JP5955855B2 - 幹細胞の観察方法、分化傾向状態の細胞領域の除去方法、及び、幹細胞の観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞の観察方法、分化傾向状態の細胞領域の除去方法、及び、幹細胞の観察装置に関する。特に本発明は、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別可能な幹細胞の観察方法、分化傾向状態と識別された細胞領域の除去方法、及び、幹細胞の観察装置に関する。

ヒト由来のＥＳ細胞（胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）といった幹細胞は、多種類の細胞に分化する能力を有している。このような幹細胞を大量に培養した後に目的の細胞に分化させることによって、病気の解明、創薬スクリーニング、毒性試験、又は、再生医療といった、これまで困難であったヒト細胞を用いた大規模な薬効評価又は医療への応用が可能となるため、幹細胞が注目されている。

ところで、未分化状態を維持して幹細胞を培養する過程において、未分化状態を維持できずに分化傾向状態となってしまう細胞があり、このような細胞の出現により、幹細胞全体の品質を低下させてしまうことがあった。そのため、幹細胞の品質管理の重要性が指摘されているが、適切な品質管理を行うには、幹細胞をモニタリングし、分化又は未分化の状態を判別し、未分化状態を維持していない分化傾向にある細胞を除去する必要がある。

このように分化又は未分化の状態を判別する方法として、位相差コントラスト顕微鏡などの光学顕微鏡を用いて、透過照明にて得られる透過光画像を目視で判断して、未分化状態の幹細胞コロニーと分化傾向にある幹細胞コロニーとの判別を行うことが行われている（例えば、非特許文献１の１７頁参照）。そして、目視判断により分化傾向にあると判断したコロニーは最終的にはピペットなどで吸引して回収され、除去される。

「ヒト多能性幹細胞培養実習プロトコール」、[online]、理化学研究所 発生・再生科学総合研究センター 幹細胞研究支援・開発室、［平成２３年９月２２日検索］、インターネット＜URL:http://www.cdb.riken.jp/hsct/protocol.html＞

ところで、上述した位相差コントラスト顕微鏡などの光学顕微鏡を用いた判別方法は、目視による細胞の微妙な形状の違いを判別することによって行われているため、観察者の主観や経験に左右されやすく、見落としが起きやすかった。また、未分化のマーカーとなる遺伝子発現をターゲットとしたレポーター遺伝子の導入により、蛍光や発光にてラベルすることにより確認する方法があるが、レポーター遺伝子を安定発現するヒト幹細胞株を作成する必要がある。

また、幹細胞を固定した後に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ：Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性又は特性のタンパク質などの未分化マーカーの存在を、色素の発色又は蛍光抗体を用いて確認する手法がある。しかし、この手法では、幹細胞の培養を継続することができないので、抜き取り確認程度にしか用いることができない。

本発明の一態様に係る観察方法は、透明部材内に幹細胞を配置するステップと、透明部材を導光部材上に光学媒体を介して載置するステップと、導光部材中に照明光を入射し光学媒体を介して当該照明光を、溶液が収容された透明部材内の幹細胞に向けて出射させるステップと、幹細胞に向けて出射された照明光が幹細胞によって散乱し、導光部材を透過した当該散乱光を検出するステップと、を備えている。

上述した一態様に係る観察方法では、幹細胞に向けて出射された照明光が幹細胞によって散乱し、導光部材を透過した当該散乱光を検出することによって、幹細胞を観察している。このような幹細胞によって散乱した散乱光を検出する観察方法によれば、幹細胞を透過した透過光を検出する観察方法に比べて、分化傾向状態にある幹細胞をより暗く表示させることができる（例えば、図９又は図１０参照）。このため、この一態様に係る観察方法によれば、散乱光を用いるといった簡易な手法により、幹細胞をラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別することができる。

また、仮に幹細胞を観察するのに培養液を用いなくてもよければ屈折率の関係から導光部材を用いなくても斜向照明を容易に行うことができるが、幹細胞を観察するには、透明部材内に幹細胞を配置すると共に透明部材中に培養液を収容する必要がある。上述した一態様に係る観察方法であれば、導光部材と光学媒体とを用いることによって、幹細胞を観察するための斜向照明を容易に得ることができる。

上述した一態様に係る観察方法では、散乱光の強度を指標としているために、強度分布の２次元情報と細胞コロニーの存在位置とさえ把握できれば、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別することができる。そのため、顕微鏡だけでなく、マクロレンズなどの低倍のレンズを用いて、透明部材である容器全体や容器の光範囲を一度に観察して判断することが可能である。

上述した一態様に係る観察方法において、照明光を幹細胞に向けて出射させるステップで、幹細胞に照射される照明光が、透明部材を導光部材上に載置する方向に対して斜めに出射されるようにしてもよい。この幹細胞に向けて斜めに出射される照明光の出射角度が、載置方向に対して５３度〜９０度の間であってもよい。照明光の出射角度が上述した範囲にあることにより、未分化状態にある幹細胞コロニーと分化傾向状態にある幹細胞コロニーとのコントラストがより明確になり、両者の識別がより一層簡単になる。

