JP5980342B2 - 遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を高効率で発現する方法およびそれを用いた組換えポリペプチドの調整方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物技術分野に関し、特に、遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を高効率で発現する方法およびそれを用いた組換えポリペプチドの調整方法に関する。

本発明の発明者は、以前の研究において、創造的な試みと実験および検証を経て、コリシンを攻撃端とし、その他の識別標的細胞のポリペプチド（天然または人工設計である）の識別ポリペプチドを操作可能に連結して、一系列の新型組換えポリペプチド得た。特許文献１に記載しているとおりである。発明の名称が「抗体模擬物を含む新型の抗生物質およびその調製方法と応用」に公開された新型の抗生物質ＰＭＣ−ＡＭ１は、広範囲スペクトル抗生性能を有しており、髄膜炎菌、多剤耐性緑膿菌、バンコマイシン耐性腸球菌、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌に対して、現存の抗生物質よりも顕著な抗菌効果を果たしている。特許文献２に記載されている、発明の名称が「新型の抗生物質およびその塩基配列、調製方法と応用」である発明では、一系列の抗ブドウ球菌溶解素新型抗生物質を公開した。それぞれＰＭＣ−ＳＡ１、ＰＭＣ−ＳＡ２、ＰＭＣ−ＳＡ３、ＰＭＣ−ＳＡ４、ＰＭＣ−ＳＥおよびＰＭＣ−ＰＡと六種類の新型抗生物質であり、体外および体内の実験において、現存の抗生物質、抗真菌抗生物質および化学療法薬よりさらに優れた標的指向性および殺傷効率を有する。これらの新型抗生物質は、抗菌効果が顕著であるだけでなく、且つほかの抗生物質が比べることができない生物学的安全性および抗薬剤耐性を有する。

上述の系列の組換えタンパク質は、水溶性タンパク質の一種類であって、一般的に６００あまりのアミノ酸残基によって構成されている。しかしながら、この種類のタンパク質のペプチド鎖は、カルボキシル末端に寄るところに、４０個のアミノ酸残基により構成された一区切りの疎水区域がある。構造が単一である他の水溶性タンパク質に比べて、前記タンパク質の組み替えと発現はさらに難しいので、その生産率に影響を与える。そこで、上述の組換えタンパク質を発現する工程を改善し、タンパク質の発現率を高めることで、大規模生産により上述の一系列の組換えタンパク質を実際の臨床応用と実践における技術的難題を解決することができる。

中国特許出願第２００９１００９２１２８．４号明細書 中国特許出願第２００９１０１５７５６４．５号明細書

本発明は、発明者の先行特許出願で開示された組換えポリペプチドの構造と性質および特徴に焦点を合わせて、遺伝子組換え菌のタンパク質を高効率で発現する方法を提供する。

遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を高効率で発現する方法として、遺伝子組換え菌の組換えタンパク質のポリペプチドは、一端が親水性を有するコリシンポリペプチド端末であり、他端は、疎水性を有する標的物質識別ポリペプチド端末である。その特徴は、以下のステップを含む。

（１）遺伝子組換え菌の組換えタンパク質をコードする遺伝子組換えプラスミドを大腸菌ｐＥＴシステムの遺伝子組換え菌であるＥ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）に形質転換することによって、陽性モノクローンを得る。

（２）陽性モノクローンを増殖させることで得られた液体種菌を誘導し、大量増殖を行い、発現された遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を含む上清液を得る。

（３）上清液に含まれている発現された遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を分離して精製する。

上述の大量増殖で使用する培地は、ＮａＣｌ６．０〜６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース０．６〜２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８〜１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０〜４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０〜１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２〜０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含み、水を溶媒とする。

上述の大量増殖で使用する培地は、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含み、水を溶媒とする。Ｅ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）を遺伝子組み換え菌とする工程において、メチオニンは、４０ｍｇ／Ｌである。

上述の誘導方法は、熱衝撃による誘導方法を使用する。操作方法は、以下に示すとおりである。液体種菌をタンクに入れた後、３０℃で２〜３時間初期成長させ、ＯＤ値が０．４〜０．６に達したときに、４２℃で熱衝撃を３０分行う。次いで、温度を３７℃まで下げ、再び１．５〜２時間成長させ、細菌を回収する。
上述の熱衝撃誘導ステップにおいて、培地に最終濃度が０．５ｍＭのＰＴＧを添加する。

