JP5923466B2 - Ｃｎｓ状態の治療 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡ干渉により中枢神経系（ＣＮＳ）の病的状態に関与する遺伝子の発現および／または活性を調節する組成物を鼻腔内投与することにより上記の状態を治療するための方法および組成物に関する。本発明の組成物は、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）および関連する化合物を含む。好ましい実施形態において、タウ、ハンチンチン、アセチルコリンエステラーゼおよびＣＮＳのこれらのまたはその他の遺伝子の変異対立遺伝子を標的にする、鼻腔内送達されるｓｉＮＡ分子は、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病および／またはパーキンソン病のようなＣＮＳの疾患、ならびに特にＣＮＳの遺伝子の変異に関連する先天性疾患の治療のための医薬品の調製において有用である。

遺伝子発現を調節するツールとしてのＲＮＡｉ
ＲＮＡ干渉とは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。１９９０年代の初めに植物においてこの現象が発見された後に、Ａｎｄｙ ＦｉｒｅおよびＣｒａｉｇ Ｍｅｌｌｏは、ｄｓＲＮＡが、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）において、非常に効率のよい形で遺伝子発現を特異的かつ選択的に阻害したことを示した（Ｆｉｒｅら、１９９８）。第１の鎖（センスＲＮＡ）の配列は、標的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の対応する領域の配列と一致していた。第２の鎖（アンチセンスＲＮＡ）は、ｍＲＮＡに相補的であった。得られたｄｓＲＮＡは、対応する一本鎖ＲＮＡ分子（特にアンチセンスＲＮＡ）よりも、数桁効率がよいことがわかった。

ＲＮＡｉのプロセスは、酵素ＤＩＣＥＲがｄｓＲＮＡと遭遇し、それを低分子干渉ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡと呼ばれる小片に切り刻むときに開始する。このタンパク質は、ＲＮアーゼＩＩＩヌクレアーゼファミリーに属する。タンパク質の複合体は、これらのＲＮＡの残渣をまとめ、それらのコードを案内として用いて、標的ｍＲＮＡのような、マッチする配列を有する細胞内の任意のＲＮＡを探し出して破壊する（ＢｏｓｈｅｒおよびＬａｂｏｕｅｓｓｅ、２０００；ならびにＡｋａｓｈｉら、２００１を参照されたい）。

遺伝子ノックダウンのためにＲＮＡｉを用いる試みにおいて、哺乳動物細胞は、このアプローチの使用を妨げうる、ウイルス感染に対する種々の進んだ防御機構を有することが認識された。実際に、ウイルスｄｓＲＮＡの非常に低いレベルの存在は、インターフェロン応答を引き起こし、全体的な翻訳の非特異的抑制をもたらし、これは次いでアポトーシスを引き起こす（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９７、ＧｉｌおよびＥｓｔｅｂａｎ、２０００）。

２０００年に、ｄｓＲＮＡは、マウスの卵細胞および初期胚において３つの遺伝子を特異的に阻害することが報告された。翻訳の停止、およびそれによるＰＫＲ応答は、胚が発達し続けたので観察されなかった（ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００）。Ｒｉｂｏｐｈａｒｍａ ＡＧ（ドイツクルムバッハ）での研究により、短い（２０〜２４塩基対）ｄｓＲＮＡを用いて、急性期応答を開始することなくヒト細胞において遺伝子のスイッチを消すことにより、哺乳動物細胞でのＲＮＡｉの機能が示された。他の研究グループにより行われた同様の実験で、これらの結果が確認された（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１；Ｃａｐｌｅｎら、２００１）。種々の正常および癌のヒトおよびマウスの株化細胞で試験すると、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が、それらの対応するｓｉＲＮＡと同様に効率よく遺伝子の発現を停止させうることが決定された（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００２）。最近、低分子ＲＮＡ（２１〜２５塩基対）の別の群が、遺伝子発現の下方制御を媒介することが示された。これらのＲＮＡ、すなわち低分子一時調節ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＲＮＡ；ｓｔＲＮＡ）は、線虫において発達の間に遺伝子発現の時期を調節する（総説として、ＢａｎｅｒｊｅｅおよびＳｌａｃｋ、２００２、ならびにＧｒｏｓｓｈａｎｓおよびＳｌａｃｋ、２００２を参照されたい）。

科学者らは、線虫、ショウジョウバエ、トリパノソーマ類および他の無脊椎動物を含むいくつかの系においてＲＮＡｉを用いている。いくつかのグループは、最近、異なる哺乳動物株化細胞において（特にＨｅＬａ細胞において）、タンパク質生合成の特異的抑制を示しており、このことは、ＲＮＡｉがｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子サイレンシングのために広く用い得る方法であることを示している。これらの結果に基づいて、ＲＮＡｉは、急速に、遺伝子の機能の確認（同定および割り当て）のためのよく認識されたツールになってきている。短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いるＲＮＡｉは、部分的にしか配列決定されていない遺伝子の機能の理解をもたらす。

最近、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔらは、「アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）」と呼ばれる特別に工学的に作製された化合物のクラスが、遺伝子発現を調節するＲＮＡの非コード小片であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の作用を効果的に抑えうることを示している（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００５）。

ｓｉＮＡ生成物の鼻腔内送達
ウイルスベクター、ポリマー、界面活性剤または賦形剤を用いる肺への核酸のエアロゾル送達は、肺疾患の治療のために記載されている。鼻腔内送達のために適切な核酸は、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含めて提案されている（ＵＳ２００５／０２６５９２７およびＷＯ２００５／１１５３５８を参照されたい）。

肺へＲＮＡｉ誘発薬剤を送達するための好ましい物質は、カチオンポリマー、修飾カチオンポリマー、脂質および導入に適する界面活性剤を含む（ＵＳ２００５０００８６１７を参照されたい）。

ＣＮＳへの送達
ＣＮＳ疾患の治療のための鼻腔内送達は、ガランタミンならびにガランタミンの種々の塩および誘導体のようなアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を用いてのみ達成されていた（例えばＵＳ２００６００３９８９、ＷＯ２００４／００２４０２、ＷＯ２００５／１０２２７５を参照されたい）が、低分子干渉ＲＮＡをＣＮＳ内に放出することによる神経変性障害の治療は、カテーテルを外科的に埋め込むことにより、以前に行われていた（例えばＷＯ２００５／１１６２１２を参照されたい）。ＷＯ０２／０８６１０５は、鼻腔に端を発する神経路を介してＣＮＳにオリゴヌクレオチドを送達する方法を記載している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が検討されているが、ＲＮＡ干渉についての言及はない。さらに、この文献には、送達されたオリゴヌクレオチドの生理活性についての開示がない。静脈内投与されたｓｉＮＡが、血液網膜関門を横切って、眼において遺伝子の発現を調節することがさらに示されている（ＷＯ０３／０８７３６７、ＵＳ２００５／０２２２０６１）。ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＰＩＮ−１、プレセニリン１（ＰＳ−１）および／またはプレセニリン２（ＰＳ−２）のようなアルツハイマー病に関与する所定の遺伝子の発現の調節、ならびにハンチンチンまたはアタキシン−１のようなハンチントン病に関与する遺伝子の発現の調節は、細胞培養と、くも膜下腔内および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの埋め込み、血液脳関門の化学的または浸透圧的開放、あるいは脳動脈系（すなわち、線条体、皮質）への直接注入または潅流を含む方策によるｉｎ ｖｉｖｏとの両方において、ｓｉＮＡを用いて既に達成されている。例えばＷＯ２００５／００３３５０、ＵＳ２００５／０４２６４６およびＧＢ２４１５９６１を参照されたい。

ＲＮＡｉによるタウ標的
タウは、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む年齢に関連する認知症の遺伝性および後天性の形において中心的な役割を有する（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２；Ｌｅｅら、２００１；Ｍｕｌｌａｎら、１９９２；Ｐｏｏｒｋａｊら、１９９８；Ｈｕｔｔｏｎら、１９９８）。ＡＤは、２つの主な異常な特徴：アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断に由来するベータ−アミロイド（ＡＰ）を含む老人斑；および糸状タウタンパク質を含む神経原繊維変化を特徴とする。ＡＤの希な遺伝性の形は、散発性および遺伝性の両方のＡＤの全ての形の病因において、ＡＰ生成についての必須の役割を明らかにしている（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２）。家族性ＡＤの原因であることが知られている３つの遺伝子である、ＡＰＰ、プレセニリン１およびプレセニリン２をコードする遺伝子における変異は、神経毒性ベータ−アミロイドの生成を増進するように主に働く（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２）。

