JP5906306B2

JP5906306B2 - 微量サンプル由来ｃＤＮＡ増幅法

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Publication number: JP5906306B2
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Inventors: 弘之角田; フアンフアン; 真理太田; 神原　秀記; 秀記神原
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Description

本発明は、1又は少数の細胞に含まれるRNA又はDNAなどの微量核酸成分の分析に関するものであり、特にmRNAからcDNAを生成し、それらを均一に増幅する方法に関するものである。

遺伝子発現解析は生体の状態を正確に知る手段として広く用いられている。代表的な発現解析方法としてはリアルタイムPCR法及びマイクロアレイ法が知られており、その解析用に、様々な試料から抽出したmRNAが利用されている。例えば、培養して増やした細胞から抽出したmRNA、又は複数の細胞から構成される組織片から抽出したmRNAなどが利用されることが多い。そして計測の結果、各mRNAの量が複数の細胞から集められた平均値として解析されることになる。

一方、近年の学術分野の発展は著しく、今まで均一な細胞集団とみなして採取された組織片や細胞集団の中にも複数の細胞種が存在することが判明してきた。例えば癌組織中には癌の元となる癌幹細胞が存在し、癌幹細胞から癌細胞が供給されることが分かってきた。また再生医療への応用が期待される胚幹（ES）細胞ではその細胞集団中の個々の細胞は決して均一でなく分化能が異なる細胞が存在することも明らかになってきた。つまり1細胞ごとに個性が異なる細胞を対象にするこれらの研究では、細胞集団の平均値として発現解析を行う今までの手法では不十分であり、1細胞レベルで個々の細胞の遺伝子を解析しなければ、真の発現解析を行ったことにならない可能性がある。

しかしながら、1細胞中に含まれるmRNAの量は非常に少ない。ヒト培養細胞中に含まれるmRNAはおよそ2pg以下であると考えられており、この微量mRNAの発現解析を通常の方法で行うことは困難である。そのため、1細胞の微量mRNAの発現解析を実現するために様々な手法の開発が試みられてきた。

定量的に遺伝子発現解析を行う手法としてはリアルタイムPCR法が優れている。1細胞中のmRNA量をリアルタイムPCR法で解析する研究はすでに本発明者らにより報告されており、1細胞からmRNAを抽出し、磁気ビーズ上にcDNAライブラリを構築し、これをリアルタイムPCRの試料として用いる方法を開発している（特許文献１及び非特許文献１）。そこでは遺伝子ごとに異なるリアルタイムPCR用プライマーを用いて増幅し、同じプライマーで増幅した標準サンプルの検量線と比較することで精密な定量分析を実現している。しかし、この方法では一度に計測できる遺伝子が数種類と限られており、網羅的な発現解析を行うことが難しかった。

一方、網羅的な遺伝子発現解析を行う手法としてはマイクロアレイ法が優れている。栗本らはglobal amplification法と組み合わせて、1細胞の網羅的発現解析を実現している（特許文献２、非特許文献２及び３）。しかし、マイクロアレイ法は、チップ上に区分けして配置した各遺伝子配列特異的プローブとサンプル核酸とのハイブリダイゼーションを指標に発現強度を測定するため、定量性に劣っている。

またリアルタイムPCR法とマイクロアレイ法で共通する問題点として、塩基配列が未知のサンプルの解析を行うことができないという点がある。細胞中には様々な未知のバリアントmRNAやタンパク質をコードしていないが遺伝子の発現調節に関わる多数の未知の非コードRNAなどが存在する。生命を理解する上で、これら未知のRNAに対する発現解析の重要度は近年非常に高まっている。

そのような状況下、最近の大規模DNAシーケンサの発展に伴い、新たな手法としてmRNAから生成したcDNAを基にしてDNAシーケンサで配列解析し、発現解析を行う手法（RNA-Seq）が注目を浴びている。RNA-Seqでは一度に数千万から数億本ものDNA断片の塩基配列を解読することができる。解析された配列を基に、既知の遺伝子配列に対してマッピング操作をコンピュータ上で行い、マップされた配列断片の数をカウンティングしてRNA発現量を計算する。

RNA-Seqではマッピングを行う参照ゲノムDNA配列さえ判っていれば、未知のmRNAの発現解析も可能であり、今までの発現解析法の欠点を克服できる大きな利点がある。また計測できるダイナミックレンジも5 logと広く、細胞中に発現しているmRNAの全てを一度に定量することも可能であると考えられている。さらにRNA-Seqでは単に遺伝子発現量を比較するのではなく、配列を解析することで遺伝子自体の変異など定量分析以上の情報も得ることができるため、今までに無い新たな解析手法として、大きなインパクトを生命科学分野に与えている。

このように大規模DNAシーケンサによるRNA-Seqは非常に優れた解析法ではあるが、このシーケンサで単一細胞の発現解析を行う場合を考えると、乗り越えるべき大きな課題がある。それは、大規模シーケンサは解析試料として大量のDNAが必要であるため、DNAを増幅させる過程が必須であるという点である。例えばライフテック社のSOLiDシーケンサ用の試料調製ではエマルジョンPCRによる個別増幅を行う工程が必要であるが、その工程の前に、DNA試料をおよそ数百ngまで増幅させておく必要がある。この増幅の過程では増幅用アダプターの付加やDNA断片長によるサイズセレクションなどシーケンサンサ仕様に何段階もの試料調製の工程が必要になる。そのため、実際に単一細胞のような微量なmRNAから大規模シーケンサ仕様に数百ngまでDNAを増幅させることは大きな困難を伴う。また、たとえ増幅できたとしてもその増幅の過程で増幅に偏りが生じ、単一細胞中のmRNAの発現量比を反映しない試料になってしまう可能性も高い。

各シーケンサ装置の仕様に合わせて、各社からRNA-Seq用サンプル調製キットが販売されているが、どのキットでも1細胞レベルである2pg以下のmRNA試料からのサンプル調製には対応していない。従って、単一細胞のRNA-Seqを行うためには独自のサンプル調製手法を開発する必要があり、論文レベルではその報告がなされている。

例えばTangらは上記global amplification法を改良し、大規模シーケンサを用いてマウス卵やES細胞の単一細胞発現解析に成功している（非特許文献４及び５）。global amplification法は以下の工程から成り立つ。

(1) 1細胞からmRNAを抽出し、ポリT配列とPCR増幅用タグ配列を有するDNAプライマー（UP1）を用いてcDNAを合成する。(2) cDNA合成時に残った未反応DNAプライマーを1本鎖DNA分解酵素であるエキソヌクレアーゼIで分解する。(3) 熱でエキソヌクレアーゼIを不活化した後、RNaseHによるmRNAの分解と、TdT（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase）によるcDNAの3’末端へのポリA配列の付加を行う。(4) 上記UP1プライマーとは異なる増幅用タグ配列とポリT配列とを有するDNAプライマー（UP2）を用いて2本鎖合成反応を行う。(5) 合成した2本鎖DNAを鋳型にして、UP1プライマーとUP2プライマーのセットでPCR増幅を行う。

この方法は微量なサンプルからの増幅に適した手法であるが、一般的にこの種の手法を用いる時に大きな問題になるのは増幅の偏りである。増幅の偏りとは先ほども述べたように遺伝子を増幅する工程で遺伝子の種類ごとに増幅率が異なり、細胞中のmRNAの発現量比を反映しない結果が生じてしまうことを指す。これは別名、増幅バイアスと言い、遺伝子発現量の定量的な比較を行う上で大きな問題になってくる。

発生や分化の解明で見られる遺伝子発現量はステージにより大きく変化するので数倍の増幅バイアスがあっても大きな問題にならないケースもある。しかし、今後発展が予想される医療分野でマーカーを探索する場合、2倍程度しか遺伝子発現量に差がない遺伝子であってもそれらを区別することが望まれる場合がある。そのような場合には、数倍の増幅バイアスを生じる発現解析の手法ではそのわずかな遺伝子発現量差を区別することが困難である。このため1細胞中のmRNAを対象とした、できる限り増幅バイアスが少なく、かつ大規模シーケンサに適用できる十分量の試料が調製できる方法の開発が望まれている。

特開2007-319028号国際公開WO 2006/085616号

Taniguchi et al., Nature Methods 6, 503-506 (2009) Kurimoto et al., Nucleic Acids Research 34, e42 (2006) Kurimoto et al., Nature Protocol 2, 739-752 (2007) Tang et al., Nature Methods 6, 377-382 (2009) Tang et al., Cell Stem Cell 6, 468-478 (2010)

