JP5905260B2 - ヒトＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー遺伝子のエクソン４３、４６、５０〜５３のうちの少なくとも１個の効率的なスキッピングのための方法及び手段 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝学、特にヒト遺伝学の分野に関する。本発明は、特にヒトＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの調節に関する。

ミオパシーは、筋肉の機能不全をもたらす障害である。筋ジストロフィー（ＭＤ）は、進行性の脱力及び骨格筋の変性によって特徴付けられる遺伝病を意味する。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、筋ジストロフィーの最も一般的な小児型である。これらは劣性障害であり、ＤＭＤ及びＢＭＤの責任遺伝子はＸ染色体上に存在するため、この突然変異は男児３５００人に約１人の発生率で主に男性に影響を及ぼす。

ＤＭＤ及びＢＭＤは、収縮における筋線維安定性を維持するための細胞骨格と細胞外マトリックスとの間の相互作用に必要な筋タンパク質である、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の遺伝的欠損に起因する。ＤＭＤは１２歳前に車椅子補助への依存をもたらす重篤な致死性神経筋障害であり、ＤＭＤ患者は多くの場合呼吸及び心不全により３０歳前に死亡する。対照的に、ＢＭＤ患者は多くの場合高齢期まで歩行可能であり続け、ほぼ標準的な平均寿命を有する。ＤＭＤ遺伝子におけるＤＭＤ突然変異は、機能ジストロフィンの欠損をもたらす、フレームシフトを生じる挿入若しくは欠失又はナンセンス点突然変異によって特徴付けられる。一般にＢＭＤ突然変異は、リーディングフレームをインタクトに保ち、部分的に機能的なジストロフィンを合成させる。

過去１０年間、ジストロフィン転写産物の途絶したリーディングフレームを回復するための特定のスプライシング修飾は、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の有望な治療法として浮上してきた（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１０（２）：１４０〜９、Ｙｏｋｏｔａ、Ｄｕｄｄｙ、Ｐａｒｔｉｄｇｅ、Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ．２００７；２６（３）：１７９〜８４、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００７；３５７（２６）：２６７７〜８６）。

スプライシングシグナルに干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いて、特定のエクソンのスキッピングをＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体に誘導し、したがってオープンリーディングフレームを回復させて重症型のＤＭＤをより軽症型のＢＭＤ表現型に変換することができる（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００１；１０：１５４７〜５４；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２００３；１２（８）：９０７〜１４）。ｉｎ ｖｉｖｏの実証実験は、先ずエクソン２３におけるナンセンス突然変異に起因するジストロフィン欠損型ｍｄｘマウスモデルで得られた。変異エクソン２３を標的とするＡＯＮの筋肉内及び静脈内注射は、少なくとも３カ月間ジストロフィン発現を回復させた（Ｌｕら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３；８：１００９〜１４；Ｌｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５；１０２（１）：１９８〜２０３）。これは、線維膜におけるジストロフィン関連タンパク質の回復、そして処置筋肉の機能改善を伴った。マウス５番染色体に統合されたヒトＤＭＤ遺伝子の完全コピーを含むｈＤＭＤマウスモデルにおいて、ヒトエクソンのｉｎ ｖｉｖｏスキッピングも達成された（Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００４；１０：２３２〜４０；‘ｔ Ｈｏｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：５８９９〜９０７）。

近年、エクソン５１のスキッピングを誘導するＡＯＮを４名のＤＭＤ患者の前脛骨筋の小領域に注射した、ヒト初回投与試験の完成に成功した。処置した４名の患者全員において筋線維の大部分に新規ジストロフィン発現が観察され、ＡＯＮは安全で耐容性良好であった（ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００７；３５７：２６７７〜８６）。

方法
第一の態様において、本発明は、患者、好ましくは患者の単離細胞におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０〜５３のうちの少なくとも１個のスキッピングを誘導及び／又は促進するための方法であって、前記細胞及び／又は前記患者に前記エクソン内の一続きの少なくとも８ヌクレオチドと結合する分子を提供するステップを含む方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ法を包含することを理解するべきである。

したがって、患者、好ましくは前記患者の単離細胞におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０〜５３のうちの少なくとも１個のスキッピングを誘導及び／又は促進するための方法であって、前記細胞及び／又は前記患者に前記エクソン内の一続きの少なくとも８ヌクレオチドと結合する分子を提供するステップを含む方法が提供される。

本明細書で定義されているように、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体は、好ましくは、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者のＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。

患者は、本明細書で後に定義するＤＭＤ若しくはＢＭＤの患者又は患者の遺伝的背景によりＤＭＤ若しくはＢＭＤを発症し易い患者を意味するものとすることが好ましい。ＤＭＤ患者の場合、用いられているオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記患者のＤＭＤ遺伝子に存在する一突然変異を修正し、したがって好ましくは、ＢＭＤタンパク質に類似したＤＭＤタンパク質を生成するであろう。前記タンパク質は、好ましくは、本明細書で後に定義する機能ジストロフィンであろう。ＢＭＤ患者の場合、用いられているオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記患者のＢＭＤ遺伝子に存在する一突然変異を修正し、したがって好ましくは、前記ＢＭＤ患者に本来存在していたジストロフィンよりも機能的なジストロフィンを生成するであろう。

エクソンスキッピングは、通常であればそこに存在する特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞に誘導することを意味する。エクソンスキッピングは、例えば前記エクソンのスプライシングに必要とされるスプライスアクセプター配列のスプライスドナー等、必須配列に干渉することができる分子、又はヌクレオチド配列がｍＲＮＡに含まれるべきエクソンとして認識されるのに必要とされるエクソン包含シグナルに干渉することができる分子を、前記ｍＲＮＡのｍＲＮＡ前駆体を発現している細胞に提供することにより行われる。ｍＲＮＡ前駆体という用語は、細胞核中のＤＮＡ鋳型から転写により合成された、未プロセシング又は部分プロセシングされたｍＲＮＡの前駆体を意味する。

本発明の状況では、本明細書に示されているエクソンのスキッピングの誘導及び／又は促進は、処置された患者の１又は複数の（筋）細胞におけるＤＭＤ ｍＲＮＡの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が前記エクソンを含まないことを意味する。これは、実施例に記載されているように、ＰＣＲによって評価されることが好ましい。

好ましくは、患者の１又は複数の（筋）細胞におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０〜５３のうちの少なくとも１個のスキッピングを誘導及び／又は促進することによる本発明の方法は、前記患者に機能ジストロフィンタンパク質を提供し、及び／又は前記患者における異常ジストロフィンタンパク質の生成を低下させ、及び／又は前記患者における機能ジストロフィンの生成を増加させる。

患者に機能ジストロフィンタンパク質を提供すること及び／又は前記患者における異常ジストロフィンタンパク質の生成を低下させることは通常、ＤＭＤ患者に適用される。機能ジストロフィンの生成を増加させることは通常、ＢＭＤ患者に適用される。