神経原繊維変化の主要な成分であるタウもまた、ＡＤの病因において重要な役割を演じる（Ｌｅｅら、２００１）。タウの変異は、類似の優性遺伝性神経変性疾患である、第１７染色体に関連するパーキンソン症を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）を引き起こす。ＦＴＤＰ−１７において、タウの変異は、タウタンパク質の配列を変化させるか、または異常なスプライシングを導く（Ｌｅｅら、２００１；Ｌｅｗｉｓら、２００１；Ｏｄｄｏら、２００３）。タウの発現の異常は、進行性核上性麻痺および皮質基底核神経節変性症を含むいくつかのその他の重要な神経変性障害にも寄与する（Ｈｏｕｌｄｅｎら、２００１）。つまり、全般的にまたは対立遺伝子特異的な様式でのいずれかによりタウ発現を低下させる努力が、ＦＴＤＰ−１７、ＡＤまたはその他のタウ関連疾患において治療上有効であると証明されうる。

ＲＮＡｉによるタウ変異および／または関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の対立遺伝子特異的サイレンシングは、細胞培養において既に達成されている（Ｍｉｌｌｅｒら２００３、２００４）。さらに、対象のｓｉＲＮＡは、尾静脈への注射により、マウスモデルへの送達が成功した（ＵＳ２００４／０２４１８５４）。
ＵＳ２００５／０２６５９２７ ＷＯ２００５／１１５３５８ ＵＳ２００５０００８６１７ ＵＳ２００６００３９８９ ＷＯ２００４／００２４０２ ＷＯ２００５／１０２２７５ ＷＯ２００５／１１６２１２ ＷＯ０２／０８６１０５ ＷＯ０３／０８７３６７ ＵＳ２００５／０２２２０６１ ＷＯ２００５／００３３５０ ＵＳ２００５／０４２６４６ ＧＢ２４１５９６１ ＵＳ２００４／０２４１８５４ ＷＯ２００５／０４５０３７ ＷＯ０３／０７０７４４ ＧＢ２４０６５６８ ＷＯ２００４／０２９２１２ ＷＯ２００５／０４４９７６ ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、１９９１ The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing、Easton PA、第１９版のＡｌｆｏｎｓｏ、Ｇ．ら、１９９５ Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．、Ｌｉｍ，Ｆ．、Ａｒｒａｓａｔｅ，Ｍ．およびＡｖｉｌａ，Ｊ．（２０００）．The FTDP-17-linked mutation R406W abolishes the interaction of phosphorylated tau with microtubules. J. Neurochem. 74:2583~2589

上記は、ＲＮＡｉに関連する技術およびＣＮＳへの送達アプローチについての検討である。この検討は、以下の本発明の理解のためにのみ与えられ、記載される業績のいずれかが、請求される本発明の先行技術であることを承認するものでない。ｓｉＮＡ分子をＣＮＳに送達でき、それによりそのような送達がＲＮＡ干渉活性をもたらす簡便な方法に対して、当該技術により満たされない要求が存在する。我々は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現を調節してＣＮＳ疾患を治療するための技術を、ｓｉＲＮＡ分子を鼻腔内投与によりＣＮＳに標的導入することにより、開発した。

本発明は、ＲＮＡ干渉を引き起こす化合物の鼻腔内投与により中枢神経系（ＣＮＳ）の病状を治療するための方法および組成物を提供する。

本発明の組成物は、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴミアおよびＲＮＡ干渉を媒介可能な分子を含む短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）および関連する化合物を含む。

本発明の方法は、ＣＮＳの病的状態の治療のための本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡの有効量の、それを必要とする患者への投与を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法は、治療用ｓｉＮＡの鼻腔内投与を含む。特に、本発明の組成物は、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病および／またはパーキンソン病、ならびに特にＣＮＳの遺伝子の変異に関連する先天性疾患を含むＣＮＳ病状の治療のための医薬品の製造において用い得る。本発明の方法に従って治療できる病状および疾患は、好ましくは、海馬、皮質および／または線条体に影響するものを含む。

一実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡまたは同様の化学組成物に関し、それはタウ、ハンチンチンまたはアセチルコリンエステラーゼ遺伝子、ＣＮＳのこれらのまたは他の遺伝子の変異対立遺伝子のｍＲＮＡ発現の干渉を目的とし、最終的には産生されるタンパク質の量を調節する。好ましい実施形態において、本発明の組成物を鼻腔内投与して、ＣＮＳ内の対象の遺伝子の異常なバージョンを特異的に標的にする。

以下の図面を参照しながら、ほんの一例として本発明を説明する。

マウスに０．９％のＮａＣｌ（対照）、１ｎｍｏｌ／μｌのｓｉＲＮＡ−ＧＦＰ（マウス１）、２ｎｍｏｌ／μｌのｓｉＲＮＡ−ＧＦＰ（マウス２）、および２ｎｍｏｌ／μｌのｓｉＲＮＡ−ＧＦＰ＋ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（マウス３）を鼻腔内投与した後のＧＦＰ発現レベルを示す図である。ＣＮＳの皮質、海馬、線条体および球の分析を行った。 ｓｉＲＮＡが、ＧＦＰタンパク質のレベルを低下させることを示す図である。ＧＦＰに対して設計されたｓｉＲＮＡを、トランスジェニックＧＦＰマウスに鼻腔内投与した。動物を異なる時間に屠殺し、回収した組織をウェスタンブロットにより分析した。塩水対照を、対照としてマウスＣＩ、ＣＩＩおよびＣＩＩＩに投与した。値は、対照マウスのＧＦＰタンパク質で標準化したＧＦＰタンパク質の発現レベルを示す。 ｓｉＲＮＡが、ＧＦＰのｍＲＮＡのレベルを低下させることを示す図である。ＧＦＰに対して設計されたｓｉＲＮＡを、トランスジェニックＧＦＰマウスに鼻腔内投与した。動物を異なる時間に屠殺し、異なる組織からのｍＲＮＡを回収した。この図において、線条体および皮質のＧＦＰのｍＲＮＡ発現は、定量ＰＣＲにより分析した。 ｓｉＲＮＡが、異なる変異を有するＭＡＰＴ遺伝子転写産物のレベルを低下させることを示す図である。異なる変異に設計されたｓｉＲＮＡを、配列番号１５９（Ｐ３０１Ｌ変異）および配列番号１６０（Ｒ４０６Ｗ変異）で分析した。ＲＮＡを、特異的ｓｉＲＮＡで４８時間処理した細胞から調製した。試料を、ＭＡＰＴに特異的なプライマー（本文に記載する）を用いる定量ＰＣＲにより分析した。値は、対照として擬似トランスフェクションされた細胞に対する１８Ｓで標準化した異なる転写産物の平均発現レベルを示す。 ｓｉＲＮＡが、ＭＡＰＴ遺伝子転写産物のレベルを低下させることを示す図である。ＲＮＡを、異なるｓｉＲＮＡで２４、４８時間および７２時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞から調製した。試料を、本文中に記載する特異的プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲにより分析した。値は、擬似トランスフェクションされた対照に対する１８Ｓで標準化した異なる転写産物の平均発現レベルを示す。 Ｒ４０６Ｗ変異に設計されたｓｉＲＮＡ配列番号１６０が、ｉｎ ｖｉｖｏにてＭＡＰＴタンパク質レベルを低減させることを示す図である。ｓｉＲＮＡ配列番号１６０は、トランスジェニックＭＡＰＴマウスに鼻腔内投与された。動物を、ｓｉＲＮＡ投与の７日目に屠殺し、海馬組織をウェスタンブロットにより分析した。 ＭＡＰＴ変異および遺伝子配列アクセッション番号のリストである。 ＭＡＰＴ変異および遺伝子配列アクセッション番号のリストである。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。 本発明のｓｉＮＡにより標的にされるＭＡＰＴの領域、およびこれらの領域を標的にするｓｉＮＡ２本鎖の配列表である。

本発明は、ＲＮＡｉを引き起こす化合物の鼻腔内投与によるＣＮＳ病状の治療のための方法および組成物に関する。本発明の組成物は、ＣＮＳの異常状態に関連する標的遺伝子の発現を調節する短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を含む。

本発明の方法は、本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡの有効量を、必要とする患者に投与する段階を含む。

ｓｉＲＮＡの設計
ある遺伝子は、例えば、本発明によるｓｉＮＡが、病的状態に関与する遺伝子または該遺伝子の対立遺伝子の発現を選択的に減少または阻害する場合に、該ｓｉＮＡにより「標的にされる」。あるいは、ｓｉＮＡは、該ｓｉＮＡが遺伝子転写産物にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する場合に、該遺伝子を標的にする。ｓｉＮＡは、遺伝子を標的にする能力について、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにおいて試験されうる。

