JP5986381B2 - ベクター - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子をバキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入するための導入ベクターに関する。また、本発明は、導入ベクターおよび由来するバクミドおよびバキュロウイルスの使用方法にも関する。

バキュロウイルス発現系は、構造的および生化学研究のために真核細胞において何千ものタンパク質を発現させるために用いられている(１４)。単一の組換えタンパク質を発現する能力に加え、バキュロウイルスシステムは、また、複合体を形成する複数のタンパク質を共発現させるためにも用いられている(１５−２２)。全ゲノム相関解析が生きている細胞の多くの重要な機能が多サブユニットタンパク質複合体によって実行されることを明らかにしているので、これは重要である(２３)。主に２つの方策を用いて、バキュロウイルスシステムを使用したタンパク質の共発現を達成している。それぞれが１つの組換えタンパク質を発現する２以上のウイルスを細胞に同時に感染させることが、非常に一般的な手法である(１９、２４、２５)。しかしながら、これらの研究でのタンパク質複合体の収率は非常に変わりやすく、異なる２つのバキュロウイルスによる同じ細胞の共感染はポアソン分布とならない(２６)。ゆえに、共感染手法は技術的に容易であるにもかかわらず、実際には、大量の精製タンパク質を必要としない用途のための相対的に単一の複合体の回収に限られている。

多くのタンパク質を必要とする構造的研究および大きなワクチン試験などの用途のため、そして多くのサブユニットから形成される複雑な複合体のために、ポリヘドリン又はｐ１０遺伝子座に挿入された複数の同種の発現カセットからタンパク質を共発現させる他の手法が使われている(１５−１８、２２、２７)。この手法は、組換えウイルスに感染している培養物のすべての細胞が、再現性のある方法でタンパク質複合体の形成に必要なタンパク質のすべてを発現する点で利点がある。共感染と単一のバキュロウイルス手法を比較すると、後者は組換え複合体の有意に良好な収率を示した(２８)。しかしながら、単一の組換えウイルスを使用した複数のタンパク質の発現に欠点がないわけではない。桿状のバキュロウイルスはそのゲノムに挿入の完全な耐性を示すが、遺伝子は相同組み換えによってウイルスへ移るので、導入ベクターは大腸菌において容易に操作できるサイズでなければならない。したがって、導入ベクターに挿入されうる遺伝子の数には制限がある。このため、実際には、単一の遺伝子座から４以上のタンパク質をめったに発現させることができない。加えて、バキュロウイルスは、相同組換えを促す配列を含み、タンパク質を発現する(２９−３２)。したがって、大量の反復配列を含有するウイルスは、再編成および組換えを起こしやすい(２１、３３、３４)。

単一のバキュロウイルス共発現手法は、ポリヘドリン遺伝子座にＴｎ７標的をすでに含有するバクミドのｃｈｉＡ／カテプシン遺伝子座に、ｌｏｘＰ部位が挿入されている点で変更されている(２０)。これにより、大腸菌での組換えを用いてこれら各々の遺伝子座に複数の発現カセットが挿入される。この系は、異なる遺伝子を発現するように変更された発現カセットの反復的な重複に依存すると推測されるので、この系への挿入は遺伝的に多少不安定であることが証明されている(２１)。

近年、バキュロウイルス研究は、ウイルス遺伝子が選択的にノックアウトされたＥＴ組換え系の使用により恩恵を受けている(３５−４９)。しかしながら、ｐ１０およびポリヘドリン以外の遺伝子の遺伝子座にタンパク質の発現を設計し、促すためのこの技術の潜在能力は研究されていない。

本発明は、単一のバキュロウイルスゲノムから複数の組換えタンパク質(すなわちバキュロウイルスのものではないタンパク質)を効率良く発現させる方法に関する。この方法によって、単一タンパク質発現カセットがＥＴ組換え系を使用してウイルスゲノム内の異なる遺伝子座に効率よく挿入される。さらに、この方法により、数多くのサブユニットを有する複合体が発現される。

発現系としてバキュロウイルスを使用した単一タンパク質の発現が十分に確立されている。発現系の基本的な方法論は、その初期の製造からほとんど変化していない。１３３ｋｂのバキュロウイルスｄｓＤＮＡゲノムは非常に大きくて、直接操作することができない。したがって、大腸菌において、外来タンパク質をコードする遺伝子をＡｃＭＮＰＶ昆虫ウイルスの発現カセットを含むベクターにクローニングし、ついで、これをウイルスＤＮＡにて昆虫細胞へ導入する。この昆虫細胞では、ウイルスおよび細胞のタンパク質が相同組換えを媒介し、その結果外来タンパク質を発現する(昆虫細胞に関して)感染性のウイルスが産生される。組換えが起こる場合にはただ複製するだけであるウイルスゲノム(１、２)、そして組換えウイルスの選別の速度を上げるトランスポゾンＴｎ７(３)の使用に基づくバクミドによる大腸菌における組換えの実行を含め、このテーマにおいていくつかの変更が既になされている。また、先に簡単に述べたように、昆虫細胞の多タンパク質複合体の発現は、バキュロウイルス発現系を使用して達成された。まず最初に、単一タンパク質を各々発現する複数のウイルスを用いて感受性細胞に共感染させ、タンパク質複合体を発現させた後に精製した。しかしながら、これは効率が良いとは言い難く、スケールアップに適当となるほどの再現性がない。別法として、複数の発現ユニットを組み込むが、単一のウイルス遺伝子座と組換えを起こすベクターが製造された(４−６)。これらのベクターは、すべての組換えタンパク質サブユニットを感染細胞ごとに生産し、組換えタンパク質複合体を有意に高く回収する点に利点があった。加えて、単一のウイルスだけがすべてのタンパク質を発現するので、感染の結果は非常に再現性があった。これらのベクターの不利な点は２つある。第一に、ベクターが反復配列を含み、バキュロウイルスが相同組み換えを促すタンパク質を発現するので、特に３又は４の発現ユニットを含むコンストラクトからの発現は、何世代ものウイルス継代に渡って必ずしも遺伝的に安定していない(それは、バキュロウイルスタンパク質発現のための産業的なスケールアップに必要である)。第二に、容易に維持でき、これらのベクターから発現されうるタンパク質の数を制限する大腸菌において操作することができる挿入物の大きさに実務上制限がある。複数のタンパク質の産生のために提唱された他の手法は、バキュロウイルス内の一つの遺伝子座に外来タンパク質(一又は複数)を挿入し、次いでそのタンパク質を発現するウイルスを選別し、そしてこのウイルスゲノムを用いて第二の遺伝子座に組換えて他のタンパク質を発現させることである(７)。しかしながら、この手法には高い技術と時間(第一遺伝子座のために１６日および各々続く遺伝子座のために２５日)が必要であるため、この手法はほとんど使われていなかった。最近の発達は、ＢＡＣベースのＴｎ７トランスポゾン系を変更してバキュロウイルス内の第二遺伝子座にＬｏｘＰ部位を挿入し、大腸菌内のこの遺伝子座に別の遺伝子を挿入させることである(８)。しかしながら、この方法は依然として、細菌ベクター内のプロモーターに重複からの反復配列があることは、コンストラクトが何世代ものウイルス継代に遺伝的に不安定であることを示し、さらに導入ベクターが大腸菌での操作に対して最大の実務上のサイズに急速に達するという問題を抱えている。

本発明の方法は、遺伝的な不安定性および複数回の組換えの必要性といった、従来法に特有の問題の少なくともいくつかを克服する。

第一態様によると、本発明は、バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
以下を含むグループ化選別カセットと、
(i) 第一の選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
(ii)第二の選択マーカーをコードする発現可能な配列、
この発現カセットおよびグループ化選別カセットに隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の該遺伝子座の配列に実質的に対応する配列と
を含んでなる導入ベクターを提供する。