したがって、好ましい方法は、患者又は前記患者の１又は複数の細胞に機能ジストロフィンタンパク質が提供され、及び／又は前記患者における異常ジストロフィンタンパク質の生成が減少し、及び／又は機能ジストロフィンの生成が前記患者で増加する方法であって、前記異常又は機能ジストロフィンレベルが方法開始における前記患者の前記ジストロフィンレベルと比較することによって評価される方法である。

異常ジストロフィンの生成減少はｍＲＮＡレベルで評価することができ、好ましくは、異常ジストロフィンｍＲＮＡ初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下がＲＴ−ＰＣＲによってなお検出可能であることを意味する。本明細書において、異常ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質は、非機能ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とも言う。非機能ジストロフィンタンパク質は、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体メンバーと結合できないジストロフィンタンパク質であることが好ましい。非機能ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは通常、そのインタクトなＣ末端を備えるジストロフィンタンパク質を含有しない、又はコードしない。

前記患者又は前記患者の細胞における機能ジストロフィンの生成増加は、ｍＲＮＡレベルで（ＲＴ−ＰＣＲ解析により）評価することができ、好ましくは、検出可能量の機能ジストロフィンｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出できることを意味する。別の実施形態において、検出可能なジストロフィンｍＲＮＡの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が機能ジストロフィンｍＲＮＡである。

前記患者又は前記患者の細胞における機能ジストロフィンの生成増加は、タンパク質レベルで（免疫蛍光及びウエスタンブロット解析により）評価することができ、好ましくは、検出可能量の機能ジストロフィンタンパク質が免疫蛍光又はウエスタンブロット解析により検出できることを意味する。別の実施形態において、検出可能ジストロフィンタンパク質の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が機能ジストロフィンタンパク質である。

本明細書に定義されているように、機能ジストロフィンは、配列番号１として識別されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンであることが好ましい。機能ジストロフィンは、そのＮ末端部分のアクチン結合ドメイン（Ｎ末端の最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５アミノ酸）を有するジストロフィンであることが好ましく、当業者に知られている通り、これらドメインのそれぞれが野生型ジストロフィンに存在している。本明細書に示されているアミノ酸は、配列番号１に表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。即ち、機能ジストロフィンは、少なくともある程度の野生型ジストロフィン活性を呈するジストロフィンである。「少なくともある程度」は、好ましくは、対応する野生型機能ジストロフィン活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味する。この文脈において、機能ジストロフィンの活性とは、好ましくは、アクチン及びジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）との結合のことである（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。ジストロフィンのアクチン及びＤＧＣ複合体との結合は、当業者の知る通り、筋生検由来の全タンパク質抽出物を用いた共免疫沈降か、切片の免疫蛍光解析のいずれかによって可視化することができる。

Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーを患う個体又は患者は通常、ジストロフィンをコードする遺伝子に、完全タンパク質の合成を妨げる、即ち、早期停止によりＣ末端の合成を妨げる突然変異を有する。Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーにおいて、ＤＭＤ遺伝子もまた野生型遺伝子と比べて突然変異を有するが、この突然変異は通常早期停止を誘導せず、通常Ｃ末端は合成される。この結果、必ずしも同じ活性量ではないが、野生型タンパク質と少なくとも本質的に同じ活性を有する機能ジストロフィンタンパク質が合成される。ＢＭＤ個体のゲノムは通常、Ｎ末端部分（Ｎ末端の最初の２４０アミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１〜３６８５）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５アミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードするが、その中央の桿状ドメインは野生型ジストロフィンよりも短い可能性がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。ＤＭＤ治療のためのエクソンスキッピングは通常、桿状ドメインにおけるエクソンをスキッピングしてリーディングフレームを修正し、（より小さい桿状ドメインの結果タンパク質が若干小さくなるが）ジストロフィンタンパク質のＣ末端を含む残り部分を合成させることによる、ｍＲＮＡ前駆体における早期停止の克服を対象とする。好ましい一実施形態において、本明細書に定義されている方法による処置を受けているＤＭＤ個体は、少なくともある程度の野生型ジストロフィン活性を呈するジストロフィンを提供される。より好ましくは、前記個体がＤｕｃｈｅｎｎｅ型患者又はＤｕｃｈｅｎｎｅ型患者の疑いがある場合、機能ジストロフィンはＢＭＤ個体のジストロフィンである。通常、前記ジストロフィンは、アクチンとＤＧＣの両方と相互作用することができるが、その中央の桿状ドメインは野生型ジストロフィンよりも短い可能性がある（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。野生型ジストロフィンの中央の桿状ドメインは、２４個のスペクトリン様リピートを含む（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａら、（２００６）、Ｅｎｔｒｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｉｄｅｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｃａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ ｒｕｌｅ、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、３４：１３５〜１４４）。例えば、本明細書に提供されているジストロフィンの中央の桿状ドメインは、アクチン及びＤＧＣと結合できるだけの長さの、５〜２３、１０〜２２又は１２〜１８個のスペクトリン様リピートを含むことができる。

本発明の方法は、患者の筋原又は筋細胞の１又は複数種の特性を緩和する、又は欠失を有する全ＤＭＤ患者の合計６８％に発生する、ＤＭＤ遺伝子におけるエクソン４４、４４〜４６、４４〜４７、４４〜４８、４４〜４９、４４〜５１、４４〜５３（エクソン４３スキッピングにより修正できる）、１９〜４５、２１〜４５、４３〜４５、４５、４７〜５４、４７〜５６（エクソン４６スキッピングにより修正できる）、５１、５１〜５３、５１〜５５、５１〜５７（エクソン５０スキッピングにより修正できる）、１３〜５０、１９〜５０、２９〜５０、４３〜５０、４５〜５０、４７〜５０、４８〜５０、４９〜５０、５０、５２（エクソン５１スキッピングにより修正できる）、エクソン８〜５１、５１、５３、５３〜５５、５３〜５７、５３〜５９、５３〜６０（エクソン５２スキッピングにより修正できる）及びエクソン１０〜５２、４２〜５２、４３〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５２（エクソン５３スキッピングにより修正できる）を含むがこれらに限定されない欠失を有するＤＭＤ患者の１又は複数種の症状を緩和することができる（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．２００９）。

或いは、本発明の方法は、患者の筋細胞の１又は複数種の特性を改善することができる、又は欠失を有する全ＤＭＤ患者の合計３６％に発生する、ＤＭＤ遺伝子におけるエクソン４３、４６、５０〜５３に小さな突然変異又は単一エクソン重複を有するＤＭＤ患者の１又は複数種の症状を緩和することができる（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．２００９）。