１９９９年に、Ｔｕｓｃｈｌらは、ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を解読し、それらの効率が２本鎖の長さ、３’末端突出の長さおよびこれらの突出の配列の関数であることを示した。

標的遺伝子内の正しい相同領域を選択することは、正確なサイレンシングのために非常に適切である。標的遺伝子配列の短い断片（例えば１９〜４０ヌクレオチド長）は、本発明のｓｉＮＡの配列として選択される。あるいは、対象の対立遺伝子の可変領域は、ｓｉＮＡ化合物の標的として選択される。一実施形態において、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡである。このような実施形態において、標的遺伝子配列の短い断片は、標的遺伝子ｍＲＮＡの断片である。好ましい実施形態において、候補ｓｉＲＮＡ分子となる標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列断片を選択するための基準は、１）天然ｍＲＮＡ分子の５’または３’末端からの少なくとも５０〜１００ヌクレオチドである標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、２）Ｇ／Ｃ含量が３０％と７０％の間、最も好ましくは約５０％の標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、３）繰り返し配列（例えばＡＡＡ、ＣＣＣ、ＧＧＧ、ＴＴＴ、ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ、ＴＴＴＴ）を含まない標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、４）ｍＲＮＡに接近可能な標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、および５）標的遺伝子に独特な標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列を含む。標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列断片は、上記で特定される基準の１つまたは複数を満たしてよい。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が６０％以下であり、かつ／または繰り返し配列を欠く。

実際は、対象の遺伝子は、最適なオリゴヌクレオチドの設計についての上記の全ての変数を考慮した予測プログラムに、ヌクレオチド配列として導入される。このプログラムは、ｓｉＲＮＡにより標的にされうる領域について、任意のｍＲＮＡヌクレオチド配列を走査する。この分析の出力は、可能性のあるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのスコアである。最高スコアは、典型的には化学合成により作製される２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（他の長さも可能であるが、典型的には２１ｂｐ長）の設計に用いられる。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの安定性または利用可能性の増加を目的とする、当該技術において公知のいくつかの化学修飾も行ってよい。

候補オリゴヌクレオチドを、動物からヒト臨床研究への移行を促進するために、種間配列保存について、さらにフィルタにかけることができる。

標的領域に完全に相補的なｓｉＮＡに加えて、縮重ｓｉＮＡ配列を用いて、相同領域を標的にしてよい。ＷＯ２００５／０４５０３７は、さらなる標的配列を与えうる例えば非正規塩基対、例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対を組み込むことにより、このような相同配列を標的にするｓｉＮＡ分子の設計について記載している。ミスマッチが確認される場合、非正規塩基対（例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基）を用いて、複数の遺伝子配列を標的にするｓｉＮＡ分子を作製できる。非限定的な例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対のような非正規塩基対を用いて、配列相同性を有する標的同士を違えるための配列を標的にしうるｓｉＮＡ分子を作製できる。よって、本発明のｓｉＮＡを用いる１つの利点は、相同遺伝子間で保存されたヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように単一ｓｉＮＡを設計できることである。このアプローチにおいて、複数のｓｉＮＡ分子を用いて異なる遺伝子を標的にする代わりに、単一ｓｉＮＡを用いて、複数の遺伝子の発現を阻害できる。

配列同一性は、当該技術において知られる配列比較およびアラインメントアルゴリズム（ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、１９９１およびそこに引用される参考文献を参照されたい）、ならびに例えばデフォルトパラメータを用いてＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアに備えられるスミス−ウォーターマンアルゴリズムにより（例えばウィスコンシン大学遺伝計算グループ）ヌクレオチド配列間の相違の百分率を算出することにより算出してよい。ｓｉＮＡと標的遺伝子の部分との間の９０％、９５％または９９％より大きい配列同一性が、好ましい。あるいは、ｓｉＮＡと天然ＲＮＡ分子との間の相補性は、ハイブリッド形成により機能的に、そして標的遺伝子の発現を減少または阻害するその能力により機能的に定義されうる。遺伝子発現に影響するｓｉＮＡの能力は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて経験的に決定できる。

本発明の好ましいｓｉＮＡ分子は、２本鎖である。一実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子は、平滑末端を含む。別の実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子は、突出ヌクレオチド（例えば１〜５ヌクレオチドの突出、好ましくは２ヌクレオチドの突出）を含む。特定の実施形態において、突出しているヌクレオチドは、３’突出である。別の特定の実施形態において、突出しているヌクレオチドは、５’突出である。任意の型のヌクレオチドが突出の一部分となり得る。一実施形態において、ヌクレオチドもしくは突出しているヌクレオチドは、リボ核酸である。別の実施形態において、ヌクレオチドもしくは突出しているヌクレオチドは、デオキシリボ核酸である。好ましい実施形態において、ヌクレオチドもしくは突出しているヌクレオチドは、チミジンヌクレオチドである。別の実施形態において、ヌクレオチドもしくは突出しているヌクレオチドは、修飾または非古典的ヌクレオチドである。ヌクレオチドもしくは突出しているヌクレオチドは、非古典的ヌクレオチド間結合を有してよい（例えばホスホジエステル結合以外）。

ｓｉＮＡ２本鎖の合成
ｓｉＮＡは、当該技術において知られる任意の方法により合成できる。ＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学合成されるのが好ましい。さらに、ｓｉＲＮＡは、限定されないが、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）、Ａｍｂｉｏｎ（米国）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（スコットランド）を含む商業的なＲＮＡオリゴ合成供給業者から得ることが可能である。あるいは、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞を、プロモーターの制御下に逆相補ｓｉＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクションすることにより、細胞において発現できる。一旦発現されると、ｓｉＮＡは、当該技術において公知の方法を用いて細胞から単離できる。

一本鎖ＲＮＡ分子を用いて作業する場合は、アニーリングステップが必要である。ＲＮＡをアニールするためには、３０μｌの各ＲＮＡオリゴの５０μＭ溶液を、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムと混合する。次いで、溶液を９０℃にて１分間インキュベートし、１５秒間遠心分離し、３７℃にて１時間インキュベートする。

ｓｉＲＮＡが短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の２本鎖は、リンカー領域（例えばヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー）により接続されてよい。

ｓｉＮＡの化学修飾。
本発明のｓｉＮＡは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含んでよい。当該技術において公知の化学修飾は、ｓｉＮＡの安定性、利用可能性および／または細胞による取り込みを増大させうる。当業者は、ＲＮＡ分子に組み込みうる他の型の化学修飾を認識しているだろう（修飾の型の概説について国際公開ＷＯ０３／０７０７４４およびＷＯ２００５／０４５０３７を参照されたい）。

一実施形態において、修飾を用いて、分解に対する耐性または取り込みを向上させうる。このような修飾の例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に２本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖に対して）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基の組込みを含む（一般的にはＧＢ２４０６５６８を参照されたい）。

別の実施形態において、修飾を用いて、ｓｉＲＮＡの安定性を増進させるか、または標的導入効率を増加させうる。修飾は、ｓｉＲＮＡの２本の相補鎖間の化学架橋結合、ｓｉＲＮＡの鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、ヌクレオ塩基修飾および／または主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）修飾、２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドを含む（一般的に、国際公開ＷＯ２００４／０２９２１２を参照されたい）。

別の実施形態において、修飾を用いて、標的ｍＲＮＡおよび／または相補ｓｉＮＡ鎖中の相補ヌクレオチドに対する親和性を増加もしくは減少させうる（一般的に、国際公開ＷＯ２００５／０４４９７６を参照されたい）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドは、２−チオ、５−アルキニル、５−メチルまたは５−プロピニルピリミジンに置換できる。さらに、非修飾プリンは、７−デザ、７−アルキルまたは７−アルケニルプリンで置換できる。

別の実施形態において、ｓｉＮＡが２本鎖ｓｉＲＮＡである場合、３’末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドにより置き換えられる（一般的に、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１を参照されたい）。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を下方制御する２本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、一方の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み、他方の断片がそのｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む２つの別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられたｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、ここで、ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドが、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対を形成しない（つまり、ｓｉＮＡ分子は、各鎖上に少なくとも２ヌクレオチドの突出を含む）。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各断片の２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは、２’−デオキシ−チミジンのような２’−デオキシピリミジンヌクレオチドである。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各断片の２１ヌクレオチド全ては、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態において、アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドが、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対を形成する。別の実施形態において、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分と塩基対を形成する。上記の実施形態のいずれにおいても、上記のアンチセンス領域を含む断片の５’末端は、リン酸基を場合により含みうる。