上述した一態様に係る観察方法において、散乱光を検出するステップで、幹細胞によって散乱し導光部材を透過した散乱光の画像を撮像部で取得するようにしてもよい。細胞からの散乱光強度画像を高い信号／ノイズ比で取得するためには、暗視野照明などを行うことが一般的であり、そのためには顕微鏡下にて差動距離の短い高いＮＡのコンデンサレンズを使用する必要があり、透明部材内に存在する幹細胞に対してコンデンサレンズを近づけなければならないために、操作が難しかった。しかしながら、本発明の一態様に係る観察方法によれば、散乱光画像を取得する目的で、幹細胞が配置された透明部材を載置する導光部材を利用している。そのため、画像を得るための操作が容易であり、且つ、高い信号／ノイズ比で散乱光強度画像を取得することができるようになる。

上述した一態様に係る観察方法は、透明部材を保持機構で保持するステップと、撮像部で取得した散乱光画像を表示部によって表示させるステップと、表示させるステップで表示された散乱光画像における所定の細胞領域に対する選択入力を受け付けて当該選択された領域に対応するマーカーを当該画像上に表示させるステップと、幹細胞の散乱光画像を取得した後、導光部材を透明部材の下方から退避させるステップと、幹細胞の透過光画像を撮像部で取得して、当該透過光画像を表示部によって表示させるステップと、透過光画像を表示させるステップで表示された透過光画像上にマーカーを重ねて表示させるステップと、を更に備えるようにしてもよい。

この場合、透過光画像上において、分化又は未分化にかかわらずコロニーの存在位置を把握することができる。また、導光部材を透明部材の下方から退避させるステップを有していることから、幹細胞が配置された透明部材の底面側へのアクセス自由度を高めることができる。そして、散乱光画像にて判別した細胞コロニーに対して、細胞の入っている透明部材を別の装置に移動することなく、透過光画像上のマーカーに対応する透明部材の所定の領域に印を付与するといったようなことを行うことができる。これにより、分化傾向状態にある幹細胞コロニーの位置を容易に認識することができる。

上述した何れかの態様に係る幹細胞の観察方法によって透明部材内の幹細胞を観察し、当該観察によって幹細胞のうち分化傾向状態であるとされた細胞領域を除去するようにしてもよい。この場合、未分化状態にある幹細胞コロニーと分化傾向状態にある幹細胞コロニーとの識別が容易且つ確実であり、このような容易且つ確実な識別に基づいて分化傾向状態にある幹細胞コロニーを除去できるため、幹細胞の品質管理を容易に行うことができる。

また、本発明の一態様に係る観察装置は、透明部材内に配置された幹細胞を観察するための観察装置である。この観察装置は、透明部材を載置可能な面を有する導光部材と、導光部材中に照明光を入射し、透明部材と導光部材との間に配置される光学媒体を介して当該照明光を、培養液が収容された透明部材内の幹細胞に向けて出射させる第１の光源と、導光部材を移動させる移動部と、移動部で導光部材を移動させる際に透明部材を保持する保持部と、保持部で保持された透明部材内に配置された幹細胞に向けて照明光を照射する第２の光源と、第１の光源からの照明光が幹細胞によって散乱し導光部材を透過した当該散乱光、及び、第２の光源からの照明光が幹細胞を透過した透過光をそれぞれ撮像する撮像部と、を備えている。

上記の一態様に係る観察装置によれば、幹細胞によって散乱した散乱光を撮像して、散乱光画像を容易に取得することができ、これにより、分化傾向状態にあり暗く表示される幹細胞を容易に識別することができる。このため、この一態様に係る観察装置を用いることにより、幹細胞をラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別することが容易に実行できる。

本発明の一態様によれば、幹細胞をラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを容易に識別することができる。また、本発明の一態様によれば、必要に応じて、分化傾向状態とされた幹細胞を除去することができる。

観察装置の一実施形態を示す図である。 図１に示した観察装置において、導波路をシャーレから退避させた状態を示す図である。 光源からシャーレへ入射される光の角度変化を模式的に示す図である。 光源の放射角度とシャーレへの出射角度との関係を示す図である。 導波路を使った場合のシャーレへの出射角度と、使わなかった場合のシャーレへの出射角度との違いを示す図である。 導波路とシャーレとの間に水が配置された状態を示す図である。 幹細胞における斜方照明と散乱光強度との関係を示す図であり、（ａ）が未分化状態の幹細胞での関係を示し、（ｂ）が分化傾向状態の幹細胞での関係を示す。 幹細胞コロニーにおける散乱光強度を示す図である。 未分化状態と分化傾向状態とが混在する幹細胞の画像であり、（ａ）が散乱光画像を示し、（ｂ）が透過光画像を示す。 未分化状態と分化傾向状態とが混在する別の幹細胞の画像であり、（ａ）が散乱光画像を示し、（ｂ）が透過光画像を示す。 図１及び図２に示した観察装置で幹細胞を観察する観察方法の第１実施形態を示すフローチャートである。 図１１に示した観察方法における画像の遷移を示す図である。 図１１に示した観察方法の変形例を示すフローチャートである。 図１及び図２に示した観察装置で幹細胞を観察する観察方法の第２実施形態を示すフローチャートである。 図１４に示した観察方法における画像の遷移を示す図である。 図１５に示した観察方法の変形例を示すフローチャートである。

以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。

［第１実施形態］
図１及び図２に示されるように、観察装置１は、試料保持部１０、光照射装置２０Ａ，２０Ｂ、画像取得装置３０、制御装置４０、表示装置５０及び印付与装置６０を備えている。