更に、エクソン４３及び５１の同時スキッピングを必要とするエクソン４４〜５０の欠失、エクソン４５及び５１の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５０の欠失、エクソン４３及び５３の同時スキッピングを必要とするエクソン４４〜５２の欠失、エクソン４５及び５３の同時スキッピングを必要とするエクソン４６〜５２の欠失、エクソン５０及び５５の同時スキッピングを必要とするエクソン５１〜５４の欠失、エクソン５２及び５５の同時スキッピングを必要とするエクソン５３〜５４の欠失、エクソン５２及び５７の同時スキッピングを必要とするエクソン５３〜５６の欠失、エクソン４３及び４４の同時スキッピングを必要とするエクソン４３若しくはエクソン４４におけるナンセンス突然変異、エクソン４５及び４６の同時スキッピングを必要とするエクソン４５若しくはエクソン４６におけるナンセンス突然変異、エクソン５０及び５１の同時スキッピングを必要とするエクソン５０若しくはエクソン５１におけるナンセンス突然変異、エクソン５１及び５２の同時スキッピングを必要とするエクソン５１若しくはエクソン５２におけるナンセンス突然変異、エクソン５２及び５３の同時スキッピングを必要とするエクソン５２若しくはエクソン５３におけるナンセンス突然変異、又はエクソン４３、４６、５０、５１、５２及び／若しくは５３に関する二重又は複数エクソン重複等（これらに限定されないが）、特定の欠失、小さな（点）突然変異又は二重若しくは複数エクソン重複を有する患者を含む、一部の患者のため、エクソン４３、エクソン４６及び／又はエクソン５０〜５３に加えて、追加のエクソンのうちの１個の同時スキッピングがオープンリーディングフレームの回復に必要とされる。

好ましい方法において、エクソン４３のスキッピングが誘導され、又はエクソン４６のスキッピングが誘導され、又はエクソン５０のスキッピングが誘導され、又はエクソン５１のスキッピングが誘導され、又はエクソン５２のスキッピングが誘導され、又はエクソン５３のスキッピングが誘導される。これらエクソンのうちの２個のスキッピングの誘導もまた本発明の方法に包含される。例えば、エクソン５０及び５１、又は５２及び５３、又は４３及び５１、又は４３及び５３、又は５１及び５２のスキッピングが好ましい。当業者であれば、患者で同定された突然変異の種類及び同一性（関与する特定のエクソン）に依存し、前記患者においてエクソンのどの組合せをスキッピングする必要があるか理解できるであろう。

好ましい方法において、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者の１又は複数種の症状（単数又は複数）が緩和される、及び／又はＤＭＤ又はＢＭＤ患者由来の１又は複数の筋細胞の１又は複数種の特性（単数又は複数）が改善される。このような症状又は特性は、細胞、組織レベルで又は患者自身において評価することができる。

１又は複数種の特性の緩和は、患者由来の筋原細胞又は筋細胞における次のアッセイ、即ち筋細胞によるカルシウムの取り込み低減、コラーゲン合成の低下、形態学的変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの低下、並びに／又は筋線維の機能、完全性及び／若しくは生存性の改善のうちのいずれかにより評価することができる。これらパラメーターは通常、筋生検切片の免疫蛍光及び／若しくは組織化学的解析を用いて評価される。

筋線維の機能、完全性及び／又は生存性の改善は、次のアッセイ、即ち血中クレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーの疑いのある筋肉の生検切片における筋線維壊死の検出可能な減少及び／又はジストロフィーの疑いのある筋肉の生検切片における筋線維直径の均質性の検出可能な増加のうちの少なくとも１種を用いて評価することができる。これらアッセイのそれぞれは当業者に知られている。

クレアチンキナーゼは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通り、血液中で検出することができる。クレアチンキナーゼの検出可能な減少は、処置前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者におけるクレアチンキナーゼ濃度と比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を意味することができる。

筋線維壊死の検出可能な減少は、好ましくは筋生検で、より好ましくはＨｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通り生検切片を用いて評価される。壊死の検出可能な減少は、生検切片を用いて壊死が確認された領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少となり得る。減少は、処置前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者で評価された壊死との比較により測定される。

筋線維直径の均質性の検出可能な増加は、好ましくは筋生検切片で、より好ましくはＨｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に記載されている通りに評価される。増加は、処置前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者における筋線維直径の均質性との比較によって測定される。

１又は複数種の症状の緩和は、患者自身における次のアッセイ、即ち歩行能力喪失までの時間延長、筋力改善、重量物持ち上げ能力の改善、床からの立ち上がりに要する時間の改善、９メートル歩行時間の改善、４段階段を登るのに要する時間の改善、脚の機能グレードの改善、肺機能改善、心機能改善、クオリティーオブライフ改善のうちのいずれかにより評価することができる。これらアッセイのそれぞれが当業者に知られている。一例として、Ｍａｎｚｕｒら（Ｍａｎｚｕｒ ＡＹら、（２００８）、Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｒｅｖｉｅｗ），Ｗｉｌｅｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ．）の刊行物は、これらアッセイのそれぞれに対して広範な説明を与える。これらアッセイのそれぞれに対して、アッセイにおける測定パラメーターの検出可能な改善又は延長が判明し次第、これは好ましくは、本発明の方法を用いることによって、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー又はＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーの１又は複数種の症状が個体において緩和したことを意味する。検出可能な改善又は延長は、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら、（２００６）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、１６：５９１〜６０２．２００６）に説明されている通り、統計的に有意な改善又は延長であることが好ましい。或いは、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー又はＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーの１又は複数種の症状（単数又は複数）の緩和は、本明細書で後に定義する通り、筋線維の機能、完全性及び／又は生存性の改善を測定することにより評価することができる。

本発明に係る方法における治療は、少なくとも１週間、少なくとも１カ月、少なくとも数カ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年以上の期間がかかる可能性がある。

本明細書に定義されている、本発明に係る使用のための各分子若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの均等物は、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患又は発症リスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官へのｉｎ ｖｉｖｏでの直接投与に適切となることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで直接投与することができる。本発明の分子、オリゴヌクレオチド又は組成物の投与頻度は、患者の年齢、患者の突然変異、分子の数（用量）、前記分子の製剤等、数種類のパラメーターに依存し得る。頻度は、２週間、３週間、４週間、５週間又はそれ以上長い期間に少なくとも１回の範囲となることができる。

分子若しくはオリゴヌクレオチド又はそれらの均等物は、細胞そのものへと送達することができる。前記分子、オリゴヌクレオチド又はそれらの均等物を個体に投与する場合、それらを送達方法と適合する溶液に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下及び／又は脳室内投与のため、溶液は生理食塩水であることが好ましい。本明細書に定義されている前記分子、オリゴヌクレオチド又はそれらの機能的均等物の細胞及び細胞内、好ましくは筋細胞への送達を更に増強する賦形剤の使用が、本発明の方法に特に好ましい。好ましい賦形剤は、表題「医薬組成物」節に定義されている。