一実施形態において、本発明は、センスまたはアンチセンスの鎖のいずれかまたは両方が、１もしくは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、好ましくは１〜５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１もしくは複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）、好ましくは１〜５の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または１もしくは複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）、好ましくは１〜５のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチドと、場合によっては、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方の３’末端、５’末端、もしくは３’および５’末端の両方に末端キャップ分子とを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態において、センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１もしくは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、好ましくは１〜５のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾され、場合によっては、１もしくは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、好ましくは１〜５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または３’末端、５’末端、もしくは３’および５’末端の両方の末端キャップ分子は、同じまたは異なる鎖に存在する。

一実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の各鎖に約１〜約５以上（特に約１、２、３、４、５以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。

別の実施形態において、本発明は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖の３’末端、５’末端もしくは３’および５’末端の両方にあり得る。さらに、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方のｓｉＮＡ配列鎖の種々の他の位置に存在可能であり、例えば、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が２’−５’ヌクレオチド間結合を含みうるか、またはｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が２’−５’ヌクレオチド間結合を含みうる。

一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の例えば５’末端、３’末端、５’および３’末端の両方、またはそれらの任意の組合せにおいて、１つまたは複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。

別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の例えば５’末端、３’末端、５’および３’末端の両方、またはそれらの任意の組合せに、１つまたは複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の非環状ヌクレオチドを含む。

一実施形態において、本発明は、センスまたはアンチセンス領域のいずれかまたは両方に存在するいずれか（例えば１つまたは複数または全て）のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、かつセンスまたはアンチセンス領域のいずれかまたは両方に存在するいずれか（例えば１つまたは複数または全て）のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである、本発明の化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。場合によっては、上記のセンスまたはアンチセンス領域に存在する３’−末端ヌクレオチド突出を含む任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態において、本発明は、センスまたはアンチセンス領域のいずれかまたは両方に存在するいずれか（例えば１つまたは複数または全て）のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、かつセンスまたはアンチセンス領域のいずれかまたは両方に存在するいずれか（例えば１つまたは複数または全て）のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである、本発明の化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。場合によっては、上記のセンスまたはアンチセンス領域に存在する３’−末端ヌクレオチド突出を含む任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子の各鎖が約２１〜約２３ヌクレオチド長である、標的ＲＮＡ、好ましくはＣＮＳで発現されるＲＮＡ、より好ましくはＭＡＰＴ ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を導く化学合成２本鎖ＲＮＡ分子を特徴とする。ＲＮＡ分子の１本の鎖は、ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉により標的ＲＮＡの切断を導くために、標的ＲＮＡに対して十分に相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖は、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドなどのような本明細書に記載される１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。

一実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬品を特徴とする。

一実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む活性成分を特徴とする。

一実施形態において、本発明は、２本鎖小型干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の、標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を下方制御するための使用であって、該ｓｉＮＡ分子が、１つまたは複数の化学修飾を含み、２本鎖ｓｉＮＡのそれぞれの鎖が、約１８〜約２８以上（例えば約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８以上）のヌクレオチド長である使用を特徴とする。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を阻害する２本鎖小型干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、該２本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖が、標的ＲＮＡまたはその一部分のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、他方の鎖が、該アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、かつ２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数が、糖修飾を含む２本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。好ましくは、標的ＲＮＡまたはその一部分は、タンパク質またはその一部分をコードする。場合によっては、アンチセンス鎖の５’末端は、リン酸基を含む。アンチセンス鎖のヌクレオチド配列またはその一部分は、標的ＲＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であってよい。

一実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８〜約２９以上（例えば約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９以上）のヌクレオチドを含み、ここで、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１８ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、２つのオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、ここで、一方の断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、他方の断片は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子により接続されている。さらなる実施形態において、センス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態において、センス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、アンチセンス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、１つまたは複数の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、および１つまたは複数の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらなる実施形態において、センス鎖は、センス鎖の５’末端、３’末端または５’および３’末端の両方に末端キャップ部分（例えば逆デオキシ脱塩基部分または逆チミジンのような逆デオキシヌクレオチド部分）が存在する３’末端および５’末端を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、３’末端にグリセリル修飾を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端は、場合によりリン酸基を含む。

２本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数が糖修飾を含む、標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を阻害する２本鎖小型干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の上記の任意の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２本の鎖のそれぞれは、約２１ヌクレオチドを含みうる。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の約２１ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対を形成し、ここで、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成しない。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの断片の２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは、２’−デオキシ−チミジンのような２’−デオキシ−ピリミジンである。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖は、ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対を形成する。一実施形態において、アンチセンス鎖の約１９ヌクレオチドは、標的ＲＮＡまたはその一部分のヌクレオチド配列と塩基対を形成する。一実施形態において、アンチセンス鎖の約２１ヌクレオチドは、標的ＲＮＡまたはその一部分のヌクレオチド配列と塩基対を形成する。

一実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体または希釈剤中の本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。

非限定的な例において、化学修飾ヌクレオチドを核酸分子中に導入することは、外来から送達される天然ＲＮＡ分子に固有のｉｎ ｖｉｖｏ安定性および生物学的利用能の潜在的な制限を克服する強力なツールとなる。例えば、化学修飾核酸分子の使用は、所定の治療効果のための特定の核酸分子の用量をより低くできる。なぜなら、化学修飾核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向にあるからである。さらに、ある種の化学修飾は、特定の細胞もしくは組織を標的にし、および／または核酸分子の細胞による取り込みを向上させることにより、核酸分子の生物学的利用能を向上できる。よって、化学修飾核酸分子の活性が、天然核酸分子に比較して、例えば全てのＲＮＡの核酸分子と比較したときに減少しても、修飾核酸分子の全体的な活性は、分子の安定性および／または送達の向上により、天然分子の活性よりも大きくなりうる。天然の非修飾ｓｉＮＡとは異なって、化学修飾ｓｉＮＡは、ヒトにおいてインターフェロン活性を活性化させる可能性を最小限にもできる。

本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、該アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含みうる。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、アンチセンス領域は、該アンチセンス領域の５’末端に、約１〜約５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含みうる。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端ヌクレオチド突出は、核酸の糖、塩基または主鎖において化学修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含みうる。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、３’末端ヌクレオチド突出は、１つまたは複数のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを含みうる。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、３’末端ヌクレオチド突出は、１つまたは複数の非環状ヌクレオチドを含みうる。

別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は平滑末端を有する。

一実施形態において、本発明は、４０ヌクレオチド以下であり、かつ図８Ａ〜図８Ｆの配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）１〜１６０のいずれかのヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を含む。特定の実施形態において、ｓｉＮＡは２１〜３０ヌクレオチド長であり、かつ図８Ａ〜図８Ｆの配列番号１６１〜３１８（ＳＥＱ ＩＤ）のいずれか１つを含む。

一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾されうる本発明のｓｉＮＡ分子であって、ｓｉＮＡ鎖の一方が標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む分子を合成する段階と、（ｂ）該ｓｉＮＡ分子を、対象または生体において標的遺伝子の発現を調節するために適切な条件下で、対象または生体に導入する段階とを含む、対象または生体における標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質またはＲＮＡのレベルは、当該技術において公知の種々の方法を用いて決定できる。

別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る本発明のｓｉＮＡ分子であって、ｓｉＮＡ鎖の一方が標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む分子を合成する段階と、（ｂ）該ｓｉＮＡ分子を、対象または生体において標的遺伝子の発現を調節するために適切な条件下で、対象または生体に導入する段階とを含む、対象または生体において、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくは少なくとも１つのＭＡＰＴ遺伝子を含む複数の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。標的タンパク質またはＲＮＡのレベルは、当該技術において知られるようにして決定できる。

一実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る本発明のｓｉＮＡ分子であって、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な１本鎖配列を含むｓｉＮＡを合成する段階と、（ｂ）該ｓｉＮＡ分子を、細胞において標的遺伝子の発現を調節するために適切な条件下で細胞に導入する段階とを含む、細胞内の標的遺伝子、好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくはＭＡＰＴ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

別の実施形態において、本発明は、（ａ）化学修飾され得る本発明のｓｉＮＡ分子であって、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な１本鎖配列を含むｓｉＮＡを合成する段階と、（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を、該ｓｉＮＡ分子と、細胞において標的遺伝子の発現を調節するために適切な条件下で接触させる段階とを含む、細胞内の好ましくはＣＮＳで発現される遺伝子、より好ましくは少なくとも１つのＭＡＰＴ遺伝子を含む複数の標的遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。

ｓｉＲＮＡ２本鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｓｉＲＮＡ干渉の特異性を確認するために、標的遺伝子を発現している細胞培養物において、予備試験を行いうる。

