JP5943587B2 - ジンゲロール配糖体、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規な化合物およびその製造法ならびに用途に関し、詳しくはショウガ成分であるジンゲロールの配糖体、当該化合物の製造方法、当該化合物の用途に関する。

ジンゲロールは、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）などＺｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ属植物の根茎等に含まれる精油成分であり、アディポネクチン産生増強効果（特許文献１）、脂肪蓄積抑制効果（非特許文献１）などの効能が知られ、肥満予防、糖尿病治療、冷え改善などの効能を有する飲食品および医薬品等への応用が期待されている。

上記精油成分は、例えばショウガから公知の手法により抽出することで得ることができる。

ジンゲロールを含有するショウガは薬用として利用される他、香辛料として食用に供されるなど、歴史的に安全な食品であることが証明されている。医薬品としては、消化薬、緩下剤、鎮咳剤、制酸薬の原料として使用される。食品としては調味料、清涼飲料、アルコール飲料、菓子類などに、また化粧品の香料としても使用されている。

しかしながら、有効成分のジンゲロールは、水に不溶であり、また、強い辛味を呈し、刺激がある。また、加熱あるいは酸性条件下においてより辛みの強く脂溶性の高いショウガオールまたはジンゲロンに変換されやすいことが知られている。このことから、ジンゲロールを安定した品質で、飲食品あるいは医薬品等へ利用することが困難であった。

そのような問題から、ジンゲロールの水溶性、安定性改善を目的として、特許文献２においては、ジンゲロールまたはジンゲロール含有物と糖類の熱処理物を組み合わせることにより、安定性および水溶性の高いジンゲロール含有水溶性組成物を得たことが開示されている。しかしながら、得られる組成物はカラメル状であることから汎用性が低く、また、エタノールが残存しているために直接飲食品へ利用しにくい等の問題点があった。

したがって、ジンゲロールの水溶性、安定性および味質などの物性が改善され、飲食品、医薬部外品および医薬品工業等において取扱が容易な汎用性の高いジンゲロール誘導体があれば、その産業利用価値が高くなることが期待された。

特開２０１１−１３８６号公報 特開２００８−５６５７２号公報

Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１１、５４：６２９５−６３０４

そこで本発明の目的は、水に可溶かつ安定性の高い新規ジンゲロール配糖体、その製法およびその用途を提供することにある。

本発明者らは、従来のジンゲロールの欠点を改善するために、とりわけ、糖転移反応を利用した新しいジンゲロール誘導体の開発を目指し、研究を重ねてきた。

その結果、水に可溶で、室温において固形粉末として存在可能であり、安定性の高いジンゲロール配糖体を、少なくともジンゲロールと、食品に利用可能なマルトース等の糖供与体を含む混合溶液に、糖転移酵素を作用させることにより合成可能であることを見出した。また、ある特定の糖転移酵素を使用することによって、ジンゲロールの側鎖に存在する、従来ジンゲロールの不安定さの原因とされていたβ−ヒドロキシケトンのＯＨ基を選択的に配糖化可能であることを見出し、さらに、その製造法並びに飲食物、医薬部外品および医薬品ならびに化粧品等への用途を開発して本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。

＜１＞ ジンゲロールのＯＨ基にグルコース、マルトースまたはマルトオリゴ糖が脱水縮合していることを特徴とするジンゲロール配糖体。
＜２＞ 下記一般式(I)で示されるジンゲロール配糖体である、＜１＞に記載のジンゲロール配糖体。

（式中、
Ｒはグルコシル基、マルトシル基またはマルトオリゴ糖のグルコシル基を示し、
ｎは２，４，６または８のいずれかの整数を示す。）
＜３＞ ジンゲロール配糖体が、下記式(II)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にグルコースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体である、＜１＞または＜２＞に記載のジンゲロール配糖体。

＜４＞ ジンゲロール配糖体が、下記式(III)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にマルトースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体である、＜１＞または＜２＞に記載のジンゲロール配糖体。

＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のジンゲロール配糖体を含有する組成物。
＜６＞ 飲食品である、＜５＞に記載の組成物。
＜７＞ 化粧品である、＜５＞に記載の組成物。
＜８＞ 医薬部外品または医薬品である、＜５＞に記載の組成物。

＜９＞ ジンゲロールまたはジンゲロールを含む植物抽出物に糖転移酵素を糖供与体の存在下で作用させる工程を含むことを特徴とする、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のジンゲロール配糖体の製造方法。
＜１０＞ 糖転移酵素が、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来である、＜９＞に記載のジンゲロール配糖体の製造方法。
＜１１＞ 植物が、ショウガである＜９＞または＜１０＞に記載のジンゲロール配糖体の製造方法。

本発明により、有用な生理作用を有し、かつジンゲロールに比べ水溶性、安定性が向上したジンゲロール配糖体を提供可能である。当該配糖体は、水に溶解しやすく、室温において固形粉末として存在可能であり、さらに品質が安定であることから、飲食品、医薬部外品および医薬品ならびに化粧品等へ広く利用することができる。さらに、ジンゲロールを配糖化することでジンゲロール自身の辛みが低減されることに加え、ショウガオール、ジンゲロンへの変換を抑制できることから、ショウガオールまたはジンゲロン由来の辛味を低減することが可能となり、味質を改善することが可能である。