本発明の導入ベクターを用いて、効率良く遺伝子をバキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入すること、そして、該遺伝子を含むバキュロウイルス配列を選択することができる。特に、グループ化選別カセットによって、単一の選択マーカーを用いた選別と比較して、陽性クローン(すなわち挿入された遺伝子を含有しているバキュロウイルス配列)の識別が実質的に増加した。これにより、単一の選択マーカーの使用に勝る有意な利点を示す。少数のバキュロウイルスのみが形質転換するので、マーカーは非常に低いレベルで発現されるだけである。例えば、マーカーが抗生物質である場合、非常に低いレベルの抗生物質の使用でよい。この結果、使用する抗生物質に耐性がある細菌変異体が選別される。したがって、プレート上で生育する細菌には、変更を含んでいないものもある。２つの陽性選別法を使用することにより、このような偽陽性を選別する可能性が克服される。

本発明の導入ベクターは、相同組換えによりバキュロウイルス配列と組み換わり、バキュロウイルス配列内に遺伝子を挿入することができる限り、いずれの適切なベクターであってよい。適切な導入ベクターは当業者にとって周知である。導入ベクターの重要な特徴はさらに後述する。

バキュロウイルス配列に挿入される遺伝子は、任意の異種遺伝子(すなわちバキュロウイルスのものでない遺伝子)であってよい。異種遺伝子がタンパク質複合体のサブユニットをコードすることが好ましい。異種遺伝子は、ウイルスタンパク質、レセプターの構成成分又はシャペロン複合体をコードしてよい。異種遺伝子が、他のウイルスタンパク質と共にウイルス様粒子(ＶＬＰ)を形成しうるウイルスタンパク質をコードすることが、特に好ましい。

バキュロウイルス配列に遺伝子が挿入される遺伝子座は、挿入された遺伝子が発現し、更にバキュロウイルス配列の複製能を妨げない任意の適切な遺伝子座であってよい。さらに、使用する遺伝子座は、バキュロウイルスが細胞に感染する能力、すなわち複製するか又は細胞から細胞へ広がる能力に作用するものであってはならない。このような遺伝子座には、ポリヘドリンおよびｐ１０の遺伝子座が含まれる。本発明の発明者等によって同定された更なる他の適切な遺伝子座には、ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６が含まれる。

バキュロウイルス配列は、昆虫細胞および大腸菌などの原核細胞において複製しうる任意の適切なバキュロウイルス配列であってよい。特に、ＢＡＣレプリコンを含有する任意のウイルス性バキュロウイルスゲノムが用いられてよい。適切なバキュロウイルス配列にはＡｃＭＮＰＶバクミドが含まれる。

「発現カセット」なる用語は、遺伝子の発現に必要な成分の組合せを指す。したがって、発現カセットは、真核細胞(すなわち昆虫細胞)においてコードされた遺伝子の発現を可能とする適切なプロモーターと、該遺伝子配列に隣接する適切なポリアデニル化シグナル配列とを含む。真核細胞における遺伝子の発現のための発現カセットは、当業者に周知である。特に好適なプロモーターには、バキュロウイルスウイルス性後期プロモーター(例えばｐ３５)又はウイルス性最後期プロモーター(例えばポリヘドリンおよびｐ１０プロモーター)が含まれる。適切なポリアデニル化シグナル配列には、トリプトファンヒドロキシラーゼ(Ｔｐｈ)ポリアデニル化配列又はバキュロウイルス遺伝子からのポリアデニル化配列が含まれる。

発現カセットは、複数の遺伝子が発現する複数の遺伝子(例えば２、３又は４の遺伝子)を含みうる。しかしながら、一般に、発現カセットが単一の遺伝子を含むことが好ましい。

グループ化選別カセットは、遺伝子をうまく取り込んだクローンの識別および単離を向上させることが明らかになった。グループ化選別カセットは、２つの異なる選択マーカーを含む。また、カセットは、一又は複数の細菌性プロモーターのような細菌細胞におけるマーカーの発現に必要な任意の成分を含む。遺伝子を取り込んだ配列を選別する工程は、両方の選択マーカーを含む配列について選別することを含む。この選別工程は、細菌細胞、例えば大腸菌において実行される。選択マーカーは、カセットを含む細胞が選択される任意のマーカーであってよい。例えば、マーカーは、細胞又はコロニーの色の出現又は変化を引き起こすマーカーのような可視化されるものであってよい。あるいは、マーカーは、例えば抗生物質に耐性を与えうる。２つの選択マーカーは、同じタイプのマーカー、例えば２つの異なる抗生物質に対する耐性、又は異なるタイプのマーカー、例えば抗生物質耐性と視覚マーカーであってもよい。第一選択マーカーは好ましくは、ＬａｃＺα断片といった視覚マーカーであり、これによりＬａｃＺα断片を発現する細胞がＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌの存在下で青色になる。第二選択マーカーは、好ましくは、抗生物質耐性、例えばクロラムフェニコール、テトラサイクリン、ピューロマイシン、アンピシリン、ペニシリン、アプラマイシン、カナマイシン又はフレオマイシンに対する耐性を与える任意のマーカーである。第二マーカーがフレオマイシンに耐性を与えることが特に好ましい。

好ましい実施態様では、グループ化選別カセットはＬｏｘＰ組換え配列が隣接している。ＬｏｘＰ組換え配列は、介在配列の欠失を引き起こすＣｒｅリコンビナーゼの存在下で共に組み合わさる。したがって、グループ化選別カセットは、同じ選択マーカーが、任意の他の遺伝子をバキュロウイルス配列に挿入する場合に使用されるように取り除かれてよい。ＬｏｘＰ部位は、１回のみの組換えが部位間で生じるように変更されるのが好ましい。適切な変更ＬｏｘＰ部位、例えばＬｏｘ６６およびＬｏｘ７１変更部位は、当業者に公知である。

発現およびグループ化選別のカセットに隣接する配列は、導入ベクターとバキュロウイルス配列との間で相同組換えを生じさせる遺伝子座の配列と実質的に対応する。各々の隣接配列は、好ましくは少なくとも２０ｂｐ長、より好ましくは少なくとも３０ｂｐ長、更により好ましくは少なくとも５０ｂｐ長であり、遺伝子座の配列と特異的に組換えさせる配列を有する。

第二態様によると、本発明は、組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと本発明の第一態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
グループ化選別カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。

組換えバクミドは、グループ化選別カセットに応じて標準的な技術を使用して選別されうる。

組換えバクミドの製造方法は、さらに、バクミド又はその発現産物において遺伝子の存在を検出することを含んでよい。特定の遺伝子に応じて、適切なスクリーニング技術が使用されうる。

さらに、選別カセットがＬｏｘＰ組換え配列に隣接する場合、この方法は好ましくは、例えばバクミドをＣｒｅリコンビナーゼにさらすことによってＬｏｘＰ部位間に組換えを誘導し、グループ化選別カセットを取り除くことを含む。Ｃｒｅリコンビナーゼは、好ましくは、誘導性プロモーター、例えばアラビノースプロモーターの制御下にある。グループ化選別カセットを取り除く利点は、更なる導入ベクターがバクミドと組み換わることができることであり、この更なる導入ベクターは同じグループ化選別カセットを含むものである。更なる組換えバクミドの選別は、１回目の組換えの後に用いたものと同じ技術を用いて実施することができる。

一般に、原核細胞ベースの系が容易かつ迅速に操作できるので、組み換えバクミドの製造方法は原核細胞において実行される。原核細胞ベースの系が相同組み換えを促すことが好ましい。このような系には、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−１２９１４２０に記述されるラムダレッド組換え系が含まれる。好ましくは、組換えバクミドの製造方法は大腸菌において実行される。この方法は、大腸菌株ＥＬ３５０を使用して実行されることが特に好ましく、この菌株は、温度で調節されるラムダＰＬプロモーターの制御下にｅｘｏ、ｂｅｔおよびｇａｍを発現する統合ラムダプロファージと、アラビノース誘導性プロモーターの制御下にＣｒｅリコンビナーゼとを有する。