菌体の上清液における組換えタンパク質を精製するとき、ＣＭイオン交換カラムを使用し、その中の量はタンパク質の上清液質量でありゲル粒子体積との比が２．５ｍｇ／ｍｌである。
菌体の上清液における組換えタンパクを精製するとき、ＣＭイオン交換カラムを使用し、溶出用の硼酸緩衝液のＮａＣｌ濃度は０．２Ｍである。

組換え突然変異プラスミドは、ｐＢＨＣ−ＳＡ１、ｐＢＨＣ−ＳＡ２、ｐＢＨＣ−ＳＡ３、ｐＢＨＣ−ＳＡ４、ｐＢＨＣ−ＳＥ、ｐＢＨＣ−ＰＡまたはｐＢＨＣ−ＰｏｒＡ１を指す。

上述のいずれかの方法は、組換えポリペプチドＰＭＣ−ＳＡ１、ＰＭＣ−ＳＡ２、ＰＭＣ−ＳＡ３、ＰＭＣ−ＳＡ４、ＰＭＣ−ＳＥ、ＰＭＣ−ＰＡまたはＰＭＣ−ＡＭを製造するのに応用される。

大腸菌ｐＥＴシステム遺伝子組換え菌に用いる培地は、ＮａＣｌ６．０〜６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース０．６〜２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８〜１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０〜４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０〜１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２〜０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含み、水を溶媒とする。

大腸菌ｐＥＴシステム遺伝子組換え菌は、Ｅ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）であり、培地は、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン４０ｍｇ／Ｌを含み、水を溶媒とする。

Ｎｏｖａｇｅｎ会社のｐＥＴシステムは、現在、大腸菌において組換えタンパク質のクローンと発現によく使われるシステムである。本発明は、まず、組換え突然変異プラスミドを一系列のＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞にトランスフェクションさせ、元のＴＧ１細胞よりさらに良いタンパク発現生産率を得た。実験データを比較することにより、ＢＬ−２１（ＤＥ３）の親株としてのＢ８３４（ＤＥ３）の発現量は、ＢＬ−２１（ＤＥ３）の発現量よりも、さらに理想的な発現量を有していることがみられる。実験データにより、プラスミドＢ８３４（ＤＥ３）は、元のプラスミドＴＧ１体系を十数倍も超えるタンパク質発現量に達することができることがみられる。

培地は、細菌の成長と繁殖に必要な炭素源と窒素源および無機塩を提供する。本発明は、培地の構成要素を改善することにより、遺伝子組換え菌の成長速率を高めることで、標的タンパク質の発現収率を高める。培地における各成分の含有量を徐々に改善かつ調整することにより、遺伝子組換え菌の発酵と生産に最良な培地の配合方法を見出す。本発明において改善したＦＢ−Ｍ９複合培地は、炭素源と窒素源の含有量を適切に高めた。ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、およびｐＥＴシステム菌の成長に必要なアミノ酸を添加し、細菌の繁殖速率とタンパク質発現効率を適切に高めた。培地の配合方法を改善するのに必要なコストは、比較的に安価であることから、今後の大規模生産のために、大きな研究の余地と開発価値を提供した。

本発明における精製システムのＣＭイオンゲル粒子の携載率は、取扱説明書に記載されている所望のレベルに達していない。これは、標的タンパク質の回収率を制限した。本発明は、サンプル量を減少させ、ゲル体積を適切に増大させることにより、回収率を顕著に改善した。この結果から、一層効率的な大規模工業生産のために、より効率的なイオン交換ゲルを探す必要があることがわかる。この他に、本発明は、イオン交換ステップにおける溶出液の濃度を最適化することにより、得られた組換えタンパク質の不純物を減少させた。

上述したように、本発明は、理想的な遺伝子組換え菌株の選択、培地の構成要素の最適化、精製または回収率の改善により、多種の選択可能であり最適な、大腸菌の遺伝子組み換え菌を用いて組換えタンパク質を発現する工程を提供した。これは、最終的に高効率で発現するのに必要な融合タンパク質の最適な組み合わせを見出すために、発展の方向性と技術ロードマップを提供した。元の発現体系と比較して、本研究において発展させた発現体系は、融合タンパク質の発現量を数十倍も高め、後継の大規模な工業化生産のために、有意義な理論および実践による科学的根拠を提供した。