基本的には、細胞を、対応するｓｉＲＮＡ２本鎖とインキュベートし、その後、遺伝子発現レベルを分析する。ｓｉＲＮＡノックダウンを培養細胞における特定の表現型と関連付けるために、標的タンパク質の減少を証明するか、または標的ｍＲＮＡの低下を少なくとも証明することが必要である。標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により定量できる。さらに、タンパク質レベルは、異なる標的に対する特異的抗体が標的タンパク質の低下の直接的なモニターを可能にするウェスタンブロット分析のような、当該技術において公知の種々の方法で決定できる。

ｓｉＲＮＡは、当該技術において公知の任意のトランスフェクション法により、細胞に導入される。ｓｉＲＮＡ２本鎖の単独のトランスフェクションは、例えばリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなカチオン脂質の使用、その後、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後のサイレンシング効率のアッセイにより行いうる。

トランスフェクションの効率は、細胞の型に依存しうるが、細胞の継代数および集密度にも依存しうる。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成の時間および様式（例えば反転に対するボルテックス）も重要である。低いトランスフェクション効率は、サイレンシングの失敗の最もよくある原因である。良好なトランスフェクションは重大な問題であり、用いられる新しい株化細胞ごとに注意深く検討する必要がある。トランスフェクション効率は、レポーター遺伝子、（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈの）ＣＭＶ促進ＥＧＦＰ発現プラスミドまたはＢ−Ｇａｌ発現プラスミドをトランスフェクションすることにより試験し、次いで、翌日に位相差および／または蛍光顕微鏡により評価することができる。

標的タンパク質の豊富さおよび寿命（または代謝回転）に応じて、ノックダウン表現型は、１〜３日後、またはそれより遅くにも現れうる。表現型が観察されない場合、タンパク質の枯渇が、免疫蛍光法またはウェスタンブロット法により観察されうる。

医薬製剤および投与経路
本発明は、１つまたは複数の種のｓｉＮＡ分子の同時投与を含んでよい。これらの種は、１つまたは複数の標的遺伝子を標的にするように選択することができる。

一実施形態において、単一の型のｓｉＮＡが、本発明の治療方法において投与される。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡは、本発明の別のｓｉＮＡ、および／あるいはＣＮＳの疾患状態の治療、予防もしくは管理に有用な１つまたは複数の他の非ｓｉＮＡ治療剤との併用で投与される。用語「併用で」は、治療剤を全く同じ時間に投与することに限定されず、むしろ、本発明のｓｉＮＡと別の薬剤とが連続して、それらが他の方法で投与された場合よりも併用の利益が大きくなるような時間間隔のうちに患者に投与されることを意味する。例えば、それぞれの治療剤は、同時に、または異なる時間点で任意の順序により連続的に投与してよい。しかし、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療効果を得るように十分に近い時間で投与されるべきである。各治療剤は、任意の適切な形で、および任意の適切な経路により別々に投与できる。

本発明のｓｉＮＡは、当該技術において知られる任意の通常の方法により、医薬組成物に処方してよい（例えばThe Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing、Easton PA、第１９版のＡｌｆｏｎｓｏ、Ｇ．ら、１９９５を参照されたい）。本発明の方法で用いるための１つまたは複数のｓｉＮＡを含む製剤は、多数の形であってよく、各患者に特定の種々の因子（例えば障害の型および重篤度、投与されるｓｉＮＡの型、患者の年齢、体重、応答および過去の病歴）、製剤中のｓｉＮＡの数および型、組成物の形（例えば液体、半液体または固体の形）、ならびに／または治療計画（例えば治療剤が、遅い注入として時間をかけて、単回のボーラス投与で、１日１回、１日数回、または数日ごとに１回投与されるか）に依存してよい。

本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、当該技術において一般に知られるように、直接または局所的に投与してよい。例えば、ｓｉＮＡ分子は、対象への投与のためにリポソームを含む送達媒体を含みうる。担体および希釈剤ならびにそれらの塩は、薬学的に許容される製剤中に存在しうる。核酸分子を、限定されないが、リポソームへのカプセル化、イオン導入法、または生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡマイクロスフェア、生分解性ナノカプセルならびに生体接着性マイクロスフェアのような別の媒体への組込み、あるいはタンパク性ベクターによることを含む、当業者に知られる種々の方法により細胞に導入できる。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミンおよびポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体のようなその誘導体とともに処方し、またはそれで複合体を形成することもできる。

本発明のｓｉＮＡ分子は、膜破壊剤および／またはカチオン脂質もしくはヘルパー脂質分子と複合体を形成することができる。

本発明で用いてよい送達システムは、例えば、水性または非水性のゲル、クリーム、多層エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤ならびに粉末を含み、可溶化剤、浸透促進剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）のような賦形剤を含みうる。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。

本発明の医薬製剤は、細胞または例えばヒトを含む対象への例えば全身または局所投与のような投与に適する形にある。適切な形は、部分的に、使用、または例えば経口、経皮もしくは注射のような進入の経路に依存する。他の因子は、当該技術において知られており、毒性、および組成物または製剤がその効果を発揮することを妨げる形のような問題を含む。

本発明は、薬学的に許容される担体または希釈剤中に所望の化合物の医薬的有効量を含む、貯蔵または投与用に調製された組成物も含む。治療用途の許容される担体または希釈剤は、製薬技術において公知である。例えば、防腐剤、安定化剤、色素および香料を用いることが可能である。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤を用い得る。

医薬的有効用量は、疾患状態を予防し、その発生を阻害し、または治療する（症状、好ましくは全ての症状をある程度緩和する）のに必要な用量である。医薬的有効用量は、疾患の型、用いられる組成物、投与経路、処置される哺乳動物の型、考慮する特定の哺乳動物の生理的特徴、並行する投薬、および医薬技術の当業者が認識するその他の因子に依存する。

本発明の製剤は、通常の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および／または媒体を含む単位剤形で投与できる。経口用の製剤は、活性成分が例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性な固体希釈剤と混合されているゼラチンハードカプセル、あるいは活性成分が水または例えばピーナツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油状媒質と混合されているゼラチンソフトカプセルとしてもありうる。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤との混合物中にある活性物質を含む。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガムのような懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、例えばレシチンのような天然のホスファチド、または例えばポリオキシエチレンステアレートのようなアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、または例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールのようなエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのようなエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、または例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物でありうる。水性懸濁液は、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートのような１つまたは複数の防腐剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香料、およびスクロースもしくはサッカリンのような１つまたは複数の甘味料も含みうる。

油性懸濁液は、活性成分を、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、または流動パラフィンのような鉱物油に懸濁することにより処方できる。油性懸濁液は、例えばミツロウ、固形パラフィンまたはセチルアルコールのような増粘剤を含みうる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存されうる。

水の添加により水性懸濁液の調製に適する分散可能な粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つまたは複数の防腐剤と混合された活性成分を与える。適切な分散剤もしくは湿潤剤または懸濁化剤は、既に上述したものにより例示される。例えば甘味料、香料および着色剤のようなさらなる賦形剤も存在しうる。

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形でもありうる。油相は、植物油もしくは鉱物油またはこれらの混合物でありうる。適切な乳化剤は、例えばアカシアガムまたはトラガカントガムのような天然のガム、例えば大豆、レシチンのような天然のホスファチド、ならびに例えばソルビタンモノオレエートのような脂肪酸および無水ヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、ならびに例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのような該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物でありうる。エマルジョンは、甘味料および香料も含みうる。

この懸濁液は、上記のこれらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、既知の技術に従って処方できる。

滅菌の注射可能な製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような滅菌の注射可能な溶液または非毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の懸濁液でもありうる。許容される媒体および溶媒のなかでも、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液を用いうる。さらに、滅菌の固定油を、溶媒または懸濁化媒質として、通常、用いる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油を用いうる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注射可能な製剤に用いうる。

本発明の核酸分子は、また、全体的な治療効果を増加させるその他の治療化合物と併用して対象に投与できる。適応症の治療のための複数化合物の使用は、副作用の存在を低減しつつ有利な効果を増加させうる。

あるいは、本発明のあるｓｉＮＡ分子は、真核プロモーターから細胞内で発現させうる。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組換えベクターは、標的細胞内に送達してそこで維持されうる。あるいは、核酸分子を一過的に発現するベクターを用いうる。このようなベクターは、必要により、反復投与できる。一旦発現されると、ｓｉＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ応答を生じる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋内投与、対象から外植された標的細胞への投与後の対象への再導入、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などにより、全身で行われうる。