試料保持部１０は、透明な試料ケースであるシャーレ１１の両端を保持する部材である。シャーレ１１は、例えばｉＰＳ細胞が付着する底面がガラス又はプラスチック樹脂（例えばポリスチレン樹脂）などの透光性の部材からなり、光照射装置２０Ａから照射される照明光Ｌ１を透過すると共に、ヒトｉＰＳ細胞Ｃからの散乱光Ｌ２を透過する。シャーレ１１の内部には、培養液などの溶液１２が収容されている。溶液１２の中にヒトｉＰＳ細胞Ｃなどの幹細胞が配置されている。ヒトｉＰＳ細胞Ｃの一部は、シャーレ１１の底面１１ｂに付着している。なお、試料ケースは、幹細胞が付着する底面が、ガラスやポリスチレン樹脂などの透光性のある部材から形成されていればよく、シャーレに限定される訳ではなく、例えば、流路と接続した閉鎖系の容器で、底面が透明性の部材で形成されているものを用いてもよい。

光照射装置２０Ａは、導波路２１、光源装置２２及び移動装置２３を備えている。光照射装置２０Ａの導波路２１及び光源装置２２は、ヒトｉＰＳ細胞Ｃを収容したシャーレ１１に対して照明光Ｌ１を照射する。導波路２１は、主面２１ｓ、主面２１ｓの反対側にある裏面２１ｒ、及び、主面２１ｓと略直交する側面２１ｆを有する板状の導光部材である。導波路２１は、例えば石英ガラス等の透光性部材によって構成されており、その厚みが３ｍｍ〜８ｍｍ程度となっている。主面２１ｓ上には水１３を介してシャーレ１１が載置される。導波路２１の両端には、側面２１ｆに近接するように２つの光源装置２２が、互いの照射方向を対向させた状態で配置されている。導波路２１の材料は、石英ガラスに限定される訳ではなく、屈折率がガラス同様に空気に比べて高く透明な材料であれば、樹脂を用いて成形してもよい。また、上記では、光学媒体として水を用いた例を示したが、他の光学媒体を用いて導波路２１とシャーレ１１との間を光学結合させてもよい。

光源装置２２は、光源部を含んで構成される。光源装置２２の光源部は、フレーム部材に複数のＬＥＤ（例えば赤色ＬＥＤ）が配置された構造を有する。これら複数のＬＥＤは、導波路２１の側面２１ｆから導波路２１に、指向性を有する照明光Ｌ１を入射する。導波路２１への光の入射角度を調節するために、光源装置２２が、光源部の取り付け角度を調節できる機構を有していてもよい。また、光源装置２２は、フィルタ部を更に含んで構成されていてもよい。光源装置２２のフィルタ部は、例えば、特定の波長帯域の光のみを透過させるバンドパスフィルタである。フィルタ部は、ＬＥＤから照射される光から、測定に適した波長の照明光Ｌ１のみを透過させる。このように、光源部及びフィルタ部を組み合わせることにより、測定に適した波長の光を導波路２１へ入射させることができ、これにより、測定精度が高められる。つまり、フィルタ部を含むことにより、波長選択性を高めることができる。

光照射装置２０Ａでは、導波路２１の主面２１ｓ上に水１３を配置して、導波路２１の屈折率ｎ１と水１３の屈折率ｎ３とに基づく臨界角を所定の値に設定することにより、シャーレ１１内に照明光Ｌ１を照射している。シャーレ１１内に照明光Ｌ１を照射する手段である光学媒体としては、導波路と試料ケース底面との間の隙間を埋めるようなものであれば、水に限られることはなく、例えば、油、ガラス、樹脂、ゲル状の物質を用いてもよい。また、主面２１ｓに溝などの所望の形状を形成して主面２１ｓに対する照明光Ｌ１の入射角を所定の値に設定することにより、シャーレ１１内に照明光Ｌ１を照射してもよい。光学媒体の屈折率ｎ３（図６参照）は、試料ケース内の培養液の屈折率ｎ２と同等又はそれ以上であることが好ましく、光学媒体の屈折率ｎ３が試料ケース内の培養液の屈折率ｎ２よりも大きければ、より角度の浅い斜向した照明光を照射することができる。

光源装置２２の光源は、上述したＬＥＤに限定されることはない。例えば、光源装置２２の光源として、キセノンランプ等の白色光源を用いてもよい。この場合、ＬＥＤでは実現できない波長の光を照明光Ｌ１としてヒトｉＰＳ細胞Ｃに照射させることができる。また、図１に示す例では、光源装置２２を２個設けた例を示しているが、光源装置２２を１個だけ設けるようにしてもよいし、光源装置２２を３個以上設けるようにしてもよい。

ここで、図３を参酌して、光照射装置２０Ａでの照明光Ｌ１について詳細に説明する。図３は、光源２２からシャーレ１１へ入射される光の角度変化を模式的に示す図である。光照射装置２０Ａは、図３に示されるように、導波路２１に対して導波路２１の両側面２１ｆから照明光Ｌ１を所定の入射角度θを有する光を含んで入射させる。空気よりも高い屈折率ｎ１を有する導波路２１に入射した照明光Ｌ１は、導波路２１の主面２１ｓ及び裏面２１ｒにおいて全反射される。そして、照明光Ｌ１の一部が、主面２１ｓとシャーレ１１との間の水１３が配置された領域からシャーレ１１内に入射する。