本発明で解決しようとする課題は、例えば大規模DNAシーケンサで、1細胞中又は少数細胞中の遺伝子発現を網羅的かつ精密に解析するための試料調製方法を提供することである。そのためには1細胞中に含まれる微量（数pg）mRNAを効率良くcDNAに変換し、大規模シーケンサ仕様に十分量（数百ng）まで増幅させる必要がある。なおかつその増幅時には元の細胞中に含まれる各mRNAの発現量比が変化しないようにできる限りバイアス無く増幅させる必要がある。1細胞中のmRNA量は非常に少ないので、なるべく容器の壁やピペットなどに吸着して損失する試料を少なくし、増幅効率を高めなければならない。そこで、1つの容器内で全ての試料調製の過程を行うようにすれば、試料の損失を最小限に留める効果が期待できる。しかし、逆にこの場合、各工程の未反応試薬や反応副産物が容器内に蓄積し、続く反応工程の効率や正確性の低下を引き起こしてしまう。本発明ではこの相反する現象を防ぎ、例えば大規模DNAシーケンス試料用に、1又は少数の細胞から少ないバイアスで十分量の試料を増幅させる方法を提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を克服するために、mRNAからcDNAの合成、続くcDNAの増幅までの工程を詳細に検討し、増幅の反応効率を低下させる原因、及び増幅時にバイアスを発生させる原因を解明した。そしてそれらの問題を解決することにより増幅バイアスが少なく、増幅効率が高いcDNAの作製から増幅に至る一連の工程を構築することができ、その結果、例えば大規模DNAシーケンサで1細胞遺伝子発現解析を可能とする技術を開発するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。

［1］細胞中のmRNAからcDNAを増幅する方法であって、
（1）1つの反応容器内で、上記細胞由来のmRNAを、固体担体に固定化された第1のタグ配列及びポリT配列からなる第1のDNAプローブで捕捉し、逆転写反応により該mRNAから第1鎖cDNAを合成する工程、
（2）上記固体担体上に合成された第1鎖cDNAを反応容器内に残し、反応試薬を上記反応容器から除去する工程、
（3）上記固体担体上の第1鎖cDNAの3'末端に1種類のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列を付加する工程、
（4）上記ポリヌクレオチド配列が付加されたcDNAに、第2のタグ配列及び上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む第2のDNAプローブをハイブリダイズさせて、第2鎖cDNAを合成する工程、
（5）固体担体上に合成された第2鎖cDNAを鋳型としてDNA増幅反応を行う工程
を含むことを特徴とする方法。

［1-2］細胞が1又は少数の細胞である、［1］に記載の方法。

［2］固体担体が磁気ビーズである、［1］に記載の方法。

［3］工程（1）において、固体担体1個当たり4 x 10³分子以下の量の第1のDNAプローブを用いる、［1］又は［2］に記載の方法。

［4］工程（1）において、固体担体1個当たり2 x 10³分子を超えて10⁵分子以下の量の第1のDNAプローブを用いる、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。

［5］工程（1）において、第1のDNAプローブが、第1のタグ配列及びポリT配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群であり、第1のDNAプローブを固体担体1個当たり10⁴分子以上の量で用いる、［1］又は［2］に記載の方法。

［5-2］ランダム配列がVN（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）である、［5］に記載の方法。

［6］工程（2）において、除去する反応試薬が逆転写酵素を含む、［1］〜［5］のいずれかに記載の方法。

［7］第1のDNAプローブのDNA分解酵素反応による分解除去工程を含まないことを特徴とする［1］〜［6］のいずれかに記載の方法。

［8］工程（3）において、ヌクレオチドがアデニン（A）である、［1］〜［7］のいずれかに記載の方法。

［9］工程（3）のポリヌクレオチド配列付加反応後に、反応試薬を除去する工程をさらに含む、［1］〜［8］のいずれかに記載の方法。

［10］工程（4）において、第2のDNAプローブが、第2のタグ配列及びポリヌクレオチド配列に相補的な配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群である、［1］〜［9］のいずれかに記載の方法。

［10-2］ランダム配列がVN（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）である、［10］に記載の方法。

［11］工程（5）において、固体担体上に合成された第2鎖cDNAの末端に存在する第1のタグ配列、又は第1のタグ配列及び第2のタグ配列を利用してDNA増幅反応を行う、［1］〜［10］のいずれかに記載の方法。

［11-2］工程（5）において、固体担体上に合成された複数の第2鎖cDNAを鋳型として、一括してDNA増幅反応を行う、［1］〜［11］のいずれかに記載の方法。

［11-3］工程（5）において、少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー、又は少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー及び少なくとも第2のタグ配列を含むプライマーを用いてDNA増幅反応を行う、［1］〜［11］のいずれかに記載の方法。

［12］工程（5）において、増幅反応のサイクル数を指数関数的な増幅が起こる回数以下にする、［1］〜［11］のいずれかに記載の方法。

［13］増幅されたDNA産物から、ビーズへのDNA吸着を原理として該DNA産物を分離精製する方法により、200bp以下のDNA産物を分離除去することをさらに含む、［1］〜［12］のいずれかに記載の方法。

［14］第1鎖DNAが固定化された固体担体を繰り返して使用してDNA増幅反応を行うことを特徴とする［1］〜［13］のいずれかに記載の方法。

［14-2］工程（1）において、固体担体にmRNAを捕捉した後の残液中の3’末端のポリA配列を有しないRNAを測定することをさらに含む、［1］〜［14］のいずれかに記載の方法。

［14-3］固体担体の表面がタンパク質吸着防止剤で被覆されている、［1］〜［14］のいずれかに記載の方法。

［15］工程（2）において、反応試薬を除去した後に、固体担体を新たなバッファー溶液中で放置する工程をさらに含む、［1］〜［14］のいずれかに記載の方法。

［16］［1］〜［14］のいずれかに記載の方法により増幅されたDNA産物の量から、細胞中のmRNA量を測定することを含む、細胞中のmRNA量を測定する方法。

［17］細胞中のmRNAからcDNAを増幅するためのキットであって、
第1のタグ配列及びポリT配列からなる第1のDNAプローブが固定化された固体担体と、cDNA配列の3'末端に1種類のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列を付加するための手段と、
第2のタグ配列及び上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む第2のDNAプローブと、少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー、又は少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー及び少なくとも第2のタグ配列を含むプライマーとを含むことを特徴とするキット。

［17-2］固体担体が磁気ビーズである、［17］に記載のキット。

［17-3］固体担体1個当たり4 x 10³分子以下の量の第1のDNAプローブが固定化されている、［17］に記載のキット。

［17-4］固体担体1個当たり2 x 10³分子を超えて10⁵分子以下の量の第1のDNAプローブが固定化されている、［17］に記載のキット。

［17-5］1種類のヌクレオチドがアデニン（A）である、［17］に記載のキット。

［17-6］ポリヌクレオチド配列を付加するための手段がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）である、［17］に記載のキット。

［17-7］第2のDNAプローブが、第2のタグ配列及びポリヌクレオチド配列に相補的な配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群である、［17］に記載のキット。

［17-8］ランダム配列がVN（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）である、［17］に記載のキット。

［17-9］逆転写酵素及びDNAポリメラーゼをさらに含む、［17］に記載のキット。

［17-10］第1のDNAプローブが、第1のタグ配列及びポリT配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群である、［17］に記載のキット。

［17-11］ランダム配列がVN（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）である、［17］に記載のキット。

本発明に係る方法及びキットにより、1又は少数の細胞から大規模DNAシーケンス用の試料を少ないバイアスで十分量増幅させることが可能となる。本発明により1細胞レベルでの遺伝子発現解析を可能とすることで、生命科学及び医療分野に新しい生命情報を与えて大きな貢献がある。これまでのように平均ではなく個々の細胞の特性を理解した上で細胞の集合としての振舞いを理解し、細胞に対する薬剤応答性や特性評価を行うなど、今までに無い非常に活用範囲の広い技術が提供される。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-078675号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

本発明のプロトコールの工程の概略を示した図である。磁気ビーズに固定化する最適なプローブ量を調べるために行った実験結果を示すグラフである。Aは、逆転写時に磁気ビーズ上に存在するEEF1G遺伝子の量を定量PCR法で測定した結果を示している。Bは、2nd PCR反応まで行った増幅産物中に存在するEEF1G遺伝子の量を示している。図に示している分子の数は磁気ビーズ1個当たりの固定化UP1プローブ数を表している。逆転写反応溶液の除去・洗浄効果を示したグラフである。エキソヌクレアーゼI処理の1st PCRに与える影響を示したグラフである。横軸には定量PCRで増幅量を測定した遺伝子名を示している。縦軸は各遺伝子の増幅量の相対値を示しており、同じ実験で測定したEEF1G遺伝子の増幅量を100％として換算している。 VN配列を有しないプライマー又はVN配列を有するプライマーで2nd strand cDNAを合成したサンプルを鋳型にして増幅させた1st PCR産物（AMPureキットで精製後）の電気泳動パターンを示したグラフである。本発明のプロトコールを用いて1細胞のHCT116から作製した最終DNA増幅産物（2nd PCR産物を精製）の電気泳動パターンを示したグラフである。各工程間のDNA増幅率を示したグラフである。縦軸はDNAの増幅率を示している。横軸の1st PCR/cDNAはcDNAから1st PCR時、2nd PCR/ 1st PCRは1st PCRから2nd PCR時、2nd PCR/cDNAはcDNAから2nd PCR時の増幅率を示している。増幅率は5種類の遺伝子（EEF1G、B2M、SDHA、TBP、GUSB）を用いて測定している。図7で示した5つの遺伝子間での増幅率のばらつきを評価したグラフである。横軸は5種類の遺伝子名を示している。縦軸は各遺伝子の増幅率が、5種類の遺伝子の増幅率の相乗平均に対して何倍差があるかを示している。磁気ビーズに固定化する最適なVN配列を有するDNAプローブ量を調べるために行った実験結果を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る、1細胞の遺伝子発現解析に対応した大規模シーケンサ用試料作製法の5段階の工程を示す（図1）。