バクミドが多くの異種遺伝子、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８以上の異種遺伝子を含むことができるように、組換えバクミドの製造方法は複数回繰り返すことができる。各々の挿入された遺伝子を発現するための異なるプロモーターを使用しようとすることによって、そして、各遺伝子が異なる遺伝子座に挿入されているので、バクミド内の反復配列を低減する又は有することを防ぎ、これによりバクミドが良好な遺伝的安定性を有することができる。少なくとも一つの必須遺伝子が各々挿入された異種遺伝子の間に位置することが、さらに好ましい。このような配位により、挿入した配列の何れかの間に相同組み換えが起これば、必須遺伝子は欠失し、生きることができないバクミドとなることが確実となる。

第三態様によると、本発明は、本発明の第二態様による方法によって得られた組換えバクミドを提供する。また、挿入した遺伝子を含むバクミドは、ＬｏｘＰ配列のレムナントも含んでよい。これらのレムナントは、バクミドを識別するためのマーカーとして使われてよい。バクミドは好ましくは、少なくとも６、７、８又は９の異種遺伝子を含む。

第四態様によると、本発明は、組換えバキュロウイルスの製造方法であって、バキュロウイルスが製造されるような条件下で、本発明の第二態様による方法によって得られた組換えバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法を提供する。好ましくは、真核細胞は昆虫細胞であり、より好ましくは、昆虫ヨトウガ又はイラクサギンウワバ、例えば(Ｓｆ２１、Ｓｆ９又はＴＮ ５Ｂ-１-４)昆虫細胞由来のものである。バキュロウイルスは、標準的な技術と試験する挿入異種遺伝子の発現を使用して単離することができる。

第五態様によると、本発明はまた、本発明の第四態様による方法によって得られた組換えバキュロウイルスを提供する。

第六態様によると、本発明は、複数の異種タンパク質を発現する組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスであって、このそれぞれのタンパク質がバクミド又はバキュロウイルスの異なる遺伝子座から発現されるものである組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスを提供する。少なくとも一の必須遺伝子が異種タンパク質を発現する各遺伝子の遺伝子座の間に位置することがさらに好ましい。このような配位により、異種遺伝子を発現する遺伝子座の間で相同組み換えが起これば、必須遺伝子が欠失し、生きることができないバクミド又はバキュロウイルスが確実に生じる。好ましくは、バクミド又はバキュロウイルスは、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも８のタンパク質を発現する。タンパク質は、異種性、すなわち天然に生じるバキュロウイルスによってコードされていない。コードされた異種タンパク質は、タンパク質複合体、例えばＶＬＰ、レセプター複合体又はシャペロン複合体のサブユニットであることがさらに好ましい。

組換えバクミド又はバキュロウイルスの異なる遺伝子の遺伝子座がｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２、ｏｄｖ-ｅ５６およびｐ１０から選択されることが更に好ましい。このような遺伝子座の位置は、下記の表１にバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶに関して具体的に記述する。当業者は、この情報を用いて他のバキュロウイルス株およびバクミド内の遺伝子座の位置を容易に決定することができる。

第七態様によると、本発明はまた、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスであって、ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６の一又は複数の遺伝子の遺伝子座で異種タンパク質をコードする発現カセットが挿入しているものを提供する。

これらの遺伝子の遺伝子座は、バクミド又はバキュロウイルスの必須機能を破壊させずに異種タンパク質を特異的に高く発現させることが明らかにされている。

好ましくは、組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスは複数のタンパク質をコードしており、各々の発現カセットは異なる遺伝子座に挿入される。組換えバクミド又は組換えバキュロウイルスは、少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも８のタンパク質をコードすることが更に好ましい。コードされた異種タンパク質は、タンパク質複合体、例えばＶＬＰ、レセプター複合体又はシャペロン複合体のサブユニットであることが更に好ましい。

第八態様によると、本発明はまた、バキュロウイルス配列の遺伝子座に遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
該発現カセットに隣接する配列であって、バキュロウイルス配列内の遺伝子座の配列に実質的に対応し、該遺伝子座がｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６から選択されるものである配列と
を含む導入ベクターを提供する。

上記のように、遺伝子を列挙した遺伝子の遺伝子座に挿入することによって、バキュロウイルス配列の必須機能を破壊することなく高いレベルで遺伝子を発現させることができることが明らかになった。

第九態様によると、本発明はまた、組換えバクミドの製造方法であって、
バクミドと本発明の第八態様による導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
発現カセットを含む組換えバクミドについて選別すること
を含む方法を提供する。

このような組換えバクミドの製造とこのようなバクミドの選別の方法は、当業者にとって周知である。また、本発明はこの方法によって得られた組換えバクミドも提供する。

第十態様によると、本発明はまた、組換えバキュロウイルスの製造方法であって、本発明の方法による組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが製造されるようにバクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法を提供する。

このような組換えバキュロウイルスの製造方法は、当業者に周知である。また、本発明はこの方法によって得られた組換えバキュロウイルスも提供する。

また、本発明は、本発明の何れかの態様による導入ベクター、バクミド又はバキュロウイルスを含む細胞を提供する。

また、本発明は、一又は複数のタンパク質の製造方法であって、適切な条件下で本発明の何れかの態様による組換えバクミド又はバキュロウイルスを培養することを含む方法を提供する。一又は複数のタンパク質は一又は複数の遺伝子によってコードされ、ＶＬＰのようなタンパク質複合体又はシャペロン複合体を形成するように組み合わせてよい。一又は複数のタンパク質は、当業者に周知の標準的な技術を使用して単離されうる。