この照明光Ｌ１は、導波路２１の屈折率ｎ１と水１３の屈折率ｎ３との差から、主面２１ｓと平行な方向に向けて屈折し、シャーレ１１内に向けて出射される。シャーレ１１内の溶液１２の屈折率ｎ２は、例えば水と略同等の屈折率である。これにより、シャーレ１１に入射する照明光Ｌ１は、シャーレ１１の深さ方向（載置方向）に対して所定の出射角度ｉの傾きを持つ。例えば、図４に示す例では、溶液１２の屈折率ｎ２が１．３３の場合、光源装置２２から導波路２１への照射光Ｌ１のうち入射角度θが約３７度未満の入射光は、導波路２１からシャーレ１１に入射することなく、全反射される。一方、入射角度θが約３７度以上（正確には３７．０３度）の照明光Ｌ１は、シャーレ１１の培養液１２中に入射し、深さ方向に対する出射角度ｉが５３度〜９０度の範囲となり、ヒトｉＰＳ細胞Ｃへの所定の斜方照明を照射することができる。

このように、本実施形態に係る光照射装置２０Ａでは、光源装置２２からの光が所定の放射角度範囲（例えば３８度〜９０度）を含むようになっており、このような角度θで入射された光が、導波路２１とシャーレ１１との間に介在する水１３により、より平行に近い斜方光となってシャーレ１１に入射する。導波路２１等を使用しない場合には、空気から培養液１２への光の進入となり屈折率１から屈折率１．３３への光の進入に従う。つまり、シャーレ１１に入射される照明光は、図５に示されるように、シャーレ１１の深さ方向に対して５０度未満（出射角度Ａの場合）となる。一方、上述した構成により、光照射装置２０Ａでは、シャーレ１１の深さ方向に対する出射角度ｉが５３度〜９０度の範囲（出射角度Ｂの場合）となる光を含むようにすることができる。

光照射装置２０Ａの移動装置２３は、導波路２１及び光源装置２２を、試料保持部１０によって保持されるシャーレ１１の下方から退避させるための移動手段である。図２は、移動装置２３によって、導波路２１及び光源装置２２がシャーレ１１の下方から水平方向の右側に移動した状態を示している。この移動装置２３によって、シャーレ１１の下方に位置する光照射装置２０Ａが退避するので、シャーレ１１の底面１１ｂの外表面側へのアクセスが自由になる。

光照射装置２０Ｂは、光源部及びフィルタ部を含んで構成される第２の光源装置である。光照射装置２０Ｂは、図２に示されるように、ヒトｉＰＳ細胞Ｃを収容したシャーレ１１に対して上方から照明光Ｌ３を照射する。光照射装置２０Ｂの光源部は、シャーレ１１の中の細胞のコロニーの存在位置を把握するための光源であり、ＬＥＤ光源とコンデンサレンズから構成され、シャーレ１１内の観察領域又はシャーレ１１全体を照射できるようになっており、指向性を有する照明光Ｌ３をシャーレ１１の上方から照射する。光照射装置２０Ｂのフィルタ部は、光源装置２２のフィルタと同様に、例えば、特定の波長帯域の光のみを透過させるバンドパスフィルタである。光照射装置２０Ｂは、光照射装置２０Ａが照明光Ｌ１を照射している際には照射を行わないが、光照射装置２０Ａがシャーレ１１の下方に位置する際に照射するようにしてもよい。

画像取得装置３０は、光照射装置２０Ａからの照明光Ｌ１がヒトｉＰＳ細胞Ｃによって散乱して導波路２１を透過した散乱光Ｌ２、及び、光照射装置２０Ｂからの照明光Ｌ３がヒトｉＰＳ細胞Ｃを透過した透過光Ｌ４を撮像する装置であり、撮像装置３１及び結像レンズ３２を備える。撮像装置３１は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有し、ヒトｉＰＳ細胞Ｃからの散乱光Ｌ２による二次元の光検出画像である散乱光画像、及び、ヒトｉＰＳ細胞Ｃからの透過光Ｌ４による二次元の光検出画像である透過光画像を取得可能に構成されている。

撮像装置３１としては、例えば高感度のＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージングカメラを用いることができる。必要があれば、カメラの前段にイメージ増倍管又はリレーレンズ等を配置して画像取得装置３０を構成してもよい。また、レンズ３２は、散乱光Ｌ２や透過光Ｌ４を撮像装置３１に結像するためのレンズであり、導波路２１と撮像装置３１との間に配置されている。必要であれば、導波路２１とレンズ３２との間、或いはレンズ３２と撮像装置３１との間に光学フィルタ等の光学部材を配置してもよい。レンズ３２は、斜向照明した角度の光が観察側（つまり撮像装置側）に来ないようにするため、レンズの開口数（集光角度）が低いものを利用することが好ましい。このような開口数が低いレンズを用いることにより、コントラストのよい散乱光を取得することが可能となる。

このような画像取得装置３０は、導波路２１上においてシャーレ１１が載置された位置の下方に設けられ、シャーレ１１内のヒトｉＰＳ細胞Ｃからの散乱光Ｌ２を検出する。そして、画像取得装置３０は、シャーレ１１内に保持されたヒトｉＰＳ細胞Ｃからの散乱光Ｌ２を含む二次元光像を検出して、光学画像データを取得する。

画像取得装置３０は、導波路２１等がシャーレ１１の下方から移動した際には、シャーレ１１内のヒトｉＰＳ細胞Ｃに照射した照明光Ｌ３の透過光Ｌ４を検出する。そして、画像取得装置３０は、シャーレ１１内に保持されたヒトｉＰＳ細胞Ｃからの透過光Ｌ４を含む二次元光像を検出して、光学画像データを取得する。画像取得装置３０は、導波路２１等が存在する際に、透過光Ｌ４を含む二次元光像を検出して、光学画像データを取得してもよい。画像取得装置３０は、このようにして取得した光学画像データを制御装置４０に出力する。

