０００カプセル

式中の量に従って（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドナトリウム塩を正確に秤量し、１００メッシュスクリーンに通して篩にかけ、これに、８０℃で乾燥させるとともに８０メッシュスクリーンに通して篩にかけた式の量に準拠するラクトースを添加し、均一に混合した。この混合物の内容物を検出し、適する場合には１つ目のカプセルシェルに充填してカプセルとした。

実施例４：（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル二ナトリウム）ブチルフタリド（化合物１ｃ）の注射液の調製
式：（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドナトリウム塩 ５０ｇ
注射用の水 ４０００ｍｌ
１０００アンプル

式中の量に従って（Ｓ）−３−（３’−リン酸エステル）ブチルフタリドナトリウム塩（化合物１ｃ）を正確に秤量し、適量の注射用の水を添加した。ｐＨを６．５〜７．２に調節し、注射用の水を添加して４０００ｍｌとした。２ｇの注射用の活性炭を添加し、１５分間沸騰させて、吸引濾過により脱炭した。溶液を０．２２μｍの微孔膜に通して濾過し、ガラスアンプルに充填するとともに封止して、１１５℃で３０分間オートクレーブにかけると、注射液が得られた。

実施例５：局所脳梗塞を伴うラットにおける脳梗塞の体積に対する影響
（１）実験材料及び方法
Ｗｉｓｔａｒラット（体重２５０ｇ〜２８０ｇ）を外科手術前後で別個に育て、２３℃〜２５℃の室温で飼育した。ラットは全て食餌及び水に自由にアクセスさせた。longa他の方法に従ってｔＭＣＡＯモデルを用意した。ラットには１０％の抱水クロラールで麻酔を施し（３５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）、体温を３７±０．５℃に維持した。ラットは仰臥位で手術台上に固定した。頚部の正中線に沿って皮膚を切開し、右側の総頚動脈（Common Carotid Artery：ＣＣＡ）、外頚動脈（External Carotid Artery：ＥＣＡ）及び内頚動脈（Internal Carotid Artery：ＩＣＡ）を慎重に単離した。ＥＣＡを結紮して切断し、ＩＣＡに沿って真っ直ぐにした。小さい切り口をＥＣＡ上で切開し、０．２６ｍｍの直径を有する（０．１％ポリリシンでコーティングされた）４．０ｃｍの長さの先の丸いケイ酸（silicified）ナイロン糸をこの切り口を通じて、ラットの前大脳動脈の開始位置までＩＣＡに約１．８５ｃｍ〜２．００ｃｍ入れ、中大脳動脈の血液供給を遮断した。虚血の２時間後、ナイロン糸を慎重に引き抜き、ＥＣＡの切り口を結紮し、手術の切り口を縫合した。動物をケージに返して２４時間再灌流させた。

（２）実験群及び投与
ラットを１２の群、例えば、モデル対照群として注射用の水（１００ｍｇ／ｋｇ）、実施例１における化合物７（２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）の投与群、実施例１における化合物８（２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）の投与群、ＤＬ−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド（略してＤＬ）（２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）の投与群に無作為に分けた。ＭＣＡの遮断によって起こる虚血の１０分後にそれらを経口投与した。

（３）脳梗塞の体積の決定
ラットにおける２４時間の再灌流障害後、ラットの頭部を切り落とし、脳を直ちに摘出した。嗅索、小脳及び下位脳幹を取り出した。脳を６つの薄片に冠状切断し（第１の薄片から第５の薄片までは２ｍｍ／薄片であり、第６の薄片は４ｍｍとした）、それらを迅速に、１．５ｍｌの４％ＴＴＣ及び０．１ｍｌの１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４を含有する５ｍｌの溶液に入れて、２０分〜３０分間染色（３７℃、遮光）させた。この際、５分に１度これらを裏返した。ＴＴＣ染色後、正常組織は濃く染色して赤くなり、梗塞性の組織は白くなった。各群の脳薄片をきれいに並べ、保存用に写真を撮った。各薄片の梗塞面積を算出し、重ね合わせにより最終的に梗塞体積に変換した。梗塞体積は、脳浮腫の影響を排除するために大脳半球におけるパーセンテージで表した。

脳梗塞体積（％）＝（手術側に対する対側大脳半球の体積−手術した半球に対する非梗塞部の体積）／手術側に対する対側大脳半球の体積×１００％

（４）実験結果
２時間の虚血及び２４時間の再灌流後、溶媒対照群の脳梗塞の体積は３３．８％であった。シャム手術群は脳梗塞を全く有しなかった。他の群の脳梗塞の体積の結果は表１に示す通りである。

溶媒対照群と比較すると、化合物８及びＤＬ−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリドの群における経口投与は脳梗塞の体積を著しく低減させることができるが、化合物７の群は脳梗塞の体積を効果的に低減させなかった。（−）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド（すなわち化合物８）の群はＤＬ−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリドよりも優れており、Ｓ体の化合物８が効果的な有効成分であり、Ｒ体の化合物７は、脳虚血によって引き起こされる脳梗塞の体積を低減させる効果を有することが見出せなかった。