(1) cDNA合成：固体担体に固定化された第1のタグ配列及びポリT配列からなる第1のDNAプローブ（No.1）でmRNAを捕捉して、逆転写反応により該mRNAからcDNAを合成する反応を1つの反応容器内で行う工程；
(2) 逆転写反応溶液の除去：固体担体上に合成された第1鎖cDNAを反応容器内に残し、反応試薬を反応容器から除去する工程；
(3) ポリA配列付加（単一種ポリヌクレオチド配列付加）：固体担体上の第1鎖cDNAの3’末端にポリA配列（1種類のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列）を付加する工程；
(4) 第2鎖cDNA（2nd strand cDNA）合成：ポリA配列（単一種ポリヌクレオチド配列）が付加されたcDNAに、第2のタグ配列及びポリT配列（上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列）を含む第2のDNAプローブ（No.2）をハイブリダイズさせて、第2鎖cDNAを合成する工程；
(5) 増幅：固定担体上に合成された第2鎖cDNAを鋳型にして、DNA増幅反応を行う工程。

以下、本発明のポイントとなった点を工程ごとに詳細に説明する。

(1)のcDNA合成の工程では、固体担体として磁気ビーズを使用している。後の反応の効率の観点から、1反応に使用する磁気ビーズの個数の最適化、及び磁気ビーズに固定するDNAプローブ量の最適化が本工程における重要なポイントである。具体的には、1反応当たりに使用する磁気ビーズの個数は、好ましくは10⁶〜10⁸個、より好ましくは10^７個である。またこの時、磁気ビーズに固定するDNAプローブの量も適切な量が想定される（図2）。逆転写反応時における効率の点からは1つの磁気ビーズ当たりおよそ2 x 10³分子を超えて10⁵分子、好ましくは3 x 10³分子〜10⁵分子、より好ましくは4 x 10³分子から10⁵分子のDNAプローブを固定化することが望ましい。一方、後のPCR増幅反応における効率の点からは、およそ4 x 10³分子以下の固定化量の時がPCR増幅時に増幅効率が高い上、アーティファクトの増幅産物を生み出しにくい。よって逆転写時及びPCR増幅時の両方に最適なDNAプローブの固定化量は磁気ビーズ1個当たり2 x 10³分子を超えて4 x 10³分子、好ましくは3 x 10³分子〜4 x 10³分子、より好ましくは4 x 10³分子ということになる。

また磁気ビーズに固定化する第1のDNAプローブの3’末端にVN配列など、逆転写開始点をmRNAのポリA配列の開始点に特定する効果のある配列を導入すると、ポリA配列に複数のプローブが結合する事により生じるアーティファクト副産物の生成を低減する効果が期待できる。この場合、磁気ビーズに固定化するプローブの最適量は変化し、逆転写の効率の観点から磁気ビーズ1個当り、10⁴分子以上が望ましい（図9）。

そして本工程を経ると、1又は少数の細胞の微量mRNA由来の配列情報を有するcDNAが磁気ビーズ担体上に固定化され（cDNAライブラリ）、以降の工程ではこの微量核酸試料の反応容器やピペットへの吸着ロスを防ぐことができる。

（2）の逆転写反応溶液の除去の工程では、磁気ビーズを磁気分離し、逆転写に使用した反応溶液を取り除く洗浄操作を行う。本洗浄操作により、逆転写酵素を含む逆転写溶液の次の工程への持ち込みを防ぎ、反応阻害を防ぐことが目的であり、本工程における最も重要なポイントである。逆転写反応液を取り除く洗浄操作を行わないと1st PCRの増幅量が大幅に減少することが本発明者の実験から明らかになっている（図3）。また、実際に反応阻害に関わる要因を調べたところ、逆転写酵素であるSuperscriptIIIに、次の工程のポリA付加反応を阻害する可能性があることも確認している。

一方、上記Tangら（非特許文献４及び５）が行っているglobal amplification法では、cDNAは固定化せずに溶液中で次のポリA付加反応を行っている。この場合、その前段階の工程の未反応プライマーが次の工程に持ち込まれるのを防ぐため、エキソヌクレアーゼIで未反応プライマーを分解している。この分解工程が無いと、持ち込まれた未反応プライマーの3’末端にもポリA配列が付加し、次のDNA増幅反応時の鋳型になってしまうため、目的産物の増幅効率が著しく減少してしまう。このような余分なDNAを分解するためのエキソヌクレアーゼI処理は今まで一般的に広く用いられてきた手法である。

しかし、本発明者の実験から、エキソヌクレアーゼI処理を行うと、遺伝子の種類によって、PCRの増幅効率が大きく異なるケースが見られ、増幅バイアスが発生することが明らかになった（図4）。図4に示す例ではB2M遺伝子がそれにあたり、エキソヌクレアーゼI処理を行うことにより、他の遺伝子と比べて相対的にPCR増幅量が低下することが判明した。

その原因として、エキソヌクレアーゼIによる一部のcDNA配列の部分的分解が考えられる。エキソヌクレアーゼIは一本鎖DNAを特異的に分解するため、cDNA合成後のmRNA/cDNAハイブリッド2本鎖状態のcDNAは分解しない。しかし、ある種の遺伝子配列に部分的に1本鎖構造をとったものが存在し、その部分がエキソヌクレアーゼIの標的となり、cDNAが分解されてしまう可能性が考えられる。

磁気ビーズに固定化したDNAプローブからcDNAを合成する本発明のプロトコールではエキソヌクレアーゼIを使用する必要がない。すなわち、本発明のプロトコールは、DNA分解酵素反応による分解除去工程を含まない。そのため、本発明には、エキソヌクレアーゼI処理という増幅バイアスを生じる大きな原因を避けられる優れた特徴がある。

(3)のポリA付加反応（単一種ポリヌクレオチド配列の付加反応）の工程では、逆転写された第1鎖cDNAの3’末端に単一のヌクレオチド、例えばdATPを連続的に付加させて、第1鎖cDNAの3’末端に単一種ポリヌクレオチド配列、例えばポリA配列を形成させる。この際、(1)の工程で説明したように、磁気ビーズに固定化するDNAプローブの量を最適化（例えば3 x 10³〜4 x 10³DNA分子/磁気ビーズ）することが重要なポイントである。この最適化を行わないと、単一ヌクレオチド（例えばdATP）はこの付加反応で、cDNAの3’末端に付加するだけではなく、(1)の工程で磁気ビーズ上に固定化されたがmRNAを捕捉せずに3’末端がフリーの状態で存在するDNAプローブにも付加してしまう。このフリーのDNAプローブ上に形成されたポリA配列（単一種ポリヌクレオチド配列）は後の工程で第2のプローブがハイブリダイズする鋳型となり、PCR増幅時に目的以外のアーティファクトを生み出す原因になってしまう。実際に磁気ビーズに固定化するDNAプローブの量を増やして、3’末端がフリーのDNAプローブの割合を増加させて、その後のPCR反応を行うと、精製して取り除くことが困難なほど、大量のPCRアーティファクトが発生し、目的の産物の増幅量も低下してしまう。

ポリA付加（単一種ポリヌクレオチド付加）反応終了後は磁気ビーズの磁気分離反応を利用して、付加反応に使用した溶液を除去し洗浄することが好ましい。この工程では、(2)の工程と同様に、前の工程の反応溶液の持ち込みを防ぐことにポイントがある。この除去を行わない場合には、ポリA付加（単一種ポリヌクレオチド付加）反応に利用されなかった未反応のヌクレオチド（例えばdATP）が続くPCR増幅への工程に持ち込まれてしまう。その場合、PCR反応に利用される4種類のヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の量比が崩れ、特定のヌクレオチド（例えばdATP）のみが大量に存在することになり、DNA合成時に間違ったヌクレオチドが取り込まれ、合成したDNAに変異が導入される、あるいは増幅効率を低下させるなどの現象を引き起こしてしまう可能性が考えられる。