本発明を、以下の図を参照して例示のみとしてここに記載する。

ＥＴクローニングからの組換え体の改良した選別を示す。Ａ) ｃａｔとグループ化の組換えのために使用するＤＮＡの図。両コンストラクトは、同じバキュロウイルス隣接配列(ＡｃＭＮＰＶ)、ウミシイタケルシフェラーゼ発現カセット(Ｐｐ３５−Ｒｌｕｃ−Ｔｐｈ)およびｌｏｘＰ部位(ＬｏｘＰ)を有していた。グループ化選択マーカーは、ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子(ＺｅｏＲ)およびＬａｃＺα断片も有していた。クロラムフェニコール耐性コンストラクトでは、これはｃａｔ遺伝子に置き換えた。Ｂ) ＥＴ組換え後の陽性細菌コロニーの数。示されるように、組換えに使用するＤＮＡはＰＣＲ又は制限酵素消化の何れかによって作製した。Ｃ) Ｒｌｕｃ発現カセットの正確な挿入は、導入したＤＮＡ内の１つのプライマーとバキュロウイルスＤＮＡ内の標的遺伝子座に隣接するプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。正しいＰＣＲ産物(矢印で示す)は正しく統合した後にのみ生成される。１２の別々の組換え体(１−１２)、テンプレートなしのＰＣＲコントロール(１３)、無変更バクミドテンプレート(１４)および導入ＤＮＡテンプレート(１５)についての結果を示す。レーンＭはマーカーＤＮＡである。Ｄ) Ｃの第２継代の組換えバクミド１−１２を感染させた細胞の細胞溶解物における感染後４８時間のウミシイタケルシフェラーゼ活性(相対的な光単位)。感染していない細胞(細胞)と無変更バクミド(ＡｃＭＮＰＶ)感染細胞の等価溶解物のバックグラウンド活性は１０６分の１以下であった。 マーカー遺伝子の選択的な除去を示す。Ａ) ＡｃＭＮＰＶバクミドＤＮＡへの発現カセットのＥＴ組換え(発現)とＣｒｅが媒介する組換えによるマーカー遺伝子のみの選択的除去(選別)の方策を示す図。Ｂ) Ａにおいてａおよびｂと示したプライマーを用いたＰＣＲ。レーン１−２：ＥＴ組換え後の２つの別々のバクミド組換え、レーン３−６：Ｃｒｅ媒介組換えにより細菌の選択マーカーを取り除いた後の４つの別々の組換え体、レーン７：テンプレートなし、レーン８：無変更バクミドＤＮＡテンプレート、レーン９：選択マーカーカセットを含むプラスミドＤＮＡテンプレート、レーン１０：ＤＮＡマーカー。親およびＣｒｅ媒介組換えの組換え生成物に予測されるサイズに対応するＰＣＲ産物を、それぞれＰおよびＲと示す。Ｃ) 組換え体に更なるＣｒｅ媒介組換えを起こさなくさせるｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６のアームを組み込む不完全ｌｏｘＰの存在を確認する、ＢのＰＣＲ分析からの代表的な組換えの配列追跡ファイル。Ｄ) 昆虫細胞へ形質移入したＢからの組換えバクミドおよび親バクミドのウミシイタケルシフェラーゼ活性。ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、組換えウイルスの継代の４８時間後に検定した。非感染細胞からのバックグラウンド活性は「細胞」と示す。 ＡｃＭＮＰＶゲノム内の組換えタンパク質の発現のための他の部位の同定を示す。Ａ) タンパク質発現に使用する遺伝子座の相対的位置を示すＡｃＭＮＰＶの図。Ｂ) 挿入に使用する遺伝子座と遺伝子座に施した任意の更なる変化を示す表。Ｃ) 示した各遺伝子座に更なるホタルルシフェラーゼ発現カセットを含むように変更したウイルスを感染させて４８時間後の相対的なウミシイタケルシフェラーゼ活性。すべてのウイルスは、ｐ３５プロモーターの制御下のｐ１０遺伝子座に同じウミシイタケルシフェラーゼ発現カセットを有していた。誤差バーは、各遺伝子座について５回の結果からの標準偏差を示す。Ｄ) 示した各遺伝子座に挿入したポリヘドリンプロモーター-ホタルルシフェラーゼポリヘドリン転写終結カセットの相対的な発現を示す、規準化したホタルルシフェラーゼ活性。誤差バーは、各遺伝子座について５回の結果からの標準偏差を示す。ホタルルシフェラーゼは、同じゲノムから発現されるウミシイタケルシフェラーゼコントロールを使用して規準化した。ｏｒｆ１１、ｖ−ｆｇｆ、ｐｅおよびｏｒｆ２３の遺伝子座のホタルルシフェラーゼ挿入は、コントロールウイルスより２ログ以上低いウミシイタケルシフェラーゼレベルであったため考慮しなかった。ウイルスＰｈは、ポリヘドリン遺伝子座にホタルルシフェラーゼおよびｐ１０遺伝子座にウミシイタケルシフェラーゼを有する。ウイルスＰｈ＊は、同じｐ１０ウミシイタケルシフェラーゼ挿入を有するが、ホタルルシフェラーゼ挿入を有しない。 図３の続きである。 ｅｇｔおよびポリヘドリン遺伝子座からのインフルエンザＭ１の発現を示す。左パネルは、コントロールバキュロウイルス(レーン１および４)、ｅｇｔ-Ｍ１(レーン２)およびＹＭ１-Ｍ１(レーン３)に感染した細胞からの総タンパク質のクーマシー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー(レーンＭ)のサイズはゲルの左側に示す。右パネルは、抗Ｈ７Ｎ７抗血清にてプローブした二重ゲルのウエスタンブロットを示す。 インフルエンザＭ１およびＨＡの共発現とＶＬＰの形成を示す。Ａ) 左パネルは、総タンパク質のクーマシー染色ゲルを示す。右パネルは、抗Ｈ７Ｎ７インフルエンザウイルス血清にてプローブした二重ゲルのウェスタンブロットを示す。細胞には、ＨＡおよびＭ１を発現する二重バキュロウイルス(レーン１)、ＨＡのみを発現するバキュロウイルス(レーン２)、細胞コントロール(レーン３)、Ｍ１のみを発現するバキュロウイルス(レーン４)を感染させた。Ｂ) インフルエンザＶＬＰの陰性染色ＥＭ画像。Ｃ) 金粒子を有するイムノゴールド(ＨＡ)標識インフルエンザＶＬＰを矢印で示す。 ４つのタンパク質を共発現するバキュロウイルスの産生を示す。Ａ) ＶＰ２(レーン１)、ＶＰ５(レーン２)、ＶＰ３(レーン３)およびＶＰ７(レーン４)、非感染細胞(レーン５)又は４つすべてのタンパク質(レーン６−１０)を発現するバキュロウイルスを感染した細胞の細胞溶解物。マーカータンパク質(Ｍ)の位置とｋＤａのサイズは示した通りである。Ｂ) ＶＰ５、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ７(レーン１−４)および部分的に精製したＶＬＰ(レーン５)を発現する細胞の細胞溶解物。Ｃ) 各ＢＴＶタンパク質の発現に使用した挿入の遺伝子座とウイルスプロモーターを示す表。Ｄ) 精製したＢＴＶ ＶＬＰを示すイムノゴールド陰性染色ＥＭ(ＶＰ５の場合)。 ＣＣＴ５の過剰発現の際に形成される結晶質のプレートを示す。ＣＣＴ５を発現するバキュロウイルスによる感染最後期の培養液中の四辺形のタンパク質集合体。 昆虫細胞におけるＣＣＴの発現を示す。Ａ) ＣＣＴ１−ＣＣＴ８を発現するバキュロウイルス(それぞれレーン１−８)、細胞のみ(レーン９)又は７つのＣＣＴサブユニットを共発現するバキュロウイルス(レーン１０)を感染した細胞のクーマシー染色細胞溶解物。Ｂ) ポリクローナル抗マウスＣＣＴ抗血清を用いた二重ゲルのウエスタンブロット。Ｃ) ＣＣＴサブユニットの各々を発現するために使用した異なる遺伝子の遺伝子座とプロモーターを示す表。

バキュロウイルス発現系は、酵素的および構造的な研究のための、正しく折り畳まれた真核生物タンパク質を大量に製造するための可能性が十分に確立されている。しかしながら、ほとんどではないが多くのタンパク質は、いくつかの異なる遺伝子の生成物から作られる複合体のように、細胞内で活性であることが徐々に明らかになっている。タンパク質構造の発見の速度が上がると、タンパク質複合体の迅速かつ確実な製造および精製のためのシステムが確立されることが求められている。これは、多くのタンパク質サブユニットの共発現や真核生物の折畳みおよびプロセシングを必要とする大きな複合体に特にいえることである。以前、発明者は、同じバキュロウイルスゲノムから２、３、４および５のタンパク質を発現することが可能なバキュロウイルス導入ベクターを開発した。以前の研究の発明者の主な目的は、構造的および酵素的な研究のために、非等モル量のウイルスコードタンパク質を含有するウイルスタンパク質複合体を大量に合成することが可能なシステムを生産することである。これらのシステムによる技術からの所見の一つは、複数の遺伝子を発現する単一のバキュロウイルスが、単一の遺伝子を発現する複数のバキュロウイルスによる昆虫細胞の共感染よりも、所望のタンパク質複合体を形成するのにより効果があることである。今回の研究において、発明者等は、生物学上関連する哺乳類のタンパク質複合体のために複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを製造するために、新しい技術を使用してこの所見を利用した。

特に、発明者等は、同時に複数のタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの迅速かつ効率的な製造のために新規な細菌染色体工学技術を応用し、改良した。開発した新規のシステムは、従来の方法の３０倍の効率であり、バキュロウイルスゲノム内の任意の遺伝子座に慣例的に遺伝子を挿入することが可能である。これらの研究により、組換えタンパク質を高く発現させる、バキュロウイルスゲノム内の７つの新規な遺伝子の遺伝子座を同定した。さらに、発明者等は、複数の反復ラウンドの組換えを実行し、異なる複数の単一遺伝子挿入物からの一つの複合体において複数のタンパク質を発現するウイルスゲノムを生成させることができることを示した。例として、発明者等は、インフルエンザＡ型(Ｈ７サブタイプ)およびブルータングウイルス(セロタイプ１)、並びに癌研究の焦点である８サブユニットの哺乳類シャペロン複合体ＣＣＴ(ＴＣＰ)のためのＶＬＰタンパク質複合体を発現した。

材料および方法
多遺伝子座単一遺伝子の挿入は、ラムダｒｅｄ組換えを用いて大腸菌において達成される。本発明には、多タンパク質発現に以前は使われていなかったバキュロウイルス遺伝子座の使用と、バキュロウイルスゲノムから取り除かれ、その後再利用されうる選択マーカーの取込みが含まれる。他のシステムとは異なり、組換えタンパク質遺伝子は反復配列が隣接しておらず、その遺伝的安定性を改善する。