制御装置４０は、画像取得装置３０に接続されており、画像取得装置３０から入力された光学画像データを、図９及び図１０に示されるように、散乱光画像や透過光画像として表示装置５０に表示させる。制御装置４０は、例えばＣＰＵを具備しソフトウエアによる処理や制御を行うパーソナルコンピュータ等から構成され、表示装置５０は、例えばディスプレイ等から構成される。図９の（ａ）及び図１０の（ａ）は、制御装置４０及び表示装置５０によって表示される、ヒトｉＰＳ細胞Ｃの散乱光画像を示し、図９の（ｂ）及び図１０の（ｂ）は、ヒトｉＰＳ細胞Ｃの透過光画像を示す。図９の（ａ）及び図１０の（ａ）に示す散乱光画像において、点線の丸で囲まれた領域は、分化傾向状態である細胞コロニーを示し、その周りにある未分化状態の細胞コロニー（例えば図９中において矢印で示される）よりも著しく暗く表示されるようになっている。

ここで、分化傾向状態である細胞コロニーが未分化状態の細胞コロニーよりも暗く表示されるメカニズムについて、図７及び図８を参酌して説明する。本発明者らによれば、図７に示されるように、分化傾向状態にある細胞コロニー（図７の（ｂ））は、未分化状態にある細胞コロニー（図７の（ａ））に比べて、ひとつひとつの細胞の厚さが薄くなるか、又は、散乱光を発生させる細胞内構造が減少するものと推定される。細胞コロニーを構成する一つ一つの細胞の厚さが厚い、又は、散乱光を発生させる細胞内構造が多いと、斜方照明として入射される照明光Ｌ１が散乱光として反射される率が高いため、散乱光強度が強くなって明るめの光像となる。しかし、このように、細胞コロニーの細胞の厚さが薄いと、斜方照明として入射される照明光Ｌ１が散乱光として反射する率が低くなるため、散乱光強度が弱くなってしまう。その結果、分化傾向状態になる細胞コロニーは、暗めの光像として表されることになるものと考えられる。

このように、本実施形態では、散乱光画像を用いているため、分化又は未分化の違いが明確となっている。透過光画像では、図９の（ｂ）及び図１０の（ｂ）に示されるように、分化又は未分化の違いがそれほど明確ではなく、対応する散乱光画像での識別マークがないと、透過光画像では、分化又は未分化の状態を識別することが困難である。

制御装置４０は、マウス又はタブレット等の入力装置（不図示）による所定のマーキング入力を受け付けて、このマーキング入力の内容に応じて、図９の（ａ）等に示されるように、散乱光画像の上に当該マーキング内容（例えば点線で示した丸や矢印）を表示させる処理を行う。制御装置４０は、当該マーキングの座標位置をデータとして保持しておき、散乱光画像の後に表示される透過光画像上に、そのマーキング内容を再び表示させる。散乱光画像と透過光画像とは互いの座標位置が対応するように制御装置４０等によって位置が制御されて表示されるため、透過光画像上のマーキングを確認することで、分化傾向状態にある細胞コロニーを識別することができる。

印付与装置６０は、シャーレ１１の底面１１ｂの外表面に所定の印（マーク）を付与する部材である。印付与装置６０は、観察者による操作に応じて、シャーレ１１の底面１１ｂの外表面に、例えば図９の（ｂ）に示すマーキング箇所（点線の丸）に対応する印を付与することができるインクペンを備えている。

続いて、図１１を参照して、上述した観察装置１を用いた観察方法について説明する。

まず、培養液などの溶液１２が入ったシャーレ１１を用意し、ヒトｉＰＳ細胞などの幹細胞Ｃをシャーレ１１の底面に付着させる（ステップＳ１）。また、保持機構である試料保持部１０によって、シャーレ１１を保持する（ステップＳ２）。幹細胞Ｃをシャーレ１１に付着させてから試料保持部１０による保持を開始してもよいし、又は、試料保持部１０で保持したシャーレ１１に幹細胞Ｃを付着させてもよい。

続いて、光照射装置２０Ａの導波路２１がシャーレ１１の下部に位置するように導波路２１又はシャーレ１１を移動する（ステップＳ３）と共に、導波路２１の主面２１ｓの所定の領域に水１３を塗布し、この水１３を介するように、シャーレ１１を導波路２１の上に載置する。これにより、図１に示される配置構成となり、導波路２１とシャーレ１１との間が光学結合される（ステップＳ４）。

続いて、光照射装置２０Ａの電源装置２２を点灯し、導波路２１内に照明光Ｌ１を入射させる（ステップＳ５）。導波路２１内に入射された照明光Ｌ１は、導波路２１内で全反射を繰り返しながら、導波路２１と水１３との屈折率の差から、水１３が介在する領域において主面２１ｓと平行な方向に向けて屈折し、シャーレ１１内に向けて出射される。シャーレ１１に入射する照明光Ｌ１は、シャーレ１１の深さ方向（載置方向）に対して所定の角度ｉの傾きを持つ（図３参照）。