(4)の第2鎖cDNA合成の工程では、前工程で第1鎖cDNAの3’末端に付加したポリヌクレオチド配列（例えばポリA配列）に対して第2のDNAプローブ（No.2）をハイブリダイズさせて第2鎖cDNAの合成反応を行う。第2のDNAプローブは、第2のタグ配列と、上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する。本工程ではこの第2のDNAプローブの3'末端を2塩基のランダム配列にすることが最も重要なポイントであり、それにより増幅する小断片のアーティファクトの量を大幅に低減させることが可能になる（図5）。そのようなランダム配列として、VN配列（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）がある。

3’末端にVN配列を有しないプローブでは、ポリヌクレオチド配列（例えばポリA配列）のどの位置にハイブリダイズしても、3’末端がポリヌクレオチド配列（例えばポリA配列）の内部にさえあれば、合成が開始される。例えば(3)の工程で使用することができるTerminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）によるポリA付加（単一種ポリヌクレオチド付加）反応ではDNAの3’末端に付加される単一ヌクレオチド（例えばA）の長さは非常に長く、数百ベースを超える場合もある。従って、DNAプローブは長いポリヌクレオチド配列の至る所にハイブリダイズし、その場所から各々合成反応が始まってしまう。その結果、お互いの合成反応を阻害する可能性や、不必要なアーティファクトを生んでしまう可能性が生じる。

しかし3’末端にVN配列を導入したプローブを使用すると、ポリヌクレオチド配列（例えばポリA配列）とcDNA配列の境界部分に正確にハイブリダイズしたプローブのみから合成反応が始まり、一定長の第2鎖cDNAが効率良く合成されるため、不必要なアーティファクトの生成を防ぐことが可能になる。

また特に本発明のプロトコールでは上記(3)の工程の説明で述べたように、磁気ビーズ上に固定化された第1のDNAプローブに直接ポリヌクレオチド配列（例えばポリA配列）が付加した状態のDNA断片が存在する。これらの断片を鋳型にして増幅されるアーティファクトの量をできるだけ減らすためにも、この工程でVN配列を有するプローブを使用することは非常に重要である。

(5)の増幅の工程では、(4)の工程で作製した第2鎖cDNAを鋳型にしてDNA増幅反応（PCR反応）を行う。この時、アーティファクトとして増幅した小断片を除去することが本工程における最も重要なポイントである。特に初めに行う1st PCRの増幅産物の内、200bp以下のアーティファクトとして増幅された小断片を取り除くことが重要である。この小断片が残っていると、次の工程の1st PCR産物を鋳型にして行う2nd PCRの時に、大量の200bp以下の小断片が増幅されてしまい、目的の高分子側の増幅産物量が極端に減少してしまう。

加えて、大量に増幅された小断片はその後の精製でも完全に取り除くことが困難であり、大規模シーケンス時に、アーティファクトの小断片を大量に持ち込んでしまう結果となり、シーケンスの質を大幅に低下させてしまう。

一方、上記Tangらの方法（非特許文献４及び５）では、最終的に増幅されたアーティファクトの小断片はゲル電気泳動後、目的の高分子側の産物をゲルから切り出すことにより取り除いている。しかし、ゲルからの切り出しは切り出す位置を正確に制御することが困難であり、切り出すサンプルの範囲が実験によって異なる、切り出しバイアスが生じる可能性がある。

本発明では各工程の最適化を行い、アーティファクトの量を大幅に減らすことにより、ゲル切り出しを行わずに、ビーズへのDNAの吸着作用を利用した精製法で目的の産物を分離することを可能にした。具体的には、例えばAgencourt AMPure（BECKMAN COULTER）を利用してビーズへDNAを吸着させることができる。この方法では切り出し操作が不要であるため、切り出しバイアスが生じる可能性がない。つまり、増幅時のアーティファクトの削減とビーズへの吸着による精製を組み合わせることにより、切り出しバイアスがなく、しかも200bp以下の小断片をほぼ完全に取り除いた状態で目的の産物を精製することが可能になった（図6）。

もう1つ、本工程で重要なポイントはPCRバイアスの少ない増幅を行うために、増幅反応（PCR）のサイクル数を指数関数的な増幅が起こる回数以下に設定することである。磁気ビーズに固定化された第2鎖cDNAを鋳型にしてPCRを行う1st PCRと溶液中に増幅された1stPCR産物を鋳型にして行う2nd PCRの2段階に分けて、それぞれのステップのPCRサイクル数を低くして増幅反応を行うことにより、バイアスの少ない効率の良い増幅が可能になる（図8）。一方で本発明ではPCR増幅時に増幅効率を阻害する要因を大幅に取り除いたため、1st PCRだけでも少ないサイクル数（20回以下）で十分量（数百ng）の目的産物を増幅することも可能になっている。

以上の工程により、本発明では1又は少数の細胞からバイアスなく十分量の大規模DNAシーケンス用試料を増幅させる方法を実現した。さらに本発明には以下に示すような特徴がある。

本方法では、磁気ビーズに固定化された状態でcDNAライブラリを作製するため、cDNA固定化磁気ビーズを繰り返して鋳型として利用することが可能である。これは増幅を複数回行えるため、より大量の増幅産物を確保することができると同時に増幅した産物の増幅バイアスの評価にも使用できる。

通常1細胞のような微量のサンプルからcDNAを作製し、増幅させる時にはその増幅過程がバイアス無く上手く進んでいるかモニタリングする必要がある。しかしながら、1細胞では元々のサンプル量が微量であるため、cDNAの全量を増幅反応に使用する必要があり、cDNAの一部をモニタリング用に取り出して、cDNAライブラリ中の遺伝子の存在量比を計測することができない。そのため、PCR増幅時にバイアス無く各遺伝子が増幅したかを評価することが困難になる。

ところが磁気ビーズを使用すると、cDNAが磁気ビーズに固定化されているため、磁気ビーズを定量PCRの鋳型として再利用することが可能になる。それにより、PCR増幅前のcDNAと増幅後のPCR産物の比較が可能になり、増幅バイアスが評価できるようになる。

また本方法では磁気ビーズにポリA配列を有するmRNAを捕捉してcDNAライブラリを作製するが、この時、ポリA配列を有しないmicroRNAなどのsmall RNAは磁気ビーズに捕捉されず、溶液中に存在することになる。そのため、この溶液中のmicroRNAを定量PCRで測定すれば、1細胞中のmRNAの網羅的な発現量との関係を調べることが可能になる。従って、本発明のプロトコールは、固体担体にmRNAを捕捉した後の残液中の3'末端ポリA配列を有しないRNAを測定することを含んでもよい。細胞に外来のsiRNAを導入して細胞内のmRNAの発現抑制効果を調べたい場合などにも利用可能である。

続いて、本プロトコールの工程である、(1) cDNA合成、(2) 逆転写反応溶液の除去、(3) ポリA配列付加（単一種ポリヌクレオチド付加）、(4) 第2鎖cDNA 合成、及び(5) 増幅、に関して順を追ってその好適な実施形態を詳細に説明する。

(1) cDNA合成
本工程は、細胞の前処理法と合わせて、1又は少数の細胞の分取、細胞の溶解、mRNAの捕捉、逆転写反応の4つの工程を想定する必要がある。「1又は少数の細胞」とは、1〜100個、好ましくは1〜50個、より好ましくは1〜20個、特に1〜10個、1〜5個、1〜3個、1若しくは2個、特には1個の細胞を意味する。1又は少数の細胞の分取には、顕微鏡下のマニュアル操作で取得する方法があり、MICRODISPENSER（Drummond社）やピコピペット（アルテア技研社）など様々な微量サンプル取得用ピペットが利用できる。また装置を利用して自動で取得する方法としてはセルソーターを始めとする様々な自動細胞分取装置が利用可能である。反応用容器に分取した細胞はその後cDNAライブラリを作製するまでは同一の容器内で続く反応を行い、微量核酸の吸着による損失を最小限にする。この時使用する容器は、MaxyClear tube（Axygen社）やHydrophobic Microcentrifuge Tube（SSI社）などの、核酸低吸着性チューブを使用することが好ましい。また核酸吸着防止に容器の壁面を核酸吸着防止用ポリマーでコートすることも好ましい。