各種糖転移酵素による６−ジンゲロールの配糖化を検討した薄層クロマトグラフィーの図（写真）である。図中のＭａｌはマルトース標準品、Ｇｌｃはグルコース標準品、Ｃはα−グルコシダーゼによる反応のコントロール、Ｃ´はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによる反応のコントロールを表す。その他の表記は、使用した酵素名を示している。図１ａは展開溶媒クロロホルム：メタノール:水=６：４：１（ｖ／ｖ）の場合、図１ｂは展開溶媒２−プロパノール: １−ブタノ―ル: 水＝２：２：１（ｖ／ｖ）の場合である。 反応生成物Ｘのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による分解試験の結果を示す薄層クロマトグラフィーの図（写真）である。図中のＭａｌはマルトース標準品、Ｇｌｃはグルコース標準品を表す。ＢおよびＡは、それぞれトリフルオロ酢酸処理前および処理後を意味する。 反応生成物ＸのＭＳスペクトルを表す図である。 反応生成物Ｘの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（全体図） 反応生成物Ｘの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（４〜９ｐｐｍ拡大図） 反応生成物Ｘの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（２〜５ｐｐｍ拡大図） 反応生成物Ｘの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（０．６〜３．０ｐｐｍ拡大図） 反応生成物Ｘの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（全体図） 反応生成物Ｘの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを表す図である。（５〜８０ｐｐｍ拡大図） 反応生成物ＹのＭＳスペクトルを表す図である。 反応生成物ＺのＭＳスペクトルを表す図である。 反応生成物Ｚのグルコアミラーゼ処理による分解結果を表す薄層クロマトグラフィーの図（写真）である。図中のＳはグルコース、反応生成物ＸおよびＹ、および６−ジンゲロールを混合した標準物質である。１は反応生成物Ｚ、２は反応生成物Ｚのグルコアミラーゼ処理物を示す。 反応生成物Ｘ（ジンゲロール６−グルコシド）の外観図（写真）である。ａは凍結乾燥粉体、ｂは０．２ｗ／ｖ％水溶液の様子。 反応生成物Ｘ（ジンゲロール６−グルコシド）の０．２ｗ／ｖ％水溶液の吸収スペクトルである。 反応生成物Ｘ（ジンゲロール６−グルコシド）の消化性試験結果を表すＴＬＣの図（写真）である。図中の数字は反応時間（分）を意味する。ａはラット小腸アセトン抽出物、ｂはヒト人工胃液、ｃはヒト人工腸液による試験結果を示す。 ジンジャーオイルを基質とした酵素反応による反応生成物Ｘ（ジンゲロール６−グルコシド）の生成を表すＴＬＣの図（写真）である。図中の６−ジンゲロールおよびジンゲロール６−グルコシドは、それぞれの標準物質を示し、１および２は、それぞれコントロールおよび酵素反応溶液である。 Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株およびＡ１０株の粗酵素液によるジンゲロール６−グルコシドの生成を表すＴＬＣの図（写真）である。図中のＭａｌはマルトース標準品、Ｇｌｃはグルコース標準品、Ａ８はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株の粗酵素による反応溶液、Ａ１０はＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ１０株の粗酵素による反応溶液を示す。図中矢印はジンゲロール６−グルコシドを示す。

〈１〉ジンゲロール配糖体
本発明のジンゲロール配糖体は、ジンゲロールのＯＨ基にグルコース、マルトースまたはマルトオリゴ糖が結合したものである。

ここで、マルトオリゴ糖のグルコース重合度は特に限定されないが、通常グルコース重合度３〜８であり、好ましくは３〜６である。

本発明により、上記ジンゲロール配糖体の構造、物性等が明らかにされたため、本明細書の記載に基づいて、上記ジンゲロール配糖体を合成及び使用することができる。本発明のジンゲロール配糖体としては、上記ジンゲロール配糖体であれば、その製法は問わず、生化学的手法による製法であっても、通常の有機化学的手法を用いた有機化学的合成法であってもよい。

しかし、安全性、経済性の観点から、ジンゲロールまたはジンゲロールを含むショウガ抽出物と糖供与体を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる生化学的手法により合成することが望ましい。

本明細書でいうジンゲロールとは、６−ジンゲロール、４−ジンゲロール、８−ジンゲロール、１０−ジンゲロール、及び３Ｓ，５Ｓ−６−ジンゲジオール、３Ｒ，５Ｓ−６−ジンゲジオール等のジンゲジオールから選ばれる１種または２種以上の混合物をいう。すなわち、本発明のジンゲロール配糖体は、６−ジンゲロール、４−ジンゲロール、８−ジンゲロール、１０−ジンゲロール、３Ｓ，５Ｓ−６−ジンゲジオール、３Ｒ，５Ｓ−６−ジンゲジオールから選ばれる１種の配糖体、または２種以上の配糖体の混合物であってよい。

一つの形態では、本発明のジンゲロール配糖体は、下記一般式(I)で示されるジンゲロール配糖体である。

（式中、
Ｒはグルコシル基、マルトシル基またはマルトオリゴ糖のグルコシル基を示し、
ｎは２，４，６または８のいずれかの整数を示す。）

別の形態では、本発明のジンゲロール配糖体は、下記一般式(II)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にグルコースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体である。

別の形態では、本発明のジンゲロール配糖体は、ジンゲロール配糖体が、下記式(III)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にマルトースがα−１位で結合したジンゲ
ロール配糖体である。

別の形態では、本発明のジンゲロール配糖体は、下記式(IIa)で示されるジンゲロール配糖体である。

別の形態では、本発明のジンゲロール配糖体は、下記式(IIIa)で示されるジンゲロール配糖体である。

〈２〉ジンゲロール配糖体の製造方法
本発明のジンゲロール配糖体の製造方法は、ジンゲロールまたはジンゲロールを含む植物抽出物に糖転移酵素を糖供与体の存在下で作用させる工程を含むことを特徴とする、ジンゲロール配糖体の製造方法である。

（糖転移反応に用いるジンゲロール）
本発明の製造方法の原料、すなわち、糖転移反応に用いるジンゲロール原料としては、通常、６−ジンゲロール、４−ジンゲロール、８−ジンゲロール、１０−ジンゲロール、３Ｓ，５Ｓ−６−ジンゲジオール、３Ｒ，５Ｓ−６−ジンゲジオール等のジンゲロール類だけでなく、ショウガ抽出物等の６−ジンゲロール、４−ジンゲロール、８−ジンゲロール、１０−ジンゲロール、３Ｓ，５Ｓ−６−ジンゲジオール、３Ｒ，５Ｓ−６−ジンゲジオール等のジンゲロール類を含む植物抽出物等の混合物、または、その他のジンゲロール類を含む混合物を適宜用いることができる。
本発明におけるショウガ抽出物等の植物抽出物とは、その成分としてジンゲロールを含有している限りその原料および製法（抽出法）に特段制限は無く、公知の製法により得ることができる。例えば、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）などＺｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ属植物等の植物全体、あるいは葉部、茎部、花部、果肉部、根部等を破砕、搾汁、粉末化、ペースト化等の加工を行うこと、更には必要に応じて熱水抽出、エタノール抽出、超臨界抽出等の抽出処理を行うことで得られる。市販のショウガ抽出物としてショウガオイル等を利用することも可能である。