シャーレ１１内に向けて出射された斜方の照明光Ｌ１は、幹細胞Ｃによって散乱されて散乱光となり、導波路２１を透過する。この散乱光Ｌ２を画像取得装置３０で取得することで、散乱光画像が取得され、図１２の（ａ）に示されるように、制御装置４０によって、散乱光画像を表示装置５０に表示させる（ステップＳ５）。

続いて、表示装置５０に表示された散乱光画像を観察し、分化傾向状態にある細胞領域を１つ以上指定し、図１２の（ｂ）に示されるように、画像の座標上に点線の丸によってマーカー表示を行う（ステップＳ６）。上述したように、散乱光画像では、分化傾向状態にある細胞領域は、他の未分化状態の細胞領域に比べて著しく暗く表示されるため、分化又は未分化の識別が容易になっている。

散乱光画像を取得した後、図２に示されるように、導波路２１を移動装置２３によって、水平方向の右側に移動し、これにより、導波路２１をシャーレ１１の下部から退避させる（ステップＳ７）。その後、ステップＳ８に進み、光照射装置２０Ｂの電源装置を点灯し、照明光Ｌ３をシャーレ１１へ照射する。そして、シャーレ１１に向けて出射された照明光Ｌ３は、幹細胞Ｃを透過して、透過光Ｌ４となる。この透過光Ｌ４を画像取得装置３０で取得することで、透過光画像が取得され、図１２の（ｃ）に示されるように、制御装置４０によって、透過光画像を表示装置５０に表示させる（ステップＳ８）。

続いて、この透過光画像の表示を維持したまま、ステップＳ６で表示したマーカーを制御装置４０から再び呼びだし、図１２の（ｃ）に示されるように、透過光画像上にオーバレイ表示させる（ステップＳ９）。ステップＳ５で表示された散乱光画像と、ステップＳ９で表示された透過光画像とは、互いの座標位置が対応するように制御装置４０によって制御されているため、透過光画像上にオーバレイ表示されたマーカーが分化傾向状態にある細胞コロニーを示していることになる。

続いて、図１２の（ｃ）に示される透過光画像を見ながら、印付与装置６０のインクペンを用いて、透過光画像上のマーカーと重なるように、図１２の（ｄ）に示されるように、シャーレ１１の底面１１ｂの外表面に印を付与する（ステップＳ１０）。その後、図１２の（ｅ）に示されるように、印を付与した領域の細胞コロニーをスポイト等によって吸引して回収し、これにより、分化傾向状態にある細胞コロニーを除去する（ステップＳ１１）。

このように、本実施形態の観察方法によれば、幹細胞Ｃを透過した透過光を検出する観察方法に比べて、分化傾向状態にある幹細胞Ｃをより暗く表示させることができる（例えば、図９や図１０参照）。このため、本観察方法によれば、散乱光を用いるといった簡易な手法により、幹細胞Ｃをラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞Ｃの未分化状態と分化傾向状態とを識別することができる。

上述した観察方法では、散乱光Ｌ２の強度を指標としているために、強度分布の２次元情報と細胞コロニーの存在位置とさえ把握できれば、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別することができる。そのため、顕微鏡だけでなく、マクロレンズなどの低倍のレンズを用いて、透明部材であるシャーレ１１全体やシャーレ１１の光範囲を一度に観察して判断することが可能である。

上述した観察方法において、幹細胞Ｃに照射される照明光Ｌ１が、シャーレ１１の深さ方向に対して斜めに出射されている。この幹細胞Ｃに向けて斜めに出射される照明光Ｌ１の出射角度ｉが、深さ方向に対して５３度〜９０度の間であるようになっている。照明光Ｌ１の出射角度ｉが上述した範囲にあることにより、未分化状態にある幹細胞コロニーと分化傾向状態にある幹細胞コロニーとのコントラストがより明確になり、両者の識別がより一層簡単になる。

上述した観察方法において、幹細胞Ｃによって散乱し導波路２１を透過した散乱光Ｌ２の画像を画像取得装置３０で取得している。細胞からの散乱光強度画像を高い信号／ノイズ比で取得するためには、暗視野照明などを行うことが一般的であり、そのためには顕微鏡下にて差動距離の短い高いＮＡのコンデンサレンズを使用する必要があり、操作が難しかった。しかしながら、この観察方法によれば、散乱光画像を取得する目的で、幹細胞Ｃが配置されたシャーレ１１を載置する導波路２１を利用している。そのため、画像を得るための操作が容易であり、且つ、高い信号／ノイズ比で散乱光強度画像を取得することもできるようになる。

上述した観察方法は、透過光画像を表示させる際に、透過光画像上に散乱光画像のマーカーを重ねて表示させるようにしている。このため、透過光画像上において、未分化状態にある幹細胞コロニーと分化傾向状態にある幹細胞コロニーとの識別が容易になり、培養作業を行いやすくなる。また、導波路２１をシャーレ１１の下方から退避させるステップを有していることから、幹細胞Ｃが配置されたシャーレ１１の底面側へのアクセス自由度を高めることができる。そして、散乱光画像にて判別した細胞コロニーに対して、細胞の入っているシャーレ１１を別の装置に移動することなく、透過光画像上のマーカーに対応するシャーレの所定の領域に印を付与するといったようなことを行うことができる。これにより、分化傾向状態にある幹細胞コロニーの位置を容易に認識することができる。