細胞の溶解には、NonidetP-40などの細胞膜を溶解する作用のある界面活性剤が使用できる。その濃度は次の工程の反応を阻害しない範囲で使用する。また例えば、市販のSuperScriptIII CellsDirect cDNA Synthesis System（ライフテクノロジーズ社、以下ライフ社）などの細胞抽出用試薬キットも利用可能である。

mRNAの捕捉には、固体担体にmRNA捕捉用プローブ（第1のDNAプローブ）を固定化して使用する。具体的には磁気ビーズが固体担体として最も望ましく、Dynabeads MyOne streptavidin C1（直径1μm, ライフ社）が望ましいが、Dynabeads M-280や他の磁気ビーズでも利用可能である。さらに、セファロースビースなどの他の材質のビーズや反応チューブの内壁又はメンブレンなども、溶液の洗浄除去ができることを条件に固体担体として利用可能である。固体担体とDNAプローブの固定化はプローブの5’末端を介して行われ、結合方法としては固定化の強さとその効率からビオチン-アビジン結合を介した固定化が最も望ましいが、共有結合を介した他の固定化法も利用可能である。またDNAプローブはLNA（Locked Nucleic Acid, Exiqon社）などの核酸との結合力の高いプローブを使用することも可能である。

固定化する第1のDNAプローブの配列の3’末端には、Tの連続配列（ポリT配列）が15 bp〜35 bp、例えば24 bp付加されている。そのポリT配列の長さはmRNAのハイブリダイゼーション効率を考慮して変えることが可能である。Tの連続配列の5’側には後のPCR増幅反応時にプライマーの鋳型となる第1のタグ配列が付加されている。第1のタグ配列は増幅及び計測対象の産物の中に存在しない塩基配列であれば、特に限定されるものではないが、後のPCR増幅反応時にプライマーダイマーなどが形成されない配列が望ましい。またタグ配列に続くプローブの5’末端には固定化時に固定化担体との間に位置するスペーサーとなる配列を導入してもよい。そのようなタグ配列及び第1のプローブの設計は、当業者に周知である。

本工程では磁気ビーズに固定化する第1のDNAプローブの量が重要なポイントになる。磁気ビーズに固定化するDNAプローブの量は、後の逆転写反応の効率を考えると、1つの磁気ビーズ当たりおよそ2 x 10³分子を超えて10⁵分子、好ましくは3 x 10³分子から10⁵分子、より好ましくは4 x 10³分子から10⁵分子のDNAプローブを固定化することが望ましい。一方、後のPCR増幅の工程を考えると、およそ4 x 10³分子以下の固定化量が増幅の際にアーティファクトを生み出さないため望ましい。よって逆転写及びPCR増幅の両方に最適な固定化量は、磁気ビーズ当たり2 x 10³分子を超えて4 x 10³分子、好ましくは3 x 10³分子から4 x 10³分子、より好ましくは4 x 10³分子になる。ただし、この分子数はその分子数の測定誤差の問題から2倍程度ずれがあっても同等の分子数と考えてよい。また1反応における磁気ビーズの個数はDynabeads MyOne streptavidin C1ではおよそ10⁷個が望ましいが、10⁶個から10⁸個程度まで利用可能である。なお磁気ビーズ1個当たりに固定化する最適なDNAプローブ量はDNAプローブの3’末端にVN配列など、逆転写開始点をmRNAのポリA配列の開始点に特定する効果のある配列を導入すると変化する。この場合、逆転写の効率の観点から磁気ビーズ1個当たり、10⁴分子以上が望ましい。

逆転写の反応には50℃の高温で逆転写反応を行えるSuperScriptIIIを使用することが望ましいが、M-MLVなど他の逆転写酵素を使用することも可能である。その他に、逆転写反応時には各種RNaseインヒビター、さらにT4 gene 32 protein（ロシュ社）などの1本鎖DNA結合タンパク質を加えることが望ましいことが当技術分野で公知である。

(2) 逆転写反応溶液の除去
前工程で使用した逆転写酵素を含む逆転写反応液の除去が本発明において必須の工程であり、その反応液の除去には磁気ビーズの磁気分離反応を利用する。磁気分離の磁石にはNdFeB マグネットを使用すると、シャープに素早い分離が可能であるが、市販のMPC-Sマグネット台（ライフ社）など他の磁石も使用可能である。磁気分離した磁気ビーズの洗浄には、10 mM Tris-HCl pH8.0＋0.1％Tween20を使用するが、磁気ビーズの分散に適したバッファーなら他の溶液でも使用することができる。また磁気ビーズ以外の担体を利用する場合は、遠心操作など他の方法で、反応液を取り除く必要がある。

逆転写反応溶液の完全な除去には磁気分離の洗浄後に、新たなバッファー溶液中で磁気ビーズをしばらく放置することも有効である。この操作により、磁気ビーズに吸着した逆転写反応溶液中の成分を剥がすことができると考えられる。具体的には、GlycineをベースにしたGlysine buffer（67 mM Glysine-KOH, 6.7 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol, pH9.5）を洗浄後の磁気ビーズに加えて37℃で15分間、さらに70℃で10分間の反応を行うことにより、後の増幅効率上昇効果が期待できる。加えるバッファーはGlysine buffer以外でもTris buffer やDW（蒸留水）など磁気ビーズの洗浄効果が期待できるものであれば、他の溶液でも可能である。またこれと同じ考え方で、MPCポリマーなどのタンパク質吸着防止剤等で始めに磁気ビーズを処理しておけば、逆転写反応溶液中の成分のビーズへの吸着が防げるため、同様の効果が期待できる。

(3) 単一種ポリヌクレオチド配列付加（ポリA配列付加）
本工程では、単一種ポリヌクレオチド配列付加（ポリA配列付加）反応とmRNAの分解反応を同時に行う。mRNAの分解にはRNAaseHを使用し、単一種ポリヌクレオチド配列付加（ポリA配列付加）には、例えばTerminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）を使用する。付加するヌクレオチドはA（アデニン）が望ましいが、その他にもC（シトシン）やG（グアニン）に変更することも可能である。この単一種ポリヌクレオチド配列付加反応後には反応溶液を洗浄除去することが好ましい。この洗浄除去には上記(2)に示した時と同様に磁気ビーズの磁気分離反応を利用して行う。

(4) 第2鎖cDNA（2nd strand cDNA）合成
第2鎖cDNAの合成に用いる第2のDNAプローブは、5’側にPCRの鋳型となる第2のタグ配列、それに続く上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列（例えば、ポリA配列に相補的なTの連続配列）、さらにその3’末端に2塩基のランダム配列からなるDNAプローブを使用することが望ましい。第2のタグ配列は上記(1)で述べた第1のプローブ（No.1）とは異なる配列のタグ配列を使用する必要がある。それ以外であれば、増幅及び計測対象の産物の中に存在しない塩基配列であれば、特に限定されるものではないが、後のPCR反応時にプライマーダイマーなどが形成されない配列が望ましい。このようなプローブの設計は、当業者であればプローブ設計ソフトウエアなどを用いて容易に行うことができる。

第2のプローブは、例えばTの連続配列が24 bp付加されているものとすることができるが、そのT配列の長さはmRNAのハイブリダイゼーション効率を考慮して変えることが可能である。この第2のプローブ（No.2）では、3'末端に2塩基のランダム配列を付加することが好ましい。そのようなランダム配列としては、例えばVN配列（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）を用いることができる。このVN配列の代わりに、V配列だけの1塩基を付加したプローブも適用可能である。またこの第2鎖cDNA合成の工程からは鋳型となる磁気ビーズを別々のチューブに分割して、それぞれのチューブで反応を行い、DNA合成時の複製エラーの蓄積を分散させることが望ましいが、分割せずに全ての磁気ビーズを鋳型にして1本のチューブで反応を行うことも可能である。

(5) 増幅
本工程では、前工程で磁気ビーズ上に作製した第2鎖cDNAを鋳型にしてDNA増幅反応（PCR増幅反応）を行う。プライマーとしては、上記の第1のプローブ（No.1）と同一の配列を有するUP1プライマーと第2のプローブ（No.2）のVN配列部分以外は同一の配列を有するUP2プライマーを使用することができる。あるいは、第1及び第2のプローブの第1及び第2のタグ配列部分のみからなるプライマーも使用可能である。またプライマーに存在するポリT配列は短くすることも可能である。すなわち、少なくとも第1のタグ配列を含むプライマーを用いるか、又は少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー及び少なくとも第2のタグ配列を含むプライマーを用いて、DNA増幅反応を行う。

本プロトコールでは少ないバイアスで十分量の増幅産物を得るために、2段階（1st PCR、2nd PCR）に分けてPCRを行うことが望ましい。

1st PCRは第2鎖cDNAを合成した磁気ビーズを鋳型にして行う。1st PCR反応のサイクル数はPCR反応の指数関数的な増幅が起きているサイクル数以下となるようにし、増幅バイアスを発生させない条件に設定する必要がある。1st PCRのみで十分量の増幅が見られる場合は1st PCRのみでもよい。また1st PCRでは、上記のUP1プライマーのみを反応溶液に加えて使用する。それによりPCR増幅の直線性が期待できるが、UP1プライマーとUP2プライマーの両方を加えて使用することも可能である。