異なる体積のゲルカラムのタンパク質を溶出するプロセスにおける溶出液の電導値を示す図である。ａは、１５０ｍｌＣＭゲルカラムのタンパク質を溶出するプロセスであり、ｂは６００ｍｌＣＭゲルカラムのタンパク質を溶出するプロセスである。図の矢印の指している曲線は、溶出液の電導値を示している。矢印の指している部分は、サンプリングプロセスにおいて損失されたＰＭＣ−ＳＡによりもたらした電導の小ピークを指す。ゲル体積を増加した後、損失されたＰＭＣ−ＳＡによりもたらした電導の小ピークは、７０％減少する。もう一つの曲線は溶出されたタンパク質のＯＤ値を示す。 ＰＭＣ−ＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。ａは、１．Ｍａｒｋｅｒ、２．ＴＧ１産ＰＭＣ−ＳＡ１、３．ＢＬ−２１産ＰＭＣ−ＳＡ１、４．Ｂ８３４産ＰＭＣ−ＳＡ１を示し、ｂは、１．Ｍａｒｋｅｒ、２．０．１Ｍ ＮａＣｌ硼酸緩衝液の溶出されたＰＭＣ−ＳＡ１、３．０．２Ｍ ＮａＣｌ硼酸緩衝液の溶出されたＰＭＣ−ＳＡ１、４．０．３Ｍ ＮａＣｌ硼酸緩衝液の溶出されたＰＭＣ−ＳＡ１を示す。 ＰＭＣ−ＳＡ対ＭＲＳＡ（ＢＡＡ４２）の抑菌曲線を示す。縦軸は吸光度を示しており、横軸は細菌成長の時間を示す。（Ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群；Ａｍｐ：アンピシリンナトリウム；ＯＸＡ：オキサシリン；Ｉａ−ｗｔ：野生型コリシン；ＰＭＣ−ＳＡ１：抗黄色ブドウ球菌ポリペプチド；ＰＭＣ−ＡＭ：抗髄膜炎菌性ポリペプチド）。

以下、実施例に基づいて本発明を説明する。本発明の使用する実験材料と装置は、以下のとおりである。
（菌株）
Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１遺伝子組換え菌（ＡＥＣＯＭ，Ｋ．ＪａＫｅｓによる寄付）；
Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入した、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ−２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）および６１８遺伝子組換え菌；
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣＢＡＡ−４２。

プラスミド：ｐＢＨＣ−ＳＡ１、ｐＢＨＣ−ＳＡ２、ｐＢＨＣ−ＳＡ３、ｐＢＨＣ−ＳＡ４、ｐＢＨＣ−ＳＥ、ｐＢＨＣ−ＰＡ、ｐＢＨＣ−ＰｏｒＡ１（出願番号２００９１００９２１２８．４、および２００９１０１５７５６４．５二つの特許明細書に記載されている。申請者の実験室に保存されており、検証テストのために公衆に提供することができる。）
（主な試薬および薬品）
酵母粉末（ＯＸＩＯＤ ＬＰ００２１）、ペプトン（ＯＸＩＯＤ ＬＰ００４２）およびその他の化学試薬は、すべて国産である；
透析袋Ｓｎａｋｅ Ｓｋｉｎ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｐｉｅｒｃｅ，リテンション相対分子量１×１０４，Ｌｏｔ＃ＫＤ３２３２４）；
注射用硫酸ストレプトマイシン（華北製薬）；
注射用アンピシリンナトリウムＡＭＰ（ハルビン製薬）；
陰イオン交換カラムゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ＬｏｔＮｏ．２２５０１６）。

ＬＢ液体培地：１００ｍｌの塩化ナトリウム１ｇ、ペプトン１ｇ、酵母０．５を含む。各種の試薬を計量した後、２５０ｍｌのフラスコに入れ、１００ｍｌの水道水を添加し、それを溶解させる。高圧滅菌釜を用いて１２０℃、８ｍｉｎで滅菌する。

ＬＢ固体培地：１００ｍｌの塩化ナトリウム０．５〜１．５ｇ、ペプトン０．５〜２ｇ、酵母０．３〜１ｇ、寒天０．８〜３ｇを含む。ＬＢ固体培地は、菌種が回復した後に、培養プレートでコロニーを培養するのに用いられる。各種の試薬を計量した後、２５０ｍｌのフラスコに入れ、１００ｍｌの水道水を添加し、それを溶解させ、高圧滅菌釜を用いて１２０℃、８ｍｉｎで滅菌する。

ＦＢ−Ｍ９複合培地：ＮａＣｌ６．０〜６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース０．６〜２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８〜１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０〜４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０〜１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２〜０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌ含む。

改良されたＦＢ−Ｍ９複合培地：ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、メチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）を遺伝子組換え菌とする工程において、メチオニンは、４０ｍｇ／Ｌである。