上記実施形態では、上述した幹細胞の観察方法によってシャーレ１１上の幹細胞Ｃを観察し、当該観察によって幹細胞Ｃのうち分化傾向状態であるとされた細胞領域を除去するようにしている。このため、未分化状態にある幹細胞コロニーと分化傾向状態にある幹細胞コロニーとの識別が容易且つ確実であり、このような容易且つ確実な識別に基づいて分化傾向状態にある幹細胞コロニーを除去できるため、幹細胞の品質管理を容易に行うことができる。

観察装置１によれば、幹細胞Ｃによって散乱した散乱光Ｌ２を撮像して、散乱光画像を容易に取得することができ、分化傾向状態にあり暗く表示される幹細胞Ｃを容易に識別することができる。このため、観察装置１を用いることにより、幹細胞Ｃをラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞Ｃの未分化状態と分化傾向状態とを識別することが容易に実行できる。

上述した実施形態では、散乱光画像を表示させた後に、透過光画像を表示させるようにしていたが、例えば、図１３に示されるように、光照射装置２０Ａ，２０Ｂを切り替えて交互に点灯し、散乱光画像と透過光画像とを選択して、表示装置５０に表示させるようにしてもよい（ステップＳ１５）。このように散乱光画像を表示させる際に、両画像を交互に表示させることにより、透過光画像における分化傾向状態になる細胞コロニーの位置を、観察者がより認識しやすくなる。図１３に示される観察方法の変形例では、ステップＳ１５以外は、図１２に示される観察方法と同様である。

［第２実施形態］
続いて、観察方法の第２実施形態について、図１４及び図１５を参酌して説明する。本実施形態では、第１実施形態と同じ観察装置１を用いて観察を行う。以下、観察方法において、第１実施形態と異なる点を中心に説明する。

まず、培養液などの溶液１２が入ったシャーレ１１を用意し、ヒトｉＰＳ細胞などの幹細胞Ｃをシャーレ１１の底面に付着させる（ステップＳ１）。また、保持機構である試料保持部１０によって、シャーレ１１を保持する（ステップＳ２）。その後、光照射装置２０Ａの導波路２１がシャーレ１１の下部に位置するように導波路２１又はシャーレ１１を移動する（ステップＳ３）と共に、導波路２１の主面２１ｓの所定の領域に水１３を塗布し、この水１３を介するように、シャーレ１１を導波路２１の上に載置して光学結合を行う（ステップＳ４）。

続いて、光照射装置２０Ａの電源装置２２を点灯し、導波路２１内に照明光Ｌ１を入射させる。導波路２１内に入射された照明光Ｌ１は、全反射を繰り返しながら、水１３が介在する領域において主面２１ｓと平行な方向に向けて屈折し、シャーレ１１内に向けて出射される。シャーレ１１内に向けて出射された斜方の照明光Ｌ１は、幹細胞Ｃによって散乱されて散乱光Ｌ２となり、導波路２１を透過する。この散乱光Ｌ２を画像取得装置３０で取得することで、散乱光画像が取得され、図１５の（ａ）に示されるように、散乱光画像が表示装置５０に表示される（ステップＳ２５）。また、制御装置４０は、当該画像データを静止画像として記録する（ステップＳ２５）。

続いて、表示装置５０に表示された散乱光画像を観察し、分化傾向状態にある細胞領域を１つ以上指定し、図１５の（ａ）に示されるように、画像の座標上に点線の丸によってマーカー表示を行う（ステップＳ６）。上述したように、散乱光画像では、分化傾向状態にある細胞領域は、他の未分化状態の細胞領域に比べて著しく暗く表示されるため、分化又は未分化の識別が容易になっている。その後、図１５の（ａ）に示されるように、透過光画像の表示予定領域（同図の右側）に、ステップＳ６で表示させたマーカーを同じ座標位置となるようにオーバレイ表示させる（ステップＳ２７）。

散乱光画像を取得した後、図２に示されるように、導波路２１を移動装置２３によって、水平方向右側に移動し、これにより、導波路２１をシャーレ１１の下部から退避させる（ステップＳ７）。その後、ステップＳ２８に進み、光照射装置２０Ｂの電源装置を点灯し、照明光Ｌ３をシャーレ１１へ照射する。そして、シャーレ１１に向けて出射された照明光Ｌ３が幹細胞Ｃを透過した透過光Ｌ４を画像取得装置３０で取得することで、透過光画像が取得され、図１５の（ｂ）に示されるように、制御装置４０によって、散乱光の静止画像の隣に透過光画像を表示させる（ステップＳ２８）。

続いて、図１５の（ｂ）に示される透過光画像を見ながら、印付与装置６０のインクペンを用いて、透過光画像上のマーカーと重なるように、図１５の（ｃ）に示されるように、シャーレ１１の底面１１ｂの外表面に印を付与する（ステップＳ１０）。その後、図１５の（ｄ）に示されるように、印を付与した領域の細胞コロニーをスポイト等によって吸引して回収し、これにより、分化傾向状態にある細胞コロニーを除去する（ステップＳ１１）。

このように、本実施形態の観察方法によれば、幹細胞Ｃを透過した透過光を検出する観察方法に比べて、分化傾向状態にある幹細胞Ｃをより暗く表示させることができる（例えば、図９又は図１０参照）。このため、本観察方法によれば、散乱光を用いるといった簡易な手法により、幹細胞Ｃをラベルすることなく培養した生きた状態で、幹細胞Ｃの未分化状態と分化傾向状態とを識別することができる。