本発明の好ましい方法において、患者のＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体の別のエクソンスキッピングを誘導及び／又は促進することができる追加的な分子が用いられる。好ましくは、第二のエクソンが、患者のＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン６、７、１１、１７、１９、２１、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９又は７５から選択される。用いることができる分子は、表１〜７のうちのいずれか１表に示されている。このように、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体の２個以上のエクソンの、該ｍＲＮＡ前駆体から生成されたｍＲＮＡにおける含有が抑制される。この実施形態は、更に二重又は複数エクソンスキッピングとも言う（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ、Ｊａｎｓｏｎ ＡＡ、Ｋａｍａｎ ＷＥら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍａｋｅｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００４；７４（１）：８３〜９２、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ、Ｋａｍａｎ ＷＥ、Ｗｅｉｊ Ｒ、ｄｅｎ Ｄｕｎｎｅｎ ＪＴ、ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ ＧＪ、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ＪＣ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｏｎｅ ｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｘｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６；１４（３）：４０１〜７）。多くの場合、二重エクソンスキッピングは、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体から２個の標的エクソンのみの排除をもたらす。しかし、他の場合、前記ｍＲＮＡ前駆体における標的エクソン及び前記エクソン間の全領域は、他のエクソン（介在エクソン）がこのような領域に存在していたとしても、生成されたｍＲＮＡには存在しないことが判明した。この複数スキッピングは、エクソン４５に対するオリゴヌクレオチド１種及びエクソン５１に対するオリゴヌクレオチド１種がＤＭＤ遺伝子を転写している細胞に添加された、ＤＭＤ遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドの組合せにおいて顕著にその通りであった。このようなセットアップは、エクソン４５〜５１を含まずに生成されたｍＲＮＡを生じた。明らかに、言及されているオリゴヌクレオチド存在下のｍＲＮＡ前駆体の構造は、スプライシング機構が刺激されてエクソン４４と５２を互いに接続するようなものであった。

２本の相補的オリゴヌクレオチドの間の接続を提供することによって、介在エクソンのスキッピングも特異的に促進することが可能である。したがって、一実施形態において、少なくとも２個のジストロフィンエクソンと相補的なヌクレオチド配列は、接続部分によって分離される。少なくとも２本のヌクレオチド配列は、本実施形態において、このように単一分子を形成するよう接続される。

場合により、２種以上の化合物又は分子が本発明の方法において用いられ、前記化合物類は任意の順序で個体に投与することができる。一実施形態において、前記化合物類は同時に投与される（前記化合物類が１０時間以内、好ましくは１時間以内に投与されることを意味する）。しかし、これは必要とされない。別の実施形態において、前記化合物類は順次投与される。

分子
第二の態様において、前節の表題「方法」に記載されている方法における使用のための分子が提供される。本明細書に定義されている分子は、オリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であることが好ましい。

本研究者らにより、エクソン４３、４６、５０〜５３のうちのいずれかが、前記エクソン内の一続きの少なくとも８ヌクレオチドと好ましくは結合する分子を用いて高頻度で特異的にスキッピングされることが判明した。この効果は、一続きの８ヌクレオチド未満と結合する分子と比べて前記分子のより高い結合親和性と関連し得るが、ハイブリッド二本鎖の熱力学的、動態的又は構造的特性に有利に働く関連する他の細胞内パラメーターが存在する可能性がある。好ましい一実施形態において、前記エクソン内の一続きの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドと結合する分子が用いられる。

好ましい一実施形態において、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０〜５３のうちのいずれかの一部と相補的な配列を含む本発明の分子又はオリゴヌクレオチドは、相補部分が、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％又は更により好ましくは９８％、最も好ましくは最大１００％となるものである。「前記エクソンの一部」は、好ましくは、一続きの少なくとも８ヌクレオチドを意味する。最も好ましい一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に定義されているＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体の前記エクソンの一部と相補的な配列からなる。例えば、オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義されているＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体の前記エクソンの一部と相補的な配列及び追加的なフランキング配列を含むことができる。より好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記相補部分の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドの長さである。好ましくは、追加的なフランキング配列は、タンパク質と前記分子若しくはオリゴヌクレオチドとの結合を修飾するため、又はオリゴヌクレオチドの熱力学的特性を修飾するため、より好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を修飾するために用いられる。

本発明の方法で用いられる好ましい分子は、
エクソン４３のスキッピングのための

エクソン４６のスキッピングのための

エクソン５０のスキッピングのための

エクソン５１のスキッピングのための

エクソン５２のスキッピングのための

及びエクソン５３のスキッピングのための

から選択されるヌクレオチド配列のうちの一つの配列内の一続きの少なくとも８ヌクレオチドと結合する、又は相補的である。

前記エクソンうちの一つのエクソン内の、配列番号２〜７によって定義されている、理論的に一続きのヌクレオチドと結合するよう調製することができる数多くの分子のうち、本発明は、エクソン４３、エクソン４６及び／又はエクソン５０〜５３のうちの少なくとも１個の効率的なスキッピングのための方法で用いることができる異なる分子を提供する。スキッピング効果は前記配列内の比較的高密度の推定ＳＲタンパク質結合部位を言うことができるが、分子の取り込みに有利な他の関連パラメーター又はハイブリッド二本鎖の熱力学的、動態的若しくは構造的特性等、他の細胞内パラメーターも存在し得る。

配列番号２〜７のうちのいずれかに含まれる又はいずれかからなる一続きと結合する分子が、この分子を提供された細胞及び／又は患者における、それぞれエクソン４３、エクソン４６及び／又はエクソン５０〜５３の高効率のスキッピングをもたらすことが判明した。したがって、好ましい一実施形態において、分子が配列番号２〜７内の一続きの少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドと結合する方法が提供される。

エクソン４３、エクソン４６及び／又はエクソン５０〜５３のうちのいずれかのスキッピングを誘導及び／又は促進するための好ましい一実施形態において、本発明は、表１〜６のうちのいずれかに示されているアンチセンスヌクレオチド配列から選択されるアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。本発明の分子は、配列番号１６、配列番号６５、配列番号７０、配列番号９１、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号２４６、配列番号２９９、配列番号３５７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなることが好ましい。

本発明の好ましい分子は、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド又は５０ヌクレオチド等、８〜５０ヌクレオチド又は塩基、より好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドの、ヌクレオチドに基づく、ヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。

本発明の最も好ましい分子は、２５ヌクレオチドのヌクレオチドに基づく配列を含む。

更に、示されている配列のうちスプライス部位の保存部分に由来するものはない。したがって、前記分子は、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体由来の他のエクソン又は他の遺伝子由来のエクソンの示差的なスプライシングを媒介しないと思われる。

一実施形態において、本発明の分子は、特定の配列に結合する化合物分子、又はＲＮＡ結合タンパク質若しくはＤＭＤ ＲＮＡ前駆体分子上の対応するヌクレオチド配列と結合することができるよう修飾された非天然ジンクフィンガータンパク質等、タンパク質である。特定のヌクレオチド配列と結合する化合物分子をスクリーニングするための方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれている国際出願ＰＣＴ／ＮＬ０１／００６９７号明細書及び米国特許第６，８７５，７３６号明細書に開示されている。特定のヌクレオチド配列と結合するＲＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は、参照により本明細書に組み込まれているＦｒｉｅｓｅｎ及びＤａｒｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ５：５４３〜５４６（１９９８）により開示されている。