（糖供与体）
生化学的手法により本発明のジンゲロール配糖体を製造する場合、糖転移酵素の作用によりジンゲロール配糖体が生成するものであれば、糖供与体に特に制限は無く、使用する糖転移酵素の特性に応じて糖供与体を適宜選択することができる。糖転移酵素としてα−グルコシダーゼまたは／およびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いる場合であれば、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖残基を含有するもの、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖、デキストリン、シクロデキストリン、アミロース等のα−グルカンと称される澱粉加水分解物、または澱粉およびそれらの混合物等を用いることができる。
糖転移酵素を用いてジンゲロール配糖体を製造する際は、澱粉や澱粉分解物にα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ等の加水分解酵素を作用させて糖供与体を生成
させた後、糖転移酵素を作用させても、上記澱粉や澱粉分解物を糖供与前駆体として酵素反応溶液に添加し、加水分解酵素と糖転移酵素を共に作用させてもよい。

（糖転移酵素）
本発明の糖転移酵素は、ジンゲロールと糖供与体とを含む溶液から、ジンゲロール配糖体を生成可能な酵素であれば種類を問わないが、α−グルコシダーゼ（酵素番号：ＥＣ．３．２．１．２０）、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（酵素番号：ＥＣ．２．４．１．１９）、スクロースホスホリラーゼ（酵素番号：ＥＣ．２．４．１．７）などが挙げられる。
本発明でいうα−グルコシダーゼとはα−グルカンの非還元末端のα−グルコシド結合の加水分解反応を触媒し、α−グルコースを生じさせる酵素全般を意味する。また、α−グルコシダーゼには、加水分解反応とともに糖転移反応を触媒するものが存在し、本発明においては、加水分解反応とともに糖転移反応を触媒するα−グルコシダーゼが用いられる。
上記糖転移酵素のうち、好ましくはα−グルコシダーゼが挙げられ、より好ましくはＨａｌｏｍｏｎａｓ属微生物由来のα−グルコシダーゼが挙げられる。
上記糖転移酵素、特にα−グルコシダーゼの由来には、ジンゲロール配糖体を生成可能な酵素であれば特に制限は無く、動物、植物由来およびＭｕｃｏｒ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＨａｌｏｍｏｎａｓ属等の微生物由来酵素を適宜選択すればよい。これらの内、好ましくはジンゲロールの複数あるＯＨ基のうち、側鎖のＯＨ基を選択的に配糖化する酵素、例えばＨａｌｏｍｏｎａｓ属微生物由来のα−グルコシダーゼが挙げられ、例えば、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ８株（平成２３年５月２日付、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９６、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ａ１０株（平成２３年５月２日付、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９７、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株（平成２３年５月２日付、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０９８、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託）由来のα−グルコシダーゼが挙げられる。

また、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属由来α−グルコシダーゼを用いれば、ジンゲロールの複数あるＯＨ基のうち、側鎖のＯＨ基を選択的に配糖化することが可能である。

これらの糖転移酵素は、ジンゲロール配糖体を作製可能である範囲であれば、必ずしも精製して使用する必要はなく、通常ならば粗酵素であってよい。また、組換え・非組換えを問わず、必要に応じて宿主を選択すればよく、公知の方法を駆使して精製して
使用してもよい。また、糖転移酵素源として、糖転移酵素を産生する微生物を用いてもよい。

本発明の製造方法において、本発明の効果を妨げない限り、使用する糖転移酵素に応じて、酵素の活性化剤等を用いてもよい。Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属由来のα−グルコシダーゼを使用する場合には、必要に応じて、酵素の活性化剤として塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化ルビジウム等のアルカリ金属塩またはアンモニウム塩等を添加することにより、酵素添加量または酵素反応時間を削減することができる。

活性化剤の濃度は、酵素が活性化される濃度であれば特に制限されず、通常カチオン濃度として１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌが適当である。経済性およびイオン負荷の点から、1μｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度とすることが望ましい。

使用酵素と反応時間には、密接な関係があることから、都合に応じて酵素使用量および
反応時間を選択すれば良いが、通常は、経済性の点から、約１〜１００時間で反応が終了できるような酵素添加量を選択する。このような濃度としては、通常、糖供与体１ｇあたり０．１〜１００Ｕ、好ましくは、糖供与体１ｇあたり０．２〜５０Ｕであればよい。
本発明の製造方法における、酵素反応溶液におけるジンゲロールの濃度は、通常、１ｗ／ｖ％以上、好ましくは、２〜３０ｗ／ｖ％であればよく、糖供与体濃度（ｗ／ｖ）は、ジンゲロールに対して、０．５〜３０倍の範囲が好ましい。

（反応条件）
本発明の製造方法における反応様式は、酵素反応が進む条件であれば、反応様式は特に限定されず、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し、または連続式で反応に使用することも可能である。糖転移酵素を産生する微生物の増殖中の培地にジンゲロールと糖供与体を共存させ、目的物質を生成させることも有利に実施できる。

本発明におけるジンゲロール配糖体調製のための反応方法は、通常、前述のジンゲロールと糖供与体とを含有する溶液に糖転移酵素を加え、該酵素が十分に作用する条件、通常、ｐＨ５〜１０、温度１５〜５３℃の範囲から選ばれる条件に維持して行う。

また、通常、ジンゲロールは水相と分離するため、アジテーターまたはスターラー等で攪拌しながら、またはローテーター等で反応容器自体を回転または振動させながら反応を行うことが好適である。必要であれば、乳化剤を混合させておいてもよい。

このように生じた生成物および然る糖供与体を共存させた状態で、さらにα−グルコシダーゼまたはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、またはその他の糖転移酵素を作用させることにより、グルコース重合度を２以上とすること、またはグルコース以外の糖を、グルコシル基に転移することも当然可能であり、また、そのようにして生じた物質はモノグルコシドよりも水溶性が高いと予想される。そのようにして生じたジンゲロール配糖体及びその派生物質も本発明の範囲に包含される。

酵素反応によりジンゲロール配糖体が生成した反応溶液には、通常、目的物であるジンゲロール配糖体の他、未反応物であるジンゲロール、糖供与体、場合によっては酵素、およびグルコース等の反応副生成物が混合している。

このような混合物には、必要に応じて、α−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．１．１．３）などによって加水分解処理を行い、残存した糖供与体を低分子化させることができる。

上記混合物および混合物加水分解処理物をそのまま、ジンゲロール配糖体を含む、飲食品用、化粧品用、医薬部外品用または医薬品用組成物として、飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品に使用することができる。