ｓｉＮＡの鼻腔内投与
鼻腔内でのｓｉＮＡ送達研究は、ＧＦＰ Ｃ５７ＢＬ／６−ＴＧ（ＡＣＴＳ−ＥＧＦＰ）マウスにおいて行われた。このトランスジェニックマウス系統は、「Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」より購入した。この導入遺伝子のホモ接合マウスは、生後２週間以内に死亡するので、このトランスジェニックマウスを用いた。鶏ベータ−アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーの制御下の「増強された」ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡを有するトランスジェニックマウス系統では、赤血球と毛以外の全ての組織が励起光の下で緑色に見える。この系統は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで作製された。増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする系統ｃＤＮＡを、鶏ベータアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーと接続した。ウシグロビンポリアデニル化シグナルも構築物に含めた。ＰＣＲプライマーに含めたＥｃｏＲＩ部位を用いて、増幅させたＥＧＦＰ ｃＤＮＡを、鶏ベータ−アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサー、ベータ−アクチンイントロンおよびウシグロビンポリアデニル化シグナルを含むｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに導入した。プロモーターおよびコード配列を含む挿入断片全体を、Ｂａｍ−ＨＩおよびＳａｌＩで切り出して、ゲルにより精製した。

ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ発現を下方制御するために用いたｓｉＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ中の以下の配列を標的にした（配列番号３１９）；５’−ＧＧＣ ＵＡＣ ＧＵＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＣＣ−３’。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス鎖は、５’−Ｐ ＧＧＣ ＵＡＣ ＧＵＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＣＣ−３’であり、アンチセンス鎖は５’−Ｐ Ｕ ＧＣＧ ＣＵＣ ＣＵＧ ＧＡＣ ＧＵＡ ＧＣＣ ＵＵ−３’（配列番号３２０）であった。以下に記載する実験で用いたｓｉＲＮＡ２本鎖は、２つのチミジンヌクレオチドの３’突出を有していた。

実験プロトコル
鼻腔内送達実験のために、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴＧ（ＡＣＴＢ−ＥＧＦＰ）雄性マウス（８週齢）を用いた。ＮａＣｌ、０．９％中で希釈されたｓｉＲＮＡを鼻腔内注入されたマウスを、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）（ＮａＣｌ、０．９％）を注入された対照マウスと比較した。動物を、イソフルオランで麻酔し、２０μｌの各溶液を、各鼻孔中に滴下した。

異なる用量のｓｉＲＮＡ対ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（−／＋トランスフェクション脂質）を、２０μｌの最終容量で鼻腔内投与した。対照動物は、媒体のみで処置した。全ての場合において、動物は、干渉の最適時間を見出すために、薬物の投与後の一連の日数で屠殺した。

組織分析のために、ＣＯ_２を用いてマウスを屠殺し、脳を氷冷プレートの上に迅速に解剖して取り出した。半分をウェスタンブロット用に処理し、残りの半分を免疫組織化学用に処理した。

試料の組織を、脳の異なる領域から回収し、ウェスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲにより分析した。異なる処置条件でのＧＦＰ発現を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐプログラムの支援により測定した。阻害レベルを、異なる組織で構成的に発現されるベータ−アクチン遺伝子に関して標準化した後に得た。

実験条件は、表１に記載するように分布していた（条件は、２重または３重組で分析した）。ＧＦＰについて裸のｓｉＲＮＡを５３０μｇ（４０ナノモル）の１回の用量で鼻腔内処置されたマウスを、マウス１、２および３と命名し、ｓｉＲＮＡの接種の３および５日後に屠殺した。別の実験群（４、５、６、７、８および９と番号付けした）は、安定化ｓｉＲＮＡの２６５μｇ（２０ナノモル）の２回の用量で処置された動物からなり、３、５および８日目に屠殺した（表１）。

試料の組織は、２つの方法により回収した。一方はタンパク質緩衝溶解媒質中であり、他方はＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中であった。その後、組織中のＧＦＰタンパク質の免疫蛍光シグナルを分析するために、組織の小片をＯＣＴに入れた。全ての試料を、データ処理まで−８０℃にて貯蔵した。

表１：鼻腔内ｓｉＲＮＡ送達についての実験条件の分布の概略。ｓｉＲＮＡの用量は、表に示す。

ウェスタンブロット分析のための抽出物を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＦ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭオカダ酸およびプロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１０μｇ／ｍｌペプスタチン）からなる氷冷抽出緩衝液中で脳の領域をホモジナイズすることにより調製した。試料をホモジナイズし、１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。上清に含まれるタンパク質を、ブラッドフォード法により決定した。合計で３０マイクログラムのタンパク質を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレンに移した。導入遺伝子を検出するために用いた１次抗体は、ＥＧＦＰ抗体（１／１０００）（Ｓｉｇｍａ）および抗β−アクチン（１／２５００）（Ｓｉｇｍａ）であった。メンブレンを、４℃にて１晩、５％脱脂粉乳中で抗体とインキュベートした。２次ヤギ抗マウス抗体（１／１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）およびＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、イリノイ州Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ）を、免疫検出のために用いた。タンパク質のレベルを、密度計測により定量し、ＧＦＰの値をアクチンに関して標準化して、タンパク質の装填量のいずれの偏差も修正した。

免疫組織化学用の脳を、セーレンセン緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド中で１晩固定し、３０％のスクロース溶液中で凍結から保護した。脳を、凍結したミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ドイツヌスロッホ）上で３０マイクロメートルの矢状片に切断し、３０％エチレングリコール、２６％グリセロールおよびリン酸緩衝液、ｐＨ７．２からなる凍結保護溶液中で回収した。次いで、脳の切片を蛍光顕微鏡により分析した。

ＲＮＡｌａｔｅｒ中で単離した組織は、−８０℃にて貯蔵した。ＲＮＡｌａｔｅｒは、その密度のために、ＲＮＡ抽出の前に除去した。ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離する。ＤＮアーゼ処理を、定量ＰＣＲによるＧＦＰ発現の測定の前に行う。

脳へのｓｉＲＮＡの送達が行われるかを決定するためにｓｉＲＮＡの適用を行う。ＧＦＰ遺伝子転写産物の下方制御を決定することが目的であるので、蛍光のレベルを、ｓｉＲＮＡの投与に続いて測定した。実験プロトコルの間に、動物において２次的影響は観察されなかった。

結果：
［実施例１］
中枢神経系ｉｎ ｖｉｖｏ送達モデル
ｓｉＲＮＡの投与を、中枢神経系（ＣＮＳ）での適切な鼻腔内ｓｉＲＮＡ送達を決定するために行った。２０μｌのＮａＣｌ（０．９％）（対照）または１ｎｍｏｌ／μｌ（マウス１）、２ｎｍｏｌ／μｌ（マウス２）もしくは２ｎｍｏｌ／μｌ＋トランスフェクション脂質ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（マウス３）の濃度での２０μｌのｓｉＲＮＡで処置したマウスを、処置の４８時間後に屠殺した。実験プロトコルの間、動物において２次的影響は観察されなかった。

ＣＮＳの異なる領域（皮質、海馬、線条体または球（ｂｕｌｂ））、および異なる組織（気管、肺、鼻上皮、食道）の試料を抽出し、上記のようにＧＦＰを特異的に認識する抗体を用いるウェスタンブロットおよび免疫蛍光法によりさらに分析した。添加の対照として、ベータ−アクチンに対する抗体を用いた。

ベータ−アクチンに関して標準化した後の、ＣＮＳの異なる領域でのＧＦＰ発現阻害レベルの結果を、図１に示す。観察できるように、最高の阻害効果は、トランスフェクション脂質なしの２ｎｍｏｌ／μｌの用量で得られた。さらに、阻害は、皮質、海馬、線条体および球を含むＣＮＳの種々の組織で見られた。この結果は、リアルタイムＰＣＲによっても確認された。

［実施例２］
鼻腔内ｓｉＲＮＡ投与の異なる濃度および時期を、ＧＦＰマウスモデルにおいて用いた。２０μｌのＮａＣｌ（０．９％）（対照）、または４０ｎｍｏｌもしくは２０ｎｍｏｌ濃度の２０μｌのｓｉＲＮＡで処置したマウスを、処置の３、５および８日目に屠殺した。実験プロトコルの間、動物において２次的影響は観察されなかった。

ＣＮＳの異なる領域（皮質、海馬、線条体、小脳、脳幹または球）の試料を抽出し、ＧＦＰを特異的に認識する抗体を用いるウェスタンブロットおよび免疫蛍光法によりさらに分析した。添加の対照として、ベータ−アクチンに対する抗体を用いた。

ベータ−アクチンに関して標準化した後の、ＣＮＳの異なる領域におけるＧＦＰ発現阻害レベルの結果を、図２に示す。観察できるように、阻害効果は、脳の領域に依存した。最大のＧＦＰサイレンシングは、皮質、海馬、線条体および球で観察された。ウェスタンブロット実験の結果は、定量ＰＣＲにより確認された（図３）。図３において、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルの下方制御を、皮質および線条体において分析し、これらのレベルの明らかな低下が、マウス条件８および９で観察された。