本発明の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号８〜配列番号６９のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

更により好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１６及び／又は配列番号６５のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号６５のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞及び／又は患者におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。

本発明の別の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４６に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号７０〜配列番号１２２のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

更により好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号７０、配列番号９１、配列番号１１０及び／又は配列番号１１７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１１７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞又は患者におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４６のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。

本発明の別の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号１２３〜配列番号１６７及び／又は配列番号５２９〜配列番号５３５のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

更により好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１２７又は配列番号１６５又は配列番号１６６及び／又は配列番号１６７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１２７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞及び／又は患者におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン５０のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。

本発明の別の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号１６８〜配列番号２４１のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

本発明の別の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号２４２〜配列番号３１０のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。更により好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号２４６及び／又は配列番号２９９のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号２９９のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞及び／又は患者におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン５２のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。

本発明の別の好ましい分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３に存在する配列、

の少なくとも一部と結合する。より好ましくは、本発明は、配列番号３１１〜配列番号３５８のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。

最も好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号３５７のアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなる分子を提供する。この分子が、筋細胞及び／又は患者におけるＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン５３のスプライシング調節に非常に効率的であることが判明した。

本発明の分子のヌクレオチド配列は、本明細書で後に更に詳述するように、ＲＮＡ残基又は１若しくは複数のＤＮＡ残基及び／又は１若しくは複数のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むことができる。

本発明の分子は、ヌクレアーゼ抵抗性を高めるよう、及び／又はアンチセンスヌクレオチドの標的配列に対する親和性を高めるよう修飾された１又は複数の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい一実施形態において、アンチセンスヌクレオチド配列は、修飾塩基及び／若しくは修飾骨格及び／若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれら修飾の組合せを有する残基として定義された、少なくとも１個のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む。

好ましい一実施形態において、ヌクレオチドアナログ又はその均等物は修飾骨格を含む。このような骨格の例として、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格並びにアミド骨格が挙げられる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、以前にアンチセンス薬として研究された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環に置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合に置換された、非荷電骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解抵抗性であり、ＲＮａｓｅＨを活性化させることよりもむしろ、翻訳を停止すること、又はｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに干渉することにより、アンチセンス薬として機能すると思われる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に崩壊させる方法により組織培養細胞に首尾よく送達され、これら方法の数種を比較したある研究により、スクレイプローディングが最も効率的な送達方法であることが判明した。しかし、モルホリノ骨格は非荷電であるため、カチオン性脂質は細胞へのモルホリノオリゴヌクレオチド取り込みの効果的な媒介物ではない。近年の報告は、モルホリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を示し、これら研究は、モルホリノオリゴヌクレオチドがその非イオン性骨格のため、マグネシウムの不在下で三重鎖を形成できることを示した。

短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合又は１若しくは複数種の短鎖へテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合により形成された結合等、骨格における残基間の結合は、リン原子を含まないことが更に好ましい。

好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７〜１５００）。ＰＮＡに基づく分子は、塩基対認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣となる。ＰＮＡ骨格は、ヌクレオ塩基がメチレンカルボニル結合により骨格と結合した、ペプチド結合により結合したＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットを含む。代替的な骨格は、１炭素伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ及びＫｕｍａｒ（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、４９５〜４９７）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電リン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドより安定的である（Ｅｇｈｏｌｍら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６５、５６６〜５６８）。

更に好ましい骨格は、リボース又はデオキシリボース糖がモルホリノ六員環に置換されたモルホリノヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む。最も好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、リボース又はデオキシリボース糖がモルホリノ六員環に置換され、隣接するモルホリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合に置換された、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。

更に別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログ又はその均等物は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素のうちの１個の置換を含む。この修飾は、塩基対合を僅かに不安定化させるが、ヌクレアーゼ分解に対する顕著な抵抗性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネートや、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート等、メチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネートや、３’−アミノホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート及びチオノホスホラミデート等、ホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。

本発明の更に好ましいヌクレオチドアナログ又はその均等物は、−ＯＨ；−Ｆ；１又は複数のヘテロ原子によって分断され得る置換又は非置換、直鎖又は分岐鎖低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、アリール又はアラルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；−アミノキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシ等、２’、３’、及び／又は５’位置において１又は２基置換された１又は複数種の糖部分を含む。糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくはリボース若しくはその誘導体又はデオキシリボース若しくはその誘導体となることができる。このような好ましい誘導体化糖部分は、２’−炭素原子が糖環の３’又は４’炭素原子と結合し、これにより二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａら、２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．１：２４１〜２４２）。これら置換は、ヌクレオチドアナログ又はその均等物にＲＮａｓｅＨ及びヌクレアーゼ抵抗性を付与し、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。

当業者であれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける全位置が均一に修飾される必要がないことが理解できる。更に、上述のアナログ又はその均等物のうちの２種以上が、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込まれてもよく、又は更にはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の単一位置に取り込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種類の異なるアナログ又はその均等物を有する。

本発明に係る好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース及び／又はハロゲン化誘導体等のこれら修飾の置換誘導体等、２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明に係る最も好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートリボースを含む。

本発明の分子の機能的均等物は、前記機能的均等物の活性が少なくともある程度保持されている、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドとして定義することができる。好ましくは、前記機能的均等物の活性は、エクソン４３、４６、５０、５１、５２又は５３スキッピングを誘導し、機能ジストロフィンタンパク質を提供する。したがって、前記機能的均等物の前記活性は、エクソン４３、４６、５０、５１、５２又は５３スキッピングの検出及び機能ジストロフィンタンパク質量の定量化によって評価されることが好ましい。本明細書における機能ジストロフィンは、アクチン及びＤＧＣタンパク質複合体のメンバーと結合できるジストロフィンとして定義されることが好ましい。オリゴヌクレオチドの前記活性評価は、ＲＴ−ＰＣＲにより、又は免疫蛍光又はウエスタンブロット解析により実施されることが好ましい。前記活性は、機能的均等物の由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％以上を示す場合、少なくともある程度保持されることが好ましい。本願を通じて、単語、オリゴヌクレオチドが用いられている場合、これは本明細書に定義されているその機能的均等物に置き換えることができる。

当業者であれば、ヒトＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２及び／又はエクソン５３のうちのいずれかを効率的にスキッピングするため、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせてよいことを理解するであろう。前記エクソン（即ち、エクソン４３、４６、５０、５１、５２又は５３）のうちの１個をスキッピングするための、１、２、３、４、５種類以上のオリゴヌクレオチドの使用は、本明細書により包含されている。前記エクソンのうちの少なくとも２個をスキッピングするための、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドの使用もまた包含されている。好ましくは、前記エクソンのうちの２個がスキッピングされる。より好ましくは、これら２個のエクソンは、
−４３及び５１、又は
−４３及び５３、又は
−５０及び５１、又は
−５１及び５２、又は
−５２及び５３
である。