また、反応溶液を加熱する、またはｐＨを下げる等して酵素を失活させ、ろ過・濃縮して溶液状の、更には、乾燥、粉末化してジンゲロール配糖体含有組成物（製品）にし、飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品に使用することができる。

ジンゲロールとジンゲロール配糖体の水溶性の違いを利用して、然る抽出操作を行うことにより、それぞれを、油相および水相に分離させ、双方を回収することも有利に実施できる。通常は、ジンゲロール配糖体はより親水性の高い溶媒へ抽出されることから、これを更にイオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの方法で分離精製すれば、糖供与体、酵素、およびグルコース等の反応副生成物とも分離が可能であり、ジンゲロール配糖体の高純度品を容易に得ることができ
る。

この際、分離されるジンゲロールおよび糖供与体を、それぞれ回収し、糖転移反応の原料として再利用することも可能である。

また、糖転移反応終了後、抽出およびクロマトグラフィーなどの分離手段にかけるまでに、必要に応じてろ過、活性炭処理による脱色、酸性および塩基性イオン交換樹脂による脱ミネラル処理等をすることも有利に実施できる。

このようにして得られるジンゲロール配糖体は、以下の特徴を有する。
（１）下記に示す化合物

（２）下記に示す化合物

〈３〉ジンゲロール配糖体を含む組成物
上記のとおり、本発明のジンゲロール配糖体は、本発明の効果を妨げない限り、ジンゲロール配糖体以外に、植物抽出物成分、未反応物、酵素、反応副生成物等を含む組成物の形態でも使用することができる。
本発明のジンゲロール配糖体を含む組成物は、本発明のジンゲロール配糖体、及び通常飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品用成分として使用される成分を含むことができ、飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品等として使用することができる。
ジンゲロール配糖体の含有量は、各製品におけるジンゲロールの含有量を参考にして規定することができ、限定されないが、飲食品であれば０．０１〜１０質量％程度、化粧品であれば０．０１〜５質量％程度、医薬部外品または医薬品であれば０．０１〜１０質量％程度である。
本発明の組成物は、本発明のジンゲロール配糖体を含有する以外は、上記の様な通常の成分を用いて、通常の方法により、製造できる。
本発明のジンゲロール配糖体を添加することで、ジンゲロールの作用を利用した、アディポネクチン産生増強効果や脂肪蓄積抑制効果といった有用な生理作用を有した飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品を製造することができる。さらに、後述の実施例５および図１３に示した通り、本発明のジンゲロール配糖体は室温にて赤オレンジ色の粉末状であるため、着色料として飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品に添加することもできる。

上記飲食品としては、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬などの漬物類、たくわん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品類、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、煮魚、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品、冷凍食品、果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュースなどの果実・野菜飲料、サイダー、ジンジャーエールなどの炭酸飲料、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料などのスポーツ飲料、コーヒー飲料、緑茶などの茶系飲料、乳酸飲料、ココアなどの乳系飲料、チューハイ、清酒、果実酒などのアルコール飲料、栄養ドリンク等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記化粧品とは、薬事法により定められた化粧品を指し、例えば、日焼け防止剤、ローション、エッセンス、乳液、クリーム、ハップ剤、ペースト剤、ゲル剤、パウダー、ファンデーション、化粧水、パック剤などの基礎化粧品およびメイクアップ化粧品、石鹸、洗顔料、ボディソープなどの皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアートリートメント剤、養毛剤、育毛剤、ヘアスプレーなどのヘアケア製品、浴用剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記医薬部外品および医薬品とは、薬事法に定められた医薬部外品および医薬品を指し、例えば経口投与用製剤としてエキス剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、リモナーデ剤等の液剤とカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、錠剤等の固形剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

〈４〉試験及び評価方法
（酵素力価の測定）
本発明において、α−グルコシダーゼの酵素力価の測定は、例えば、０.２ｗ／ｖ％マルトースを基質として、ｐＨ７、３０℃、１００μＬの系で、特定量の酵素量から生じたグルコース量を測定することにより行うことができる。具体的には、例えば、上記系にて１０分間の酵素反応後、２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）を２００μｌ添加することにより酵素反応を終了させ、そこに、グルコーステストワコーＣ ＩＩ（和光純薬製）を１００μＬ添加し３７℃で３０分間インキュベートする。波長４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、生じたグルコース量を算出する。上記条件にて１分間に１μｍｏｌのマルトースを加水分解する酵素量を１Ｕと定義する。

シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの酵素力価の測定は、例えば、０．９ｗ／ｖ％の可溶性でんぷんを基質として、ｐＨ６、４０℃、１ｍＬの系で、特定の酵素量から生じたβ−シクロデキストリンを測定することにより以下の方法により行うことができる。具体的には、例えば、上記系にて１０分間の酵素反応後、４０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を２．５ｍＬ添加し酵素反応を終了させ、そこに２５０μＭの炭酸ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍＬのフェノールフタレインを含む溶液を０．３ｍＬ添加し、５５０ｎｍの吸光度を測定することにより、生じたβ−シクロデキストリン量を算出する。上記条件にて、１分間に１ｍｇのβ−シクロデキストリンを生成する酵素量を１Ｕとする。

以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞各種酵素による配糖体の調製検討
各種糖転移酵素により、ジンゲロールへの配糖化能を検討した。

まず、α−グルコシダーゼとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．由来およびＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０９８）由来のものを検討した。以後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の酵素を「ＡＮＧ」、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．由来の酵素を「ＡＣＧ」およびＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株由来の酵素を「ＨＡＧ」と表記する。なお、ＡＮＧおよびＡＣＧはそれぞれ「製品名：トランスグルコシダーゼアマノ、アマノエンザイム製」および「製品名：テイスターゼ、キリン協和フーズ製」である。ＨＡＧは、下記の参考例１の方法にて調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に単一バンドとして得られた精製酵素を使用した。

１０ｗ／ｖ％マルトース（日本食品化工製）、２．５ｗ／ｖ％ ６−ジンゲロール（ナカライテスク製）、５０ｍＭ緩衝液、各種α−グルコシダーゼをマルトース１ｇあたり１．５Ｕとなるよう反応溶液を調製し、１０μＬの系にて４０℃にて反応させた。ＨＡＧおよびＡＣＧの反応にはＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）、ＡＮＧには酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を使用した。また、ＨＡＧにおける反応系には、硫酸アンモニウムを５ｍＭとなるよう添加した。酵素の代わりに水を添加したｐＨ７における溶液をコントロールとした。

シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによる反応においては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｎｏ．３８−２由来およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ由来の酵素を使用した。以後、これらの酵素をそれぞれＣＧＴａｓｅ−１、ＣＧＴａｓｅ−２およびＣＧＴａｓｅ−３と表記することがある。なお、ＣＧＴａｓｅ−１はノボザイムズ製、ＣＧＴａｓｅ−２およびＣＧＴａｓｅ−３は日本食品化工製である。
酵素反応条件は以下の通りである。
すなわち、１０ｗ／ｖ％パインデックス＃１００（松谷化学工業製）、２．５ ｗ／ｖ％６−ジンゲロール、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、１２ｍＭ Ｃａ²⁺ 、パインデックス１ｇあたりシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ５Ｕとなるよう反応溶液を調製し、１０μＬの系にて反応させた。酵素の代わりに水を添加した溶液をコントロールとした。４０℃にて２４時間反応させ、反応溶液をメタノールにより１０倍希釈し、そのうち１μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析に供した。

ＴＬＣには、ＴＬＣアルミプレート（シリカゲル６０ Ｆ₂₅₄、 Ｍｅｒｃｋ製）を使用し、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール:水=６：４：１（ｖ／ｖ）または２−プロパノール: １−ブタノ―ル: 水＝２：２：１（ｖ／ｖ）を使用し、１０ ｖ／ｖ％硫酸／メタノール溶液を噴霧しオーブンで加熱することにより呈色させた。以後、上記ＴＬＣ条件をそれぞれ、ＴＬＣ条件１およびＴＬＣ条件２と記載する。標品としてグルコース（関東化学製）、マルトース（日本食品化工製）の１ｗ／ｖ ％水溶液を１μＬ使用した。

その結果、ＨＡＧによる反応溶液にのみ図１中矢印で示した特異的な反応産物が観察された。本分析で使用したいずれの展開溶媒においても主要な反応生成物スポットが1つ確認された。また、若干ではあるものの、その下に６−ジンゲロール由来と推察されるスポットが２つ確認された。そこで、生成物をＴＬＣにおいて上から、反応生成物Ｘ、Ｙ、およびＺとし、これらを単離精製した。

＜参考例１＞Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１由来α−グルコシダーゼの組換え発現および精製
可溶性澱粉（関東化学製）１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（和光純薬製）５ｇ／Ｌ、酵母抽出物（商品名『イーストエキストラクト』、ベクトン・ディッキンソン製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（和光純薬製）３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（関東化学製）１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物（関東化学製）０．２ｇ／Ｌ、および水からなるｐＨ７の液体培地１０ｍＬを２００ｍＬのバッフル付きフラスコに調製し、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し冷却した。

上記培地１０ｍＬに、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株のグリセロールストックを接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに１ｍＬずつ分注し遠心分離（４℃、１４，０００ｒｐｍ、２分間）し上清を取り除いた。５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（生化学工業製）、ＴＥ溶液（ｐＨ８）をチューブ１本当たり３５０μＬ添加し、３７℃にて１時間保持した。１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５０μＬ添加し転倒混和し３７℃にて３０分間保持した。ＴＥ飽和フェノールを４００μＬ添加し穏やかに転倒混和した後遠心分離（室温、１４，０００ｒｐｍ、５分間）した。上層を新たなエッペンドルフチューブに移した後、フェノールクロロホルム溶液を４００μＬ添加し穏やかに転倒混和し、上記と同様に遠心分離した。それぞれの上層を一つのエッペンドルフチューブに移し、３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液および９５（ｖ／ｖ％）冷エタノールを、それぞれ溶液の１／１０容量および２倍容量添加し遠心分離（４℃、１４，０００ｒｐｍ、１５分間）した。得られた沈殿物を７０％エタノールにてリンス洗浄し風乾した。０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ／ＴＥ溶液を４００μＬ添加し、３５℃にて３０分間保持した。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿法を上記と同様に行い、乾燥させた沈殿物をＴＥ溶液１００μＬに溶解し、ゲノム溶液とした。

クローニング用オリゴヌクレオチド、ＨＡＧ−Ｆ−ＮｄｅＩ（５´−ＡＡＡＣＡＴＡＴ
ＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧ−３´）（配列番号１）およびＨＡＧ−Ｒ−ＸｈｏＩ（５´−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧ−３´）（配列番号２）を用いてＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｈ１１株のα−グルコシダーゼをクローニングした。すなわち、ゲノム１００ｎｇ、１０×ＫＯＤ ｖｅｒ．２ ｂｕｆｆｅｒ、 ５μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ５μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭgＳＯ₄ ３μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌのプライマー溶液各１μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μＬを混合し、水で５０μＬにメスアップした。なお、上記ＰＣＲ用の試薬は全て東洋紡製である。ＰＣＲ条件は以下の通りである。９４℃に２分間保持した後、９４℃に３０秒間、５５℃に３０秒間、７２℃に２分間からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃に３分間保持した。このうち４μＬを電気泳動に供し、約１．５ｋｂの増幅断片を確認した。当該断片を市販のキット（ＧＥヘルスケア製、商品名『ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ^TM ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ』、以後、「ＧＦＸ」と表記する）にて精製した。これを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ製）で酵素処理し、ＧＦＸにて精製した。本ＤＮＡ断片を、上記と同様にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理したｐＥＴ２２ｂ(ノバジェン製)に、通常のライゲーション反応にて連結させ発現用プラスミドを作製した。本プラスミドを『ｐＥＴ２２ｂ−ＨＡＧ−Ｈ１１』と命名した。

上記ｐＥＴ２２ｂ−ＨＡＧ−Ｈ１１で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＩＬ（ストラタジーン製）を形質転換した。
すなわち、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍＬに、上記形質転換体を接種し、３７℃で一晩前培養した。このうち１ｍＬを６００ｍＬの同培地に接種し、３７℃で３時間培養した。それを氷冷し、０．１ｍｏｌ／Ｌのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬製）を６００μＬ添加した。これを１６℃で２４時間回転振盪培養した。得られた培養物を、定法に従い、遠心分離して菌体を回収した。菌体を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）約４０ｍＬに懸濁して、超音波破砕機（ｍｉｃｒｏｓｏｍ（商標） ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）にて細胞を破砕した（出力：４ワット、全出力時間： ２０分間）。これを遠心分離した上清を粗酵素液とした。