導入ベクターは、標的相同組み換えに対するＡｃＭＮＰＶの領域、発現カセット(ＡｃＭＮＰＶプロモーター、ポリリンカー、ポリアデニル化シグナル)および細菌の選別カセットを含有する。使用するＡｃＭＮＰＶプロモーターは、ウイルス後期(例えばｐ３５)又は最後期(例えばポリヘドリン、ｐ１０)遺伝子からのものである。細菌の選別カセットは変異形ＬｏｘＰ部位−細菌の選択マーカー−変異形ＬｏｘＰ部位からなる。変異形ＬｏｘＰ部位は、ＬｏｘＰ６６およびＬｏｘＰ７１の変異体上の変異体である(９)。各選択マーカーのＬｏｘＰ部位は、残っているＬｏｘＰ部位を破壊して組換えの際にマーカーが検出されるように設計する。各選択マーカーは、同じバキュロウイルスに挿入された異なる選択マーカー遺伝子間で組換えが起こらないように、異なるＬｏｘＰ変異アームを有する。

組換えタンパク質の多遺伝子座発現に使用するシステムの選択
最初の研究計画には、昆虫細胞における相同組換えの使用、又は大腸菌におけるＥＴ組換えの代替方法を用い、バキュロウイルスゲノム内の異なる遺伝子座に組換えタンパク質のための発現カセットを効率良く挿入させた。発明者等の準備データは、導入ベクターの直線化により、生産された組換えタンパク質以外の陽性選択を有しなかった遺伝子座(ｐ１０)での組換え頻度が有意に増加した(最高およそ３０％)ことを示唆した。研究計画の開始時には、特定の遺伝子座での組換え遺伝子の挿入を達成し、結果として生じたタンパク質の発現を検査するために要する時間とその再現性の面で、２つの系(ＥＴ組換えおよび昆虫細胞組換え)を考慮していた。発現の各ラウンドに要する時間の面で、ＥＴ組換え系がより迅速であり、これは主にバキュロウイルスの第二遺伝子座に遺伝子を挿入するためのバキュロウイルスゲノムの調製に必要な時間が低減したことによる。加えて、導入遺伝子の発現とは関係なく遺伝子の挿入を確認することができるアプローチを設計することができたので、発現を確認するために昆虫細胞内でウイルスを生育させる必要は、完全な昆虫細胞ベースの系の場合ほど重要ではなかった。第二に、バキュロウイルス系に挿入された遺伝子とマーカーを同時に導入することができるが、このようなマーカーの数には限界があり、それぞれは一度しか用いることができなかった。このプロジェクトの目的の一つは、マウスＣＣＴ(ＴＣＰ１)複合体(８サブユニット)を発現させることであったので、ＥＴ組換え手法が複数の遺伝子の挿入させることができ、かつ迅速であったので、この系を初期の最優先研究課題とした。

実施例１
ＥＴ組換えを効率良く選別するための試薬の開発
ＥＴ手法を使用した最初の実験は期待できるものではなかった。レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)を完全なＡｃＭＮＰＶゲノムを保因している細菌性人工染色体(バクミド)に挿入し、ルシフェラーゼレポーターと共に組み込んだクロラムフェニコール耐性遺伝子によって選別した実験を行った。クロラムフェニコール耐性細菌コロニーを回収したが、その後の分析により、それらがルシフェラーゼレポーターにより正しく変更されたバクミドを含有していないことがわかった。ＡｃＭＮＰＶを複製する条件下で昆虫細胞においてのみ発現されるように設計されたレポーターをＧＦＰに変えた場合にも、同様の結果が得られた。しかしながら、クロラムフェニコール選別なしで、ＧＦＰコンストラクトを大腸菌の組換えに使い、バクミドＤＮＡを完全に形質転換した大腸菌集団のために調製した場合、このＤＮＡは、昆虫細胞(Ｓｆ２１)に形質移入されると２、３の蛍光焦点が生じた。これらのデータは、組換え自体にではなく、挿入を含有している細菌の組換え後の選別に問題があることを示唆した。これらの問題を克服するために、発明者等は、変更ＬｏｘＰ組換え部位に隣接させたＬａｃＺα断片およびゼオシン耐性遺伝子に基づいてグループ化マーカー系を組み込んだ新規な選別カセットを設計した(図１Ａ)。このシステムを用いて、十分なゼオシンを選別プレートに加え、バックグラウンドのコロニー成長を取り除くのではなく低減し、組換えを、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌの存在下で青いコロニー表現型に基づいて選択した。クロラムフェニコール(ｃａｔ)およびグループ化選別系を用いた組換え体回収の相対的な効率を評価するために、発明者等は、変更していないバクミドを含有する組換えコンピテント大腸菌に、３０ｎｇ(およそ１２．５ｆｍｏｌ)のクロラムフェニコールベース又はグループ化選別カセットを電気穿孔した実験を行った(図１Ｂ)。
外来タンパク質コード配列の取込みに理想的な系は、挿入した遺伝子の繰り返しＰＣＲを要しないので、発明者等は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ間の組換えの効率も比較した。これは、ＥＴ組換えおよび制限酵素により生じゲル精製されたＤＮＡには決まった手順である。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物の端が制限酵素により生じた断片の端に対応するように、設計した。

グループ化選別により、陽性コロニーの数は、ＤＮＡ断片の組換えがＰＣＲによって生成された場合のクロラムフェニコールのみの選別と比較して２０倍、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって生じた場合に３０倍の増加となった(図１Ｂ)。これらの相違は有意であった(ｔ検定、ｐ＝０．０３)。クロラムフェニコール選別では、ＰＣＲによって回収されるコロニーの数と制限酵素によって生じたＤＮＡとの間に相違はなかった。しかしながら、グループ化選別では、コロニーの平均数は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡと比較して制限酵素により生じたＤＮＡでは４倍多かった(ｔ検定、ｐ＝０．０５)。新規なグループ化選別からの組換えが真正であることを確認するために、挿入した発現コンストラクトを含む変更バクミドを発現させる、ＰＣＲを、陽性コロニーから精製したバクミドＤＮＡにおいて実行した。ゼオシン耐性マーカーの内側の配列に対して一つのプライマーを設定し、導入ＤＮＡ内でなく正しい挿入部位に隣接するバクミドＤＮＡにのみ存在する配列を標的として一つのプライマーを設定した。ゆえに、ＰＣＲ産物は、組換えに用いた線状ＤＮＡとバクミドとの間で組換えが生じた場合にのみ生成する。１２の異なるバクミドＤＮＡ試料をこの方法を使用して試験したところ(図１Ｃ、レーン１−１２)、すべては正しく目標とした組換えのための診断用ＰＣＲ産物について陽性であった。これに対して、バクミドＤＮＡ単独および組換えに用いたＤＮＡ断片を含有するプラスミドＤＮＡはいずれも、ＰＣＲ産物を生成するためのテンプレートとして機能しなかった(図１Ｃ、それぞれレーン１４および１５）。組換えにより感染組換えバキュロウイルスが回収されたことを更に確認するために、同じ１２のＰＣＲ陽性バクミドクローンを、Ｓｆ２１細胞に形質移入し、２代継代し、次いで各組換え体を感染させた細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性を感染の４８時間後にアッセイした。１２の組換えウイルスの各々を感染させた細胞は、バックグラウンドの１０６倍のウミシイタケルシフェラーゼ活性を有した(図１Ｄ)。これらのデータに基づいて、発明者等は、更なる研究のためのグループ化選別の使用を進めた。