実施例１２：脳梗塞の体積に対する１ａ、１ｂ、１ｃの注射投与の影響
（１）実験群及び投与
実施例１１における虚血の遮断モデルのラットを取り出し、１２の群、例えば、シャム手術群、モデル対照群（注射用の水、１０ｍｇ／ｋｇ）、１ａ群（２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）、１ｂ群（２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）、及び１ｃ群（２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）に無作為に分けた。ＭＣＡの遮断によって起こる虚血の１０分後にそれらを静脈内投与した。

（２）結果及び考察
脳梗塞の体積の決定は実施例４と同様とした。２時間の虚血及び２４時間の再灌流後、溶媒対照群の脳梗塞の体積は３３．６％であった。シャム手術群は脳梗塞を全く有しなかった。溶媒対照群と比較すると、各群は脳梗塞の体積を著しく低減させることができる。溶媒対照群と比較すると、サンプルの群は全て、表２に示されるように、脳梗塞の体積を著しく低減させることができる。

実施例１３：１ａ、１ｂ及び１ｃの血管刺激に関する実験
１）実験の設計
１ａ、１ｂ及び１ｃを取って注射用の水に溶解して、それぞれ２つの濃度群に調製した。高濃度群：４．２ｍｇ／ｍｌ及び低濃度群：１．４ｍｇ／ｍｌとした。それらをウサギの耳介静脈を通じて静脈内投与し、投与量は５ｍｌとした。

２）投与方法：
８匹の健常なニュージーランドウサギを選択し、高濃度及び低濃度の試験薬をそれぞれウサギの左耳の耳介静脈に注射するとともに、等容量の塩化ナトリウムの注射液を、ウサギの右耳の耳介静脈に注射した。８匹のウサギに引き続き高濃度及び低濃度の試験薬を投与した後、それぞれ０．９％の塩化ナトリウムの注射液を投与した。これを１日に１回３日連続して行った。ウサギはそれぞれ、投与前、投与の４８時間後及び１４日後に秤量した。

３）一般観測及び動物のサンプリング
動物の反応及び血管の注射部位を観察して、投与前毎日記録した。最後の投与の４８時間後、それぞれ高濃度及び低濃度の試験薬を投与した２匹のニュージーランドウサギを放血させた。血管組織の反応を目視観測して記録した後、ウサギの両耳を耳の根元から切り離した（初めに左耳、次に右耳、そしてそれらにラベルを付けた）。その後、ウサギの耳の試験片をそれぞれ切り出し、１０％の中性ホルムアルデヒド溶液中に固定し（試験片は８ｃｍ長及び１ｃｍ幅；心臓からの遠位端の切り口は第１のピン刺し部から約０．５ｃｍ離し、心臓からの近位端の切り口は第３のピン刺し部から約２ｃｍ離し、心臓からの近位端は吊り下げ用の端部とした）。それぞれ高濃度及び低濃度の試験薬を投与した２匹の動物は、最後の投与後１４日目まで更なる観測のためにそのまま残し、病理検査を行った。

第１のピン刺し部の縁から、１つの切片を遠位端で切断し、第３のピン刺し部の縁から、２つの切片を近位端で切断し、薄片を調製する際に血管を横に切断した。薄片の調製は従来のパラフィンを用いて行い、薄片の厚みは４μｍ〜５μｍとした。病理組織検査を実施する前にＨ−Ｅ染色を行った。

５）判定結果
目視観測及び病理検査に従って総合判定を行った。動物の血管の注射部位の反応は、投与前に毎日目視観測して記録した。投与中、高濃度及び低濃度の試験薬を投与した動物によっては投与側及び対照側において、ウサギの耳の注射部位における血管の外側被膜（vascular epidermis）の内側及び外側が赤くなったことが目視観測され、その範囲は０．１ｃｍ×０．２ｃｍ〜０．２ｃｍ×１．０ｃｍであった。最後の投与の４８時間後、高濃度及び低濃度の試験薬を投与した４匹のウサギの両側の耳の血管の血管プロファイルが明らかになり、ウサギの耳の厚みは均等であり、著しい変化は何も観測されなかった。最後の投与の１４日後に、高濃度及び低濃度の試験薬を投与した４匹のウサギの死体解剖を行った。両側のウサギの耳の血管プロファイルは、比較的明らかであり、ウサギの耳の厚みは均等であり、著しい変化は何も観測されなかった。

高濃度及び低濃度の試験薬を投与した４匹のウサギにおける死体解剖は、最後の投与の４０時間後に行い、高濃度及び低濃度の試験薬を投与した他の４匹のウサギの死体解剖は、２週間の回復期間の最後に行った。全病理組織検査において、血管組織における変質及び壊死等の著しい刺激反応は何も観測されなかった。

実施例１３：ラットの睡眠に対する化合物７、化合物８及びＤＬ−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリドの効果：
睡眠を改善させる実験
サンプルの特性：本発明の化合物７及び化合物８のカプセル製剤の内容物は褐色粒子である。