［実施例３］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＡＰＴ ｓｉＲＮＡ２本鎖の試験
ｓｉＲＮＡの特異性を確かめるために、ＭＡＰＴ（微小管付随タンパク質タウ）の干渉を、ＭＡＰＴ発現細胞培養において分析した。これらの実験に用いた細胞は、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞であった。ＭＡＰＴ ｍＲＮＡのレベルを、対応するｓｉＲＮＡ２本鎖とのインキュベーションの後に分析した。ｓｉＲＮＡノックダウンを培養細胞での特定の表現型と関連付けるために、標的タンパク質の減少を証明するか、または少なくとも標的ｍＲＮＡの減少を証明することが必要である。

細胞培養におけるｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクション
ｓｉＲＮＡトランスフェクションについての技術のいくつかの例が、当該技術において公知である。ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションは、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなカチオン脂質を用いるｓｉＲＮＡ２本鎖の単独のトランスフェクションと、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後のサイレンシングを読み出すことからなる。

典型的なトランスフェクションプロトコルは、以下のようにして行いうる。６ウェルプレートの１つのウェルについて、我々は、ｓｉＲＮＡの最終濃度として、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞について１００ｎＭを用いてトランスフェクションした。リポフェクタミン２０００試薬のプロトコルに従って、トランスフェクションの前日に、我々は、ウェルあたり２〜４×１０^５細胞を、ＤＭＥＭ、１０％血清、抗生物質およびグルタミンを含有する３ｍｌの適切な成長培地に播種し、細胞を通常の成長条件下でインキュベートする（３７℃および５％ ＣＯ_２）。トランスフェクションの当日に、細胞は３０〜５０％集密でなければならない。我々は、２５０μｌのＤＭＥＭ中に１２．５μｌの２０μＭ ｓｉＲＮＡ２本鎖（最終濃度１００ｎＭに相当）、または２５μｌの２０μＭ ｓｉＲＮＡ２本鎖（最終濃度２００ｎＭに相当）を希釈し、混合する。また、６μｌのリポフェクタミン２０００を、２５０μｌのＤＭＥＭ中に希釈し、混合する。室温にて５分間インキュベーションした後に、希釈したオリゴマー（ｓｉＲＮＡ２本鎖）および希釈したリポフェクタミンを合わせて、室温での２０分間のインキュベーションの間に、複合体を形成させる。その後、我々は、複合体を、抗生物質が少ない２ｍｌの新鮮な成長培地とともに、細胞に滴下し、プレートを前後にゆすって穏やかに混合して、確実にトランスフェクション複合体の分布を均一にさせる。我々は、細胞を、それらの通常の成長条件下でインキュベーションし、１日後に、複合体を除去し、新鮮な完全成長培地を加える。遺伝子のサイレンシングをモニターするために、細胞を、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後に回収する。

トランスフェクションの効率は、細胞の型に依存しうるが、細胞の継代数および集密度にも依存しうる。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成の時間および様式（例えば反転に対するボルテックス）も重要である。低いトランスフェクション効率は、サイレンシングの失敗の最もよくある原因である。良好なトランスフェクションは、重大な問題であり、用いられる新しい株化細胞のそれぞれについて注意深く検討する必要がある。トランスフェクション効率は、レポーター遺伝子、（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈの）ＣＭＶ促進ＥＧＦＰ発現プラスミドまたはＢ−Ｇａｌ発現プラスミドをトランスフェクションすることにより試験し、次いで、翌日に位相差および／または蛍光顕微鏡により評価することができる。

標的タンパク質の豊富さおよび寿命（または代謝回転）に応じて、ノックダウン表現型は、１〜３日後、またはそれより遅くにも現れうる。表現型が観察されない場合、タンパク質の枯渇が、免疫蛍光法またはウェスタンブロット法により観察されうる。

トランスフェクション後、細胞から抽出した全ＲＮＡ画分を、ＤＮアーゼＩで前処理し、ランダムプライマーを用いる逆転写に用いた。ｍＲＮＡ前駆体の増幅を制御するために、少なくとも１つのエキソン−エキソン接合部をカバーする特異的プライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行った。非標的ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも、対照として必要である。ｍＲＮＡの効率のよい欠乏、さらに標的タンパク質の検出不可能な低下から、安定タンパク質の大きい貯蔵所が細胞内に存在しうることが示唆されうる。あるいは、リアルタイムＰＣＲ増幅を用いて、より精密な方法で、ｍＲＮＡの減少または消滅を試験できる。定量ＰＣＲは、各ＰＣＲサイクルの間のアンプリコン生成の指標として、反応の間に放射される蛍光をモニターする。このシグナルは、反応物中のＰＣＲ生成物の量に正比例して増加する。各サイクルでの蛍光放射の量を記録することにより、ＰＣＲ生成物の量の最初の著しい増加が標的鋳型の当初の量に相関する対数期の間のＰＣＲ反応をモニター可能である。

細胞培養において異なって発現されるＭＡＰＴ遺伝子の干渉パターンを確かめるために、ｑＲＴ−ＰＣＲを、製造者のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って行った。反応条件は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７３００用に確立され、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応が行われた。２５μｌの反応容量は、２×ＳｙＢｒグリーン、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素６．２５Ｕ、ＲＮアーゼ阻害剤ならびに１００ｎｇの鋳型ＲＮＡと混合した５０ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーからなる。ＭＡＰＴについての特異的プライマーを設計し、１８Ｓをハウスキーピング遺伝子として分析した。フォワードプライマーは、配列：ＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡ（配列番号３２１）を有し、リバースプライマーは、配列ＧＡＧＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡ（配列番号３２２）を有していた。

逆転写を、４８℃にて３０秒間の最初のステップを用いて行った。サーマルサイクルパラメータは、９５℃にて１０分、９５℃にて１５秒間と６０℃にて１分間との４０サイクルであった。解離曲線も分析して、増幅特異性を確認した。各試料の閾値サイクル（Ｃｔ）値を、対照の２４時間の試料と比較して、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の各遺伝子の下方制御の百分率を決定した。

増幅されたＰＣＲ生成物の特異性を評価するために、融解曲線分析を行った。得られた融解曲線は、プライマーの二量体と、特異的ＰＣＲ生成物との区別を可能にした。

ＭＡＰＴ ｓｉＲＮＡについてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＲＮＡｉ技術を用いるＭＡＰＴ標的の阻害を決定するために、第１ステップは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞培養での実験を行うことであった。これらのアッセイは、２つの部分で行われた。まず、図７Ａ及び図７Ｂに示すＭＡＰＴ変異に対して設計されたｓｉＲＮＡを、トランスフェクションした。その後、ＭＡＰＴ野生型に対するｓｉＲＮＡを設計し、トランスフェクション後のＭＡＰＴの下方制御を分析した。図４は、図７Ａ及び図７Ｂに既に記載したＭＡＰＴのいくつかの変異についての定量ＰＣＲ実験の代表的な結果を示す。図８Ａ〜図８Ｆは、それに対してｓｉＮＡを設計したＭＡＰＴでの標的配列（配列番号１〜１６０）を示す。ｓｉＮＡ２本鎖は、配列番号１６１〜３１８に示す。

ＭＡＰＴ ｍＲＮＡのレベルを下方制御するために変異ＭＡＰＴ Ｐ３０１Ｌ（配列番号１５９として示す標的領域）およびＭＡＰＴ Ｒ４０６Ｗ（配列番号１６０として示す標的領域）に対して設計されたｓｉＲＮＡを、分析した。図４に示す値は、対照細胞およびそれらの標準偏差で一旦標準化した遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡ干渉の百分率の平均を表す。対照細胞に比較して、４８時間でのＭＡＰＴ転写産物のレベルは、ｓｉＲＮＡ配列番号１５９処理（ＭＡＰＴ Ｐ３０１Ｌに特異的）後に２０％減少した。しかし、ｓｉＲＮＡ配列番号１６０（ＭＡＰＴ Ｒ４０６Ｗに特異的）トランスフェクションの際のＭＡＰＴの減少は、対照レベルに対して４０％まで達した。