実施例２
選択マーカーのＣｒｅ媒介除去により、同じグループ化選別による複数回の組換えが可能となる
単一遺伝子座の挿入を使用して複数の異なるサブユニットを有するタンパク質複合体を発現させるために、グループ化マーカー系を、選別カセットが変更ＬｏｘＰ部位に隣接するように設計した。これらの部位は、Ｃｒｅが媒介する組換えを単回に制限するｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１の変異(１)と、野生型ｌｏｘＰ部位に対する相同性を低減するスペーサー内の変異を組み込む。ゆえに、Ｃｒｅリコンビナーゼと共に変更バクミドをインキュベートすると、グループ化選択マーカーが除去され、ｌｏｘ組換え部位が不活性となるが、バキュロウイルス発現カセットが残る(図２Ａ)。この方策を用いてバクミドＤＮＡに複数の挿入がうまく操作されたことを確認するために、Ｃｒｅ組換えを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターが挿入されたバクミドからグループ化マーカーを取り除いた。ＥＬ３５０細胞株を用いて大腸菌において組換えを達成した(２)。この細胞株は、温度制御λＰＬプロモーターの制御下にｅｘｏ、ｂｅｔおよびｇａｍを、そしてアラビノース誘導性プロモーターの制御下にＣｒｅリコンビナーゼを発現する統合されたラムダプロファージを有する。ウミシイタケルシフェラーゼグループ化選別挿入物を組み込むように変更された３つのバクミドを含有するＥＬ３５０細胞(図１)を、アラビノースにて誘導し、次いで、カナマイシンを含むプレートに広げ、バクミドおよびＸ-ｇａｌについて選別して、Ｃｒｅが媒介した組換えによって選択マーカーを失ったコロニーをスクリーニングした。バクミドＤＮＡを４つの推定組換え体から精製し、Ｃｒｅ媒介組換えを、選択マーカーに隣接するプライマーを用いたＰＣＲを使用して確認した(図２Ｂ)。４つすべての組換え体は、成功したＣｒｅ組換えから予想されるサイズと一致するＰＣＲ産物を有した。これは、この４つの組換え体の変更ｌｏｘＰ部位全体を配列決定することによって更に確認した(図２Ｃ)。この組換え体は、ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６の両変異を組み込み、組換えの更なるラウンドにコンピテントでない無効ｌｏｘＰを含んでいた。Ｃｒｅ媒介バクミド組換え体が昆虫細胞において生存可能なままであったことをさらに確認するために、先の通りに、バクミドＤＮＡを昆虫細胞に形質移入し、２代継代させた後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。すべての組換え体は、Ｃｒｅ組換え前の親のバクミドに等価であるウミシイタケルシフェラーゼ活性を有していた(図２Ｄ)。

実施例３
異種タンパク質の高レベルの発現に適切なバキュロウイルスゲノム内の遺伝子座の同定
バキュロウイルス発現系において多大なタンパク質発現作業が行われたにもかかわらず、ほとんどの発現は、組換えタンパク質を発現させるために、ポリヘドリン又はｐ１０遺伝子の置換に集中していた。組換えタンパク質の発現に代替遺伝子座の使用を記述している文献は相対的に少ない。選別が異なるバキュロウイルス遺伝子の遺伝子座で効率的に使われるか否かを試験するために、２回目の組換えをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有しているバクミドのうちの１つに行った。これらの実験において、同じポリヘドリンプロモーター−ホタルルシフェラーゼ−ポリヘドリン転写終結因子を、ウミシイタケおよびホタルのルシフェラーゼタンパク質(図３Ａ)のための二重発現バキュロウイルスを生成する合計１３の異なる遺伝子の遺伝子座(ｃｔｘ、ｏｒｆ１１、ｅｇｔ、ｏｒｆ２３、ｖ-ｆｇｆ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２、ｃｈｉＡ、ｐｅ、ｏｄｖ-ｅ１８およびｏｄｖ−ｅ５６)に独立して挿入した。どのバキュロウイルス遺伝子が組織培養におけるウイルス増殖に必須でないか、および特定の遺伝子座のバキュロウイルス遺伝子の配列が他の発現カセットの挿入に適したか否かを決定することによって、これらの実験における挿入のための部位として遺伝子座を選択した。それでもやはり、いくつかの遺伝子座でいくつかの更なる変化、特に特定のバキュロウイルス遺伝子のノックアウトが生じる変化がされた(図３Ｂ)。組換えウイルスを、Ｓｆ２１昆虫細胞において２代継代し、３継代目に細胞を感染の４８時間後に回収し、溶解し、ホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性についてアッセイした。すべての組換え体がｐ１０遺伝子座にｐ３５プロモーター作動性ウミシイタケルシフェラーゼカセットを有していたので、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をウイルス置換およびタンパク質発現のマーカーとして用いた。各々の新規な遺伝子座のホタルルシフェラーゼの発現を、ポリヘドリン遺伝子座にホタルルシフェラーゼ遺伝子と同じウミシイタケルシフェラーゼ比較遺伝子を保因するウイルスと比較した。試験した１３の遺伝子座の中で、９つはバックグラウンドの少なくとも１０^５倍であったウミシイタケルシフェラーゼ活性を有し、これらのうちの８つ(ｃｔｘ、ｅｇｔ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２、ｃｈｉＡ、ｏｄｖ-ｅ１８およびｏｄｖ-ｅ５６)は親のウミシイタケルシフェラーゼのみ、およびポリヘドリン遺伝子座ホタルルシフェラーゼのコントロールについて測定した活性程度又はそれより上であったウミシイタケルシフェラーゼを有していた(図３Ｃ)。バックグラウンド活性の１０倍以内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を生じたウイルスとなった４つの遺伝子座(ｏｒｆ１１、ｖ-ｆｇｆ、ｐｅおよびｏｒｆ２３)は、更なる分析から除いた。残りのウイルスについて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼ活性を正規化するための参照物として用い、各遺伝子座からのホタルルシフェラーゼの相対的な発現を測定した(図３Ｄ)。７つの遺伝子座(ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６)は、バックグラウンドより少なくとも１０ ^６ 倍高いホタルルシフェラーゼ活性を有しており、これは同じ遺伝子がポリヘドリン遺伝子座から発現されたときと同程度であった(図３Ｄ)。２つのウイルス(ｃｈｉＡおよびｏｄｖ-ｅ１８)は高いレベルのウミシイタケルシフェラーゼを有していたが、ホタルルシフェラーゼの発現は相対的に低かった。

この研究により、バキュロウイルスゲノム内のいくつかの遺伝子座から高レベルの外来タンパク質の発現が可能であることが明らかとなり、良好な発現が生じるポリヘドリンおよびｐ１０に加え、７つの遺伝子座(ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６)が同定される。これらの部位のうち、３９ｋ、ｏｒｆ５１およびｇｐ３７は遺伝子のコード領域に隣接するＤＮＡへの挿入物であり、タンパク質発現を直接妨げない。これに対して、ｃｔｘ、ｅｇｔ、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６それぞれへの挿入物は、これら遺伝子からの対応するタンパク質の発現を妨げると思われる。これらの遺伝子の初めの３つは、細胞培養物におけるウイルスの増殖に必須ではないと既に記載されている(３−６)。また、ＯＤＶ-Ｅ５６タンパク質のトランケーションも報告されている(７)。

ホタルルシフェラーゼレポーターを良好に発現しなかった遺伝子座のうち、４つ(ｏｒｆ１１、ｖ-ｆｇｆ、ｐｅおよびｏｒｆ２３)は、すべての組換え体に存在していたウミシイタケルシフェラーゼマーカータンパク質の発現も低減していた。研究の焦点は最後期プロモーター発現コンストラクトの挿入に適した部位を同定することであるので、この発現の低減の主な理由は調査しなかった。ウイルス複製又は転写に対し遺伝子座特異的な効果があり、隣接遺伝子に必須なプロモーター又はエンハンサーの因子を破壊する可能性がある。ｃｈｉＡおよびｏｄｖ-ｅ１８挿入ウイルスにおけるホタルルシフェラーゼの低発現は他の理由が予測できなかった。他に、ｃｈｉＡ遺伝子座への組換えタンパク質発現カセットの挿入を記録した報告がある(８、９)。発明者等の実験におけるこの遺伝子座のホタルルシフェラーゼ遺伝子によって見られる発現レベルの低減は、挿入に隣接する遺伝子に対する影響によるものである可能性がある。ｏｄｖ-ｅ１８については、同じ変異体ウイルスを使用した最近の報告により、このタンパク質が出芽したウイルス生成および細胞間運動に必須であることが示唆されている(１０、１１)。これらの研究は、ｏｄｖ-ｅ１８のコード配列および上流の隣接遺伝子内に欠失がある変異体に基づいていた。コード配列のＡＴＧのＧＡＴへの変異の後にこの遺伝子のここでホタルルシフェラーゼカセットが挿入されたことによってｏｄｖ-ｅ１８が不活性化された実験では、感染性ウイルスを回収することが可能であった。第３継代におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現が親のウイルスと等価であることから、この変異ウイルスの複製能が障害されなかったことが示唆される。しかしなから、この変異を持たないウイルスと比較してホタルルシフェラーゼレベルがおよそ２ｌｏｇ低減したので、この変異が修復されたわずかなウイルスがレポーター遺伝子を発現する第二集団を捕捉していた可能性を除外することができない。