動物の起源：Ｋｕｎｍｉｎｇマウス（１８ｇ〜２２ｇ、雄）は、Guangdong Medical Lab Animal Centerにより提供されるクリーングレード（clean grade）の動物とした。実験動物の飼育室内において、温度は２２±２℃とし、相対湿度は５５％〜７０％とし、動物の飼料はGuangdong Medical Lab Animal Centerにより提供されるものとした。

化合物７、化合物８、ＤＬ−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド（略してＤＬ）の３つの群を実験に設定した（それぞれ２５ｍｇ／ｋｇ）。また、蒸留水対照群を更に設定した。

サンプル処理：２５ｍｇの各サンプルを取り蒸留水と合わせて２０ｍｌとして、試験に使用される均質懸濁液を形成した。

投与経路：強制経口

実験方法：
閾値を超える投与量のペントバルビタールナトリウムの催眠試験：
１８ｇ〜２２ｇの体重の４０匹の雄マウスを選択し、４つの群に無作為に分けた（各群マウス１０匹）。それらにサンプルを３０日間連続的に投与し、３０日目の強制経口によるサンプルの投与の１５分後に、各群の動物に５０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射し、注射量を０．２ｍｌ／２０ｇ体重とした。眠りに落ちたという判定基準は、マウスの正向反射が１分以上見られなかった場合とした。ペントバルビタールナトリウムの投与後６０分以内に、各群の動物の眠りに落ちた時間及び睡眠時間が観測された。

結果：

上記の表に示されるように、対照群と比較すると、各投与群の動物の体重は有意な相違を何も有しない。

上記の表に示されるように、対照群と比較すると、化合物８（（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド）の群における、閾値を超える投与量のペントバルビタールナトリウムによって誘導された動物の眠りに落ちた時間及び睡眠時間は、有意な相違を有している。

閾値未満の投与量のペントバルビタールナトリウムの催眠試験：
１８ｇ〜２２ｇの体重の４０匹の雄マウスを選択し、４つの群に無作為に分けた（各群マウス１０匹）。それらにサンプルを２８日間連続的に投与し、３０日目の強制経口によるサンプルの投与の１５分後に、各群の動物に３０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射し、注射量を０．２ｍｌ／２０ｇ体重とした。眠りに落ちたという判定基準は、マウスの正向反射が１分以上見られなかった場合とした。ペントバルビタールナトリウムの投与後２５分以内に、各群の動物の睡眠の発生の時間が観測された。

結果：

上記の表に示されるように、対照群と比較すると、化合物８（（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド）及びＤＬの群における、閾値未満の投与量のペントバルビタールナトリウムによって誘導された動物における眠りに落ちた動物の数及び睡眠の発生率は有意な相違を有している。

概要：３０日間マウスにサンプルを経口投与した後、化合物８（（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリド）及びＤＬの群が、睡眠を改善させる効果を有する。Ｓ体の効果がラセミ体のＤＬ体のものよりも大きく、ＤＬ体の効果がＲ体のものよりも大きい。

Claims (8)

1. 睡眠改善用薬剤の製造における、
   以下に示されるような：
   化学名が（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリドである化合物の使用。
2. 脳虚血性疾患治療用且つ睡眠改善用の薬剤の製造における、以下に示されるような：
   化学名が（−）−（Ｓ）−３−（３’−ヒドロキシ）−ブチルフタリドである化合物を酸と反応させることによって得られるエステルの使用であって、該酸が、医薬上許容される無機酸又は有機酸から選択される、使用。
3. 前記無機酸が、硝酸、硫酸又はリン酸からなる群から選択され、前記有機酸が、アミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、リシン、アルギニン、セリン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、ピログルタミン酸、トリプトファン又はバリン；二塩基酸、すなわち、樟脳酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、グルタル酸、エタン二酸、乳酸又はマロン酸；パモ酸、ヒドロキシナフトエ酸、ゲンチシン酸、サリチル酸、ヒドロキシ酢酸、マンデル酸、乳酸、４−アセトアミド安息香酸又はニコチン酸からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
4. 前記酸がグリシン、コハク酸、リン酸であり、前記エステルが以下に示されるようなものである：
   、請求項２に記載の使用。
5. 前記エステルが塩の形態であり、塩の形態の該エステルが、式Ｉの化合物をアミノ酸と反応させてエステルとし、これを更に、硫酸、リン酸、スルホン酸若しくは塩酸と反応させることによって得られるか；又は、式Ｉの化合物を二塩基酸と反応させてエステルとし、これを更に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トロメタミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、グリシン、リシン若しくはアルギニンと反応させることによって得られるか；又は、式１の化合物をリン酸と反応させてエステルとし、これを更に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、リシン、グリシン、アルギニン、トロメタミン、ジエタノールアミン若しくはトリエタノールアミンと反応させることによって得られる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. 塩の形態の前記エステルが以下に示されるようなものである：
   、請求項５に記載の使用。
7. 脳虚血性疾患治療用且つ睡眠改善用の薬剤の製造における、以下に示されるエステルの使用：
   
8. 脳虚血性疾患治療用且つ睡眠改善用の薬剤の製造における、以下に示されるエステルの使用：