2nd PCRは1st PCR産物の一部を鋳型にして行う。この時、スピンカラム等で1st PCR産物を精製してから鋳型に使用する方が2nd PCRの増幅効率が向上するため望ましい。鋳型に使用する1st PCR産物の量は2nd PCRの増幅具合により適時決定する。また、2nd PCRのサイクル数も1st PCRと同様にPCR反応の指数関数的な増幅が起きているサイクル数以下に収める必要がある。また2nd PCRではUP1プライマーとUP2プライマーの2種類を加えてPCRを行うが、この時使用するプライマーの5’末端はアミノ修飾しておくことが望ましい。増幅されたDNA産物はこの後、断片化と大規模シーケンス用のアダプターの付加という工程が必要になる。このアミノ修飾により、DNA産物の両末端部分にアダプターが結合しなくなり（断片化された内部配列のみに結合する）、余計なタグ配列部分が大規模シーケンスで読まれるのを防ぐ効果が出てくる。従って、後のアダプター結合を防げるのであれば、他の修飾法でも適用可能である。

増幅されたDNA産物からは目的外の小断片からなるアーティファクト増幅産物を取り除く必要がある。DNA増幅産物のアガロース電気泳動を行い、500bpから3000bp程度の領域を切り出して精製することにより、小断片を取り除くことが可能である。また、電気泳動を行わずに、ビーズへの吸着（例えばAgencourtAMPureなどを用いる）を利用して小断片を取り除く方が、切り出す位置のずれにより生じる切り出しバイアスを防げるため、より望ましい。これら以外にもカラムによる小断片の除去など、様々な方法を組み合わせて、DNA増幅産物の精製を行うことが可能である。

以上5つの工程を経て作製したDNA産物は、その後、各シークエンサーの仕様に合わせて、断片化、シーケンサ用アダプターの付加などの過程を経て、大規模シーケンサ用サンプルとして使用できるようになる。

上述した本発明のプロトコールは、キットを用いることにより、より手間を省いて簡潔に行うことができる。従って、本発明は、上述した本発明のプロトコールを実施するためのキット（以下、「本キット」ともいう）を提供する。すなわち、細胞中のmRNAからcDNAを増幅するためのキットであって、第1のタグ配列及びポリT配列からなる第1のプローブが固定化された固体担体と、cDNA配列の3'末端に1種類のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列を付加するための手段と、第2のタグ配列及び上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む第2のDNAプローブと、少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー、又は少なくとも第1のタグ配列を含むプライマー及び少なくとも第2のタグ配列を含むプライマーとを含むキットを提供する。

本キットにおいて、固体担体は磁気ビーズであることが好ましい。また、一実施形態において、固体担体1個当たり4 x 10³分子以下の量の第1のDNAプローブが固定化されている。別の実施形態において、固体担体1個当たり2 x 10³分子を超えて10⁵分子以下の量の第1のDNAプローブが固定化されている。また、DNAプローブの3’末端にVN配列など、逆転写開始点をmRNAのポリA配列の開始点に特定する効果のある配列を導入した場合、固定化担体1個当たり10⁴分子以上の量の第1のDNAプローブが固定化されている。

本キットにおいて、1種類のヌクレオチドはアデニン（A）であることが好ましい。また、ポリヌクレオチド配列を付加するための手段としては、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を用いることができる。

本キットにおいて、第2のDNAプローブは、第2のタグ配列及びポリヌクレオチド配列に相補的な配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群とすることができる。ここで、ランダム配列としては、限定されるものではないが、VN（VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである）を用いることができる。

本キットはさらに、本発明のプロトコールにおいて使用される試薬類、例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、dNTPs、ビーズへの吸着を利用した精製手段（AgencourtAMPureなど）、洗浄バッファー、細胞溶解液など、並びに本発明のプロトコールを実施するための説明書を含んでもよい。

上述した本発明のプロトコール及びキットの用途は、生物・生物化学等のバイオ分野及び検査・診断等の医療分野における計測技術であり、1細胞又は数個の細胞を対象とした遺伝子診断や創薬に必要な細胞情報を得るための計測技術などが含まれる。cDNAから均一に増幅された試料は大規模DNAシーケンサで配列解析するための試料として使用することが可能である。

以下、図面を参照して本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。

［実施例１］単一細胞からの大規模シーケンス用サンプルの調製
本実施例では、本発明のプロトコールの一例を説明する。

＜磁気ビーズへのプローブの固定＞
5’末端に2分子のビオチンを付加したUP1プローブ（配列番号1）の磁気ビーズ（Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Dynal社）への固定化を行った。始めに120μLの磁気ビーズ（約1.2x10⁹ beads）を2 mLのチューブ（エッペンドルフ社）に移した後、120μLの1xB&W buffer（1M NaCl, 0.5mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH8.0, 0.1％Tween20）を加えて混合した。続いてチューブをマグネットにセットして、磁気ビーズをチューブの壁面へ分離した後、上清を除去した。そこに120μLの1xB&W bufferを加えて磁気ビーズを再懸濁した。この操作を後2回繰り返して磁気ビーズを洗浄して120μLの磁気ビーズ溶液を作製した。

次に4μMのUP1プローブ（IDT社）2μL（約4.8 x 10¹²分子）を118μLの1xB&W bufferに加えて混合した。その溶液から15μLずつ取り出して、ボルテックスで攪拌した状態の磁気ビーズ溶液に順次添加した。室温で1時間、シェーカーで混和しながら、UP1プローブを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをマグネットで分離し、上清を除去した後、240μLの1xB&W bufferを加えて混和した。この分離・除去作業を3回行繰り返し、磁気ビーズを洗浄した。さらに240μLの10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液で同様に3回洗浄作業を行った。最後に120μL の10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液に磁気ビーズを懸濁した後、4℃で使用まで保存した。（約4 x 10³分子/磁気ビーズのプローブが固定化されたことになる）。

UP1 プローブ：
5’-dual-biotin-ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号1）。

＜細胞溶解液の調製＞
下記の濃度になるように細胞溶解液を0.2mLの低吸着チューブ（Axygen社）に調製した。

表1中：
#1 UP1-beads :UP1プローブが磁気ビーズ1個当り約4 x 10³コピー固定化されたものを1μL使用（10⁷個）。磁気分離して上清1μLを除去した後、上記表の組成の細胞溶解液を加える。
#2 必要な場合は適時加える。Array Control Spots and Spikes（Ambion社）を使用して、RNA spike 2、3、6及び8の4種類を作製し、それぞれ1当量あたり10、50、200及び1000コピーになるように100当量/μLのストック溶液を作製する。

＜単一細胞の採取＞
25cm²培養用フラスコ（BD-Falcon社）で培養したヒト大腸癌細胞HCT116（ATCC）から培養液（Advanced DMEM＋10％FBS, Invitorogen社）を取り除き、3 mLのPBS(-)溶液（Invitorogen社）で洗浄した後、1 mLの0.25％Trypsin-EDTA（Invitorogen社）を加えて37℃、2分間反応させ、細胞をフラスコの底面から解離させた。4 mLの培養液を細胞液に加えて懸濁し、トリプシンを不活化した後、15 mLの遠沈管に移し、100 rpm、3分間遠心した。上清を取り除いた後、1 mLのPBS(-)液で細胞ペレットを再懸濁し、37℃のインキュベーターで実験に使用するまで保存した。

96ウェルプレート（BD-Falcon社）の上蓋を逆さにして、その窪みに100μLのPBS(-)液のドロップを複数個作製した。それらのドロップで細胞を数段階希釈し、最終的には低吸着性のHydroCell 6cm dish（CellSeed社）上に単一細胞の取得に適切な濃度になるように細胞液のドロップを作製した。

顕微鏡下のステージにThermoPlate（CellSeed社）を設置し、プレートが37℃になるようにセットした。そのプレートの上に先ほど細胞液のドロップを作製したHydroCell dishを置き、顕微鏡下でMICRODISPENSER（Drummond社）を使用しながら、単一細胞の取得を行った。本操作で採取した単一細胞を含む約0.5μLのPBS(-)液を上記の細胞溶解液4.06μLに加えて合計で約4.55μlになる溶解液を作製した。次にその溶解液を10000rpmで15秒間遠心した後、70℃で90秒間反応させて細胞を溶解した後、氷上で保存した。

＜逆転写反応と洗浄＞
上記の前工程で作製した細胞溶解後の反応液4.55μLに下記の組成に調製した逆転写溶液0.45μLを加えた。合計で5μLになった混合液は、50℃30分間、70℃10分間の反応後、遠心してスピンダウンした後、氷上に1分間放置した。次にこの反応チューブをNdFeB マグネット（日立）に接触させて、磁気ビーズをチューブの壁面に凝集させた。上清を除去し、マグネットからチューブを離した後、50μLの10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液を加えて、磁気ビーズを混和し、同様にマグネットによる分離を行った。この作業はさらにもう一回繰り返し、磁気ビーズを洗浄した。最後に6μLの10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液で磁気ビーズを混和した。