（主な装置）
Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質クロマトグラフィー精製システム（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ，ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ，ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＱｕａｄＴｅｃ ＵＶ−Ｖｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｅｃｏｎｏ Ｐｕｍｐ）；

超音波処理機（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０）、直径５ｃｍのタンパク質精製イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＸＫ５０）、直径１１ｃｍのタンパク質精製イオン交換カラム（上海華美）；
遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０ＸＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２５）；
スペクトル計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｓｍａｒｔ Ｓｐｅｃｔ Ｐｌｕｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）；
全自動発酵槽（スイスＢｉｏｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ．ＡＧ ＬＰ３５１−４２Ｌ）；
細菌高圧ホモジナイザー（イタリアＮｉｒｏ Ｓｏａｖｉ ＮＳ１００１Ｌ２ＫＳＮ ６５６４）。

声明：本発明において使用する生体材料は、いずれも出願日以前に既知のものであり、かつ勤務先に保存されており、出願日により二十年以内に公衆に提供し、検証と試験に用いられることを保証する。

（実施例１．遺伝子組換え菌菌種の最適化選択実験）
シリコンが載ってあるＩａおよびその免疫タンパク質遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１３８１９）の古典的プラスミドは、Ｄｒ．Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ実験室からきている。（Ｑｉｕ ＸＱ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３；２１（１２）：１４８０−１４８５）。本実験室による改造を通して、ｐＢＨＣ−ＳＡ１、ｐＢＨＣ−ＳＡ２、ｐＢＨＣ−ＳＡ３、ｐＢＨＣ−ＳＡ４、ｐＢＨＣ−ＳＥ、ｐＢＨＣ−ＰＡ、ｐＢＨＣ−ＰｏｒＡ１と７種類の組換え突然変異プラスミドを得た。

ステップ１．コンピテント細胞を転換する。
組換え突然変異プラスミドｐＢＨＣ−ＳＡ１ １００ｎｇをそれぞれ４０４０ ｕｌ Ｎｏｖａｇｅｎの数種類のｐＥＴシステム遺伝子組換え菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、６１８に、５分間インキュベートし、４２℃で熱衝撃を３０秒行った後、氷に２分間置く。ＳＯＣ培地１６０ｕｌを添加し、２２０ｒｐｍ、３７℃で細菌を１時間振盪した後、プレートに蒔く（ＬＢ培地に１％の寒天を添加し、５０ｕｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、３７℃で一晩置く）。 コロニーを選択して増殖し、菌種を獲得し、低温で菌種を保存する。

ステップ２．菌種の回復
１．菌種の回復
保存された菌種を取り出し、４℃で解凍する。１．５ｍｌを取り、１０ｍｌＬＢ培地（ＡＭＰ５０μｇ／ｍｌ含有）に入れ、２２０ｒｐｍ、３７℃の条件下において５〜８時間培養する。

２．モノクローナル細菌の接種
回復された菌液を１０⁴または１０⁵倍に希釈し、１０ｕｌ希釈後の菌液を取り、調製しておいたＬＢ個体培地（ＡＭＰ５０μｇ／ｍｌ）プレートに添加し、プレートを塗布する。湿った箱に入れ、３７℃のインキュベーターで１０〜１２時間培養する。培地表面に円形の単一コロニーが形成される。

ステップ３．細菌の採択と細菌の拡大
（１）滅菌済み爪楊枝または接種ループを用い、生育を終えたプレートで規則正しい円形で、周縁が滑らかな単一コロニーを採択して、１．５ｍｌＬＢ培地に入れ、振盪培養する。２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間培養する。
（２）１．５ｍｌＬＢ菌液を１００ｍｌＬＢ培地に入れ、振盪培養する。２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間培養する。

（３）一級拡大培養：上記の１００ｍｌ菌液を７００ｍｌの改良されたＦＢ−Ｍ９複合培地に入れて培養する。振盪培養：２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間培養する。

（４）二級拡大培養：上記７００ｍｌ菌液をそれぞれ６×７００ｍｌの改良されたＦＢ−Ｍ９複合培地に入れ、振盪培養する。２２０ｒｐｍ、３７℃で５〜８時間培養する。

（５）三級拡大培養：上記６×７００ｍｌの菌液を２０Ｌの改良されたＦＢ−Ｍ９複合培地に入れ、発酵槽において培養する。攪拌速度は２２０ｒｐｍであり、最大の酸素透過量であり、３７℃で３〜５時間培養する。