粗酵素液には８９．１ ｍｇのタンパク質、８３．３ Ｕのα−グルコシダーゼ活性が含まれていた。比活性は０．９３Ｕ／ｍｇであった。なお、タンパク質の定量は、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を使用して、添付のプロトコルに従って行った。タンパク質の標準曲線は０〜１ｍｇ／ｍｌのｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を用いて作成した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。

粗酵素液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化されたイオン交換カラムに、以下の条件で供し、塩化ナトリウム濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ付近に溶出された画分（部分精製酵素１）を回収した。

（条件）
カラム ： ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
カラムサイズ： φ２６ｍｍ×２００ｍｍ
ゲル量 ： １０６ｍＬ
溶出液 ： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７）
塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
流速 ： ２ｍＬ／分
溶出液量 ： １２０ｍＬ

部分精製酵素１には、５４ｍｇのタンパク質、３７４Ｕの酵素活性が含まれていた。比活性は６．９３Ｕ／ｍｇであった。なお、本α―グルコシダーゼは、アルカリ金属塩に活性化される特徴を有することから、粗酵素液と比較して総活性が上昇した原因は、溶出液中に含まれるＮａＣlの影響であると考えられた。

前記部分精製酵素１に、硫酸アンモニウムを少量ずつ加え、終濃度１．５ｍｏｌ／Ｌとした。これを１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した疎水カラムに、以下の条件で供した。そして、硫酸アンモニウム濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ付近で溶出された画分、約５０ｍＬを回収した。これを、５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）５Ｌで２回透析し、精製酵素とした。

（条件）
カラム ： ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＢＵＴＨＹＬ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）
カラムサイズ ： φ１６ｍｍ×１５０ｍｍ
ゲル量 ： ３０ｍＬ
溶出液 ： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）
硫酸アンモニウム濃度１．５ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
流速 ： １ｍＬ／分
溶出液量 ： １２０ｍＬ

精製酵素には、１７．８ｍｇのタンパク質と、６７．５Ｕの酵素活性が含まれており、比活性は３．８Ｕ／ｍｇであった。粗酵素液からの回収率は、８１．４％であり、精製度は４．１倍であった。この画分を１μｇ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、１本のバンドのみが検出されたことから、酵素は単一に精製されていることが分かった。得られた精製酵素を実施例に用いた。

上記記載において、比活性はタンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を示し、回収率は、粗酵素液の総活性に対する酵素活性の残存率（％）を示し、精製度は、粗酵素液の比活性に対する倍率（倍）を示す。

＜実施例２＞生成物の精製
ジンゲロール配糖体の単離精製法は以下の通りである。まず、３０ｗ／ｖ％マルトース、５ｗ／ｖ％６−ジンゲロール、５ｍＭ硫酸アンモニウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）およびマルトース１ｇあたり３ＵのＨＡＧとなるよう、計３ｍＬの溶液を調製しよく攪拌した後、４０℃で４８時間インキュベートした。反応溶液をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０Ｆ₂₅₄、２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ製）に５００μＬ/枚となるようにスポッティングし、クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１（ｖ／ｖ）またはクロロホルム：メタノール：酢酸＝８０：２０：５で展開した。展開プレートの方端を前述の方法と同様に呈色させ、各反応生成物のスポットと同Ｒｆ値の展開をスパーテルで掻き取り、５０ｖ／ｖ％メタノール水溶液で抽出した。抽出液をろ紙（Ｎｏ．５、アドバンテック製）でろ過し、減圧濃縮した。これを水に溶解し、０．４５μｍフィルター（ミリポア製）にてろ過し凍結乾燥させた。これを以後の実験に用いた。

＜実施例３＞反応生成物Ｘの構造解析
（トリフルオロ酢酸による分解）
精製した生成物Ｘおよび６−ジンゲロール標品をそれぞれ０．５ ｍｇずつ量り取り、それに純水５０μＬを添加した。これに４Ｍトリフルオロ酢酸（関東化学製、以下ＴＦＡと表記することがある）を４００μＬ添加し、１００℃に１時間保持した。減圧下にて濃縮・乾固させたものを５０ｖ／ｖ％メタノール水溶液４０μＬに溶解し、実施例１で上述したＴＬＣ条件２で分析した。なお、ＴＦＡ添加前のサンプルも同様に分析した。その結果、生成物Ｘは、図２に示すように、ＴＦＡ処理により６−ジンゲロール（もしくはその分解物）とグルコースの位置にスポットを生じた。このことから、反応生成物Ｘは６−ジンゲロールとグルコースから構成される化合物である可能性が示唆された。

（ＭＳ（質量分析、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）解析）
反応生成物Ｘを０．１ｍｇ／ｍＬとなるようメタノールに溶解し、質量分析に供した。分析には、ＬＣＱ（Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ製）を用い、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）により実施した。測定はポジティブモードで行った。その結果、図３に示したようなＭＳスペクトルが得られ、そのピークおよび対応する分子量（Ｍ）は、表１の通りであった。

すなわち、反応生成物Ｘにおいては、６−ジンゲロール（分子量２９４）にグルコースが一つ付加した配糖体（分子量４５６）およびＥＳＩによってその配糖体のグリコシド結合が切断され、さらに、それにより生じた６−ジンゲロールが脱水し生成したと考えられるショウガオール（分子量２７６）に相当するピークが検出された。

（ＮＭＲ解析）
ＢＲＵＫＥＲ社製 ＡＶ４００ＭｄｉｇｉｔａｌＮＭＲ（４００ＭＨｚ）を使用しＨ−Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣの二次元分析を行った。詳細には、精製し凍結乾燥した反応生成物Ｘ１０ｍｇを０．５ｍＬのＤ₂Ｏ（ナカライテスク、９９．９０％Ｄ）に溶解し、標準物質として０．１ｍｇ／ｍＬの３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム−２，２，３，３−ｄ₄（ＴＳＰ、和光純薬）を２μＬ滴下したものを分析に供した。分析時の温度を３０３ケルビンに設定した。
ＮＭＲ解析の結果から、各シグナルを以下のように帰属した。なお、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲの解析結果は図４〜９に示した。