当業者であれば、ＤＭＤ又はＢＭＤ患者に存在する突然変異の種類、数及び位置に依存し、エクソンのどの組合せがスキッピングされるのに好ましいか理解するであろう。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくは筋細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド取り込みを増強する構成成分と結合することができる。このような構成成分の例として、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質や、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンを含むがこれらに限定されない細胞透過性ペプチド、オリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリシン又はポリリシン等、正荷電アミノ酸、及び抗体、抗体のＦａｂフラグメント又はラクダ型（ｃａｍｅｌｏｉｄ）単ドメイン抗原結合ドメイン等、短鎖抗原結合ドメインにより提供されるような抗原結合ドメインが挙げられる。

好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド結合ＰＭＯを含む。

本発明の１又は複数種のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含む好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全身送達において心筋細胞等、１又は複数の筋細胞におけるスプライシングを調節する。この点において、特定のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身送達は、筋細胞のサブセットへのターゲティングをもたらし得るが、異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋細胞の異なるサブセットへのターゲティングをもたらし得る。したがって、一実施形態において、ヒトＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０、５１、５２又は５３のスキッピングを誘導するために、異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せを使用することが好ましい。

細胞は、プラスミド由来のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現又はアデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクターによって提供されたウイルス発現により、ヒトＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２又はエクソン５３の高効率的のスキッピングをもたらす、必須配列に干渉することができる分子を提供され得る。好ましい一実施形態において、本明細書で同定されている分子の発現を駆動する発現カセットを含む、ウイルスに基づく発現ベクターが提供される。発現は、Ｕ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーター等、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより駆動されることが好ましい。筋又は筋原細胞は、水溶液中のプラスミドを提供することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを提供され得る。或いは、プラスミドは、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））又はそれらの誘導体等、公知のトランスフェクション剤を用いてトランスフェクションにより提供され得る。

アンチセンスオリゴヌクレオチド発現の好ましい一システムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターである。ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、４６、５０、５１、５２又は５３の高効率のスキッピングのための小さなアンチセンスヌクレオチド配列の長期発現に用いることができる、一本鎖及び二本鎖のＡＡＶに基づくベクターが開発された。

好ましいＡＡＶに基づくベクターは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、例えばＵ１、Ｕ６又はＵ７ＲＮＡプロモーターである。

したがって、本発明は、ヒトＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４３、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２又はエクソン５３のスキッピングを誘導するための、本発明の１又は複数種のアンチセンス配列を発現するためのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含む、ウイルスに基づくベクターも提供する。

医薬組成物
必要に応じて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する分子又はベクターは、薬学的に許容される担体を添加することにより、薬学的に活性な混合物又は組成物に取り込まれることができる。

したがって、更に別の態様において、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む分子、及び／又は本発明に係るアンチセンス配列（単数又は複数）を発現する、ウイルスに基づくベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。

好ましい医薬組成物は、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン６、７、１１、１７、１９、２１、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９又は７５のスキッピングを誘導することができる、本明細書に定義されている分子及び／又はベクターと任意選択で組み合わせた、本明細書に定義されている分子及び／又は本明細書に定義されているベクターと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む。これらエクソンのうちのいずれかのスキッピングを誘導することができる好ましい分子は、表１〜７のうちのいずれか１つに同定されている。

好ましい賦形剤は、本明細書に定義されているこのような分子、好ましくは複合体を形成した又は細胞膜により小胞又はリポソームに捕捉されたオリゴヌクレオチドを送達する複合体、小胞及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤を含む。これら賦形剤の多くは、本技術分野で公知のものである。適切な賦形剤は、このような分子、好ましくは本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドを細胞、好ましくは筋細胞に送達できる粒子に自己集合することができる、ポリエチレンイミンとその誘導体、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）とその誘導体等を含む、類似のカチオン性ポリマー、ＥｘＧｅｎ５００、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ及び／又はウイルスカプシドタンパク質を含む。このような賦形剤は、（アンチセンス等、オリゴヌクレオチド）核酸を筋細胞等、種々の培養細胞へ効率的に送達することが示された。これらの高いトランスフェクション潜在能力は、全細胞生存に関して除外される低度から中程度の毒性と組み合される。構造的修飾の容易さを利用して、更なる修飾と、これらの更なる（ｉｎ ｖｉｖｏ）核酸転移特性及び毒性を分析することができる。

リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション剤の一例を表す。これは、２種の脂質成分、カチオン性Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．ＤＯＴＡＰは、メチル硫酸塩）及び中性脂肪ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性成分は、細胞内放出を媒介する。デリバリーシステムの別のグループは、高分子ナノ粒子である。

ＤＮＡトランスフェクション剤としてよく知られているジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン等、ポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、本明細書に定義されている分子又は化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを、細胞膜を通過して細胞内に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤することができる。

これら一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンは、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドをコロイドとして製剤するための代替的アプローチを提供する。このコロイド状ナノ粒子システムは、簡便な自己集合プロセスにより調製されて、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを封入し細胞内放出を媒介することができる、いわゆるプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅ）を形成することができる。当業者であれば、本明細書に定義されている化合物、好ましくはヒトのＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー又はＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーの治療のために前記化合物を送達する、本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドの封入及び送達のための、上述又は他の市販の代替的賦形剤及びデリバリーシステムのうちのいずれかを選択し、適合させることができる。

更に、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質及び／又はその核への取り込みを促進するよう特異的に設計されたターゲティングリガンドと共有又は非共有結合することができる。このようなリガンドは、（ｉ）細胞への取り込みを促進する、細胞、組織又は器官特異的エレメントを認識する（ペプチド（様）構造を含むがこれに限定されない）化合物、及び／又は（ｉｉ）細胞への取り込み及び／又は本明細書で定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドの小胞、例えばエンドソーム又はリソソームから細胞内への放出を促進することができる化学合成物を含むことができる。

したがって、好ましい一実施形態において、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドが、少なくとも１種類の賦形剤及び／又は送達のためのターゲティングリガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達デバイス及び／又はその細胞内送達を促進する物質を提供された薬剤に製剤される。したがって、本発明は、本明細書に定義されている化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１種類の賦形剤及び／又は送達のためのターゲティングリガンド及び／又は前記化合物の細胞への送達デバイス及び／又はその細胞内送達を促進する物質を更に含む、薬学的に許容される組成物も包含する。

分子、化合物又はオリゴヌクレオチドは、単一の組成物又は調製物に製剤してはならないことを理解するべきである。当業者であれば、その同一性に依存して、どの種類の製剤が各化合物に最も適切であるか理解することができるであろう。