（６）遺伝子組換え菌とタンパク質発現誘導：上記２０Ｌの菌液を２００Ｌの改良されたＦＢ−Ｍ９複合培地に入れ、発酵槽においてタンパク質の発現を培養かつ誘導する。攪拌速度は、２２０ｒｐｍであり、最大の酸素透過量であり、３０℃、２〜４時間；４２℃、０．５時間；３７℃、１〜２時間。注：４２℃に達したとき、最終濃度が０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加する。

ステップ４．遠心分離により細菌を回収する。
培養液６０００ｇを４℃下で２０ｍｉｎ遠心分離を行う。遠心分離後の沈殿物を回収し、５０ｍＭの硼酸緩衝液（ｐＨ９．０）に入れ、菌体を硼酸緩衝液に懸濁させる。注：硼酸緩衝液に２ｍＭのＰＭＳＦ（中国語の名称の日本語訳は、「フッ化フェニルメタンスルホニルのセリンプロテアーゼ阻害剤」である）を添加する。菌体が懸濁された後に４℃下で操作する。

ステップ５．菌体を破砕する。
菌体が完全にｐＨ９．０硼酸緩衝液に懸濁した後に、高圧ホモジナイザーを用いて５００〜６００ｂａｒの高圧にして菌体を破砕する。７回繰り返して破砕し、毎回３〜５分間おきで菌体の破砕を行う。

ステップ６．菌体ＤＮＡを沈澱させる。
破砕後の菌液５５０００ｇを４℃で４０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清液を採取する。硫酸ストレプトマイシン（液体２００ｍｌあたりに１６瓶１００万単位の硫酸ストレプトマイシンを添加する）を加え、磁力攪拌機により１ｈ撹拌する。

ステップ７．透析
上記の菌液５５０００ｇを４℃で２０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を取り、透析袋に入れ、硼酸緩衝液において８〜１２時間透析する。透析液は、４時間ごとに一度換える。

ステップ８．タンパク質を精製して抗菌性遺伝子組換えポリペプチドを得る。
透析した後の菌液５５０００ｇを４℃で２０分間遠心分離し、上清液を取りビーカーに入れ、イオン交換法を用いてタンパク質を精製する。上清を取りＣＭイオン交換カラムにサンプリングし、タンパク質濃度を測定し、単位体積あたりのタンパク質含有量を計算する。サンプル量とＣＭイオンゲル粒子の割合は、操作マニュアルに従い、十分に洗浄した後、０．２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ硼酸緩衝液で溶出して新型の抗菌性遺伝子組み換えポリペプチドを得る。
結果は、図１に示す。Ｅ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）が、ＰＭＣ−ＳＡに対する発現効率は、最も高い。

その他の６種類の組換え突然変異プラスミドに対して同様な操作と比較を行った結果、いずれも表１に示す結果と同じ傾向がみられる。即ち、他の遺伝子組換え菌と比べて、Ｅ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）は、この７種類の組換え突然変異プラスミドに対する発現効率がすべて最も高い。

本実施例において、使用した従来と異なる成長誘導方法は、熱衝撃誘導である。即ち、液体種菌をタンクに入れた後に、大規模な増殖の開始温度は３０℃である。菌液が２時間前後成長した後にＯＤ値が０．４〜０．６に達したとき、４２℃で熱衝撃を３０分行う。熱衝撃終了後に、温度を３７℃まで下げ、再び１．５〜２時間成長した後に細菌を回収する。このときに、増殖菌液のＯＤ値は、１〜３またはそれ以上の数値に達することができる。必要の場合ｐＥＴシステム遺伝子組換え菌を誘導するために、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加する。

従来、上述の組換えポリペプチドを生産かつ調製するのに慣用されている方法は以下のとおりである。
突然変異プラスミド１００ｎｇと調製したＢＬ−２１遺伝子組換え菌コンピテント細胞とを４０ｕｌを氷中で５分間インキュベートした後、４２℃で３０秒の熱衝撃を行う。次いで、氷中に２分間置く。ＳＯＣ培基１６０ｕｌを加え、２２０ｒｐｍ、３７℃で一時間細菌を振った後にプレートに菌を蒔く（ＬＢ培地に１％の寒天、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌを加え、３７℃で一晩置く）。コロニーを採択し、大量増殖させる。