実施例４
多遺伝子座バキュロウイルス発現を用いたタンパク質複合体の発現
実施例３は、組換えタンパク質を発現する異なるバキュロウイルス遺伝子座の潜在能を定量的に評価するためのレポーター遺伝子の使用に注目した。組換えタンパク質複合体を発現させ、回収することが可能か否かを確認するために、異なる数のタンパク質サブユニットを有する３つの特定の複合体を標的とした。ウイルスＭ１およびＨＡタンパク質の共発現によりインフルエンザ(Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓ／１／８０) Ｈ７サブタイプ(２タンパク質複合体)について、そして、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ５およびＶＰ７の共発現によりブルータングウイルス(ＢＴＶ)セロタイプ１(４タンパク質複合体)について、ウイルス様粒子を生成した。加えて、発明者等は、マウスＣＣＴシャペロン複合体の８つすべてのサブユニットの発現を標的とし、更なる機能的および構造的研究のために用いた。

インフルエンザＡ型ＶＬＰ
これらの実験では、すべてのインフルエンザ遺伝子は、ドイツ、マールブルク、フィリップス大学の研究者から入手した、Ｈ７Ｎ７(Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓ／１／８０)単離物由来のＳＣ３５Ｍマウス適応株から得た。

多遺伝子座発現系が２つのタンパク質を有するタンパク質複合体を生産することが可能であるか否かを試験するために、インフルエンザＡ型Ｍ１タンパク質のコード配列をまず最初に、ポリヘドリンプロモーターの制御下のｅｇｔ遺伝子座に挿入した。比較のために、同じ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子座を標的とした従来のバキュロウイルス発現ベクター(ｐＡｃ-ＹＭ１)に挿入した。組換え後、結果として生じた両バキュロウイルスはＭ１タンパク質を発現した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した場合に、ｅｇｔおよびポリヘドリン遺伝子座からのタンパク質の発現レベルはいずれも、バキュロウイルス感染細胞における他のいかなるウイルス又は細胞のタンパク質よりも有意に高かった(図４)。

Ｍ１とＨＡとを発現する二重ウイルスを生成するために、細菌の選別カセットを、Ｃｒｅ組換えによってＭ１発現バクミドから除き、同じインフルエンザ株(Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓ／１／８０)のＨＡ遺伝子を２回目のＥＴ組換えによってｐ１０遺伝子座に挿入した。結果として生じたウイルスからのＭ１およびＨＡの共発現は、前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析によって確認した(図５Ａ)。さらに、インフルエンザＶＬＰは、感染細胞の培養培地から単離し、密度勾配超遠心法によって精製し、陰性染色ＥＭ分析によって可視化した(図５Ｂ)。可視化したＶＬＰが実際にインフルエンザであることを確認するために、インフルエンザＨＡに特異的に抗体を用いて粒子をイムノゴールド標識した(図５Ｃ)。

まとめると、これらのデータは、多遺伝子座手法が組換えタンパク質発現のために成功裏に使用できたこと、そしてグループ化選択マーカー系の２回の挿入によってこのような組換えウイルスを生産することが実用的であったことを裏付けるものである。インフルエンザＶＬＰは他者により広く試験されており、マウスおよびフェレットにおいて免疫原性であることが示されている。ＶＬＰを構築するこの方法は、すでに予め統合されたＭ１を有するバキュロウイルスゲノムを有し、発現の準備ができている点で有利である。ゆえに、ＶＬＰを造るためには、単回の組換えを実施すること、そしてワクチン製造のために必要な新生インフルエンザサブタイプのいずれかからのＨＡ遺伝子を加えることのみが必要である。ＶＬＰベースのインフルエンザワクチンでは、これにより、必要なクローニングを単純化し、そして、潜在的に、新規なタイプのＶＬＰを造る速度を上げるであろう。

ＢＴＶ１ ＶＬＰ
ＶＬＰがちょうど２つのタンパク質の発現によって形成されるインフルエンザとは異なり、ＢＴＶ ＶＬＰは４つの構造タンパク質(ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ５およびＶＰ７)の組み合わされた発現を必要とする。組換えのための新規な系の有用性を更に示すために、各タンパク質を単独に、および４つすべてのＢＴＶ構造タンパク質の組み合わせを発現するウイルスを製造した(図６)。新規な系の利点のうちの１つは、単一タンパク質と複数のタンパク質を発現するウイルスが同じセットの導入ベクターから製造できる点である。これにより、完全な複合体において共発現されるタンパク質の位置についてのマーカーとして働く単一タンパク質を発現するコントロールウイルスの製造が容易になる。ＢＴＶ ＶＬＰでは、インフルエンザの実施例とは異なるセットの遺伝子座を用いた(図６Ｃ)。更に、新規な系は、Zhao et al., (１２)によって記載されるｏｒｆ１６２９ノックアウトバクミドと組み合わせ、ポリヘドリン遺伝子座に従来の導入ベクターを用いて複合体のサブユニットのうちの１つを発現させた。ＶＬＰの形成は、外側のキャプシドタンパク質の１つ(ＶＰ５)のイムノゴールド標識と組み合わせた、陰性染色ＥＭ下での粒子形態によって確認した(図６Ｄ)。

マウスＣＣＴ
本発明の適用は、ウイルス様粒子の形成に限定されない。実際、多くの細胞タンパク質が複数のサブユニットを有する複合体として細胞中で存在するので、これら複合体の効率的な形成は様々な分野に適用がある。他の研究への系の有用性を示すために、シャペロン複合体ＣＣＴを選択した。この複合体は癌研究との関連があり、８つのサブユニットを有する場合、タンパク質発現の重要な試みとなる。実際、本発明のベクターおよび方法を用いずにバキュロウイルス系でこの複合体を発現させることはできなかった。先の実施例３において同定された、異なる遺伝子座を各々標的とし、マウスＣＣＴのサブユニットの１つを各々発現する８つの導入ベクターを構築した。これらを用いて、各サブユニットを単独で、そしてサブユニットを組み合わせて発現する組換えウイルスを生成した。サブユニットの１つ(ＣＣＴ５)では、タンパク質が細胞において過剰に発現される場合、異常な表現型が見られた。細胞内に針状晶が見られ、細胞が破裂した感染後期では、培養培地中に四角形のプレート状の結晶物質が見られた(図７)。このタンパク質のために精製スキームを作り、そして、このプロジェクトのＣＣＴパートのための協力者に、予備的結晶化条件と感染細胞材料を供給した。

他のＣＣＴサブユニットの発現により感染後期の細胞に可視集合体が生じたものもあったが、いずれも通常の外観を有する集合体とはならなかった。

８つすべてのＣＣＴサブユニットは高レベルに発現され(図８Ａ)、マウスＣＣＴに対して生じたポリクローナル抗血清と交差反応した。内在性昆虫細胞ＣＣＴサブユニットの１つとポリクローナル抗体との間にいくつかの交差反応があった(図８Ｂ、レーン９)。しかしながら、この内在性シグナルのみが、すべてが感染した細胞内で高いレベルで蓄積した３つのサブユニット(ＣＣＴ１、ＣＣＴ５およびＣＣＴ６)と同じ位置に配置したので、明確に検出することができた。他の全てのサブユニットは、わずかに異なる分子量のタンパク質として移動したので、移動を基に昆虫細胞タンパク質を区別することができた。