＜ポリA付加反応と洗浄＞
上記の前工程で作製した磁気ビーズ混和液6μLに下記の組成のポリA付加溶液6μLを加えた。合計で12μLになった混合液を37℃で15分間反応させて、RNAの分解とcDNAの3’末端へのポリA配列の付加を行った。続いて70℃で10分間反応させて酵素を不活化してから氷上に放置した。次に上記と同様に磁気分離による上清の除去と50μLの10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液での磁気ビーズの洗浄操作を1回行った。最後に12μLの10 mM Tris pH8.0＋0.1％Tween20溶液で磁気ビーズを混和した。

＜2nd strand cDNAの合成＞
上記の前工程で作製した磁気ビーズ混和液12μLの内、3μLを下記の2nd strand cDNA合成溶液19μL（0.2 mLの低吸着チューブに調製）に加えて、合計で22μLになるように調製した。残った磁気ビーズ混和液（残量9μL）も同様に2nd strand cDNA合成溶液に3μL加えて、合計4本のチューブ分のサンプル溶液を調製した。これら4本のチューブを95℃で3分間、44℃で2分間、72℃で6分間反応させた後4℃で放置した。

UP2-VNプローブ：
5’-ATATCTCGAGGGCGCGCCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（配列番号2）
〔配列中、VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである〕。

＜1st PCR増幅と精製＞
上記の前工程で作製した2nd strand cDNA合成後の反応液22μLに対して、下記に示した1st PCR反応液19μLを加えて、合計41μLの混合液を作製した。この混合は4本全てのチューブで行った。混合液を作製した4本のチューブは95℃で3分間反応後、95℃30秒間、67℃1分間、72℃6分間（サイクル毎に+6秒）のサイクルを20回繰り返した後、4℃で保存した。

増幅したPCR産物はAgencourt AMPure XP キット（ベックマン・コールター社）を使って精製した。41μLのPCR産物4本分の164μLに対して、AMPure XP キットで定められている200bp以下の断片を取り除く条件である0.6x量のAMPureXP試薬98.4μLを混合して、キットの使用説明書に従って精製を行い、最終的に50μLの溶出液を得た。

UP1 primer：
5’-ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号3）。

＜2nd PCR増幅＞
上記の前工程で作製した精製1st PCR産物溶液50μLの内、1μLを使用し、以下に示す2nd PCR反応溶液をチューブ4本分作製した。続いて95℃で3分間反応後、95℃30秒間、67℃1分間、72℃6分間（サイクル毎に＋6秒）のサイクルを15回繰り返した後、4℃で保存した。

Amine-UP1 primer：
5’-NH₂- ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号4）
Amine-UP2 primer：
5’-NH₂- ATATCTCGAGGGCGCGCCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号5）。

＜2nd PCR産物の精製＞
作製した2nd PCR産物はAgencourt AMPure XPキットを使って精製した。50μLのPCR産物4本分の200μLに対して、AMPure XPキットで定められている200bp以下の断片を取り除く条件である0.6x量のAMPureXP試薬120μLを混合して、キットの使用説明書に従って精製を行い、最終的に50μLの溶出液を得た。

続いてこの50μLの溶出液をPCR purification kit（JENA社）で付属の説明書に従いながら精製し、最終的におよそ50μLのDNA断片溶液を得た。DNA断片1μLをバイオアナライザー電気泳動装置（Agilent社）で解析した。1細胞のHCT116から作製した最終DNA増幅産物（2nd PCR産物を精製）の電気泳動パターンの結果を図6に示す。その結果から、低分子側のアーティファクト断片が取り除かれ、大規模シーケンサ用試料として使用する目的の産物が得られていることが判明した（図6）。また精製後の最終産物のDNA量を測定すると、およそ700ngから1200ngのDNA断片が得られることが判明した。

［実施例２］増幅効率及び増幅バイアスの評価
実施例１で示したプロトコールの各工程におけるDNAの増幅効率及び増幅バイアスを評価するために、定量PCR法で各遺伝子の量を測定した。定量測定にはApplied Biosystems社の7900HT Fast Real-Time PCR system装置を使用した。始めに実施例１のプロトコールに準じて、1細胞のHCT116からcDNAライブラリを作製し、5種類の遺伝子（EEF1G、B2M、SDHA、TBP、GUSB）のcDNA量を測定した。この5種類の遺伝子の定量PCRにはMGB蛍光プローブを使用したTaqMan Probe法を用いた。各々の遺伝子に対するMGB 蛍光プローブとPCRプライマーは下記の配列番号6から20に示した。定量PCRの反応試薬にはPremix Ex Taq（タカラバイオ社）を使用した。付属マニュアルに沿って反応試薬を調製し、標準DNA試料からの検量線を用いて定量する絶対定量法により、各cDNAの量を測定した。

プライマー配列：
EEF1G qPCR-F: 5’- TTTCCGCTGAGTCCAGATT-3’ (配列番号6)
EEF1G qPCR-R: 5’- CCCTGATTGAAGGCTTTG-3’ (配列番号7)
EEF1G MGB Probe: 5’-FAM-TGGACTACGAGTCATACACA-MGB-3’ (配列番号8)
B2M qPCR-F: 5’- GCATCATGGAGGTTTGAAG -3’(配列番号9)
B2M qPCR-R: 5’- TATAACCCTACATTTTGTGCAT -3’ (配列番号10)
B2M MGB Probe: 5’-FAM-CGCATTTGGATTGGATGA-MGB-3’ (配列番号11)
SDHA qPCR-F: 5’- CACTGGGAAGGTCACTCTG -3’ (配列番号12)
SDHA qPCR-R: 5’- TTCTGTCATCACCACATCTTG -3’ (配列番号13)
SDHA MGB Probe: 5’-FAM-CCATTCGCTCCTACTGAT-MGB-3’ (配列番号14)
TBP qPCR-F: 5’- ACCCACCAACAATTTAGTAGTTAT -3’(配列番号15)
TBP qPCR-R: 5’- GCTCTGACTTTAGCACCTGTTA -3’ (配列番号16)
TBP MGB Probe: 5’-FAM-AGCCAGAGTTATTTCCTGG-MGB-3’ (配列番号17)
GUSB qPCR-F: 5’- TGAACAGTCACCGACGAGAG -3’(配列番号18)
GUSB qPCR-R: 5’- TCCAAACATTGTGACTTGGCTAC -3’ (配列番号19)
GUSB MGB Probe: 5’-FAM- CAGCGTTCCTTTTGCGAG -MGB-3’ (配列番号20)。

次に上記と同様に1細胞のHCT116からcDNAライブラリを作製し、1st PCR及び2nd PCRの工程まで反応を進めた。これら1st PCRの産物及び2nd PCRの産物に対して上記と同様に定量PCRを行い、各々5種類の遺伝子のDNA量を測定した。

図7は、5種類の遺伝子のcDNAから1st PCRにおける増幅率（1st PCR／cDNA）、1st PCRから2nd PCRにおける増幅率（2nd PCR／1st PCR）、そしてcDNAから2nd PCRにおける増幅率（2nd PCR／cDNA）を示している。cDNAは5つのサンプル分の平均値を、1st PCR及び2nd PCRは3つのサンプル分の平均値を用いて計算している。その結果、5つの遺伝子（EEF1G、B2M、SDHA、TBP、GUSB）の増幅率に大きな差は生じていないことが確認できる。

図8では、5つの遺伝子間での増幅率のばらつきを評価するために、各遺伝子の増幅率が、5つの遺伝子の増幅率の相乗平均に対して何倍差があるかを示している。その結果、最も増幅のばらつきが大きいと予想されるcDNAから2nd PCRまでの過程であってもその倍率は0.5倍から1.5倍の間に収まっており、本発明のプロトコールが非常に増幅バイアスの少ない方法であることが判明した。

［実施例３］磁気ビーズ固定化プローブ量の最適化
mRNAの捕捉用に磁気ビーズ上に結合させるUP1プローブ量を最適化するために、UP1プローブの固定化量を変えて磁気ビーズを作製し、逆転写反効率及びcDNA増幅効率を測定した。