大量増殖：８〜１０リットルのＦＢ培地、２５０ｒｐｍ、３７℃、３〜４時間；次いでＩＰＴＧを添加し、２５０ｒｐｍ、２８℃で４時間再成長させ、４℃、６０００ｇ、２０分間菌体を遠心沈殿し、４℃、５０ｍＭの硼酸緩衝液（ｐＨ９．０、２ｍＭＥＤＴＡ）８０−１００ｍｌを取り、菌体を懸濁する。ＰＭＳＦ ５０ｕｇを添加した後に、超音波処理によって菌体を破砕する（４℃、４００Ｗ、１分間、４〜５回繰り返し、２〜３分間おきに菌液の温度を確保する）。破砕された菌体（４℃、７５，０００ｇ、９０分間）を高速遠心分離して沈殿させる。上清を取り、硫酸ストレプトマイシン５００万単位を添加してＤＮＡを沈澱する（４℃で１時間攪拌する）。１０，０００ｇ、４℃、１０分間遠心沈澱した後、上清を取り、分子量１５，０００の透析袋に入れ、４℃、５０ｍＭの硼酸緩衝液１０リットルにして一晩透析した後に、再度１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心沈殿させ、上清を取り、ＣＭイオン交換カラムにサンプリングする。十分に洗浄した後に、０．３ＭＮａＣＩ＋５０ｍＭの硼酸緩衝液で溶出すれば、調製された新型の抗生物質を得ることができる。

実施例２．培地の改善
従来のコリシンＩａ成長培地は、ＦＢ培地である。（Ｑｉｕ ＸＱ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３；２１（１２）：１４８０−１４８５／Ｋａｒｅｎ Ｊａｋｅｓ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ａｂｒａｍｓ，Ａｌａｎ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｉｃｉｎ Ｅ１ Ｃｈａｎｎｅｌ ｂｙ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ＪＢＣ，１９９０；２６５（１２）：６９８４−６９９１）。ＦＢ培地は、２５ｇ／Ｌのペプトン、７．５ｇ／Ｌの酵母粉末、６ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌのグルコースを含む。

本発明では、グルコースの含まないＦＢ培地を使用した。その配合方法は以下のとおりである。ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌである。 並びに上述のグルコースの含まないＦＢ培養液およびＭ９培養液を一定の体積の割合で複合して配置することによって、本発明のＦＢ−Ｍ９複合培地を得た。

Ｍ９培地は、母液が５×Ｍ９であり、Ｎａ₂ＨＰＯ₄７Ｈ₂Ｏ６４．０ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄１５．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄１．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０５ｇ／Ｌ、２％のグルコースを含む。
最初に二種類の培地の複合を試みる。

ＦＢ−Ｍ９：ＦＢ：Ｍ９の体積比＝７：１０、配合方法は、ＮａＣｌ６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄７Ｈ₂Ｏ１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、グルコース０．６ｇ／Ｌである。

本発明は、このような配合方法を用いて発酵かつ生産を行う。発酵工程は、実施例１のステップ３と同様である。その結果は、表２に示す。１リットルあたりの培養液の得られた湿菌体重量は、ＦＢ培地のみで得られた湿菌体重量より明らかに高い。回収したタンパク質生産量は明らかに高くなり、平均生産量は３０ｍｇ／Ｌにまで達することができる。

本発明はさらに繰り返して比較することにより、最終的に改善されたＦＢ−Ｍ９培地が得られた。実施例１に記載された発酵条件下で、３４ｍｇ／Ｌの目的タンパク質生産率に達することができる。表３に示したとおりである。

改良されたＦＢ−Ｍ９培地は、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌを含む。Ｂ８３４遺伝子組換え菌の成長過程においてメチオニンが必要となるため、Ｂ８３４を遺伝子組換え菌とする工程において、ＦＢ−Ｍ９培地には、さらにメチオニン（４０ｍｇ／Ｌ）を添加した。

実施例３．タンパク質の精製条件を最適化する。
本発明において調製した組換えポリペプチド（ＰＭＣ−ＳＡ１、ＰＭＣ−ＳＡ２、ＰＭＣ−ＳＡ３、ＰＭＣ−ＳＡ４、ＰＭＣ−ＳＥ、ＰＭＣ−ＰＡ、ＰＭＣ−ＡＭ）の基本構造は、コリシンＩａである。また、コリシンＩａの等電点は、約９．１５であるため、その典型的な精製方法は、イオン親和クロマトグラフィー交換法を使用した。（Ｑｉｕ ＸＱ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３；２１（１２）：１４８０−１４８５）。