結論
３つすべてのタンパク質複合体について、単独で発現した場合と他のタンパク質と発現した場合とでは、同じ組換えタンパク質の蓄積に明らかな違いがあった。ほとんどすべての場合において、複数のタンパク質が同じウイルスから発現されると、タンパク質発現のレベルが低減した。これはある程度予測されることであった。転写、ＲＮＡプロセシング、翻訳およびタンパク質の折畳みに必要なタンパク質が競合するので、高く発現されるバキュロウイルス遺伝子の２つが共に発現されると別々に発現されるよりも低いことが予測できる。しかしながら、ＢＴＶ ＶＬＰおよびＣＣＴの実施例に関して注目すべきことは、タンパク質発現の低減が異なる遺伝子の遺伝子座間で可変的であったことであった。ＢＴＶ、ＶＰ２、ＶＰ５、ＶＰ３およびＶＰ７を用いた実施例では、すべて、単独で発現した場合に、タンパク質の有意かつ類似な蓄積が生じた。しかしながら、４つすべてのタンパク質を発現する単一のバキュロウイルスに組み込んだ場合、ＶＰ２およびＶＰ３はＶＰ５およびＶＰ７より低いレベルで蓄積した(図６Ａ)。単一および４重の両ウイルスでは遺伝子が同じ遺伝子の遺伝子座から発現されたので、この効果はゲノム統合の位置効果によって説明することができない。１つの説明は、この効果が異なる遺伝子のために使われる異なるプロモーターによるものであることが考えられる。ＶＰ５およびＶＰ７は共にｐ１０プロモーターの制御下で発現され、ＶＰ２およびＶＰ３はポリヘドリンプロモーターの制御下で発現された。これは、ｐ１０遺伝子の欠失によりポリヘドリン遺伝子座１３からの発現が増加したという文献の報告と一致した。ゆえに、２つのｐ１０プロモーターの存在下でのポリヘドリンプロモーターの複製により、ポリヘドリンプロモーター作動性遺伝子からの発現を選択的に低減することが予測される。しかしながら、これは、ＣＣＴ複合体の場合に観察される効果を完全に説明するものではない。ＣＣＴ５およびＣＣＴ２はいずれもｐ１０プロモーターから発現され、単独で発現される場合には組換えタンパク質を安定して高いレベルで発現した(図８ＡおよびＢ、レーン２および５)。しかしながら、同じウイルスに組み込んだ場合、ＣＣＴ５の発現はＣＣＴ２と比較して実質的に低減した(図８ＡおよびＢ、レーン１０)。これらのデータから、ｐ１０遺伝子座に存在する他のｃｉｓ作動性配列は、いずれもこの遺伝子座に挿入されているＣＣＴ２およびＢＴＶ ＶＰ５の発現を相対的に上げるように働いているようである。インフルエンザＨＡが同じ部位に挿入された場合に見かけの発現が相対的に低いことは、転写効果よりもむしろＥＲでのこのタンパク質の代謝回転に関連しているようである。ＣＣＴ２およびＶＰ５は共に細胞質に蓄積する。

本発明者等は、組換えタンパク質のための発現カセットの慣例的な挿入に使うことができる程度にまでバキュロウイルスに適用できるようにＥＴ組換え系の効率を向上させた。さらに、発明者等は、タンパク質の高レベルの発現に使うことができる７つの遺伝子の遺伝子座(ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６)を同定し、３つの実施例(インフルエンザＡ型およびＢＴＶ ＶＬＰ、およびＣＣＴ複合体)を用いて、この系を用いて多タンパク質複合体が蓄積されうることを示した。

前述のすべての文書は出典明記によって本明細書に援用される。

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Claims (19)

1. バキュロウイルス配列の遺伝子座に、タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子を挿入するための導入ベクターであって、
   ａ．タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
   ｂ．(i) 第一選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
   (ii)第二選択マーカーをコードする発現可能な配列、
   を含む除去可能なグループ化選別カセットであって、それぞれの側にＬｏｘＰ組換え配列が隣接し、該ＬｏｘＰ配列が単回のみの組換えが起こるように変更されている、除去可能なグループ化選別カセットと、
   ｃ．前記発現カセットおよびグループ化選別カセットを含む挿入される配列の両端に隣接する配列であって、このとき、バキュロウイルス配列内の遺伝子座の配列と相同性があり、相同組換えを生じさせる配列と
   を含んでなる導入ベクター。
2. 第一選択マーカーが視覚マーカーである、請求項１に記載の導入ベクター。
3. 第一選択マーカーがＬａｃＺα断片である、請求項２に記載の導入ベクター。
4. 第二選択マーカーが抗生物質に対する耐性を与える、請求項１に記載の導入ベクター。
5. 抗生物質耐性遺伝子がフレオマイシンに対する耐性を与える、請求項４に記載の導入ベクター。
6. 発現およびグループ化選別カセットに隣接する配列が、以下の遺伝子座：ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２、ｏｄｖ-ｅ５６およびｐ１０のいずれか一つの配列に相同性がある、請求項１から５のいずれか一項に記載の導入ベクター。
7. 組換えバクミドの製造方法であって、
   ａ．バクミドと請求項１から６のいずれか一項に記載の導入ベクターとを共に相同組換えさせることと、
   ｂ．発現カセットとグループ化選別カセットとを含む組換えバクミドについて選別すること
   を含む方法。
8. ＬｏｘＰ配列間に組換えを誘導し、バクミドから選別カセットを取り除くことを更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、請求項７に記載の方法によって組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが生成されるように該バクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
10. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、請求項８に記載の方法によって組換えバクミドを製造し、バキュロウイルスが生成されるように該バクミドを含む真核細胞を培養することを含む方法。
11. タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えバクミドであって、
    ａ．タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
    ｂ．(i) 第一選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
    (ii)第二選択マーカーをコードする発現可能な配列、
    を含む除去可能なグループ化選別カセットであって、それぞれの側にＬｏｘＰ組換え配列が隣接し、該ＬｏｘＰ配列が単回のみの組換えが起こるように変更されている、除去可能なグループ化選別カセットと、
    を含む配列が、バキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入されている、
    組換えバクミド。
12. タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスであって、
    ａ．タンパク質複合体のサブユニットをコードする遺伝子に作用可能に連結した真核生物プロモーターを含む発現カセットと、
    ｂ．(i) 第一選択マーカーをコードする発現可能な配列、および
    (ii)第二選択マーカーをコードする発現可能な配列、
    を含む除去可能なグループ化選別カセットであって、それぞれの側にＬｏｘＰ組換え配列が隣接し、該ＬｏｘＰ配列が単回のみの組換えが起こるように変更されている、除去可能なグループ化選別カセットと、
    を含む配列が、バキュロウイルス配列の遺伝子座に挿入されている、
    組換えバキュロウイルス。
13. 複数のタンパク質を発現し、各タンパク質がバクミドの別々の遺伝子座から発現される、請求項１１に記載の組換えバクミド。
14. 複数のタンパク質を発現し、各タンパク質がバキュロウイルスの別々の遺伝子座から発現される、請求項１２に記載の組換えバキュロウイルス。
15. 複数のタンパク質が相互作用してタンパク質複合体を形成する、請求項１３に記載の組換えバクミド又は請求項１４に記載の組換えバキュロウイルス。
16. タンパク質複合体がウイルス様粒子又はシャペロン複合体である、請求項１５に記載の組換えバクミド又は組換えバキュロウイルス。
17. 別々の遺伝子座が、ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２およびｏｄｖ-ｅ５６から選択される、請求項１３に記載の組換えバクミド又は請求項１４に記載の組換えバキュロウイルス。
18. 請求項１から６のいずれか一項に記載の導入ベクター、請求項１１、１３、１５から１７のいずれか一項に記載のバクミド、又は請求項１２、１４から１７のいずれか一項に記載のバキュロウイルスを含む細胞。
19. 好適な条件下で、請求項１２、１４から１７のいずれか一項に記載のバキュロウイルス、又は請求項１１、１３、１５から１７のいずれか一項に記載の組換えバクミドを含む宿主細胞を培養することを含む、一又は複数のタンパク質の製造方法。