¹Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ)
δ６．９３（ｓ，１Ｈ，１６），６．８８（ｄ，１Ｈ，１３）， ６．７５（ｄ，１Ｈ，１２），５．００（ｄ，１Ｈ，１´），４．０５（ｍ，１Ｈ，６），３．９０（ｄｄ，１Ｈ，６´ａ），３．８５（ｓ，３Ｈ，１７），３．７０（ｄｄ，１Ｈ，６´ｂ), ３．６０（ｔ，１Ｈ，３´），３．５０（ｔ，１Ｈ，２´），３．４９（ｔ，１Ｈ，５´），３．４２（ｔ，１Ｈ，４´），２．９５（ｄ，２Ｈ，９），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，７ａ），２．８５（ｄ，２Ｈ，１０），２．５２（ｄｄ，１Ｈ，７ｂ），１．５３（ｍ，１Ｈ，５ａ), １．３８（ｍ，１Ｈ，５ｂ），１．２５（ｍ，２Ｈ，２），１．２２（ｔ，２Ｈ，３）， １．２２（ｔ，２Ｈ，４），０．８５（ｔ，３Ｈ，１）

１３Ｃ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）
δ１４７．３６（１５），１４３．１０（１４），１３３．５６（１１），１２１．０８（１２），１１５．５６（１３），１１２．８８（１６），９６．５７（１´），７５．９７（５´），７４．１６（６），７３．８４（３´），７２．９５（８），７１．２８（２´），６９．２９（４´),６０．１９（６´），５６．０１（１７），４７．４３（７），４４．６６（９），３２．４１（５），３０．９７（４），２８．９２（１０），２３．５５（３），２１．８３（２），１３．２６（１)

ＨＭＢＣにおいてＨ１´−Ｃ６およびＨ６−Ｃ１´の相関が確認されたため、配糖化部位をＣ６のＯＨ基と決定した。
以上、ＴＦＡ処理、ＭＳ解析およびＮＭＲ解析の結果より、ＨＡＧによる６−ジンゲロールの配糖化反応により生じた主生成物Ｘは、下記式（IV）で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にグルコースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体であることが明らかとなった。以降、反応生成物Ｘを簡易的に、ジンゲロール６−グルコシドと呼ぶことがある。

＜実施例４＞反応生成物ＹおよびＺの構造解析
（反応生成物ＹおよびＺのＭＳ解析）
各精製物を実験３と同様の方法にてＭＳ解析した。その結果、図１０および１１に示したようなＭＳスペクトルが得られ、その主要ピークおよび対応する分子量（Ｍ）は表２の通りであった。

すなわち、反応生成物ＹのＭＳ分析において検出された分子量は、６−ジンゲロール（分子量２９４）が脱メトキシされた物質（分子量２４６）および当該物質のモノグルコシド（４１０）に相当していた。本生成物は、生成量が微量でありＮＭＲ解析に不十分であったことから、ＭＳ分析結果より以下の構造であると推定した。
反応生成物Ｙ：脱メトキシされた６−ジンゲロールのいずれかのＯＨ基にグルコースが脱水結合した化合物。
反応生成物Ｚの、６４１ｍ／ｚは、６−ジンゲロールにグルコース （分子量１８０）が２分子縮合し、ナトリウムイオンが付加した分子量 （２９４＋１８０＋１８０−１８−１８＋２３＝６４１）と一致した。

（反応生成物Ｚのグルコアミラーゼ処理）
反応生成物Ｚは、Ｙと同様に生成量がごく微量であったことから、ＮＭＲ解析に不十分であった。そこで、反応生成物Ｚにグルコアミラーゼを作用させ、その反応生成物をＴＬＣにて分析することにより、反応生成物Ｚの構造を推定した。すなわち、０．１ｇ／ｍＬ反応生成物Ｚ、４Ｕ／ｍＬグルコアミラーゼ（生化学工業製）、４ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）となるよう混合し、４０℃にて２４時間インキュベートした。コントロールとして、グルコアミラーゼ無添加のものを同様にインキュベートした。２μＬをＴＬＣに供し、実施例１で上述のＴＬＣ条件２により分析した。なお、６−ジンゲロール、反応生成物ＸおよびＹ、およびグルコースを混合し５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液を標準物質としてスポッティングした。その結果、図１２に示すように、Ｚをグルコアミラーゼ処理すると反応生成物Ｘ（ジンゲロール６−グルコシド）を生成することが分かった。これは、反応生成物Ｚは、反応生成物Ｘのグルコース残基にさらにもう一分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合した構造を取っていることを意味していた。さらに、本実施例の酵素反応において使用したＨａｌｏｍｏｎａｓ属由来α−グルコシダーゼは、α１，４型の転移酵素であることから、その結合様式はα−１，４であると考えられた。以上、ＭＳおよび本結果より、反応生成物Ｚは、以下の構造であると推定した。
反応生成物Ｚ：６−ジンゲロールの側鎖ＯＨ基にマルトースがα−１位で結合した化合物であることが明らかとなった。

＜実施例５＞ジンゲロール６−グルコシドの外観、溶解性および吸収極大
精製したジンゲロール６−グルコシドの凍結乾燥品は、図１３に示すように、室温にて赤オレンジ色の粉末状であり、水に可溶であった。また、０．２ｗ／ｖ％の水溶液を調製し、幅１０ｍｍの石英セルにて、波長６００〜２００ｎｍにおける吸収スペクトルを測定したところ、ジンゲロール６−グルコシドは、図１４に示すように、波長２７８ｎｍに吸収極大を有していることがわかった。

＜実施例６＞反応生成物の消化性
ジンゲロール６−グルコシドの、ラット小腸アセトンパウダー、ヒト人工胃液およびヒト人工腸液による、消化性試験を行った。
（ラット小腸アセトンパウダーによる消化性）
ラット小腸アセトンパウダー（Ｓｉｇｍａ製）５０ｍｇを純水１ｍＬに溶解し、ボルテックスにてよく混合した後氷冷した。これを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を酵素液として用いた。ジンゲロール６−グルコシド１ｍｇに０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）１０μＬ、および酵素液９０μＬを添加しよく混合し３７℃でインキュベートした。これを経時的にサンプリングし、１μＬをＴＬＣプレートにスポッティングしドライヤーで即座に乾燥させることにより反応を停止した。実施例１で上述したＴＬＣ条件２にて分析し、スポットの消失を観察した。

（ヒト人工胃液による消化性）
Ｐｅｐｓｉｎ １：１００ （和光純薬製）３．２ｍｇ、ＮａＣｌ２．０ｍｇおよびＨ
Ｃｌ ７μＬを混合し、純水にて０．８ｍＬにメスアップしたものを人工胃液とした。ジンゲロール６−グルコシドを０．５ｍｇ量り取り、純水１０μＬに溶解した。これに人工胃液を４０μＬ添加し、３７℃にてインキュベートした。これを経時的にサンプリングした。上記と同様の方法にて反応を停止し、ＴＬＣ分析した。