その作動原理は、以下のとおりである。ｐＨ９．０の硼酸緩衝液システムにおいて、ＰＭＣ−ＳＡ分子のほとんどが、正電荷イオンとして存在している。クロマトグラフィックカラムに負電荷の帯電するＣＭゲル粒子が流れるとき、正電荷の帯電した上述の組換えタンパク質分子は、電荷間の吸引力により、負電荷の帯電するＣＭゲル粒子に掛かる。その他の混入タンパク質は、次第にゲルカラムから流し出される。

本実施例において、その他のステップは、実施例１と同様である。混入タンパク質が洗浄された後、それぞれ０．１〜０．３ＭＮａＣｌの含有する硼酸緩衝液でゲルカラムに対して、勾配溶出を行う。

Ｎａ⁺イオンは、組換えタンパク質分子イオンよりさらに強い正電荷性を有するため、組換えタンパク質イオンは、Ｎａ⁺イオンによりＣＭゲル粒子から置換される。イオン交換精製において、二つの変量が操作可能であり、そこからより良好な目的タンパク質の回収率を得ることができる。（１）０．０５〜１Ｍの範囲内で異なる濃度のＮａＣｌを選択することができる。ＣＭゲル粒子に搭載された異なる正電荷強度を帯びているタンパク質分子をそれぞれ溶出する。（２）使用するＣＭゲル粒子の量は、さらに最適化することができる。一定のイオン強度下において、各ＣＭゲル粒子の担持されているタンパク質量は、相対的に恒常性を有している。蛋白質に対するゲルカラムの担持量を増加させるためには、ゲルカラムの体積を増大する必要がある。

ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、ＧＥ社が生産した陰イオン交換カラムゲルである。その取扱説明書によると１００ｍｌのゲルごとに、最大で９ｍＭの陽イオンと結合することができる。動的結合過程において、実際に利用可能な結合容量は、サンプルの性質が変化するにつれて変化する。分子量と結合容量とは、反比例の関係を有している。その標準試料の中で本発明の調製した組換えポリペプチドの分子量に近いのは、ＢｏｖｉｎｅＣＯＨｂ−（Ｍｒ６９ｋＤ）である。その理論上の動的結合容量は、３０ｍｇ／ｍｌである。即ち１００ｍｌ容量のＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲルを用いて組換えタンパク質のサンプルを回収するとき、理論上の最大回収率は、約３００ｍｇ（０．００４ｍＭ）であるが、その取扱説明書に従い、本発明のＣＭゲル粒子と組換えタンパク質分子との間の実際の動的結合容量は、３ｍｇ／ｍｌであり、理論値の１０％だけ達している。

混入タンパク質洗浄工程の後半期において、電導度曲線は、一過性の上昇する小ピーク（図１ａ）がみられる。この現象に基づいて推測したのは、サンプルの中における組換えタンパク質の量が比較的に大きいとき、ＣＭゲル粒子は、目的タンパク質との結合容量に限度があるため、サンプルにおける組換えタンパク質の一部分だけ回収できることである。ＣＭゲル粒子に搭載されなかった組換えタンパク質は、混入タンパク質とともに一括してゲルカラムから流し出される。組換えタンパク質が正電荷を帯びているため、電導度曲線の一過性の上昇ピークがみられる。

本発明の最適化する方法において、目的タンパク質の損失を低減するために、各バッチのサンプル量を取扱説明書に規定された量の１／３に減らすと同時に、使用するゲル体積を増大させる。ゲル体積を１５０ｍｌから６００ｍｌにする。即ち上清液のタンパク質量：ゲル粒子の体積＝２．５ｍｇ／ｍｌである。溶出過程における組換えタンパク質の損失が低減され、実験データに示すように、組換えタンパク質の回収率は、３．５倍に増加された。その結果は、図１ｂに示す。

この他に、溶出用の硼酸緩衝液におけるＮａＣｌの勾配を０．１Ｍ−０．２Ｍ−０．３Ｍに設定する。図２ｂに示すように、０．２Ｍの溶出効率とタンパク質純度が最も高い。

実施例４．タンパク質純度および活性検出
ステップ１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
実施例４の最適化方法により抽出した融合タンパク質サンプルに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および硝酸銀染色を行う。図２に示すように、電気泳動図ａにおいて、相対分子質量が約７０ｋＤのところに、明確なウェスタンブロッティングのバンドがある。即ち本発明の調製したＰＭＣ−ＳＡ１である。図ｂは、実施例４において、改善された勾配溶出法により得たタンパク質は、異質バンドが取り除かれ、純度が高くなる。本発明の最適化方法により調製して得たその他の六種類の組換えタンパク質の純度も、同様に増加された。