好ましい一実施形態において、０．１ｎＭ〜１□Ｍの範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ濃度の、本明細書に定義されている分子又はオリゴヌクレオチドが用いられている。より好ましくは、用いられている濃度は、０．３〜４００ｎＭ、更により好ましくは１〜２００ｎＭの範囲である。本明細書に定義されている分子又はオリゴヌクレオチドは、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で用いることができる。数種類の分子又はオリゴヌクレオチドが用いられる場合、これらの濃度は、オリゴヌクレオチドの合計濃度又は添加された各オリゴヌクレオチドの濃度を意味することができる。上述のオリゴヌクレオチド（単数又は複数）の濃度範囲は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける使用に好ましい濃度である。当業者であれば、用いられているオリゴヌクレオチド（単数又は複数）、処置される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベルに依存して、用いられる培地並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件、用いられるオリゴヌクレオチド（単数又は複数）濃度は更に変化することができ、更なる最適化が必要となり得ることを理解するであろう。

より好ましくは、ＤＭＤ又はＢＭＤを予防、治療するために本発明に用いられる化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドは合成的に生成され、薬学的に許容される組成物又は調製物の製剤形態で、細胞、組織、器官及び／又は患者に直接投与される。医薬組成物の被験者への送達は、好ましくは１又は複数種の非経口注射、例えば静脈内及び／又は皮下及び／又は筋肉内及び／又はくも膜下及び／又は脳室内投与、好ましくはヒトの身体の１又は複数部位における注射により行われる。

本発明の１又は複数種のヌクレオチドアナログ又はその均等物を任意選択で含む、本明細書に定義されている好ましいオリゴヌクレオチドは、全身送達において１又は複数の心筋細胞等、筋細胞におけるスプライシングを調節する。この点において、特定のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むオリゴヌクレオチドの全身送達は、筋細胞のサブセットへのターゲティングを生じ得るが、一方異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むオリゴヌクレオチドは、筋細胞の異なるサブセットへのターゲティングを生じ得る。

この点において、特定のヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むオリゴヌクレオチドの全身送達は、筋細胞のサブセットへのターゲティングを生じ得るが、一方異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むオリゴヌクレオチドは、筋細胞の異なるサブセットへのターゲティングを生じ得る。したがって、この実施形態において、少なくとも１種類の筋細胞におけるＤＭＤ ｍＲＮＡスプライシングを調節するための異なるヌクレオチドアナログ又はその均等物を含むオリゴヌクレオチドの組合せを使用することが好ましい。

好ましい一実施形態において、薬剤としての使用のため、好ましくはＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節するため、より好ましくは本明細書に同定されているエクソン４３、４６、５０〜５３のうちのいずれかのスキッピングを促進又は誘導するための分子又はウイルスに基づくベクターが提供される。

使用
更に別の態様において、本発明は、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節するための、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは分子及び／又は本発明に係る１若しくは複数種のアンチセンス配列を発現するウイルスに基づくベクター及び／又は医薬組成物の使用を提供する。スプライシングは、好ましくはヒト筋原細胞又は筋細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで調節される。より好ましくは、スプライシングはヒト筋細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで調節される。したがって、本発明は更に、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節するための、又はＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者を治療するための薬剤を調製するための、本明細書に定義されている分子及び／又は本明細書に定義されているベクター及び／又は本明細書に定義されている医薬組成物の使用に関する。

本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意義で用いられ、この単語の前の項目が包含されるが、特に言及されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。更に、動詞「からなる」は、「から本質的になる」に置き換えてもよく、本明細書に定義されている分子、ウイルスに基づくベクター又は組成物が、特に同定されている成分以外に、本発明の独自の特性を変化させない追加的な成分（単数又は複数）を含んでよいことを意味する。更に、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」による要素への言及は、文脈がその要素の１つ及び１つだけが存在することを明らかに必要としない限り、１を超える要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」は通常、「少なくとも１」を意味する。

本明細書に同定されている各実施形態は、他に断りがない限り、共に組み合わせることができる。本明細書に引用されているあらゆる特許及び参考文献は、これによりその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

ヒトコントロール筋管において、エクソン４３を標的とする一連のＡＯＮ（ＰＳ２３７、ＰＳ２３８及びＰＳ２４０；それぞれ配列番号６５、６６、１６）を５００ｎＭで試験した。ＰＳ２３７（配列番号６５）は、最高レベルのエクソン４３スキッピングを再現可能に誘導した（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処置細胞）。 エクソン４５欠失を有するＤＭＤ患者由来の筋管において、エクソン４６を標的とする一連のＡＯＮ（ＰＳ１７７、ＰＳ１７９、ＰＳ１８１及びＰＳ１８２；それぞれ配列番号９１、７０、１１０及び１１７）を２種類の異なる濃度（５０及び１５０ｎＭ）で試験した。ＰＳ１８２（配列番号１１７）は、最高レベルのエクソン４６スキッピングを再現可能に誘導した（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー）。 ヒトコントロール筋管において、エクソン５０を標的とする一連のＡＯＮ（ＰＳ２４５、ＰＳ２４６、ＰＳ２４７及びＰＳ２４８；それぞれ配列番号１６７、１６５、１６６及び１２７）を５００ｎＭで試験した。ＰＳ２４８（配列番号１２７）は、最高レベルのエクソン５０スキッピングを再現可能に誘導した（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処置細胞）。 ヒトコントロール筋管において、エクソン５２を標的とする２種類の新規ＡＯＮ（ＰＳ２３２及びＰＳ２３６；それぞれ配列番号２４６及び２９９）を２種類の異なる濃度（２００及び５００ｎＭ）で試験し、以前に記載したＡＯＮ（５２−１）と直接比較した。ＰＳ２３６（配列番号２９９）は、最高レベルのエクソン５２スキッピングを再現可能に誘導した（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処置細胞）。

次の実施例は、説明目的のためだけに提供されており、決して本発明の範囲を限定することを目的としない。

（例１〜４）
材料及び方法
ＡＯＮ設計は、（部分的に）ｍ−ｆｏｌｄプログラムにより予見される標的エクソンＲＮＡの重複オープン二次構造に、また（部分的に）ＥＳＥ−ｆｉｎｄｅｒソフトウエアにより予見される重複推定ＳＲ−タンパク質結合部位に基づいて行った。ＡＯＮは、Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｂ．Ｖ．（ライデン、オランダ）により合成し、これは２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び全長ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。

組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ解析
健常個体（「ヒトコントロール」）（例１、３及び４；エクソン４３、５０、５２スキッピング）又はエクソン４５欠失を有するＤＭＤ患者（例２；エクソン４６スキッピング）由来の筋管培養物を以前記載した通りに処理した（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００２；１２：Ｓ７１〜７７及びＨｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２００３；１２（８）：９０７〜１４）。ＡＯＮのスクリーニングのため、筋管培養物を５０ｎＭ及び１５０ｎＭ（例２）、２００ｎＭ及び５００ｎＭ（例４）又は５００ｎＭのみ（例１及び３）の各ＡＯＮでトランスフェクションした。トランスフェクション試薬ＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎ（Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＢＶ、オランダ）は、ＡＯＮ１□ｇ当たり２□ｌのＵＮＩＦｅｃｔｙｌｉｎを用いた。エクソンスキッピング効率は、標的エクソン（４３、４６、５０、５１、５２又は５３）側方のエクソンに存在するプライマーを用いたネステッドＲＴ−ＰＣＲ解析により決定した。配列検証のため、アガロースゲルからＰＣＲ断片を単離した。定量化のため、ＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐｓキットを用いてＡｇｉｌｅｎｔ２１００ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）においてＰＣＲ産物を解析した。