実施例１に示した方法に従い、磁気ビーズにUP1プローブをビオチン-アビジン結合を介して固定化した。この時、磁気ビーズと反応させるUP1プローブの量は200pmol（約1.2 x 10¹⁴分子）、20pmol、8pmol、4pmolの4種類を用いて行った。これらのプローブ量で反応させると、磁気ビーズ当たりそれぞれ1 x 10⁵、1 x 10⁴、4 x 10³、2 x 10³分子のUP1プローブが固定化される計算になる。これら4種類のUP1プローブ固定化磁気ビーズ10⁷個を使用して、mRNA 2pgを捕捉し、逆転写反応を行い、その磁気ビーズ上に存在するEEF1G遺伝子の量を定量PCR法で測定した（図2A）。その結果、1 x 10⁵から4 x 10³分子/ビーズのプローブ量では逆転写量に変化は無かったが、2 x 10³分子/ビーズまで固定化量を減少させると逆転写量が低下することが判明した。そのため、ビーズ1個当たり2 x 10³分子を超える量、例えば3 x 10³分子以上のプローブ量を使用することが好ましいことがわかった。

またUP1プローブの3’末端にVN配列を導入したDNAプローブ(UP1-VNプローブ)を用いて同様に磁気ビーズへの最適な固定化量を求めた（図９）。3種類の遺伝子（EEF1G, B2M,TBP）で検証した結果UP1VNプローブでは磁気ビーズ1個当たり10⁴分子以上を固定化すると逆転写効率が高い事が判明した。

UP1-VNプローブ
5’-dual-biotin- ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（配列番号21）
〔配列中、VはA又はG又はCであり、NはA又はG又はC又はTである。〕
そこで次に、逆転写量の低下が見られなかった1 x 10⁵、1 x 10⁴、4 x 10³分子/ビーズ由来のサンプルを実施例１の方法に従い、2nd PCRの工程まで行い増幅産物を得た。それらの増幅産物中に含まれるEEF1G遺伝子量を定量PCR法で測定し、増幅効率を評価した（図2B）。その結果、磁気ビーズ上に固定化したプローブ量が最も多い1 x 10⁵分子/ビーズ由来のPCR産物ではEEF1G遺伝子の増幅量が最も少なく、逆に固定化したプローブ量が最も少ない4 x 10³分子/ビーズ由来のサンプルでは増幅量が最も多い結果となった。

［実施例４］逆転写反応溶液の次の工程への持込みが与える影響の検証
実施例１のプロトコールで逆転写反応溶液の除去・洗浄操作を行わずに次の工程に逆転写反応溶液を持ち込んだ場合に発生する影響を調べた。実施例１に示した方法に準じて2pgのmRNAを用いて、逆転写反応の工程までを行った。その後、通常通りに逆転写反応溶液の除去・洗浄操作を行うサンプルと、この操作を行わないサンプルとに分けて、続くポリA付加反応、1st PCRによる増幅へと本プロトコールの工程を進めた。そして逆転写時と、それぞれの条件の1st PCR（洗浄操作無し又は有り）時のEEF1G遺伝子の量をリアルタイムPCR法で測定し、DNA増幅量を比較した。

その結果、逆転写反応溶液の除去を行わなかったサンプルでは、その除去を行ったサンプルに比べて、EEF1G遺伝子の1st PCRの増幅量が大幅に減少していることが明らかとなった（図3）。

［実施例５］エキソヌクレアーゼI処理がPCR増幅反応に与える影響の検証
前工程でのエキソヌクレアーゼIの使用が、後の工程のPCR増幅反応に与える影響を調べるために、未反応の逆転写用プローブを除去する工程でエキソヌクレアーゼI処理を行い、その後のPCR増幅効率を調べた。

実施例１のプロトコールにおいて、逆転写用UP1プローブを磁気ビーズに固定化せずにフリーの状態で逆転写反応を行った。逆転写の鋳型にはHCT116由来のmRNA 20pgを使用した。逆転写後、5μLの逆転写反応溶液に1μLのエキソヌクレアーゼI（0.5U/μL）を添加して、37℃で30分間反応させた。80℃で25分間処理して、エキソヌクレアーゼIを失活させた後、続けて実施例１に示した通常のRNA分解、ポリA付加反応、1st PCRの工程を進めた。また、エキソヌクレアーゼIを加える直前の逆転写直後のサンプルと、エキソヌクレアーゼIを加えて、1st PCRまで進んだサンプルとに含まれる4種類の遺伝子（EEF1G、B2M、TBP、SDHA）の量を定量PCR法で測定した。

図4には、EEF1Gの量を100％とした場合の残りの3種類の遺伝子の相対量を逆転写時、及びエキソヌクレアーゼ処理後の1st PCR増幅時に測定した値を示している。図4の縦軸は各遺伝子の増幅量の相対値を示しており、同じ実験で測定したEEF1G遺伝子の増幅量を100％として換算している。その結果、B2M遺伝子は他の遺伝子と比べて、エキソヌクレアーゼI処理を行った場合には1st PCR時の増幅率が大きく低下していた。そのため、エキソヌクレアーゼI処理によって増幅バイアスが発生している可能性が示唆された。

［実施例６］VN配列付加プローブを用いたプロトコールの検証
UP2 プローブ（No.2）の3’末端に2塩基のVN配列を付加したUP2-VNプローブを使用して2nd strand cDNA合成を行い、続くPCR増幅へ与える影響を調べた。実施例１に示した2nd strand PCR合成の工程で、VN配列を有するUP2-VNプローブ（配列番号2）又はVN配列を有しないUP2 プローブ（配列番号21）（シグマ社）を使用して2nd strand cDNAの合成を行い、最終的に1st PCRによる増幅産物を得た。増幅したPCR産物は実施例１で示したAgencourt AMPure XPを使用して精製した。精製したPCR産物の一部をバイオアナライザー（Agilent社）で電気泳動し、その増幅産物の分布を調べた。

VN配列を有しないプローブを用いて増幅した産物では（図5A）、およそ100bp付近（泳動時間50〜60s付近）に取り除かれずに残っている多量のアーティファクトの小断片が存在した。一方、VN配列を有するプローブを使用した例では（図5B）、100bp付近の小断片は完全に取り除かれ、目的の高分子側の断片のみが回収できていることが明らかとなった。

UP2 プローブ：
5’-ATATCTCGAGGGCGCGCCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号22）。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加、削除、置換をすることが可能である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参照により本明細書にとり入れるものとする。

配列フリーテキスト

配列番号1〜22：人工配列（合成DNA）

Claims

細胞中のmRNAからcDNAを増幅する方法であって、
（1）1つの反応容器内で、上記細胞由来のmRNAを、固体担体に固定化された第1のタグ配列及びポリT配列からなる第1のDNAプローブで捕捉し、逆転写反応により該mRNAから第1鎖cDNAを合成する工程、
（2）上記固体担体上に合成された第1鎖cDNAを反応容器内に残し、反応試薬を上記反応容器から除去する工程、
（3）上記固体担体上の第1鎖cDNAの3'末端に1種類のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列を付加する工程、
（4）上記ポリヌクレオチド配列が付加されたcDNAに、第2のタグ配列及び上記ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含む第2のDNAプローブをハイブリダイズさせて、第2鎖cDNAを合成する工程、
（5）固体担体上に合成された第2鎖cDNAを鋳型としてDNA増幅反応を行う工程
を含み、第1のDNAプローブのDNA分解酵素反応による分解除去工程を含まないことを特徴とする方法。
固体担体が磁気ビーズである、請求項1に記載の方法。
工程（1）において、固体担体1個当たり4 x 10³分子以下の量の第1のDNAプローブを用いる、請求項2に記載の方法。
工程（1）において、固体担体1個当たり2 x 10³分子を超えて10⁵分子以下の量の第1のDNAプローブを用いる、請求項2に記載の方法。
工程（1）において、第1のDNAプローブが、第1のタグ配列及びポリT配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群であり、第1のDNAプローブを固体担体1個当たり10⁴分子以上の量で用いる、請求項1又は2に記載の方法。
工程（2）において、除去する反応試薬が逆転写酵素を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
工程（3）において、ヌクレオチドがアデニン（A）である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
工程（3）のポリヌクレオチド配列付加反応後に、反応試薬を除去する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
工程（4）において、第2のDNAプローブが、第2のタグ配列及びポリヌクレオチド配列に相補的な配列に続いて、3'末端側に2塩基のランダム配列を含むプローブ群である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
工程（5）において、固体担体上に合成された第2鎖cDNAの末端に存在する第1のタグ配列、又は第1のタグ配列及び第2のタグ配列を利用してDNA増幅反応を行う、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
工程（5）において、増幅反応のサイクル数を指数関数的な増幅が起こる回数以下にする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
増幅されたDNA産物から、ビーズへのDNA吸着を原理として該DNA産物を分離精製する方法により、200bp以下のDNA産物を分離除去することをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
第1鎖DNAが固定化された固体担体を繰り返して使用してDNA増幅反応を行うことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
工程（2）において、反応試薬を除去した後に、固体担体を新たなバッファー溶液中で放置する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により増幅されたDNA産物の量から、細胞中のmRNA量を測定することを含む、細胞中のmRNA量を測定する方法。