ステップ２．抑菌活性の検出
実施例１、実施例２、および実施例３によって調製方法を改善した後に得た組換えタンパク質ＰＭＣ−ＳＡ１とＰＭＣ−ＡＭに対して、以下のように抗菌活性試験を実施した。

１０ｍｌのＢＭ培地に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ，ＡＴＣＣＢＡＡ−４２）菌液を１０ｕｌ（１０⁵ＣＦＵ／ｍｌ）接種する。抗菌剤を添加し、抗菌剤に基づいて六つのパラレルグループに分ける。その六つのパラレルグループはそれぞれ、アンピシリンナトリウム２ｕｇ／ｍｌ、オキサシリン４ｕｇ／ｍｌ、野生型コリシンＩａ、ＰＭＣ−ＳＡ、Ｐｈ−ＮＭ（４ｕｇ／ｍｌ）およびブランク対照群である。３７℃、２１０ｒｐｍで振盪培養し、一時間ごとに菌液の光学密度（５９５ｎｍ）を測定し、成長直線図を作成する。詳細は、図３に示す。
抑菌実験曲線から、本発明における改良方法により調製した組換えポリペプチドは、良好な抗菌活性を有することがわかる。

Claims (8)

1. 一端が親水性を有するコリシンポリペプチド端末であり、他端が疎水性を有する標的物質識別ポリペプチド端末であるポリペプチドを有する遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を発現する方法であり、
   前記遺伝子組換え菌の組換えタンパク質をコードする遺伝子組換えプラスミドを大腸菌ｐＥＴシステムの遺伝子組換え菌であるＥ．ｃｏｌｉＢ８３４（ＤＥ３）に形質転換することによって、陽性モノクローンを得るステップ（１）と、
   前記陽性モノクローンを増殖させることで得られた液体種菌を誘導し、大量増殖を行い、発現された前記遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を含む上清液を得るステップ（２）と、
   前記上清液に含まれている発現された前記遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を分離して精製するステップ（３）と、を含み、
   大量増殖で使用する培地は、ＮａＣｌ６．０〜６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース０．６〜２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ ₂ ＨＰＯ ₄ ・７Ｈ ₂ Ｏ６．８〜１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ ₂ ＰＯ ₄ ３．０〜４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ ₄ Ｃｌ１．０〜１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ ₄ ０．２〜０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ ₂ ０．０１ｇ／Ｌ、およびメチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含有し、水を溶媒とすることを特徴とする遺伝子組換え菌の組換えタンパク質を高効率で発現する方法。
2. 大量増殖で使用する培地は、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、およびメチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含有し、水を溶媒とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記誘導を行う方法は、熱衝撃による誘導方法であり、
   その操作方法は、液体種菌をタンクに入れた後、３０℃で２〜３時間初期成長させ、ＯＤ値が０．４〜０．６に達したとき、４２℃で熱衝撃を３０分行い、次いで、温度を３７℃まで下げ、再び１．５〜２時間成長させてから、細菌を回収することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 前記熱衝撃による誘導方法において、大量増殖で使用する培地に最終濃度が０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記上清液に含有する発現された前記遺伝子組換え菌の組換えタンパク質は、ＣＭイオン交換カラムを用いて分離精製され、
   その中のサンプル量は、上清液のタンパク質量とゲル粒子体積との比例である２．５ｍｇ／ｍｌに基づいて決められることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記上清液に含有する発現された前記遺伝子組換え菌の組換えタンパク質は、ＣＭイオン交換カラムを使用して分離精製され、
   溶出用の硼酸緩衝液におけるＮａＣｌの濃度は、０．２Ｍであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドの調整方法に用いられる培地であって、
   ＮａＣｌ６．０〜６．７ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース０．６〜２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８〜１８．３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０〜４．３ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０〜１．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２〜０．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、およびメチオニン０〜４０ｍｇ／Ｌを含有し、水を溶媒とすることを特徴とする大腸菌ｐＥＴシステム遺伝子組換え菌に用いられる培地。
8. 前記大腸菌ｐＥＴシステム遺伝子組換え菌はＥ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４（ＤＥ３）であり、
   前記培地は、ＮａＣｌ６．０ｇ／Ｌ、ペプトン２５．０ｇ／Ｌ、酵母粉末７．５ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６．８ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄３．０ｇ／Ｌ、ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂０．０１ｇ／Ｌ、およびメチオニン４０ｍｇ／Ｌを含有し、水を溶媒とすることを特徴とする請求項７に記載の培地。