２回目の実験において、ＭＡＰＴ ｗｔに指向された異なるｓｉＲＮＡを設計した。ＭＡＰＴは異なるアイソフォームを有するので、配列アラインメントを行い、ｓｉＲＮＡを共通の領域に対して設計した。ＭＡＰＴアイソフォームの参照配列のアクセッション番号は、ＮＭ＿００５９１０、ＮＭ＿０１６８３４、ＮＭ＿０１６８３５およびＮＭ＿０１６８４１として列挙される。配列番号１２８および配列番号１３９に相当するＭＡＰＴ ｗｔに対する２つの異なるｓｉＲＮＡを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞にトランスフェクションした。以下の図５は、定量ＰＣＲ分析の代表的な結果を示す。値は、対照細胞およびそれらの標準偏差で一旦標準化したそれぞれの遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡ干渉の百分率の平均を表す。対照細胞に比較して、２４、４８または７２時間でのＭＡＰＴ転写産物のレベルは、特異的ｓｉＲＮＡ処理の後に著しく低下した。配列番号１２８に相当するｓｉＲＮＡは、ＭＡＰＴ転写産物を７０％低下させ、この低下は、４８時間および７２時間まさに継続された。ｓｉＲＮＡ配列番号１２９も、擬似トランスフェクションさせた細胞と比較して、約６０％のＭＡＰＴの下方制御の非常に良好なレベルに達した。

［実施例４］
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＡＰＴ ｓｉＲＮＡ２本鎖の試験
病理学的モデルでの鼻腔内送達の概念を証明するために、前頭側頭型認知症に関与するＭＡＰＴを、適切なＭＡＰＴトランスジェニックマウスモデルにおいて下方制御した。

マウス系統の説明
ＭＡＰＴトランスジェニックマウスの作製のために、２つのＮ末端エキソンとともにヒト４反復タウアイソフォームをコードするプラスミドｐＳＧＴ４２（Ｍｏｎｔｅｊｏ ｄｅ Ｇａｒｃｉｎｉら、１９９４）を、鋳型として用いて、ＦＴＤＰ−１７変異Ｇ２７２ＶおよびＰ３０１Ｌを別々に、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）手順を用いて導入した。次いで、制限断片ＳａｃＩＩ／ＡｓｅＩ（Ｇ２７２Ｖ変異を含む）およびＡｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｐ３０１Ｌ変異を含む）を、ＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで予め切断したプラスミドｐＳＧＴＲ４０６Ｗに連結し（Perez, M.、Lim, F.、Arrasate, M.およびAvila, J. (2000). The FTDP-17-linked mutation R406W abolishes the interaction of phosphorylated tau with microtubules. J. Neurochem. 74:2583~2589）、プラスミドｐＳＧＴＶＬＷを作製することにより、三重変異タウｃＤＮＡを組み立てた。変異タウのオープンリーディングフレームを、ｐＳＧＴＶＬＷから、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片として切り出し、ＣＭＶプロモーターに関して前向きにＰＢＫＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ部位に連結して、ｐＢＫＶＬＷを作製した。ｐＢＫＶＬＷのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片を、次いで、ｔｈｙ１プロモーターに関して前向きにｐＴＳＣ２１ｋ（Ｌｕｔｈｉら、１９９７）のＸｈｏＩ部位に連結した。得られたプラスミドｐＴＴＶＬＷは、３つの特定のアミノ酸の変更Ｇ２７２Ｖ、Ｐ３０１ＬおよびＲ４０６Ｗをコードすることが、ＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ領域の配列決定により確かめられた。ベクター配列を、ＮｏｔＩ消化および大きい断片のゲル精製により除去し、次いで、単個細胞ＣＢＡ ３Ｃ５７ＢＬ／６胚への前核注入により導入した。創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスをＰＣＲにより同定し、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑させた。分析した全てのトランスジェニックマウスは、ヘテロ接合体であった。マウスを、食物および水を自由に摂取させて、ケージあたり４匹飼育し、７時に光を開始する１２／１２時間明暗サイクルで、温度制御環境下に維持した。ＰＣＲスクリーニングを、オリゴヌクレオチドＴＴ１、５’−ＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号３２３、マウスｔｈｙ１遺伝子のエキソン２内）；ＴＴ２、５’−ＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＧＴＡＣＧ−３’ （配列番号３２４；ヒトタウｃＤＮＡの５９末端）；およびＴＨＹ、５’−ＣＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号３２５；マウスｔｈｙ１遺伝子のイントロン２内）を用いて、尾部ＤＮＡに対して行った。我々は、ＴＴ１およびＴＴ２を用いて、内因性マウスＤＮＡではなく導入遺伝子からの４７０−ｂｐ生成物を特異的に増幅し、ＤＮＡの内部対照として、ＴＴ１およびＴＨＹを用いて、導入遺伝子ではなくマウスゲノムＤＮＡからの４５０−ｂｐ生成物を特異的に増幅した。導入遺伝子は、海馬および前頭側頭皮質において主に発現された。

実験手順
鼻腔内ｓｉＲＮＡ投与の異なる濃度および時期を、トランスジェニックＭＡＰＴマウスモデルにおいて用いた。マウスを、２０μｌのＮａＣｌ（０．９％）（対照）または２０ｎｍｏｌ濃度の２０μｌのｓｉＲＮＡで処理した。

実験条件は、表２に記載するように分布させた（各条件は、３重に分析した）。マウスを、ＭＡＰＴについてのｓｉＲＮＡ（配列番号１６０）、１または２用量で鼻腔内処置し、ｓｉＲＮＡの接種後、異なる時間で屠殺した。

表２． 鼻腔内ｓｉＲＮＡ送達についての実験条件の分布の概略。ｓｉＲＮＡの用量は、表に示す。

ＣＮＳの異なる領域（皮質、海馬、線条体、小脳、脳幹または球）の試料を抽出し、ウェスタンブロット、免疫蛍光法および定量ＰＣＲによりさらに分析した。変異ヒトＭＡＰＴを特異的に認識する抗体を用いた。装填対照として、ベータ−アクチンに対する抗体を用いた。異なる処理条件でのＭＡＰＴ発現を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐプログラムの支援により測定した。阻害レベルを、異なる組織で構成的に発現されているベータ−アクチン遺伝子に関する標準化の後に得た。

ベータ−アクチンに関して標準化した後の、ＣＮＳの異なる領域におけるＭＡＰＴ発現阻害レベルの結果を、図６に示す。観察できるように、ＭＡＰＴ発現に対する阻害効果は、海馬で観察され、ここではトランスジェニックタンパク質が高レベルで発現された。遺伝子発現の下方制御が最高の動物条件は、ｓｉＲＮＡ注入の７日後に屠殺された動物に相当した。ウェスタンブロット実験の結果は、定量ＰＣＲにより確認された。

［参考文献１］
［参考文献２］
［参考文献３］

Claims (13)

1. 配列番号１２８、１２９および１５９から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、または配列番号２８８および２８９から選択されるヌクレオチド配列を有する、タウ遺伝子にＲＮＡ干渉を引き起こすｓｉＲＮＡの、タウ遺伝子に関連する障害の治療のための医薬品の調製における使用であって、前記医薬品が鼻腔内投与用に処方されており、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖の１９ヌクレオチドは、前記センス鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖上で少なくとも２ヌクレオチドの突出を含み、前記センス鎖は、標的がコードするＲＮＡのヌクレオチド配列を含む、使用。
2. 前記障害が、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病および／またはパーキンソン病、ならびにＣＮＳの遺伝子の変異に関連する先天性疾患である、請求項１に記載の使用。
3. 前記ｓｉＲＮＡが、治療を必要とする患者において、発現レベルが変化したタウの発現および／または変異を有するタウの発現を調節する、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記ｓｉＲＮＡが、タウの変異対立遺伝子の発現を調節する、請求項３に記載の使用。
5. タウ遺伝子の発現が、細胞内で調節される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
6. タウ遺伝子の発現が、ＣＮＳの細胞内で調節される、請求項５に記載の使用。
7. 前記ｓｉＲＮＡがｍｉＲＮＡレベルを調節する、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記３’突出がジヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記ジヌクレオチドの突出が、チミジンヌクレオチドで作られている、請求項８に記載の使用。
10. 複数の種のｓｉＲＮＡが用いられる、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
11. 前記複数の種が、同じｍＲＮＡ種を標的にする、請求項１０に記載の使用。
12. 前記複数の種が、異なるｍＲＮＡ種を標的にする、請求項１０に記載の使用。
13. 配列番号１２８、１２９および１５９から選択されるヌクレオチド配列を標的とする、または配列番号２８８および２８９から選択されるヌクレオチド配列を有する、タウ遺伝子にＲＮＡ干渉を引き起こすｓｉＲＮＡを含む、ＣＮＳ障害の治療用の医薬組成物であって、前記組成物は鼻腔内投与用に処方されており、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖の１９ヌクレオチドは、前記センス鎖の相補ヌクレオチドと塩基対を形成し、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖上で少なくとも２ヌクレオチドの突出を含み、前記センス鎖は、標的がコードするＲＮＡのヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。