結果
ＤＭＤエクソン４３スキッピング
エクソン４３内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号２として定義されているエクソン４３内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、エクソン４３スキッピングを確実に誘導できることを示した。図１に示す通り、ＰＳ２３７（配列番号６５）は、５００ｎＭで最高レベルのエクソン４３スキッピング（最大６６％）を再現可能に誘導した。比較のため、それぞれ最大１３％及び３６％のエクソン４３スキッピングレベルを誘導する、ＰＳ２３８及びＰＳ２４０も示す（図１）。エクソン４３の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン４３スキッピングは、未処置細胞（ＮＴ）には観察されなかった。

ＤＭＤエクソン４６スキッピング
エクソン４６内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、ＤＭＤ遺伝子にエクソン４５欠失を有するＤＭＤ患者由来の筋管培養物にトランスフェクションした。このような突然変異を有する患者のため、アンチセンスが誘導するエクソン４６スキッピングは、疾病の１又複数種の症状を確実に緩和することができる、新規ＢＭＤ様ジストロフィンタンパク質の合成を誘導した。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号３として定義されているエクソン４６内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、５０ｎＭと比較的低濃度のＡＯＮであってもエクソン４６スキッピングを確実に誘導できることを示した。図２に示す通り、ＰＳ１８２（配列番号１１７）は、最高レベルのエクソン４６スキッピング（５０ｎＭで最大５０％、１５０ｎＭで７４％）を再現可能に誘導した。比較のため、１５０ｎＭでそれぞれ最大５５％、５８％及び４２％のエクソン４６スキッピングレベルを誘導する、ＰＳ１７７、ＰＳ１７９及びＰＳ１８１も示す（図２）。エクソン４６の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン４６スキッピングは、未処置細胞（ＮＴ）には観察されなかった。

ＤＭＤエクソン５０スキッピング
エクソン５０内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号４として定義されているエクソン５０内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、エクソン５０スキッピングを確実に誘導できることを示した。図３に示す通り、ＰＳ２４８（配列番号１２７）は、最高レベルのエクソン５０スキッピング（５００ｎＭで最大３５％）を再現可能に誘導した。比較のため、５００ｎＭで最大１４〜１６％のエクソン５０スキッピングレベルを誘導する、ＰＳ２４５、ＰＳ２４６及びＰＳ２４７も示す（図３）。エクソン５０の正確なスキッピングは、新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって確認した。エクソン５０スキッピングは、未処置細胞（ＮＴ）には観察されなかった。

ＤＭＤエクソン５１スキッピング
エクソン５１内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号５として定義されているエクソン５１内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、エクソン５１スキッピングを確実に誘導できることを示した。配列番号１８０を有するＡＯＮは、最高レベルのエクソン５１スキッピングを再現可能に誘導した（データなし）。

ＤＭＤエクソン５２スキッピング
エクソン５２内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号６として定義されているエクソン５２内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、エクソン５２スキッピングを確実に誘導できることを示した。図４に示す通り、ＰＳ２３６（配列番号２９９）は、最高レベルのエクソン５２スキッピング（２００ｎＭで最大８８％、５００ｎＭで９１％）を再現可能に誘導した。比較のため、５００ｎＭを投与した場合、それぞれ最大５９％及び１０％レベルのエクソン５２スキッピングを誘導するＰＳ２３２及びＡＯＮ５２−１（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ２００５により以前刊行された）も示す（図４）。新規のより小さな転写産物断片の配列解析によって、エクソン５２の正確なスキッピングを確認した。エクソン５２スキッピングは、未処置細胞（ＮＴ）には観察されなかった。

ＤＭＤエクソン５３スキッピング
エクソン５３内の配列を標的とする一連のＡＯＮを設計し、健常なコントロール筋管培養物にトランスフェクションした。続く単離ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析は、本明細書では配列番号７として定義されているエクソン５３内の一続きのヌクレオチドを標的とするほぼ全てのＡＯＮが、エクソン５３スキッピングを確実に誘導できることを示した。配列番号３２８を有するＡＯＮは、最高レベルのエクソン５３スキッピングを再現可能に誘導した（データなし）。

［配列表］
ＤＭＤ遺伝子アミノ酸配列

Claims (20)

1. 配列番号２８７（５’−ＧＧＵＡＡＵＧＡＧＵＵＣＵＵＣＣＡＡＣＵＧＧ−３’）の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン５２をスキッピングするための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、ヌクレオチドアナログとなる修飾を含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記オリゴヌクレオチドが、１又は複数のＲＮＡ残基、及び／又は１又は複数のＤＮＡ残基を含むことになる修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含み、
   前記ヌクレオチドが、修飾塩基、及び／若しくは非天然ヌクレオシド間結合、又はこれら修飾の組合せを有することになる修飾を含む、
   請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記ヌクレオチドアナログが、修飾塩基を有することになる修飾を含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記オリゴヌクレオチドが、修飾骨格を有することになる修飾を含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記ヌクレオチドアナログが、２’、３’及び／又は５’位置において１又は２基置換された１又は複数の修飾糖部分を含むことになる修飾を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−置換ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことになる修飾を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートリボースを含むことになる修飾を含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’ｇｇｕａａｕｇａｇｕｕｃｕｕｃｃａａｃｕｇｇ３’（配列番号２８７）からなるホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
    糖部分が、２’−Ｏ−メチル置換されていることになる修飾を含む、
    請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 前記修飾骨格が、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格及びアミド骨格からなる群から選択されるものとなる修飾を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
13. 前記オリゴヌクレオチドが、モルホリン環及び／又はホスホロジアミデートヌクレオシド間結合、及び／又はペプチド核酸、及び／又はロックド核酸を含むことになる修飾を含む、請求項１〜７及び１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
14. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）となる修飾を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 配列番号２８７（５’−ＧＧＵＡＡＵＧＡＧＵＵＣＵＵＣＣＡＡＣＵＧＧ−３’）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの発現を駆動する発現カセットを含むウイルスに基づくベクター。
16. ＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節するため、又はＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者を治療するための医薬として使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１５に記載のウイルスに基づくベクター。
17. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１５に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
18. ＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者の治療のための薬剤を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター又は請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
19. Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型又はＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー患者のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中のエクソン５２のスキッピングを誘導及び／又は促進するための、請求項１８に記載の使用。
20. ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体中のエクソン５２のスキッピングを誘導及び／又は促進することが、前記Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型又はＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー患者の筋細胞中でのものである、請求項１９に記載の使用。