本実施形態の観察方法では、散乱光画像を静止画像として、透過光画像の隣に表示させるようにしている。このため、分化傾向状態である細胞コロニーの位置を、散乱光画像を参照しながら、透過光画像上で識別することができ、識別作業がより一層、容易になる。

上述した実施形態では、散乱光画像を表示させた後に、透過光画像を表示させるようにしていたが、例えば、図１６に示されるように、光照射装置２０Ａ，２０Ｂを切り替えて交互に点灯し、散乱光画像と透過光画像とを選択して、表示装置５０に表示させ、散乱光画像の静止画像を記録するようにしてもよい（ステップＳ３４，Ｓ３５）。このように散乱光画像を表示させる際に、両画像を交互に表示させることにより、透過光画像における分化傾向状態になる細胞コロニーの位置を、観察者がより認識しやすくなる。図１６に示される観察方法の変形例では、ステップＳ３４，３５以外は、図１４に示される観察方法と同様である。

以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、表示装置５０に表示される画像の上下左右の表示方向が、シャーレ１１の底面に印を付与する作業がやりやすいように、作業の上下左右方向と合致するように表示を制御してもよい。また、印付与装置６０はインクペンを備えていたが、その他のマーキング装置であってもよい。また、分化傾向状態にある細胞コロニーの位置を散乱光画像上にマーカーした場合に、制御装置４０によって当該マーカーした位置とシャーレ１１における細胞の位置とを対応づけさせて、シャーレ１１に印付与装置６０でマークさせるのではなく、その対応した位置情報に応じて、レーザなどで分化傾向状態にある細胞コロニーを除去してしまってもよい。また、上述した実施形態では、観察対象の細胞を容器の底面に配置して観察を行っていたが、これに限定されるわけではなく、容器内の培養液中に浮いている浮遊細胞を上記の観察装置を用いた観察方法で観察するようにしてもよい。

本発明は、幹細胞の未分化状態と分化傾向状態とを識別するための観察方法又は観察装置に適用することができる。

１…観察装置、１０…試料保持部、１１…シャーレ、２０Ａ，２０Ｂ…光照射装置、２１…導波路、２２…光源装置、２３…移動装置、３０…画像取得装置、４０…制御装置、５０…表示装置、６０…印付与装置、Ｃ…幹細胞、Ｌ２…散乱光、Ｌ４…透過光。

Claims (8)

1. 透明部材内に幹細胞を配置するステップと、
   前記透明部材を導光部材上に光学媒体を介して載置するステップと、
   前記導光部材中に照明光を入射し、前記光学媒体を介して当該照明光を、溶液が収容された前記透明部材内の幹細胞に向けて出射させるステップと、
   前記幹細胞に向けて出射された照明光が前記幹細胞によって散乱し、前記導光部材を透過した当該散乱光を検出するステップと、
   を備えた幹細胞の観察方法。
2. 前記照明光を前記幹細胞に向けて出射させるステップで、前記幹細胞に照射される照明光は、前記透明部材を前記導光部材上に載置する方向に対して斜めに出射されることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の観察方法。
3. 前記幹細胞に向けて斜めに出射される照明光の出射角度が、前記載置方向に対して５３度〜９０度の間であることを特徴とする請求項２に記載の幹細胞の観察方法。
4. 前記散乱光を検出するステップで、前記幹細胞によって散乱し前記導光部材を透過した前記散乱光の画像を撮像部で取得することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の幹細胞の観察方法。
5. 前記透明部材を保持機構で保持するステップと、
   前記撮像部で取得した前記散乱光画像を表示部によって表示させるステップと、
   前記表示させるステップで表示された前記散乱光画像における所定の細胞領域に対する選択入力を受け付けて当該選択された領域に対応するマーカーを当該画像上に表示させるステップと、
   前記幹細胞の前記散乱光画像を取得した後、前記導光部材を前記透明部材の下方から退避させるステップと、
   前記幹細胞の透過光画像を前記撮像部で取得して、当該透過光画像を前記表示部によって表示させるステップと、
   前記透過光画像を表示させるステップで表示された前記透過光画像上に前記マーカーを重ねて表示させるステップと、
   を更に備えることを特徴とする請求項４に記載の幹細胞の観察方法。
6. 前記透過光画像上に前記マーカーを重ねて表示させるステップで、前記透過光画像上のマーカーに対応する前記透明部材の所定の領域に印を付与する請求項５に記載の幹細胞の観察方法。
7. 請求項１〜６の何れか一項に記載の幹細胞の観察方法によって前記透明部材内の幹細胞を観察し、当該観察によって前記幹細胞のうち分化傾向状態であるとされた細胞領域を除去することを特徴とする除去方法。
8. 透明部材内に配置された幹細胞を観察するための観察装置であって、
   前記透明部材を載置可能な面を有する導光部材と、
   前記導光部材中に照明光を入射し、前記透明部材と前記導光部材との間の配置される光学媒体を介して当該照明光を、溶液が収容された前記透明部材内の幹細胞に向けて出射させる第１の光源と、
   前記導光部材を移動させる移動部と、
   前記移動部で前記導光部材を移動させる際に前記透明部材を保持する保持部と、
   前記保持部で保持された前記透明部材内に配置された前記幹細胞に向けて照明光を照射する第２の光源と、
   前記第１の光源からの照明光が前記幹細胞によって散乱し前記導光部材を透過した当該散乱光、及び、前記第２の光源からの照明光が前記幹細胞を透過した透過光をそれぞれ撮像する撮像部と、
   を備える幹細胞の観察装置。