（ヒト人工腸液による消化性）
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（和光純薬製）１０ ｍｇ、０．２Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄ ２５０μＬおよび０．２Ｍ ＮａＯＨ １１８μＬを混合し、純水にて０．８ｍＬにメスアップしたものを人工腸液とした。ジンゲロール６−グルコシドを０．５ｍｇ量り取り、純水１０μＬに溶解した。これに人工腸液を４０μＬ添加し、３７℃にてインキュベートした。以後の操作は上記と同様である。

各種消化酵素による、ジンゲロール６−グルコシドの消化性試験の結果、図１５に示すように、ラット小腸アセトン抽出物、ヒト人工胃液およびヒト人工腸液にいずれにおいても、１２０分間の処理においてジンゲロール６−グルコシドは減少しなかった。すなわち、ジンゲロール６−グルコシドは、これらの消化酵素には分解されず、このような消化酵素に対して安定であることがわかった。

＜実施例７＞ジンゲロール６−グルコシドの安定性
ジンゲロール６−グルコシドを１ｍｇ量り取り、５０％エタノール、０．１Ｍ ＨＣｌの水溶液１ｍＬに溶解した。これを、密栓可能な容器で、６０℃にて１８時間インキュベートしたときの残存率を測定することにより、ジンゲロール６−グルコシドの安定性を評価した。すなわち、サンプルを２０μＬずつ採取し、これをアセトニトリル：水＝８０：２０（ｖ／ｖ）の溶液１８０μＬと混合した。これをＨＰＬＣ分析に供した。インキュベート０時間におけるジンゲロール６−グルコシドのＵＶ吸収ピーク面積を１００（％）としたときの、１８時間後における相対ピーク面積を残存率（％）とした。なお、比較対象として、６−ジンゲロールの安定性を同様に評価した。

測定条件は下記の通りである。
カラム ： ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８（ＡＳ−３０３、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
溶媒 ： アセトニトリル：水＝７：３（ｖ／ｖ）
流速 ： １ｍＬ／分
温度 ： ３０℃
検出 ： ＵＶ２８０ｎｍ
注入量 ： ２０μＬ

なお、本条件における各物質の溶出時間は以下の通りである。
ジンゲロール６−グルコシド ： ３．０分
６−ジンゲロール ： ４．７分
６−ショウガオール ： ７．８分
本試験の結果、処理１８時間後において、６−ジンゲロールは、約半量が６−ショウガオールへ変換しており、残存率は４９％であった。一方で、ジンゲロール６−グルコシドの残存率は９４％であった。このことから、６−ジンゲロールの構造が変化しやすい０．１ＭのＨＣｌ溶液においても、ジンゲロール６−グルコシドは安定であることがわかった。

＜実施例８＞ジンジャーオイルを基質とした反応
１０％ｖ／ｖジンジャーオイル（稲葉香料製）、２０％ｗ／ｖマルトース、５ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）および０．３Ｕ／ｍＬ
のＨＡＧを含む１ｍＬの水溶液を調製し、４０℃にて９３時間酵素反応させた。なお、酵素無添加のものをコントロールとした。反応溶液を熱失活し、１μＬを、実施例１で上記に示したＴＬＣ条件２にて分析した。なお、標品として、６−ジンゲロールおよび単離精製したジンゲロール６−グルコシドを分析に供した。
その結果、図１６に示すように、反応後の主生成物としてジンゲロール６−グルコシドと同Ｒｆ値にスポットが現れた。このことから、６−ジンゲロール以外の成分を含むジンジャーオイルを基質とした場合においても、ＨＡＧによりジンゲロール６−グルコシドを生成可能であることがわかった。

＜実施例９＞Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株およびＡ１０株由来酵素による反応
参考例１に示したＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｈ１１株の培養と同条件において、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株およびＡ１０株を１００ｍＬの培地にて好気的に培養し、遠心分離により集菌した。菌体を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）３０ｍＬに懸濁し、それぞれ超音波破砕機（ｍｉｃｒｏｓｏｍ（商標） ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）にて細胞を破砕した（出力：４ワット、全出力時間：２０分間）。これを遠心分離した上清を粗酵素液とした。Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８株およびＡ１０株の粗酵素液のα−グルコシダーゼ活性は、それぞれ０．０３２Ｕ／ｍＬおよび０．０２３Ｕ／ｍＬであった。

１０ｗ／ｖ％マルトース（日本食品化工製）、２．５ｗ／ｖ％ ６−ジンゲロール（ナカライテスク製）、５ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）、上記粗酵素液を、α−グルコシダーゼ活性としてマルトース１ｇあたり０．１５Ｕとなるよう反応溶液を調製し、１０μＬの系にて３７℃にて１７時間反応させた。反応溶液１μＬを実施例１で上記に示したＴＬＣ条件２にて分析した。その結果、図１７に示すように、ジンゲロール６−グルコシドが生成していた。このことから、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ａ８およびＡ１０株の未精製酵素においてもジンゲロール６−グルコシドを生成可能であることがわかった。

Claims (9)

1. 下記一般式(I)で示されるジンゲロール配糖体。
   
   （式中、
   Ｒはグルコシル基、マルトシル基またはマルトオリゴ糖のグルコシル基を示し、
   ｎは２，４，６または８のいずれかの整数を示す。）
2. ジンゲロール配糖体が、下記式(II)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基にグルコースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体である、請求項１に記載のジンゲロール配糖体。
   
3. ジンゲロール配糖体が、下記式(III)で示される、６−ジンゲロールの側鎖のＯＨ基に
   マルトースがα−１位で結合したジンゲロール配糖体である、請求項１に記載のジンゲロール配糖体。
   
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のジンゲロール配糖体を含有する組成物。
5. 飲食品である、請求項４に記載の組成物。
6. 化粧品である、請求項４に記載の組成物。
7. 医薬部外品または医薬品である、請求項４に記載の組成物。
8. ジンゲロールまたはジンゲロールを含む植物抽出物にＨａｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来の糖転移酵素を糖供与体の存在下で作用させる工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のジンゲロール配糖体の製造方法。
9. 植物が、ショウガである請求項８に記載のジンゲロール配糖体の製造方法。